[go: up one dir, main page]

NO173287B - Fremgangsmaate for rensing av enkeltkjedet og dobbeltkjedet vevplasminogenaktivator - Google Patents

Fremgangsmaate for rensing av enkeltkjedet og dobbeltkjedet vevplasminogenaktivator Download PDF

Info

Publication number
NO173287B
NO173287B NO87871883A NO871883A NO173287B NO 173287 B NO173287 B NO 173287B NO 87871883 A NO87871883 A NO 87871883A NO 871883 A NO871883 A NO 871883A NO 173287 B NO173287 B NO 173287B
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
tpa
column
chain
molecular weight
daltons
Prior art date
Application number
NO87871883A
Other languages
English (en)
Other versions
NO871883L (no
NO173287C (no
NO871883D0 (no
Inventor
Mitsuyoshi Morii
Masaharu Ohoka
Toshihiko Suzuki
Katsuyuki Suzuki
Nobuhiro Kawashima
Noriko Morii
Kunizo Mori
Original Assignee
Mitsui Toatsu Chemicals
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from JP10320086A external-priority patent/JPH0779692B2/ja
Application filed by Mitsui Toatsu Chemicals filed Critical Mitsui Toatsu Chemicals
Publication of NO871883D0 publication Critical patent/NO871883D0/no
Publication of NO871883L publication Critical patent/NO871883L/no
Publication of NO173287B publication Critical patent/NO173287B/no
Publication of NO173287C publication Critical patent/NO173287C/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6456—Plasminogen activators
    • C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/814—Enzyme separation or purification
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/814—Enzyme separation or purification
    • Y10S435/815—Enzyme separation or purification by sorption

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for rensing av enkeltkjedet og/eller dobbeltkjedet vevplasminogenaktivator (heretter angitt som sc-tPA og dc-tPA) fra en blanding inneholdende sc-tPA og/eller dc-tPA.
tPA (vevplasminogenaktivator) er et protein som produseres i et vev i et høyere dyr som tjener til å aktivere plasminogen, en forløper for plasmin som er kjent for å være et proteolyttisk enzym spesifikt for fibrin, og som nå er bragt i fokus som et potensielt trombolyttisk middel.
tPA har to molekylærformer, enkeltkjedet tPA og dobbeltkjedet tPA, med samme molkylvekt (ca. 70.000 daiton)
og erholdes som en blanding i vanlige prosedyrer for tPA-produksjon. En dobbeltkjedet form har ca. 10 ganger høyere aktivitet for aktivering av plasminogen enn en enkeltkjedet form (Europa-patentpublikasjon nr. 112122A). Imidlertid er det kjent at sc-tPA har sterkere bindingskapasitet til fibrin enn dc-tPA, og så snart det er bundet til fibrin, omdannes det raskt til dc-tPA (D.C. Rijken et al., J. Biol. Chem. 257, 2920-2925, 1982). For å oppnå en effektiv be-handling av trombosis med tPA, må følgelig en øket bindingskapasitet av tPA til fibrin ved koaguleringen av blod erholdes under anvendelse av en tPA-blanding inneholdende en forøket mengde av sc-tPA, eller ved anvendelse av et preparat bare inneholdende sc-tPA.
Under disse omstendigheter og for å undersøke egen-skapene og funksjonene av tPA mer detaljert, har det vært et stort behov for forbedrede metoder for erholdelse av utelukkende den enkeltkjedede form, og for isolering av den enkeltkjedede og dobbeltkjedede form fra en blanding derav.
En tidligere kjent metode for fremstilling av tPA omfatter eksempelvis dyrkning av celler som er opprinnelig i stand til å produsere tPA eller manipulert til å bære tPA-genet, hvoretter tPA isoleres fra de resulterende dyrkede celler og/eller fra dyrkningssupernatanten. Eksempelvis beskriver ovenfor angitte Europa-patentpublikasjon nr. 112122A en metode for rensing av tPA under anvendelse av en
Erythrina trypsin-inhibitor (heretter angitt som ETI),
eller en immobilisert Kunits-inhibitor som produseres i frøene av Erythrina latissima og andre Erythrina-planter og som virker som en inhibitor overfor trypsin, plasmin og tPA, men ikke overfor urokinase. Ved denne metode ble imidlertid en separat isolering av sc-tPA fra dc-tPA ikke tatt i be-traktning.
Ved en tidligere kjent metode for fremstilling av sc-tPA tilsettes en proteinaseinhibitor slik som "Aprotinin" til et dyrkningsmedium for å undertrykke omdannelse av tPA fra enkeltkjedet til dobbeltkjedet form (D.C. Rijken et al., J. Biol. Chem. 256, 7035-7041, 1981).
Ved en annen metode for rensing av sc-tPA anvendes et immobilisert monoklonalt antistoff som adsorberer spesifikt sc-tPA (katalog fra BioPool, Sverige). Denne metode er imidlertid dårligere enn metoden med ETI vedrørende kapasitet til adsorbering av tPA og stabiliteten av den kolonne som anvendes. Enn videre og ufordelaktig kan denne metode ikke fjerne en urenhet som er et protein med en molekylvekt på 110.000 - 20.000 dalton og som potensielt virker som et antigen for å reagere med et anti-humant tPA-antistoff.
Under forløpet for forskjellige undersøkelser med hensyn til metoder for rensing av tPA fra et urent tPA-preparat ved tPA-produksjon, har fire av foreliggende oppfinnere innlevert en patentsøknad for en oppfinnelse som omfatter en metode for isolering og fjerning av et protein som har en molekylvekt på 110.000 - 20.000 dalton og som reagerer med et anti-humant tPA antistoff produsert i et dyrkningsmedium inneholdende kalvefosterserum, og en metode for dyrkning av transformerte celler produsert ved genmanipulering, og selektiv separering av humant celleavledet tPA fra vertcelleavledet tPA (norsk patentsøknad 863095).
Under forløpet for grundige undersøkelser med hensyn til forskjellige karakteristika av sc-tPA og dc-tPA har enn videre foreliggende oppfinnere funnet at disse to former av tPA varierer i affinitet med ETI, og har nå fullført fore-
liggende oppfinnelse som et resultat av denne observasjon.
Et mål med foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en metode for isolering av sc-tPA og dc-tPA effektivt og lett fra en blanding derav.
Et annet mål ved oppfinnelsen er å tilveiebringe en metode for isolering av sc-tPA fra et urent tPA-preparat som inneholder sc-tPA og/eller dc-tPA.
Oppfinnelsen angår således en fremgangsmåte for separat rensing og separering av enkeltkjedet vevplasminogenaktivator (tPA) og dobbeltkjedet tPA fra en blanding inneholdende begge, hvilken fremgangsmåte er kjennetegnet ved at den omfatter trinnene: (a) en blanding inneholdende enkeltkjedet tPA og dobbeltkjedet tPA bringes i nær kontakt med en kolonne som bærer en immobilisert Erythrina trypsin-inhibitor som et affinitetsmiddel for å absorbere angitte tPA på angitte kolonne; (b) kolonnen behandles med et elueringsmiddel som har en pH varierende fra 4,5 til 6,0 for selektivt å eluere enkeltkjedet tPA; og (c) kolonnen behandles med et elueringsmiddel som har en pH lavere enn 4,5, for selektivt å eluere dobbeltkjedet tPA; hvori angitte elueringsmidler inneholder benzamidin eller arginin i en konsentrasjon på minst 1 mM.
Oppfinnelsen angår enn videre en fremgangsmåte for rensing og separering av enkelt-kjedet tPA fra en blanding inneholdende enkeltkjedet tPA og dobbeltkjedet tPA, hvilken fremgangsmåte er kjennetegnet ved at den omfatter trinn for å bringe angitte blanding i nær kontakt med en kolonne som bærer en immobilisert Erythrina trypsin-inhibitor som et affinitetsmiddel for å absorbere angitte blanding av tPA på angitte kolonne og deretter selektivt eluere angitte enkelt-kjedet tPA som er blitt absorbert på kolonnen med et elueringsmiddel som har en pH varierende fra 4,5 til 6,0, hvori angitte elueringsmiddel inneholder benzamidin eller arginin i en konsentrasjon på minst 1 mM.
Foreliggende oppfinnelse er anvendbar uavhengig av type av celler for å fremstille tPA. Nærmere bestemt kan sc-tPA og/eller dc-tPA isoleres fra hvilke som helst av pattedyrceller slik som melanomaceller og humane, normale celler, eller fra celler med inkorporert humant tPA-gen ved genmanipulering. I tillegg gjør oppfinnelsen det mulig å
isolere og rense sc-tPA og dc-tPA fra et serumtilsatt medium såvel som fra et serumfritt medium, dvs. uavhengig av en bestanddel av dyrkningsmediet.
Ifølge et annet trekk ved oppfinnelsen kan den ovenfor angitte prosedyre for isolering og rensing mer effektivt utføres ved tilsetning av et amidinderivat eller et guanidin i
derivat slik som arginin og benzamidin, som et additiv til elueringsmidlet. Eksempelvis kan et elueringsmønster med tilstrekkelig skarpe aktivitetstopper for tPA alltid erholdes under forskjellige elueringsbetingelser som innbefatter variasjoner i kolonnestørrelse og lignende.
Foretrukne eksempler på en bærer for ETI-immobilisering ifølge oppfinnelsen innbefatter uløselig agarose, dextran, cellulose, polyacrylamid og polyethylenglycidyl-metacrylatpolymer. Foretrukne eksempler for metoder for ETI-immobilisering innbefatter konvensjonelt kjente metoder slik som en metode for binding av ETI til en bærer som er preaktivert med cyanogenbromid, en carbo-imido-koblingsmetode hvori en fri aminogruppe er bundet til en fri carboxyl-gruppe, og en glutaraldehyd-koblingsmetode hvori en aminogruppe er bundet til en bærer på forhånd omdannet til en aminoalkylform. Et annet eksempel på en immobilisert ETI-bærer er en som er perjodataktivert, hvori en aldehydgruppe dannet deri, reagerer med en aminogruppe i ETI ved en pH mellom 4 og 6, under dannelse av en Schiff-base, og som deretter reduseres med natriumborhydrid eller natriumcyanbor-hydrid. Et materiale for en bærer kan enn videre omdannes til et hydrazid-succinylderivat hvori en carboxylligand skal bindes til en aminogruppe gjennom EDC (l-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)-carbodiimid) eller ved diazonisering. Cellulose-fibre og partikler omdannes til hydrazidderivater og kan
anvendes i henhold til metoden ifølge Parikh et al.
(Methods in Enzymology, 3j4, 77-102, red.; W.B. Jakobi og Wilcheck, Academic Press, N.Y.). Polyacrylamidpartikler kan bindes direkte ved en glutar-adelhyd-koblingsmetode eller via diazonisering av et p-aminobenz-amidoethylderivat eller
et hydrazidderivat.
Elueringsmidler for anvendelse for eluering av tPA
i henhold til foreliggende oppfinnelse innbefatter syreløs-ninger med pH-verdier under 6, vannløselige saltløsninger og bufferløsninger.
Foretrukne eksempler på en slik syreløsning innbefatter den inneholdende minst én syre valgt fra gruppen av syrer omfattende typisk sitronsyre, oxalsyre, melkesyre, ravsyre, eddiksyre, fthalsyre, glutaminsyre, asparaginsyre, adipinsyre, fosforsyre og saltsyre.
Foretrukne eksempler på en vannløselig saltløsning innbefatter vandige løsninger inneholdende minst ett salt valgt fra gruppen bestående av salter omfattende typisk natriumklorid, kaliumklorid, lithiumklorid, ammoniumklorid, bariumklorid, calciumklorid, magnesiumklorid, natriumsulfat, ammoniumsulfat, kaliumnitrat, kaliumthiocyanat, natrium-thiocyanat, ammoniumthiocyanat.
Enn videre innbefatter foretrukne eksempler på en bufferløsning en natriumfosfatbuffer, en kaliumfosfatbuffer, en "Veronal-buffer, blandinger i en kombinasjon slik som natriumfosfat-fosforsyre, kaliumfosfat-fosforsyre, sitronsyre-natriumcitrat, ravsyre-borat, melkesyre-natriumlactat, eddiksyre-natriumacetat, oxalsyre-natriumoxalat, glycin-saltsyre og kaliumhydrogenfthalat-natriumhydroxyd.
Disse elueringsmidler kan ytterligere inneholde ett eller flere vannløselige, organiske løsningsmidler.
Foretrukne konsentrasjoner av et additiv bestående
av et amidinderivat eller et guanidinderivat for anvendelse ved eluering av tPA varierer fra 1 mM til en maksimal løse-lighet derav. Eksempelvis ved en pH mellom 4,5 og 6,0, idet en anvendbar konsentrasjon reduseres i proporsjon med at pH nærmer seg 4,5, mens en høyere konsentrasjon er nødvendig når pH nærmer seg 6,0.
En utførelsesform av oppfinnelsen omfatter å kjøre
en cellekultursupernatant inneholdende humant tPA gjennom en ETI-kolonne for å adsorbere tPA, uønskede proteiner fjernes
ved vaskning, sc-TPA gjenvinnes deretter fra kolonnen under
anvendelse av et elueringsmiddel med en pH varierende fra 4,5 til 6,0 med et additiv, hvoretter dc-tPA gjenvinnes ved å forandre pH på elueringsmidlet til under 4,5.
Det er kjent for fagmannen at et amidinderivat eller et guanidinderivat binder konkurrerende til et aktivt senter av en trypsin-lignende proteinase for å dissosiere et enzym-inhibitorkompleks. Imidlertid er det en fullstendig ny teknikk å anvende dette fenomen i et spesifikt middel slik som isolering av sc-tPA og dc-tPA under de mest egnede betingelser for isolering.
Hvis et utgangsmateriale som skal behandles ifølge oppfinnelsen eventuelt inneholder en liten mengde av uønskede substanser slik som trypsin-lignende enzymer etc., kan disse substanser adsorberes til eller desorberes fra ETI og virke som interfererende faktorer ved renseprosessen ifølge oppfinnelsen. Om nødvendig, anbefales følgelig en forbehand-ling for fjerning av disse uønskede substanser.
Denne fjerningsprosedyre utføres under anvendelse
av en immobilisert soyabønne trypsin-inhibitor (heretter angitt som STI), eller en annen Kunits-type-inhibitor som produseres i soyabønnefrø og har en lignende molekylvekt som ETI og en aminosyresekvens som er homolog med ETI til 80% eller mere.
STI er meget lik ETI i sin spesifisitet, men inhi-berer ikke tPA. En kombinert anvendelse av disse to inhibi-torer resulterer i en selektivitet som er sammenlignbar med den som oppnås under anvendelse av et immobilisert anti-humant tPA monoklonalt antistoff. Denne prosedyre omfatter å kjøre en cellekultursupernatant inneholdende humant tPA gjennom en immobilisert STI-kolonne for å binde og fjerne en del av en liten mengde av uønskede proteinaser innbefattet i kultursupernatanten, hvoretter et resulterende avløp kjøres gjennom en immobilisert ETI-kolonne for å binde tPA, ETI-kolonnen vaskes for å fjerne uønskede proteiner, hvoretter sluttelig sc-tPA og dc-tPA isoleres og renses separat ved forandring av pH-verdiene på eluatene.
Ifølge et viktig trekk ved oppfinnelsen er det til-veiebragt en metode som er anvendbar uavhengig av type av celler som inneholder tPA. Nærmere bestemt gjør oppfinnelsen det mulig å isolere og rense sc-tPA og/eller dc-tPA fra en hvilken som helst type av celler slik som melanomaceller, humane, normale celler og celler transformert med humant tPA-gen ved genmanipulering. I tillegg gjør oppfinnelsen det også mulig å isolere og rense sc-tPA og/eller dc-tPA
fra en serumtilsatt kultursupernatant såvel som fra en serum-fri kultursupernatant, dvs. uavhengig av en bestanddel av dyrkningsmediet.
Ifølge et annet glimrende trekk ved oppfinnelsen
er den tilveiebragte metode anvendbar ved et hvilket som helst ønsket trinn ved isolering og rensing av sc-tPA og/eller dc-tPA i forskjellige behandlinger av, eller pre-parative prosedyrer for tPA. Eksempelvis utføres isolering og rensing av ønsket sc-tPA og/eller dc-tPA ved dyrkning av celler som er i stand til å produsere tPA, hvoretter den resulterende blanding avledet fra dyrkningen, behandles med fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. En blanding avledet fra dyrkningen, betyr et urent ekstrakt av dyrkede celler, en cellefri dyrkningssupernatant eller et bearbeidet materiale av disse. Hvilke som helst av disse velges etter behov.
Andre viktige trekk ved oppfinnelsen fremgår fra
den etterfølgende beskrivelse av utførelsesformer for rensing av humant tPA.
Eksempel 1;
En kolonne som bærer et immobilisert affinitetsmiddel, ETI eller STI, for anvendelse i de etterfølgende eksempler, ble fremstilt på følgende måte.
I henhold til metoden ifølge Joubert et al. (Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 362, 531-538, 1981) ble frø av Erythrina latissima oppsamlet og preparert. Malte og av-fettede frø fikk stå over natten ved 10°C i en 0,5 M NaCl-løsning for ekstraksjon. Løsningen med frøene ble sentri-fugert for å oppsamle supernatant, og den beregnede substans ble oppsamlet fra supernatanten ved ammoniumsulfatutfelling. Det således fremstilte materiale ble underkastet kromatografi suksessivt på Sephadex<®> G-50 (Pharmacia Fine Chemicals), DEAE-cellulose (Phoenix Chemicals) og DEAE-Sepharose<®>
(Pharmacia fine Chemicals). Det resulterende, rensede preparat utviste et enkelt bånd med en tilsynelatende molekylvekt på 22.000 dalton når det ble underkastet elektro-forese i en 15% polyacrylamidgel inneholdende 0,1% natrium-dodecylsulfat (SDS).
26 mg av dette rensede preparat ble bundet til 5 ml bromcyanid-aktivert agarose (Sepharose<®>, Pharmacia Fine Chemicals), ble ekvilibrert med en fosfatbuffer, pH 7,4, inneholdende 0,4 M NaCl, 0,1% Triton<®> X-100 (Wako Jun-yaku Co., Japan) og 0,02% natriumazid som stabilisator, og ble sluttelig forpakket i en engangs plastsprøyte under dannelse av en 5 ml kolonne (heretter angitt som ETI-Sepharose<®->kolonne). 25 mg kromatografisk rent STI (fra Sigma Co.) ble bundet til 5 ml bromcyanid-aktivert agarose, ble ekvilibrert med en fosfatbuffer, pH 7,4, inneholdende 0,4 M NaCl og 0,1% Triton<®> X-100, og ble sluttelig pakket i en engangs plastsprøyte under dannelse av en 5 ml kolonne (heretter angitt som STI-Sepharose<®->kolonne). Eksempel 2; 2 1 av en kultursupernatant av humane melanomaceller (Bowes, ATCC CRL 1224 G361) inneholdende 10% varme-inaktivert (ved 56°C i 30 minutter) kalvefosterserum og 20 KIU (kalli-krein-inhibitoreriheter)/ml"Aprotiniri<1> ble stabilisert med 0,02% Tween<®> 80 (Wako Jun-yaku Co., Japan) og 0,4 M NaCl,
og ble underkastet STI-Sepharose<®->kolonnen.
Avløpet fra STI-kolonnen ble oppsamlet, og den plasminogen-avhengige fibrinolyttiske aktivitet ble målt.
Ca. 98% av aktiviteten tilført kolonnen, ble påvist. Av-løpet ble stabilisert med 1,0 M NaCl (sluttkonsentrasjon) og ble deretter underkastet en ETI-Sepharose<®->kolonne.
Avløpet fra ETI-kolonnen ble oppsamlet, og den
plasminogen-avhengige fibrinolyttiske aktivitet ble målt.
Ca. 10% av aktiviteten tilført kolonnen, ble påvist. Ved zymografi med et anti-humant tPA-antistoff etter SDS-polyacrylamidgelelektroforese utviste avløpet to fraksjoner med hensyn til plasminogenaktivator, en med en molekylvekt på 110.000 - 20.000 dalton, og den andre med en molekylvekt på 70.000 dalton. Etter å ha kjørt hele avløpet gjennom kolonnen, ble kolonnen vasket med 20 ganger kolonnevolumet av en væske inneholdende 1,0 M NaCl og 0,2% Tween<®> 80. Den gjenvundne væske hadde ca. 5% av den aktivitet som ble til-ført kolonnen, og utviste to plasminogenaktivatorfraksjoner ved zymografi, en med en molekylvekt på 110.000 - 20.000 dalton og den andre med en molekylvekt på 70.000 dalton.
Proteiner adsorbert på kolonnen, ble eluert under anvendelse av en lineær pH-gradient fra 5,5 til 3,0 under anvendelse av 0,2 M sitronsyrebuffere inneholdende 0,15 M NaCl.
Ved denne eluering ble to aktivitetstopper observert, en topp eluert ved pH mellom 5,2 og 4,5, og den andre ved pH mellom 4,5 og 3,7. Disse to fraksjoner utviste en felles molekylvekt på 70.000 dalton ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese. Aktiviteten av disse kombinerte fraksjoner var ca. 80-85% av aktiviteten tilført kolonnen.
Etter reduksjon med (3-mercaptoethanol ble disse to fraksjoner underkastet SDS-polyacrylamidgelelektroforese og deretter en sølvbeisingsanalyse. Det ble fastslått at fraksjonen eluert ved pH-området varierende fra 5,2 til 4,5, utviste et bånd med en molekylvekt på 70.000 dalton eller relativt langsommere vandrende bånd på gelen etter reduksjonen, mens fraksjonen eluert ved pH varierende fra 4,5 til 3,7, utviste et bånd med en molekylvekt på 30.000 til 40.000 dalton, men båndet med en molekylvekt på 70.000 dalton forsvant etter reduksjonen. Ut fra dette resultat ble det tPA som ble eluert med bufferen ved en pH mellom 5,2 og 4,5, identifisert som sc-tPA, og det tPA som ble eluert ved pH mellom 4,5 og 3,7, ble identifisert som dc-tPA.
Eksempel 3; 2 1 av en kultursupernatant av humane foster-forhudsceller ("Flow" 7000 (Flow Laboratories Inc., USA)) inneholdende 10% varmeinaktivert (ved 56°C i 30 minutter) kalvefosterserum og 20 KIU/ml "Aprotinin" ble stabilisert med 0,02% Tween<®> 80 og 0,4 M NaCl og ble underkastet en STI-Sepharose<®->kolonne på samme måte som beskrevet i eksempel 2.
Avløpet fra STI-kolonnen ble oppsamlet, og den plasminogen-avhengige fibrinolyttiske aktivitet ble målt. Ca. 98% av den aktivitet som ble tilført kolonnen, ble påvist. Avløpet ble stabilisert med 1,0 M NaCl (sluttkonsentrasjon) og ble deretter underkastet en ETI-Sepharose<®->kolonne.
Avløpet fra ETI-kolonnen ble oppsamlet, og den plasminogen-avhengige fibrinolyttiske aktivitet ble målt. Ca. 45% av aktiviteter- tilført kolonnen, ble påvist. Ved zymografi med et anti-iiumant tPA-antistoff etter SDS-polyacrylamidgelelektroforese utviste avløpet flere fraksjoner eller bånd for plasminogenaktivator, noen få bånd tilnærmet en molekylvekt på 100.000 dalton, flere bånd tilnærmet 50.000 til 70.000 dalton og ett bånd tilnærmet 35.000 dalton.
ETI-Sepharose<®->kolonnen ble vasket med 20 ganger kolonnevolumet av 0,1 M NH4HC03, pH 7,5, inneholdende 1,0 M NaCl og 0,2% Tween<®> 80. Den gjenvundne væske hadde ca. 5% av den aktivitet som ble tilført kolonnen og utviste samme zymografiske bånd som ovenfor beskrevet.
Eluering ble utført på samme måte som beskrevet i eksempel 2, med det unntak at buffere inneholdende 0,15 M NaCl og 0,1 M glycin, pH 4,5 og pH 3,5, ble anvendt.
Som et resultat ble et elueringsmønster likt det i eksempel 2, observert. Aktiviteten av de kombinerte fraksjoner var ca. 40-50% av aktiviteten tilført til kolonnen. 1-sse to fraksjoner utviste en felles molekylvekt på 70.000 dalton ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese. Etter reduksjon med |3-mercaptoethanol ble disse to fraksjoner underkastet SDS-polyacrylamidgelelektroforese og deretter sølvbeisingsanalyse. Det ble fastslått at fraksjonen eluert med pH 4,5 buffer, hadde en molekylvekt på 70.000 dalton og utviste ingen forandring i molekylvekt eller relativt langsommere vandrende bånd på gelen etter reduksjonen, mens fraksjonen eluert med pH 3,5 buffer, utviste et bånd for en molekylvekt på 30.000 til 40.000 dalton, men ikke noe bånd svarende til et bånd for en molekylvekt på 70.000 dalton etter reduksjonen. Ut fra dette resultat ble det tPA som ble eluert ved pH 4,5, identifisert som sc-tPA, og det tPA som ble eluert ved pH 3,5, ble identifisert som dc-tPA.
Eksempel 4:
2 1 av en kultursupernatant av muse-fribroblastceller transformert med humant tPA-gen (norsk patentsøknad nr. 864742) supplert med 2% varme-inaktivert (ved 56°C i 30 minutter) kalvefosterserum og 20 KIU/ml"Aprotinin", ble stabilisert med 0,02% Tween<®> 80 og 0,4 M NaCl og ble underkastet en STI-Sepharose<®->kolonne.
Avløpet fra STI-kolonnen ble oppsamlet, og den plasminogen-avhengige fibrinolyttiske aktivitet ble målt. Ca. 98% av aktiviteten tilført kolonnen, ble påvist. Av-løpet ble stabilisert med 1,0 M NaCl (sluttkonsentrasjon)
og ble deretter underkastet en ETI-Sepharose<®->kolonne.
Avløpet fra ETI-kolonnen ble oppsamlet, og den plasminogen-avhengige fibrinolyttiske aktivitet ble målt. Ca. 10% av aktiviteten tilført kolonnen, ble påvist. Ved zymografi med et anti-humant tPA-antistoff etter SDS-polyacrylamidgelelektroforese utviste avløpet to fraksjoner for plasminogenaktivator, en med en molekylvekt på 110.000 20.000 dalton, og den andre med en molekylvekt på 70.000 dalton. Etter at alt av avløpet var kjørt gjennom kolonnen, ble kolonnen vasket med 20 ganger kolonnevolumet av en væske inneholdende 2,0 M NaCl og 0,2% Tween<®> 80. Den gjenvundne væske hadde ca. 5% av den aktivitet som ble tilført kolonnen, og utviste to plasminogen-aktivatorfraksjoner ved zymografi, en med en molekylvekt på 110.000 - 20.000 dalton og den andre med en molekylvekt på 70.000 dalton.
Proteiner adsorbert på kolonnen, ble eluert med
0,2 M natriumfosfatløsninger inneholdende 0,15 M NaCl, pH 4,5
og pH 3,5. Elueringsmønsteret likt det i eksempel 2, ble erholdt. Aktiviteten av de resulterende kombinerte to fraksjoner var ca. 80% av aktiviteten tilført kolonnen. Disse to fraksjoner utviste en felles molekylvekt på 70.000 dalton ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese.
Etter reduksjon med |3-mercaptoethanol ble disse to fraksjoner underkastet SDS-polyacrylamidgelelektroforese og deretter sølvbeisingsanalyse. Det ble fastslått at eluatet med pH 4,5-løsning utviste et bånd med en molekylvekt på 70.000 dalton og således ingen forandring i molekylvekt eller relativt langsommere vandrende bånd på. gelen etter reduksjonen, mens eluatet med pH 3,5-løsning utviste et bånd med en molekylvekt på 30.000 til 40.000 dalton, men ikke noe bånd svarende til båndet med en molekylvekt på
70.000 dalton etter reduksjonen. Ut fra dette resultat ble det bekreftet at det tPA som ble eluert ved pH 4,5, er sc-tPA, og det tPA som ble eluert ved pH 3,5~, var dc-tPA.
Eksempel 5; 2 1 av en kultursupernatant av humane melanomaceller (Bowes, ÅTCC CRL 1224 G361) inneholdende 10% varme-inaktivert (ved 56°C i 30 minutter) kalvefosterserum og 20 KIU/ml"Aprotinin" ble stabilisert med 0,02% Tween<®> 80 og 1 M NaCl og ble underkastet en ETI-Sepharose<®->kolonne.
Avløpet fra kolonnen ble oppsamlet, og den plasminogen-avhengige fibrinolyttiske aktivitet ble målt. Ca. 10% av aktiviteten tilført kolonnen, ble påvist. Ved zymografi med et anti-humant tPA-antistoff etter SDS-polyacrylamidgel-elektrof orese utviste avløpet to fraksjoner for plasminogenaktivator, en med en molekylvekt på 110.000 - 20.000 dalton og den andre med en molekylvekt på 70.000 dalton.
Etter at alt av avløpet var kjørt gjennom kolonnen, ble kolonnen vasket med 20 ganger kolonnevolumet av en væske inneholdende 2 M NaCl. og 0,2% Tween<®> 80. Den gjenvundne væske hadde ca. 5% av den aktivitet som ble tilført kolonnen og utviste to plasminogenaktivatorfraksjoner ved zymografi, en med en molekylvekt på 110.000 - 20.000 dalton,
og den andre med en molekylvekt på 70.000 dalton.
Proteiner adsorbert på kolonnen, ble eluert ved anvendelse av en lineær pH-gradient fra 6,5 til 3,0 under anvendelse av 0,2 M "Veronal" buf fere inneholdende 0,2 M benzamidin og 0,15 M NaCl.
Ved denne eluering ble to aktivitetstopper observert, en topp eluert ved pH varierende fra 6,0 til 4,5 og den andre ved pH varierende fra 4,5 til 3,5. Disse to fraksjoner utviste en felles molekylvekt på 70.000 dalton ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese. Aktiviteten av disse kombinerte fraksjoner var ca. 80-85% av aktiviteten tilført kolonnen.
Etter reduksjon med p-mercaptoethanol ble disse to fraksjoner underkastet SDS-polyacrylamidgelelektroforese
og deretter en sølvbeisingsanalyse. Det ble fastslått at fraksjonen eluert ved pH varierende fra 6,0 til 4,5, utviste et bånd med en molekylvekt på 70.000 dalton og således ingen forandring i molekylvekt eller relativt langsommere vandrende bånd på gelen etter reduksjonen, mens fraksjonen eluert ved pH varierende fra 4,5 til 3,5, utviste et bånd med en molekylvekt tilnærmet 30.000 til 40.000 dalton, men båndet med en molekylvekt på 70.000 dalton forsvant etter reduksjonen. Ut fra dette resultat ble det tPA som ble eluert med bufferen ved en pH mellom 6,0 og 4,5, identifisert som sc-tPA, og det tPA som ble eluert ved pH mellom 4,5 og 3,5, ble identifisert som dc-t<p>A.
Eksempel 6; 2 1 av en kultursupernatant av humane foster-forhudsceller ("Flow" 7000) inneholdende 10% varme-inaktivert (ved 56°C i 30 minutter) kalvefosterserum og 20 KIU/ml "Aprotinin" ble stabilisert med 0,02% Tween<®> 80 og 1 M NaCl og ble underkastet en ETI-Sépharose<®->kolonne.
Avløpet fra ETI-kolonnen ble oppsamlet, og den plasminogen-avhengige fibrinolyttiske aktivitet ble målt. Ca. 45% av aktiviteten tilført kolonnen, ble påvist.
Ifølge zymografi med et anti-humant tPA-antistoff etter SDS-polyacrylamidgelelektroforese utviste avløpet fle re fraksjoner eller band for plasminogenaktivator, noen få bånd med molekylvekter tilnærmet lik 100.000 dalton, flere bånd med molekylvekter tilnærmet lik 50.000 til 70.000 dalton og ett bånd med en molekylvekt tilnærmet lik 35.000 dalton.
ETI-Sepharose<®->kolonnen ble deretter vasket med
20 ganger kolonnevolumet av 0,1 M dinatriumfosfat-natrium-hydroxydbuffer, pH 9,5, inneholdende 2,0 M NaCl. Den gjenvundne væske hadde ca. 5% av aktiviteten tilført kolonnen og utviste samme bånd som beskrevet ovenfor ved zymografi.
Eluering ble utført med 0,1 M natriumfosfat-forsyreløsning inneholdende 0,3 M arginin og 0,15 M NaCl (pH 5,5) og 0,2 M sitronsyrebuffer (pH 3,0) inneholdende 0,15 M NaCl.
Som et resultat av dette ble to fraksjoner erholdt fra eluatet med buffere med forskjellige pH-verdier. Aktiviteten av de kombinerte fraksjoner var ca. 40-50% av aktiviteten tilført kolonnen. Disse to fraksjoner utviste en felles molekylvekt på 70.000 dalton ved SDS-polyacrylamid-gelelektrof orese .
Etter reduksjon med (3-mercaptoethanol ble disse fraksjoner underkastet SDS-polyacrylamidgelelektroforese og deretter en sølvbeisingsanalyse. Det ble fastslått at eluatet med en pH 5,5 buffer utviste et bånd med en molekylvekt på 70.000 dalton og således ingen forandring i molekylvekt eller relativt langsommere vandrende.bånd på gelen etter reduksjonen, mens eluatet med pH 3,0 buffer utviste et bånd med en molekylvekt på 30.000 til 40.000 dalton, men båndet svarende til båndet med en molekylvekt på 70.000 dalton forsvant etter reduksjonen.
Ut fra dette resultat ble det tPA som ble eluert ved 5,5, identifisert som sc-tPA, og det tPA som ble eluert ved 3,0, ble identifisert som dc-tPA.
Eksempel 7:
2 1 av en kultursupernatant av muse-fibroblastceller transformert med humant tPA-gen (norsk patentsøknad nr.
864742) supplert med 2% varme-inaktivert (ved 56°C i 30 minutter) kalvefosterserum og 20 KIU/ml "Aprotinin" ble stabilisert med 1 M NaCl og underkastet en ETI-Sepharose<®->kolonne.
Avløpet fra ETI-kolonnen ble oppsamlet, og den plasminogen-avhengige fibrinolyttiske aktivitet ble målt.
Ca. 10% av aktiviteten tilført kolonnen, ble påvist. Ved zymografi med et anti-humant tPA-antistoff etter SDS-polyacrylamidgelelektroforese utviste avløpet to fraksjoner for plasminogenaktivator, en med en molekylvekt på 110.000 - 20.000 dalton og den andre med en molekylvekt på ca. 70.000 dalton. Etter at alt av avløpet var kjørt gjennom kolonnen, ble kolonnen vasket med 20 ganger kolonnevolumet av 2 M NaCl-løsning. Den gjenvundne væske hadde ca. 5% av aktiviteten tilført til kolonnen og utviste to bånd for plasminogenaktivator ved zymografi, et med en molekylvekt på 110.000 - 20.000 dalton og det andre med en molekylvekt på ca. 70.000 dalton.
Proteiner adsorbert på kolonnen ble deretter eluert med 0,1 M natriumfosfatbuffer (pH 6,0) inneholdende 0,5 M benzamidin og 0,15 M NaCl og 0,1 M sitronsyrebuffer (pH 3,0) inneholdende 0,15 M NaCl. To forskjellige fraksjoner ble erholdt i to forskjellige eluater. Aktiviteten av de kombinerte resulterende to fraksjoner var ca. 80% av aktiviteten tilført til kolonnen. Disse to fraksjoner utviste en felles molekylvekt på 70.000 dalton ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese.
Etter reduksjon med [3-mercaptoethanol ble disse to fraksjoner underkastet SDS-polyacrylamidgelelektroforese og deretter en sølvbeisingsanalyse. Det ble fastslått at eluatet med pH 6,0 buffer utviste et bånd med en molekylvekt på ca. 70.000 dalton og således ingen forandring i molekylvekt eller relativt langsommere vandrende bånd på gelen etter reduksjonen, mens eluatet med pH 3,0 buffer utviste et bånd med en molekylvekt på 30.000 til 40.000 dalton, men ikke noe bånd svarende til en molekylvekt på 70.000 dalton etter reduksjonen. Ut fra dette resultat ble det tPA som ble eluert ved pH 6,0, identifisert som sc-tPA og det tPA som ble eluert ved 3,0, ble identifisert som dc-tPA.
Eksempel 8; 2 1 av en kultursupernatant av kinesiske hamster-ovarieceller transformert med humant tPA-gen (CHO-celle C127I, ATCC CRL 1616) supplert med 10% varme-inaktivert (ved 56°C i 30 minutter) kalvefosterserum og 40 KIU/ml "Aprotinin" ble stabilisert med 1 M NaCl og underkastet en 5 ml ETI-Sepharose<®->kolonne som var blitt ekvilibrert med 0,05 M natriumfosfatbuffer (pH 7,5) inneholdende 1,0 M NaCl. Kolonnen ble deretter vasket med 0,05 M Na2HP04 (pH 9,5) inneholdende 2,0 M NaCl og 10 mM arginin.
Hele avløpet fra ETI-kolonnen hadde ca. 10% av den plasminogen-avhengige fibrinolyttiske aktivitet som ble til-ført kolonnen og utviste ved zymografi et bånd med en molekylvekt på 110.000 - 20.000 dalton og et bånd med en molekylvekt på ca. 70.000 dalton.
Proteiner adsorbert på kolonnen, ble først eluert med 0,05 M Na2HP04~NaOH buffer (pH 4,5) inneholdende 0,01 M arginin og 0,1 M NaCl. Den fibrinolyttiske aktivitet av eluatet var ca. 60% av aktiviteten tilført kolonnen. Proteiner gjenværende på kolonnen, ble eluert med 0,1 M sitronsyrebuffer (pH 3,0) inneholdende 0,1 M NaCl. Ca. 25% av aktiviteten tilført kolonnen, ble gjenvunnet. Disse to fraksjoner utviste en felles molekylvekt på 70.000 dalton ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese.
Etter reduksjon med 3-mercaptoethanol ble eluat-fraksjonene underkastet SDS-polyacrylamidgelelektroforese og deretter en sølvbeisingsanalyse. Det ble fastslått at eluatet med pH 4,5-bufferen utviste et bånd med en molekylvekt på ca. 70.000 dalton og således ingen forandring i molekylvekt eller relativt langsommere vandrende bånd på gelen etter reduksjon, mens eluatet med pH 3,0 buffer utviste et bånd med en molekylvekt på 30.000 til 40.000 dalton, men båndet med en molekylvekt på ca. 70.000 dalton forsvant etter reduksjonen. Ut fra dette resultat ble det bekreftet at det tPA som ble eluert ved pH 4,5, var sc-tPA, og det
tPA som ble eluert ved pH 3,0, var dc-t PA.
Ut fra forsøksresultatene ble en relasjon mellom pH og konsentrasjonen av arginin for eluering av sc-tPA fastslått som følger. Ved pH 4,5, 1 mM - 50 mM; ved pH 5,0, 0,03 M eller mer; ved pH 5,5, 0,10 M eller mer; og ved pH 6,0, 0,2 M eller mer.
Eksempel 9; 1 mol NaCl (sluttkonsentrasjon) ble tilsatt til 2 1 av en kultursupernatant av humane amniotiske fosterceller (FL, ATCC CCL-62) transformert med humant tPA-gen assosiert med humant cytomegalovirus (HCMV) som en promoter for human tPA-ekspresjon. Cellekultursupernatanten ble deretter underkastet rensing av enkeltkjedet tPA og dobbeltkjedet tPA under anvendelse av en ETI-kolonne på samme måte som beskrevet i eksempel 8.
Den fibrinolyttiske aktivitet av fraksjonene eluert ved 4,5 og 3,0, var ca. 70% og ca. 15% av den som ble til-ført kolonnen.
Eksempel 10;
Vertceller, Saccharomyces cerevisiae, transformert med humant tPA-gen, ble dyrket etter konvensjonell metode (Principles and Practice of Recombinant DNA Research with Yeast in the Molecular Biology of Yeast Saccharomyces: Metabolism and Gene Expression, s. 603-636, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982).
Cellene ble brutt opp med glassperler og fikk ned-senkes i 0,05 M natriumfosfatbuffer (pH 7,5) inneholdende 1 M NaCl og 0,02% Tween<®> 80 for ekstraksjon. Det filtrerte ekstrakt ble underkastet rensing av tPA på samme måte som beskrevet i eksempel 6.
Eluatet med pH 5,5 buffer hadde en molekylvekt på 70.000 dalton som ikke ble forandret ved reduksjon som utført i de ovenfor angitte eksempler 2 - 8, og utviste en aktivitet på 85% av den som ble tilført kolonnen. Eluatet med pH 3,0 buffer forandret sin molekylvekt (70.000 dalton) ved reduksjon, dvs. et bånd med en molekylvekt på 70.000 dalton forsvant, og et bånd med en molekylvekt på 30.000 til 40.000 dalton fremkom i stedet. Ca. 10% av aktiviteten tilført kolonnen, ble observert i dette eluat.

Claims (2)

1. Fremgangsmåte for separat rensing og separering av enkeltkjedet vevplasminogenaktivator (tPA) og dobbeltkjedet tPA fra en blanding inneholdende begge, karakterisert ved at den omfatter trinnene: (a) en blanding inneholdende enkeltkjedet tPA og dobbeltkjedet tPA bringes i nær kontakt med en kolonne som bærer en immobilisert Erythrina trypsin-inhibitor som et affinitetsmiddel for å absorbere angitte tPA på angitte kolonne; (b) kolonnen behandles med et elueringsmiddel som har en pH varierende fra 4,5 til 6,0 for selektivt å eluere enkeltkjedet tPA; og (c) kolonnen behandles med et elueringsmiddel som har en pH lavere enn 4,5, for selektivt å eluere dobbeltkjedet tPA; hvori angitte elueringsmidler inneholder benzamidin eller arginin i en konsentrasjon på minst 1 mM.
2. Fremgangsmåte for rensing og separering av enkelt-kjedet tPA fra en blanding inneholdende enkeltkjedet tPA og dobbeltkjedet tPA, karakterisert ved at den omfatter trinn for å bringe angitte blanding i nær kontakt med en kolonne som bærer en immobilisert Erythrina trypsin-inhibitor som et affinitetsmiddel for å absorbere angitte blanding av tPA på angitte kolonne og deretter selektivt eluere angitte enkelt-kjedet tPA som er blitt absorbert på kolonnen med et elueringsmiddel som har en pH varierende fra 4,5 til 6,0, hvori angitte elueringsmiddel inneholder benzamidin eller arginin i en konsentrasjon på minst 1 mM.
NO871883A 1986-05-07 1987-05-06 Fremgangsm}te for rensing av enkeltkjedet og dobbeltkjedet vevplasminogenaktivator NO173287C (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP10320086A JPH0779692B2 (ja) 1986-05-07 1986-05-07 一本鎖ｔ−ＰＡと二本鎖ｔ−ＰＡを分離する方法
JP18685086 1986-08-11

Publications (4)

Publication Number Publication Date
NO871883D0 NO871883D0 (no) 1987-05-06
NO871883L NO871883L (no) 1987-11-09
NO173287B true NO173287B (no) 1993-08-16
NO173287C NO173287C (no) 1993-11-24

Family

ID=26443851

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO871883A NO173287C (no) 1986-05-07 1987-05-06 Fremgangsm}te for rensing av enkeltkjedet og dobbeltkjedet vevplasminogenaktivator

Country Status (8)

Country Link
US (1) US4898825A (no)
EP (1) EP0245100B1 (no)
AU (1) AU590840B2 (no)
CA (1) CA1284961C (no)
DE (1) DE3780506T2 (no)
DK (1) DK173151B1 (no)
FI (1) FI96211C (no)
NO (1) NO173287C (no)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6001355A (en) * 1982-12-14 1999-12-14 Dowdle; Eugene Bernard Davey Pro-tPA for the treatment of thrombosis, embolism and related conditions
JP2507339B2 (ja) * 1986-08-11 1996-06-12 三井東圧化学株式会社 粗ｔＰＡの精製方法
US4898826A (en) * 1987-12-10 1990-02-06 Invitron Corporation Method to solubilize tissue plasminogen activator
DE3832898A1 (de) * 1988-09-28 1990-04-12 Boehringer Mannheim Gmbh Praeparat von in prokaryonten exprimiertem plasminogenaktivator
DE3903581A1 (de) * 1989-02-07 1990-08-16 Boehringer Mannheim Gmbh Gewebs-plasminogenaktivator-derivat
US5676947A (en) * 1989-02-07 1997-10-14 Boehringer Manneheim Gmbh Method for treating thromboembolic conditions using thrombolytically active proteins
US6326155B1 (en) 1995-03-20 2001-12-04 Dyax Corp. Engineering affinity ligands for macromolecules
US5612473A (en) * 1996-01-16 1997-03-18 Gull Laboratories Methods, kits and solutions for preparing sample material for nucleic acid amplification
US5731186A (en) * 1996-02-05 1998-03-24 Schering Aktiengesellschaft Method for the production of rDSPA α1
EP0904541B1 (en) * 1996-03-20 2004-10-06 Dyax Corp. PURIFICATION OF TISSUE PLASMINOGEN ACTIVATOR (tPA)
WO2016073668A1 (en) * 2014-11-06 2016-05-12 The Regents Of The University Of Colorado Identification of novel disease states using viscoelastic analysis in the presence of a thrombolytic agent
WO2016200765A1 (en) 2015-06-08 2016-12-15 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Time independent viscoelastic analysis parameter for prediction of patient outcome
WO2017205074A1 (en) 2016-05-11 2017-11-30 Chapman Michael P Viscoelastic analysis in patients with disease associated with the cardiovascular system

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4766075A (en) * 1982-07-14 1988-08-23 Genentech, Inc. Human tissue plasminogen activator
DE3382389D1 (de) * 1982-12-14 1991-10-02 South African Inventions Plasminogenaktivator.
PT79518B (pt) * 1983-11-21 1986-12-12 Ciba Geigy Ag 54). 5 ^ig do plasmídeo pBR 322 /PHO5 Bam Rsa 637 são digeridos com a endonuclease de restrição Xbal. Apos digestão completa o DNA ê extraído com fenol/clorofórmio e precipitado com etanol. 0 DNA ê redissolvido em Tris.HCl 50mM pH8,0 numa concentração de 50 p-g/nd. e ê digerido com 11 unidades de fosfatase alcalina do intestino de vitela (Boehringer), durante 1 hora a 379C. - 97 fORHjf y| A enzima ê inativada a 65 9C durante 1 hora. 0 DNA ê purificado por cromatografia de troca iõnica em DE 52 ( Whatman) e precipitação com etanol como descrito no Exemplo 9Aa. Dois oligodeoxinucleotídeos sintéticos com a formula 5’-CTAGAAGGGGTATCTTTGGATAAGA - 3' 3’- TTCCCCATAGAAACCTATTCTCTAG -5' são fosforilados individualmente nas suas extremidades 5' como descrito no Exemplo 9Ab. Os oligodeoxinacleotídeos fosforilados são misturados em quantidades equimolares . A mistura ê aquecida durante 10 min. a 759C, depois deixada arrefecer lentamente atê à temperatura ambiente e guardada a -209C. Este adaptador ê designado por adaptador C. 1 ^ig (120 pmoles) do adaptador C emparelhado e fosforilado e 5 pg (1,5 pmoles) de pBR322/ /PH05 Bam-Rsa 637 desfosforilado e cortado com Xba I são ligados em 40^1 de Tris.HCl 60mM pH 7,5, MgCl2 lOmM, DTT 5mM, ATP lmM, 1600 unidades da ligase de DNA do T4 a 159C durante 20 horas. A ligase de DNA ê inactivada durante 10 min. a 859C e o excesso de adaptadores ê removido por precipitação com isopropanol. 0 DNA ê redissolvido em H20 numa concentração de 0,25 mg/ml. Os múltiplos de adaptadores são removidos por digestão com a endonuclease de restrição BglII. 0 DNA ê precipitado com etanol, redissolvido e depois digerido com Bam HI. Os fragmentos de restrição são separados num gel de 0,6¾ de agarose de baixo ponto de fusão em Tris-borato-EDTA pH8,3. 0 fragmento Bam HI-BglII de 662 pb (derivado de fragmento Bam HI-Rsa I de 637 pb) ê localizado e removido do gel. c) Isolamento de um fragmento de vector contendo a sequência codificadora do TPA maduro ( fig. 23) 5 yig do plasmídeo p31R/SS-TPA /\ 2, são digeridos com as endonucleases de restrição Bam HI e BglII. Após digestão completo de DNA e precipitado com etanol e ressuspenso em Tris.HCl 50mM pH 8,0 numa concentração de 75 jxg /ml. Os fragmentos de DNA sao desforilados nas suas extremidades 5' por digestão com 1 unidade de fosfatase alcalina de intestino de vitela ( Boehringer) em 60 de Tris.HCl 50mM pH 8,0 durante 1 hora a 379 C. A fosfatase ê inactivada por incubação a 659C durante 1,5 horas. 0 DNA é purificado por cromatografia de troca iónica em DE-52 (Whatman) como descrito no Exemplo 9Aa. 0 DNA ê precipitado com etanol, redissolvido em Tris-HCl lOmM, pH8,0 e aplicada num gel de 0,6 °'o de agarose de ponto de fusão baixo. 0 fragmento maior Bam HI -BglII de 5,2 kb ê removido do gel. d) Ligação dos fragmentos de DNA isolados e transformação de E.coli HB 101 (cf. figs 23 e 24 ). Dois blocos de gel de agarose de ponto de fusão baixo contendo 0,1 pmoles do fragmento Bam HIBglII de 5,2 kb de p31R/SS-TPA/\ 2 e 0,2 pmoles do fragmen to BamHI -BglII de 662 pb de pBR322/PHO5 Bam-Rsa 637, respectivamente, são misturados, liquefeitos a 659C e diluídos para baixar a concentração de agarose para 0,3¾. A ligação ê feita em 150^1 de Tris.HCl 60mM, pH 7,5; MgCl^ lOmM, 99 jr £ DTT 5mM, ATP ImM e 800 unidades de ligase de DNA do T4 (Biolabs) a 159C durante 16 horas. Amostras de 10 ^il e 30 yjl são misturadas com 100 p.1 de células E.coliHB 101 competentes para a transformação como descrito no Exemplo 4a. - R 6 colonias transformadas amp são crescidas individualmente em meio LB contendo 100 ^g/ml de ampicilina. 0 DNA de plasmídeo ê analisado quanto ao tamanho e orientação da invenção por corte com a endonuclease de restrição Bam Hl. Um único clone com a orientação correcta da inserção é designado por p31/PHO5 637-TPA (cf. fig. 23). 0 plasmídeo pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 637 pode também ser substituído por pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 595, pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 811 e pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 1312 . Seguindo o processo descrito atras são isolados clones únicos com inserções do tamanho e orientação esperados e designados por p31/PHO5 595C-TPA, p51/PHO5 811C-TPA e p31/PHO5 1312 C-TPA. 0 adaptador C pode também ser substituído pelo adaptador B com a seguinte férmula 5' -CTAGATAAGAGATCTGC -3’ 3’ TATTCTCTAGACG -5' o qual codifica Lis -Arg na construção final (fig. 24). A fosforilação dos oligodeoxinucleotídeos sintéticos e emparelhamento são como descrito para o adaptador C. Para a adição do adaptador 5 de pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 637 cortado com Xba I são digeridos com 2 unidades de nuclease (Sigma) em 50 yjl de acetato de sédio 30mM pH 4,6, NaCI 200mM e ZnSO^ ImM durante 40 min. a 379C para criar extremidades cerses (ver fig.23). Apos extração com fenol clorofórmio o DNA ê precipitado com etanol e redissolvido em H^O numa concentração de 0,25 mg/ml. 0,4 ^g (120 pmoles) de adaptador A fosforilado e emparelhado e 5 ^ig (1,5 pmoles) de pBR 322/PHO5 Bam -Rsa 637 cortado com Xba I /S^ são ligados através das extremidades cerses como descrito para o adaptador C exceptuando a utilização de ATP 3,5 mM. As outras construções são como descrito atras. Os clones resultantes são identificado pela letra A e referidos como p31/PHO5 595A-TPA, p31/PHO5 637A-TPA, p31/PHO5 811A-TPA e p31/PHO5 1312 A-TPA. Exemplo 16: Subclonagem de construção genética no vector de levedura de elevado numero de copias pJDB2O7 e transformação de S. cerevisiae GRF18 As construções descritas nos Exemplos 13-19 contêm o promotor de PH05 com ou sem extensões para a região codificadora do gene de PH05 . A região codificadora do TPA com ou sem prepo-sequência e os sinais de terminação da transcrição de PH05 num arranjo tendem, tudo inserido num vector derivado do pBR 322. Os fragmentos Bam HI-HIND III contendo todo o arranjo são ligados ao fragmento Bam Hl -Hind III de 6,4 kb do pJDB 207 como descrito para uma reacção analoga no Exemplo 10. Células E.coli HB101 competentes são transformadas e vãrias colonias amp^ de cada experiência são crescidas individualmente em meio LB com 100 ^ig/ml de ampicilina. 0 DNA de plasmídio é analisado por corte com as endonucleases de restrição Hind III, Bam Hl e Pst I. Partindo dos plasmídeos p31/PHO5-TPA 18, ρ31 /PHO5-TPA 42, p31R/SS-TPA /\ 2, p31R/SS-TPA/\ 3, Ρ31/ΡΗΟ5 595C-TPA, p31/PHO5 637C-TPA,’ p31/PHO5 811C-TPA, P31/PHO5 1312C-TPA, p31/PHO5 595B-TPA, p31/PHO5 637-TPA, P31/PHO5 811 B-TPA, p31/PHO5 1312 B-TPA, p31/PHO5 595 A-TPA P31/PHO5 637-TPA, p31/PHO5 811-A-TPA e p31/PHO5 1312A-TPA obtem-se os clones que se seguem com as inserções correctas PJDB2O7/PHO5-TPA18 PJDB2O7/PHO5-TPA42 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA Λ 2 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA Λ 3 PJDB2O7/PHO5 595C-TPA PJDB2O7/PHO5 637C-TPA PJDB2O7/PHO5 811C-TPA PJDB2O7/PHO5 1312C-TPA PJDB2O7/PHO5 595B-TPA PJDB207/PH05 637B-TPA pJDB2O7/PHO5 811B-TPA PJDB2O7/PHO5 1312B-TPA pJDB2O7/PHO5 595A-TPA PJDB2O7/PHO5 637A-TPA PJDB2O7/PHO5 811A-TPA PJDB2O7/PHO5 1312A-TPA . Estes plasmídeos são introduzidos individualmente em Saccharomyces cerevisiae estirpe GRF 18 como descrito no Exemplo 11. Uma única colónia de levedura de cada uma das transformações de levedura ê picked. Os clones obtidos são designados por . Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2Ò7/PHO5-TPA18 Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5-TPA42 Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7R/PHO5-SS-TPA/\ 2 Sacchãtúiuycea cerevisíae GRFi8/pJD32O7R/?HO5~SS-TPA /\ 3 Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 595C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 637C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 811C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 1312C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 595B-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 637B-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 811B-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 1312B-TPA As células de levedura são crescidas colhidas e extraídas como descrito nos Exemplos 11 e 12. A actividade de TPA nos extractos celulares é testado como descrito no Exemplo 12. Os resultados estão apresen tados na tabela 3. Tabela 3: Actividade de TPA da estirpe de levedura Saccharomyces cerevisiae GRF18 transformada com diferentes plasmídeos e testada em condições de desrepressão (Pi baixo) : plasmídeo Actividade de TPA(unidades/l de cultura de células de levedura/ OD^qq) PJDB2O7/PHO5-TPA18 750 PJDB2O7/PHO5-TPA42 700 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA_A 2 600 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA 3 650 PJDB2O7/PHO5 595C-TPA 900 Exemplo 17: Substituição cromossómica do gene de PHO5 pelo gene do TPA (ver fig.25) A região codificadora da proteína TPA ê colocada no cromossoma II de levedura na posição da região codificadora da proteína PH05 . Experimentálmente isto ê con seguido por cotransformação. Saccharomyces cerevisiae estirpe GRF 18 ê cotransformada com 25 ^ig do plasmídeo p31/PHO5 -TPA 18, linearizado com BnmHI e Hind III, e 3 ^xg do plasmídeo de levedura Yepl3 (51). De 24 colónias Leu obtidas, uma ê Pho5 e ao mesmo tempo produz aproximadamente 35 unidades de TPA/1 de cultura de células de levedura /0D600. Por crescimento deste transformante num meio contendo leucina (YPD, 10g/l de Bacto Yeast Extract, 20g/l de Bacto Peptone, 20 g/l de glucose) durante 10 gerações, segregantes Leu~são obtidos com uma frequência de 10-20¾ os quais provavelmente perderam o plasmideo Yep31. Por análise ou Southern do DNA total de levedura isolado dos segregantes Leu (52) verifica-se que no nível de DNA que as sequências codificadoras da proteína TPA substituem as sequências codificadores da proteína PH05 deixando inal. teradas as sequências ladeantes do cromossoma II. Seleccionou-se uma estirpe que se designou por Saccharomyces cerevisiae GRF 18 (pho-5-ΤΡΑ)♦ Exemplo 18: Melhoramento de estirpe por mutação A estirpe Saccharomyces cerevisiae GRF18 /pJDB2O7/PHO5-TPA (IA) é ainda desenvolvida para produção de TPA por mutação e selecção de baixa actividade de fosfatase ácida. Saccharomyces cerevisiae H2 4 3/pJDB 20 7/ /PH05 -TPA (IA) um mutante termo-sensível de Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB2O7/PHO5 TPA (IA) ê obtido por irra_2 diação com UV (0,08 yiWcm , 15 segundos, 99,2¾ de morte). As colónias são crescidas em meio YPD osmc ticamente estabilizado contendo sorbitol 1,2M (10 g/l de Bacto Yeast Extract, 20 g/l de Bacto Peptone, 20g/l de glucose, 20 g/l de agar Bacto) e transferidas para meio YPD sem sorbitol. Saccharomyces cerevisiae H243 ê isolada como colónia de crescimento lento. Cerca de 10$ células de Saccharomyces cerevisiae H243/pJDB2O7/PHO5 -TPA (IA) são semeadas em agar YNB (6,8 1 de yeast Nitrogen Base sem aminoãcidos ; 20 g/1 de glucose, 20 g/1 de agar Bacto, suplementado com 20 mg/1 de histidina) e são irradiadas directamente com UV (0,08 -2 uWcm durante 12 segundos). A morte e de 98¾. As colonias obtidas a partir das células sobreviventes são transferidas para meio de Pi baixo e dois dias depois coradas para a actividade de fosfatase acida por um teste de sobrecamada de agar mole (48). Os mutantes negativos para a fosfatase _4 acida são obtidos com uma frequência de mutaçao de 3,2x10 . A estirpe com o título de TPA mais elevado é seleccionado e referido como Saccharomyces cerevisiae H423/pJDB2O7/PHO5-TPA (IA). As actividades de TPA de tres estirpes diferentes de levedura transformadas com pJDB2O7/PHO5-TPA (IA) estão apresentadas na Tabela 4. Tabela 4: Actividade de TPA de diferentes estirpes de Saccharomyces cerevisiae transformadas em condi ções de desrepressão (Pi baixo) Actividade de TPA (unidades/1 de cultura de células de levedura /OD^qq) GRF18/pJDB2O7/PHO5-TPA(lA) 625 H243/pJDB2O7/PHO5 -TPA(IA) 1560 H423/pJDB2O7/PHO5 -TPA(IA) 7200 • 1 Exemplo 19 : Produção de TPA por uma estirpe recombinante da levedura Saccharomyces cerevisiae numa escala de 30 1. Saccharomyces cerevisiae estirpe GRF 18/pJDB2O7/PHO5-TPA(lA) possui um plasmídeo que inclui uma marca para leucina permitindo manutenção selectiva do plasmídeo no organismo hospedeiro, um gene estrutural para o TPA humano e o promotor da fosfatase acida PH05 que permite a expressão do gene do TPA em meios com quantidades limitativas de fosfato inorgânico (condições de desrepressão). A estirpe ê mantida em culturas de agar inclinado preparadas com um meio definido sem o aminoãcido leucina para assegurar a retenção do plasmídeo. Agar recentemente inoculado e incubado durante 24 horas a 30?C. A cultura â superfície de um dos agares inclinados ê ressuspensa em 3ml de meio de pre-cultura o qual ê então transferido para o primeiro balão de pre-cultura com agitação. 0 balão de 500 ml tem uma unica saída e contem 100 ml de meio I de pre-cultura tendo o seguinte composição ( valoreq em g/1). L-asparagina, 2,0; L-histidina, 0,02 glucose, 10 ; Kt^PO^, 1,0 ; MgSO4· 7H2O, 0,5 ; NaCl 0,1 ; CaCl2~2H2O, 0,1 ; solução de vitaminas 5 jil/1 e solução de micronutriantes 5 ml/1. 0 meio e ajustado a pH7,2 usando NaOH antes da esterilização . A glucose, vitaminas e micronutrientes são esterilizados à parte e adicionados ao meio. As soluções &quot;stock” de vitaminas e micronutrientes têm as seguintes composições (em g/1): Vitaminas - biotina, 0,0002; D-pantotenato de cãlcio , 0,04 ; acido fõlico, 0,0002; acido micotínico, 0,04 ; acido p-aminobenzõico, 0,02 ; hidrocloreto de piridoxina, 0,04; riboflãvina, 0,02 ; hidrocloreto de tiamina, 0,04; e inositol 0,2 em 1 1 de agua desionizada ; micronutrientes - acido bórico 0,05 ; CuSO &quot;^H 0, 0,004 ; Kl, 0,01; FeCl^.óH^O, 0,02 ; MnSO^, 0,04 ; NaMoO^. 2^0, 0,02 e ZnSO^.71^0, 0,04 em 1 1 de agua desionizada. 0 meio ê preparado usando agua desionizada. A primeira pré-cultura é incubada durante 24 horas a 309C num agitador orbitol com 5cm de excentricidade a uma velocidade de 250 rev/min. Os balões com a primeira pré-cultura constituem o inoculo para os balões da segunda pré-cultura. Estes balões recebem um inoculo de 1¾ (v/v). Eles contem 100 ml de meio II de pré-cultura tendo a seguinte composição (mg/1): Extracto de levedura (Difco), 10,0 ; L-asparagina, 6,6; Κ^ΡΟ^ 1.0 ; MgSO^.7H2O, 1,0 ; L-histidina, 0,02 e D-glucose (mono-hidrato) , 33,0. 0 meio que ê preparado usando agua desionizada tem um pH de aproximadamente 6,0. A glucose é esterilizada separadamente. As condições de incubação são idênticas âs da primeira pré-cultura. 0 caldo de cultura de 3 balões ê combinado para dar um inoculo a 1¾ v/v para o fermentador principal de produção. 0 fermentador de produção tem um volume total de aproximadamente 45 1, contem 4 saliências e um agitador de turbina de disco de seis lâminas com um diâmetro de 115 mm. A velocidade de agitação é de 600 rev/min, a sobrepressão de 0,3 bar e uma velocidade de arejamento de 0,5 vol/vol/min. * ,· Η Ο fermentador contem 30 1 de um meio com as composições seguintes: (valores em g/1): L-asparagina, 2,0 ; L-histidina, 0,02 ; Kí^PO^, 0,03; MgSO^. 71^0, 0,5; NaCl, 0,1, CaCl2.2H2O, 0,1 ; KC1, ip ; D-glucose (mono -hidrato) , 20,0 ; solução de vitaminas 5 ml/1 e solução micronutrientes, 5ml/l. 0 meio ê ajustado pH 7,2 usando NaOH antes da esterilização. A glucose, vitaminas e micronutrientes são esterilizados separadamente e adicionados ao meio. As soluções &quot;stock&quot; de vitaminas e micronutrientes têm composição idêntica às descritas para o meio I de prê-cultura. A temperatura de fermentação ê de 309C. 0 pH desce para 5,0 onde ê controlado usando NaOH. Apos fermentação durante cerca de 20 horas atinge-se a produção máxima de TPA. A densidade óptica que atinge 2-3 unidades e a actividade de fosfatase ácida dão indicações uteis àcer ca do progresso da fermentação. 0 calor de fermentação ê arrefecido para 109C antes da colheita das células de levedura. Exemplo 20: Recuperação e purificação do TPA e pro-TPA por cromatografia com anticorpos monoclonais anti-TPA a) Preparação de extractos celulares 0 líquido de cultura (pH4) dos 30 1 de fermentação (cf.Exemplo 19) é arrefecido atê 109C e centrifugado usando uma centrífuga Alfa-Laval BRPX-207. As células separadas são ressuspensas em 21 de tampão de lise A ( NaH2P04 20mM, f^HPO^ 80mM, NaCl 150 mM, 0,01¾ de Tween, Benzamidina lOmM e EDTA lOmM). • 1 ί »» A solução é arrefecida atê 59C e passa da através de um moinho Dyno (tipo KDL-Pilot) com uma velocidade de alimentação de 101/h. 0 moinho estã equipado com 500 ml de pérolas de vidro de 0,5 -0,75 m de diâmetro e ê ligado a 3000 rev/min. Antes da adição das pérolas de vidro às células em suspensão aquelas são lavadas com 300 ml de tampão de lise A contendo 30 mg de BSA. A suspensão de células ê centrifugada ( rotor Sorvall 653, 40 min. 9000 rpm) e o sedimento rejeitado. b) Digestão do DNA^e fraccionamento com sulfato de amonio Adiciona-se 5 mg de DNAse a 2 1 da suspensão clarificada e a mistura ê agitada durante 30 min. a 49C. Subsequentemente a solução é levada a 35¾ de saturação com (NH^^SO^ (p/v) e ê agitada durante 1 hora a 49C. A solução ê centrifugada como descrito atrãs e o sedimento contendo toda a actividade de TPA ê ressuspensa em 1 1 de tampão H contendo 1¾ de Tween e 0,1¾ de SDS. A suspensão ê agitada durante pelo menos 1 hora a 49C. c) Cromatografia de imunoafinidade I) Purificação do anticorpo anti-TPA 5 ml de soro de coelho, anti -TPA (oferecido pelo Dr. E. Reich, Friedrich -Miescher-Institut Basel) são passados por uma coluna de sefarose com lisina para renovar o plasminogenio de soro. A coluna ê lavada com 1-2 volumes de PB5 pH 7,4 contendo NaCl 100 mM, KCI 2,7 mM, Na2HP04 8,lmM e KH2PO4 1,5 mM. $ rf* « « Ο líquido da coluna e de lavagens são juntos. 0 anti-soro sem plasminogênio é precipitado pela adição de (NH^)2SO^ sólido para uma concentração final de 50¾ (p/v). A solução ê mantida durante a noite a 4?C e em seguida centrifugada ( rotor Sorvall GSA,1200 rpm, 20 min.) . 0 precipitado e dissolvido num peque no volume de PB5 e dializado contra PBS contendo 0,1 ¾ de NaNj. A IgG desta solução dializada e purificada numa coluna de proteína A -sefarose (55). II) Preparação de uma coluna com anticorpo anti-TPA 13 mg de anticorpo anti-TPA purificado são dializados contra MOPS 0,1 M pH7,0. 0 anticorpo e ligado a 5 ml de Affigel 10 activado ( Biorad ) segundo as instruções do fabricante. A matrix do gel ó equilibrada com PBS contendo 1¾ de Tween 80, 0,1¾ de SDS, NaCl 0,2M, Benzamidin lOmM e 0,1¾ de NaN^. A matrix e aplicada numa coluna de 5 ml. III) Purificação de TPA por cromatografia de imunoafinidade. 0 sedimento redissolvido do fraccionamento com sulfato de amónio ê centrifugado para remover o material insolúvel ( rotor Sorvall GSA, 30 min. 12000rpm) e subsequentemente aplicado â coluna de afinidade a uma ve locidade de fluxo de cerca de lOml/hr a 49C. Depois de todo o volume ter passado através da coluna esta ê lavada com 10 volumes da coluna de PBS contendo 0,05¾. de Tween 80. A coluna ê eluída usando glicina-ΗΟΙΟ,ΙΜ pH2,5 contendo 0,1 ¾ de Tween. São colhidas fracções de 2 ml e testados para a actividade de TPA segundo o método de Rânby (49). Como substracto usa-se D-Val-Leu-Lis -pNA (Kabi -S-2251). As fracções com actividades mais elevadas são reunidas, neutralizadas usando Tris IM e concentradas por ultrafiltração usando uma membrana Amicon YM10. 0 TPA assim obtido apresenta cerca de 90¾ de pureza e estã predominantemente em forma de cadeia unica ( pro-TPA) como evidenciado por SDS-PAGE em condições de redução. 0 peso molecular aparente em condições não redutoras ê de cerca de 60 000 por SDS -PAGE (ver figura A). Figuras A e B : electroforese em gel de poliacrilamida-SDS do produto do gene TPA em levedura (Figura A) e a sua actividade enzimãtica num gel de actividade (placas com caseína) ( figura B). B:gel de actividade A:gel com SDS ad figura A (SDS-PAGE): Faixas 1 e 4 : proteínas padrão (marcadores de peso molecular) Faixas 2 e 5 : TPA de melanoma Faixas 3 e 6 : TPA de levedura Faixas 1 - 3 : em condições de redução Faixas 4 - 6 : em condições de não-redução As amostras correram num gel de 12,5¾ que se corou para proteínas usando azul Coomassie brilhante. ad. figura B (gel de actividade, cf. Exemplo 23): Faixa 1 : TPA de melanoma Faixa 2 : TPA de levedura Sobre-camada para plasminogénio de agar com caseira (referência 56) . Exemplo 21: Recuperação e purificação de TPA e pro-TPA por cromatografia de afinidade com DE-3 a. Preparação de uma coluna de DE-3 Sepharosé 26 mg do inibidor DE-3 purificado a partir de Erythrina latíssima (16) são acoplados a 5 ml de Sepharose 4b ® activada com brometo de cianogênio (Pharmacia) segundo as instruções do fabricante. A matrix ê equilibrada com tampão fosfato salino (&quot;PBS&quot;) pH 7,4 contendo NaCl 0,4M, 0,1¾ de Triton X-100R e 0,02¾ de azida de sódio. A matrix ê então acamada numa coluna de 5 ml. b. Purificação de TPA e pro-TPA por cromatografia em DE-3 R Sepharose 4b Os extractos celulares (cf. Exemplo 20a) são tornados 0,4 M relativamente a NaCl e 0,1¾ para Triton X-lOCr^ e filtrados através de uma membrana de 0,45 ^im (Millipore). A solução ê então aplicada à coluna de DE-3 Sepharose (ver atras) a uma velocidade de fluxo de 45ml/hr â temperatura ambiente e o efluente ê rejeitado. Depois do volume total do extracto ter passado através da coluna esta ê lavada com cerca de 50 ml de PB5 contendo NaCl 0,4 M e 0,1 ¾ de Triton X-lOO*' sendo colhidos fracções de 2 ml a 49C. 0 conteúdo protêico de cada fracção ê determinado por medição da absorvância de UV a 280nm. A proteína adsorvida verificou-se ser eluída como um pico bem definido. As fracções contendo os valores mais elevados de absorvância de UV e de activida125 de fibrinolítica determinada pelo teste da I fibrina (47) são reunidas dando 8 ml de solução que se guardou a -209 C. Isto representa aproximadamente 70-80¾ da actividade total aplicada à coluna. As fracções com as actividades »· mais baixas são reunidas separadamente. A recuperação total de actividade em ambos os conjuntos de fracções monta os 90-100¾. c). Purificação de pro-TPA por cromatografia em DE-3 Sepharose 4b® na presença de um inibidor de proteíases. A cromatografia dos extractos de células de levedura ê feita de modo semelhante ao descrito no Exemplo 21b exceptuando a inclusão neste caso do inibidor de tripsina pancreãtica bãsica (BPTI) a 0,1 KlU/ml usando o teste fluorimétrico como Cbz-Gly-Gly-Arg-AMC como substracto (37) determinou-se o conteúdo em TPA e pro-TPA da solução purificada. 90¾ do TPA estã na forma de pro-enzima e 10¾ na forma activa. Assim, a conversão de pro-TPA em TPA durante o processo de purificação é inibido pelo BPTI. Exemplo 22: Separação de pro-TPA do TPA A solução de TPA e pro-TPA obtida como descrito no Exemplo 21c e ajustada a pH8,0 com Tris.HCl O,1M contendo 0,1¾ de Triton X-lOcP e tornado lmM relativamente ao diisopropilfluorofosfato. Apos incubação a 37?C durante 4 horas, a mistura ê passada através de uma coluna de 5 ml de DE-3 Sepharose® (cf. Exemplo 21a). 0 efluente contendo o TPA irreversivelmente inibido é rejeitado. A coluna e lavada com 6 volumes de coluna de PBS contendo NaCl 0,4 M e 0,1¾ de Triton X-IOC^ e subsequentemente eluída com PB5 contendo K SCN 1,6M, NaCl 0,4M e 0,1¾ de Triton X-10C^ como descrito no Exemplo 21b . As fracções apresentando as absorvân. 1 s· P0RWI « ? » ... Ή , - - - , __. «τ'. cias de UV mais elevadas são reunidas. 0 conjunto de fracções contem pro-TPA numa forma substancialmente pura uma vez que não se detecta actividade amidolítica no teste fluorimêtrico usando Cbz-Gli-Gli-Arg-AMC (37) como substrato. A actividade amidolítica assim como a fibrinolítica pode ser restabelecida por tratamento com plasmina a qual converte pro-TPA em enzima activa. Exemplo 23: Propriedades do produto do gene TPA em levedura a. Propriedades enzimãticas 0 produto do gene TPA em levedura obtido segundo o Exemplo 19 e purificado por eromatografia de afinidade em DE-3 (cf. Exemplo 21b) ê enzimãticamente activo como se mostra por clivagem de plasminogênio zimogênio em plasmina na ausência e na presença de fibrina. A actividade enzimãtica pode ser verificada pelos testes colorimêtricos descritos por Ranby (49) (cf. Exemplo 12) e por Verheijen et al. (60) , em placas de caseína e de fibrina (56) e num teste de fase solida com 12 9 I - fibrinogenio ( 47). A actividade enzimãtica em placas de caseína ê mostrada na figura B ( cf. Exemplo 20 c III). A actividade enzimãtica do TPA obtido ê grandemente estimulada pela fibrina. 0 TPA parcialmente purificado por eromatografia de afinidade em DE-3 ê testado num teste de velocidade parabólica (cf. Ranby (49)). Tomando a velocidade reacção Δ E versus Δ t^ entre e 5 minutos como uma medida da actividade enzimãtica a estimulação por concentração óptimas de fibrina ê de 10-20 vezes ( ca. 100 yig /ml) . 0 efeito pode ser observado com fragmentos de fibrina obtidos por digestão com CnBr
AU606582B2 (en) * 1985-09-06 1991-02-14 Codon Methods for the recovery of tissue plasminogen activator

Also Published As

Publication number Publication date
FI871948A (fi) 1987-11-08
DK173151B1 (da) 2000-02-14
EP0245100A2 (en) 1987-11-11
CA1284961C (en) 1991-06-18
DE3780506T2 (de) 1993-01-07
FI96211C (fi) 1996-05-27
AU590840B2 (en) 1989-11-16
EP0245100B1 (en) 1992-07-22
FI96211B (fi) 1996-02-15
FI871948A0 (fi) 1987-05-04
US4898825A (en) 1990-02-06
EP0245100A3 (en) 1988-01-07
DE3780506D1 (de) 1992-08-27
DK233787D0 (da) 1987-05-07
NO871883L (no) 1987-11-09
DK233787A (da) 1987-11-08
NO173287C (no) 1993-11-24
AU7241887A (en) 1987-11-12
NO871883D0 (no) 1987-05-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4752603A (en) Plasminogen activator and pharmaceutical composition having thrombolytic activity
Chibber et al. [48] Plasminogen
NO173287B (no) Fremgangsmaate for rensing av enkeltkjedet og dobbeltkjedet vevplasminogenaktivator
US5141863A (en) Purification procedure of TPA from crude preparations
EP0238551A1 (en) Methods for the recovery of tissue plasminogen activator
EP0210870B1 (en) Method of purifying crude tissue plasminogen activator
CA1258242A (en) Urokinase zymogen and composition containing the same
EP0276328B1 (en) Process for separating single-strand human tpa and double-strand human tpa from each other
JPH0694480B2 (ja) 試薬および方法
JPH0223158B2 (no)
Kula et al. Consecutive use of ω-aminoalkylagaroses. Resolution and purification of clostripain and collagenase from Clostridium histolyticum
NO166314B (no) Fremgangsmaate for fremstilling av en plasminogenaktivatoravledet fra human nyre.
EP0275282A1 (en) Process for purifying a plasminogen activator
CA1333163C (en) Methods for the recovery of tissue plasminogen activator
US5158882A (en) Method for purifying a crude tissue plasminogen activator preparation
US5139939A (en) Process for the production of human tissue plasminogen activator and cell strain useful therefor
JPS63317082A (ja) ｔＰＡの精製
JP2714817B2 (ja) ウロキナーゼ前駆体の製造方法
JPH0779692B2 (ja) 一本鎖ｔ−ＰＡと二本鎖ｔ−ＰＡを分離する方法
JPS6379593A (ja) ｔＰＡを精製する方法
JPH0377900A (ja) 血漿因子、その精製方法およびそれを有効成分として含有する血栓溶解剤