NO173279B - Fremgangsmaate for fremstilling av et stabilt zink-protamin-alfa-interferonkompleks - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av et løselig zink-protamin-a-interferonkompleks som er anvendbart som en initierbar doseringsform med langvarig frigivelse for administrering av a-interferon.

Initierbare farmasøytiske formuleringer er velkjent innen faget. Se Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA, 16. utgave, 1980. Vanligvis

er slike formuleringer i form av dispersjoner slik som kol-loider, emulsjoner og suspensjoner. Mer nylig har initier-

bare formuleringer med langvarig frigivelse omfattende poly-merer blitt anvendt.

Typiske initierbare formuleringer med langvarig frigivelse innbefatter vandige eller vann-blandbare suspensjoner, men slike suspensjoner utviser ofte stabilitetsproblemer og kan ikke tilveiebringe tilstrekkelig lang retensjonstid av den aktive bestanddel i formuleringen, enten fordi dispersjonen brytes ned eller fordi dispersjonen er for løselig i de omgivende kroppsvæsker (eksempelvis blod og lymfesyste-mene ) .

Et eksempel på en vellykket vandig basert suspensjon

med langvarig frigivelse er protamin-zink-insulinsuspensjon. United States Pharmacopeia (USP) inntredelsesangivelsene for suspensjon indikerer en standardformulering inneholdende 40-100 USP Insulin-enheter/ml av en vandig løsning av zink (0,15

til 0,25 mg zink/100 USP Insulin-enheter) og protamin (1 til 1,5 mg protamin/100 USP Insulin-enheter) ved pH 7,1 til 7,4. Typisk er pH opprettholdt med 0,15 til 0,25% (w/v) dibasisk natriumfosfat, og formuleringen inneholder også 1,4 til 1,8%

(w/v) glycerol og 0,18 til 0,22% (w/v) cresol eller 0,22 til 0,28% (w/v) fenol. Avhengig av insulinkonsentrasjonen og pa-sientens respons kan en injeksjon frigi insulin i opptil 3 dager.

Interferonet er en familie av proteiner som .utviser antiviral aktivitet overfor visse vira og anticanceraktivitet overfor visse cancere. Interferoner innbefatter naturlig eller rekombinant a-(leukocytt) , (3-( f ibroblast) og gamma-( immun )-interferon, men a-interferoner foretrekkes for anvendelse i komplekset fremstilt ifølge oppfinnelsen. Humant a-interferon er en naturlig forekommende blanding av minst elleve komponenter, innbefattende de som er betegnet som ax- og a2-interferon, hvor den sistnevnte er mer foretrukket.

Humant a-interferon som utviser biologiske egenskaper lik

det naturlig forekommende oc-interferon kan fremstilles ved rekombinante metoder. Rubenstein, Biochem. Biophys. Acta., 695, 5-16 (1982); Nagata et al.. Nature, 284, 316-320 (1980); EP 32,134 og US patentskrift nr. 4 289 690 beskriver metoder for fremstilling av -interferon. Også innbefattet innen oppfinnelsens ramme er de såkalte cx-hybridinterferoner hvori fragmenter av to eller flere naturlige a-interferonarter er forbundet (se f.eks. EP 51,873). Parenteral administrering av o<2-interferon er blitt rapportert å være effektiv ved behand-ling av Kaposis sarcoma, basal cellecarcinoma, multippel mye-loma og virusvorter. Den effektive dose av a-interferon kan lett bestemmes av fagmannen.

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av et stabilt zink-protamin-a-interferonkompleks. Selv om det kjente zink-protamin-insulinkompleks er avhengig av disse tre komponenter for uløseliggjørelse, omfatter zink-protamin-a-interferonkomplekset fremstilt ifølge oppfinnelsen også et andre protein, HSA, for å oppnå maksimal dannelse av uløselig kompleks, og kan overraskende inneholde opptil et molart overskudd av glycin, en zinkchelator.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er kjennetegnet ved at den omfatter følgende trinn: a) justering av en løsning av 2«IO<6> - 200«IO<6> internasjonale enheter av oppløst lyofilisert a-interferon til en pH på 7,5 til 8,5, i en buffer inneholdende 0 til 50 mg glycin/ml og 0 til 10 mg humant serumalbumin/ml; b) omsetning av den angitte bufrede løsning av a-interferon med 0,25 til 5 mg protaminfri base eller et farma-søytisk akseptabelt salt derav med omrøring og tilsetning av 1 til 20 mg av et zinksalt med omrøring, idet det angitte zinksalt tilsettes samtidig med eller etter tilsetningen av den angitte protaminfrie base eller det farmasøytisk akseptable salt derav.

Tabell 1 i det følgende viser resultatene av å utelate forskjellige komponenter, og effekten av tilsetningsrekkeføl-gen av zink og protamin for et preparat omfattende 1 mg HSA/ml, 0,1 mg a-interferon (IFN)/ml og 20 mg glycin (G)/ml i 0,02

M fosfatbuffer(p). Spalte 1 viser effekten av tilsetnings-rekkefølgen, idet tilsetning av zink først resulterer i 5% løselig protein, mens tilsetning av protamin først resulterer i mindre enn 1% løselig protein. Spalte 3, 4 og 5 viser at i fravær av buffer, fravær av buffer og glycin og fravær av HSA dannes ikke en maksimal mengde av kompleks, da minst 5% løselig protein foreligger i hver av disse kombinasjoner.

Selv om spalte 2 viser at nærvær av glycin ikke er nødvendig for å danne et kompleks med maksimal uløselighet, viser spalte 1 at glycin ikke er skadelig for komplekset til tross for dets zinkchelaterende egenskaper, så lenge protamin tilsettes før zink.

Glycin er tilstede i 0 til 50 mg/ml som et resultat av dets nærvær av lyofilisert interferon som anvendes for å fremstille kompleksene. Se US patentskrift 4 496 537, hvori en buffer, glycin og HSA tilsettes til interferonløsningen før lyofilisering for å sikre biologisk stabilitet.

En uløselig kompleksdannelse er et likevektsfenomen,

og som det fremgår i tabell 1 kan praktisk talt fullstendig uopp-løseliggjørelse (dvs. 99%) oppnåes for å maksimere en langvarig frigivelse. Hvis imidlertid en viss løselig fraksjon ønskes for øyeblikkelig frigivelse, kan forholdet mellom - komponentene forandres, eller fortrinnsvis pH-justeres. Maksimal dannelse av uløselig kompleks oppnåes når interferon-løsningen justeres til pH 8,0 til 8,4, fortrinnsvis pH 8,2,

men justering av pH til mellom pH 7,5 og 8,5 vil muliggjøre dannelse av løselige deler for umiddelbar frigivelse av a-in-terf eron. Den følgende tabell 2 viser variasjonen i kompleksdannelse på grunn av forandringer i pH.

Frigivelse av a-interferon fra komplekset er ikke mål-bart in vitro da det ikke oppløseliggjøres ved fortynning, men snarere ved fortrengning ved fysiologiske chelatorer såvel som serumalbumin. In vivo frigivelsesgraden kan måles ved anvendelse av radioiodert a-interferon og overvåkning av forsvinningen av radioaktivitet ved injeksjonsstedet og nærvær av radioaktivitet i serum og urin. Slike tester utført i rot-ter viste langvarig frigivelse i mer enn 2 uker.

Mengden av a-interferon i kompleksene er 2x10^ til 200x10^ internasjonale enheter (I.U.) pr. ml kompleks, fortrinnsvis 2x10^ I.U./ml.

Zink kan tilveiebringes med fra 1 til 20 mg av et zinksalt/ml, hvori zinksaltet kan være valgt fra zinkacetat, zink-klorid eller zinksulfat, hvor zinkacetat er foretrukket.

Protamin kan tilveiebringes av 0,25 til 5 mg, fortrinnsvis 2,5 mg protamin/ml, hvori protaminet er valgt fra protaminfri base, protaminklorid, protaminfosfat eller protaminsulfat, hvor sulfatet er foretrukket.

HSA er tilstede i et konsentrasjonsområde på fra 0 til 10 mg/ml, fortrinnsvis 0,5 til 1 mg/ml.

Enhver kjemisk og farmasøytisk forenelig buffer kan anvendes for å fremstille interferonløsningen, hvor fosfatbuffer er foretrukket. Interferonløsninger utviser maksimal stabilitet ved pH 6,5 til 8,0, fortrinnsvis 7,0 til 7,4 (se US patentskrift nr. 4 496 537). Natriumhydroxyd er foretrukket for justering av pH på interferonløsningen til pH 7,5 til 8,5 før dannelse av komplekset. Buffermidlet må ikke ha en sterk affinitet for zink, da det^e vil være tilbøyelig til å fjerne zink fra komplekset. Denne mangel på affinitet for zink er spesielt viktig når glycin er tilstede, da glycin er en zinkchelator, men i fravær av glycin kan en viss affinitet for zink av bufferen tolereres. En buffer med en viss affinitet for zink (eksempelvis citrat eller acetat) kan anvendes for å øke den løselige fraksjon for umiddelbar frigivelse av interferon.

En foretrukken metode for fremstilling av et uløselig kompleks er å rekonstituere en lyofilisert a-interferonprøve fremstilt som beskrevet i US patentskrift 4 496 537 med en løsning omfattende zinkacetat og protaminsulfat ved den ønskede pH. I det etterfølgende angis eksempler på fremstilling av lyofilisert a-interferon og rekonstituerte komplekser.

EKSEMPEL 1

LYOFILISERT a- INTERFERON

Tilsett en porsjon av vann for injeksjon, USP til et egnet kar ustyrt med en rører. Tilsett fortløpende og oppløs under omrøring natriumfosfat, dibasisk, vannfri reagens; monobasisk natriumfosfat, USP; albumin, human, USP; og a-2-interferon. Bring satsen til sluttvolum med vann for injeksjon, USP.

Filtrer aseptisk i et sterilt område løsningen i et sterilisert kar gjennom et sterilisert 0,2 mikrometers filter som er biitt vasket og testet for integritet. Test integrite-ten av filteret etter filtrering.

Fyll aseptisk løsning inn i steriliserte ampuller, anbring de fylte ampuller i en sterilisert lyofilisator og lyofiliser løsningen. Kork, forsegl og krymp ampullene aseptisk.

EKSEMPEL 2

g- INTERFERONKOMPLEKS

Oppløs det lyofiliserte -interferon i en del vann for injeksjon. Juster til pH 8,2 med natriumhydroxyd. Tilsett protaminsulfat og omrør, tilsett zinkacetat og omrør. Bring den totale blanding til sluttvolum med det gjenværende vann for injeksjon. Fortrinnsvis tilsettes natriumhydroxyd, protaminsulfat og zinkacetat som konsentrerte vandige løsninger (eksempelvis for protamin, 100 mikroliter av en 25 mg/ml vandig løsning).

a-interferon bulkløsninger (dvs. ulyofiliserte) eller andre egnede a-interferonprøver kan anvendes for å danne komplekset, fortrinnsvis under anvendelse av samme tilset-ningsrekkefølge som for komponentene som ovenfor beskrevet, dvs. fosfatbuffer, HSA og glycin tilsettes til vandig a-interferon, pH justeres, protamin tilsettes, zink tilsettes og løsningen justeres til sluttvolumet.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et stabilt zink-protamin-a-interferonkompleks, karakterisert ved at den omfatter følgende trinn:

   a) justering av en løsning av 2•IO<6> - 200«IO<6> internasjonale enheter av oppløst lyofilisert a-interferon til en pH på 7,5 til 8,5, i en buffer inneholdende 0 til 50 mg glycin/ml og 0 til 10 mg humant serumalbumin/ml; b) omsetning av den angitte bufrede løsning av a-interferon med 0,25 til 5 mg protaminfri base eller et farma-søytisk akseptabelt salt derav med omrøring og tilsetning av 1 til 20 mg av et zinksalt med omrøring, idet det angitte zinksalt tilsettes samtidig med eller etter tilsetningen av den angitte protaminfrie base eller det farmasøytisk akseptable salt derav.