NO173099B - Reseptor fra den lille rhinovirus reseptorgruppen, fremgangsmaate ved fremstilling og in vitro anvendelse av denne reseptor - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en reseptor med bindingsaktivitet for den minste gruppen av rhinovirus for anvendelse in vitro, en fremgangsmåte ved fremstilling av denne, samt anvendelse derav.

Humant rhinovirus representerer en stor slekt innenfor familien Picorna-virus, og omfatter over 90 forskjellige serotyper (6,11). Disse RNA-virus angriper respirasjonskanalen hos mennesker og forårsaker akutte infeksjoner, som fører til snue, hoste, heshet etc, og vanligvis betegnes som forkjølelse (15). Infeksjoner med rhinovirus hører til de

hyppigste sykdommer hos mennesket. Skjønt sykdomsforløpet som regel er av harmløs natur, fører forkjølelsen allikevel til en alminnelig svekkelse av organismen. Derved kan den føre til sekundærinfeksjoner ved andre patogener.

Den store gruppen av humant rhinovirus kan inndeles i to undergrupper, når man benytter konkurransen om bindingsseter på celleoverflaten av humane celler i cellekulturer (som regel HeLa-celler) som kriterium for tilordningen. Denne opprinnelige tilordningen av noen få representanter for rhinovirus (10) kunne utvides ved bredt anlagte eksperimenter på 88 representanter (4, 1). Resultatet av disse eksperimentene gjør det nærliggende å slutte at til tross for det store antallet, finnes det overraskende nok bare to fra hverandre forskjellige reseptorer på celleoverflaten, til hvilke representanter for den ene eller den andre rhinovirusgruppen kan binde seg. Inntil nå kunne 78 serotyper fra den store "rhinovirus reseptorgruppen" tilordnes 8 fra den lille "rhinovirus reseptorgruppen" (RVRG). 2 ytterligere representanter forholdt seg ikke entydig, slik at ingen endelig inndeling var mulig (1).

I de siste årene er det blitt fastslått en betydelig økning i rhinovirusinfeksjoner i tettbebodde områder. Mens det ved de fleste andre infeksjonssykdommer oppstår en langvarig eller blivende immunitet mot den angjeldende sykdomskilde, kan infeksjoner med rhinovirus opptre igjen og igjen. Grunnen til den manglende blivende immuniteten er det store antallet av rhinovirusstammer, som seg i mellom viser ingen eller bare liten immunologisk kryssreaksjon (6, 11) . Etter den oppståtte infeksjonen lar det seg riktignok påvise antistoffer mot den aktuelle virusstammen, men disse yter ingen beskyttelse mot andre rhinovirusstammer. På grunn av det store antallet stammer som sirkulerer i befolkningen, er gjentatte infeksjoner med rhinovirus mulig.

Derfor frembyr tilstedeværelsen av bare to reseptorer løfter om flere angrepsmuligheter for en resultatrik bekjempelse av rhinovirale infeksjoner.

Da reseptorer vanligvis er svært spesifikke, har man muligheten for å oppnå en målrettet påvirkning av reseptorene med egnede substanser, f.eks. ved blokkering av reseptorene. Når man setter inn stoffer som blokkerer reseptoren, kan man forhindre at reseptorens spesifikke virus trenger inn i cellen. De samme stoffene som på denne måten kan forhindre en infeksjon, kan også anvendes ved terapi av en manifest rhinovirusinfeksjon. Frembringelsen av slike stoffer blir vesentlig lettere, i mange tilfeller først da med hensikt gjort mulig, når den tilsvarende reseptoren er karakterisert.

Det var derfor en oppgave for den foreliggende oppfinnelsen å isolere og å rense reseptoren for den lille

RVRG.

De eneste opplysningene om rhinovirale reseptorer som hittil har vært tilgjengelige vedrører reseptorene fra den store RVRG.

Rensingen og karakteriseringen av reseptorene fra den store RVRG ble gjennomført ved hjelp av et monoklonalt antistoff, som ble fremstilt ved immunisering av mus med HeLa-celler. Denne reseptoren blir glykosylert og har en molekylvekt på 440 kD i naturlig tilstand, denaturering med natriumlaurylsulfat fører til dissosiasjon i underenheter på 9 0 kD, hvilket gjør det nærliggende å slutte at den funksjonelle reseptoren foreligger som pentamer (17). Reseptoren for den lille RVRG ble inntil videre hverken karakterisert eller renset. De eneste data for denne reseptoren henviser til dens oppbygging fra protein, og viser dessuten at dette - eller liknende proteiner også er tilstede på celler fra en rekke andre arter. Dette adskiller reseptoren fra den lille RVRG vesentlig fra reseptoren fra den store gruppen, som bare kunne finnes på menneskelige og i noen få tilfeller på apeceller. En påvirkning, f.eks. en blokkering av reseptoren med stoffer som forhindrer inntrengningen av virus i cellen, synes egnet som mulig forebyggelse eller også som terapi ved en allerede eksisterende infeksjon.

Reseptoren ifølge oppfinnelsen er kjennetegnet ved at molekylvekten, bestemt ved gelpermeasjonskromatografi, utgjør omlag 450 kD; sedimentasjonskonstanten, bestemt ved sukkergradient-sentrifugering i nærvær av overflateaktive stoffer, tilsvarer omlag 28,4 S; den blir bundet av Lens culinaris lektin; at den ikke blir bundet av heparin-sefarose; den binder seg irreversibelt til en anionbytter; dens bindingsaktivitet ikke ødelegges av neuraminidase; den består av underenheter som er assosiert ved intermolekylære disulfidbroer; den oppviser ikke noen binding til rhinovirus i nærvær av EDTA; og jodacetamid påvirker bare lite bindingsaktiviteten til rhinovirus.

Det var oppgaven for den foreliggende oppfinnelsen å fremskaffe forutsetningene for fremstilling av substanser som muliggjør en beskyttelse mot infeksjoner med rhinovirus fra den lille reseptorgruppen. Denne oppgaven løstes med den foreliggende oppfinnelsen ved at

a. membraner blir isolert og renset fra celler,

fortrinnsvis HeLa-celler,

b. reseptorene i membranene blir solubilisert med overflateaktive stoffer, fortrinnsvis Triton-X100, CHAPS, Zwittergent, oktylglukosid eller DOC,

spesielt foretrekkes oktylglukosid,

c. de uløselige bestanddelene blir fjernet og

d. reseptorene blir renset ved kromatografi, fortrinnsvis på en kolonne bestående av Concanavalin-A-, resin-sefarose- eller Lens culinaris-lektin.

Disse cellene ble dyrket i suspensjon på i og for seg kjent måte, cellene ble sprengt, cellekjernene fjernet og membranene renset. De reseptorene som befant seg i membranene ble deretter solubilisert. For optimering av solubiliseringen av aktive reseptorer fra rensete HeLa-celler ble forskjellige overflate-aktive stoffer utprøvet ved forskjellige konsentrasjoner. Avgjørende for valget av et bestemt overflateaktivt stoff var evnen til å solubilisere så mye membranmateriale som mulig med så høy virusbindingsaktivitet som mulig. Som det best egnete viste seg 1% 1-0-n-oktyl-^-D-glukopyranosid (fig. 0).

De uløselige bestanddelene ble fjernet, og de reseptorene som befant seg i løsning ble ytterligere renset. For å kunne forfølge virusbindingsaktiviteten »ble det utviklet en sensitiv filterbindingstest, som muliggjorde binding av <35>S-merket virus på reseptorer som var blitt immobilisert på nitrocellulosepapir.

Det nødvendige virus for testen ble dyrket og renset på i og for seg kjent måte (13).

Da det er kjent at de fleste membranproteiner er glykosylert, ble reseptoren renset på en Lens culinaris lektinkolonne. Dette lektinet har spesifisitet for a-D-glukose og a-D-manoseenheter (16). Bundet materiale ble eluert med IM a-D-metylglukosid i fosfatbuffret NaCl-løsning med 1% oktylglukosid.

Alikvoter ble påsatt på nitrocellulose i duplikat og inkubert med såvel naturlig som også oppvarmet virus. Autoradiografi av fraksjonene viste sterk binding til naturlig virus ved det materialet som ble eluert, sammenliknet med fraksjonene fra gjennomløpet. Det oppvarmete virus viste svak binding til gjennomløpsmaterialet. Dette tyder på uspesifikke interaksjoner som blir fremkalt ved den høye andelen av hydrofobe proteiner; oppvarmet rhinovirus oppviser forhøyet hydrofobisitet (9). Da det var blitt fastslått at renset virus ved lengre tids lagring ved 4°C etter hvert omdannes til partikler som oppviser den samme antigenisiteten som oppvarmet virus (C-determinanter), ble disse forurensningene fraskilt umiddelbart før gjennomføringen av bindingstesten ved immunoutfelling med monoklonale antistoffer spesifikke for C-determinantene, eksempelvis MAK 2G2. Disse monoklonale antistoffene oppnår man på i og for seg kjent måte ved immunisering av mus eller kaninunger med C-determihanter og påfølgende kloning etter Kohler og Milstein (18).

Ved siden av L. culinaris lektinkolonnen ble også anvendt concanavalin A-, risin- og heparinsefarosekolonner til å rense reseptoren. Gjennomløp og eluert materiale ble testet som ovenfor. Con.A sefarosekolonner ble eluert med IM a-D-metylmannosid, hvorved tilnærmet 2 0% bindingsaktivitet kunne gjenvinnes; eluering av risinkolonnen med IM galaktose førte til tilnærmet 100% gjenvinnbar bindingsaktivitet. I motsetning til reseptoren for Coxsackie B virusgruppen (7), holdt heparin-sefarose bindingsaktiviteten ikke tilbake. Eluatet fra L. culinaris kolonnen ble oppdelt på en superosekolonne ved hjelp av FPLC (Pharmacia) (gelpermeasjonskromatografi) . Ved sammenlikning med merkete proteiner kunne man bestemme molekylvekten for den aktive reseptoren til 450 kD. Samtidig kunne man fraskille en større del av de kontaminerende proteinene (fig. 1).

Reseptoren fra den lille rhinovirus reseptorgruppen vandrer i en polyakrylamidgel i nærvær av SDS med en tilsynelatende molekylvekt på 120 kD. I noen tilfeller kan også observeres et knapt synlig bånd med en noe lavere molekylvekt, som muligens representerer en modifikasjon av hovedmengden av reseptorproteinet (fig. 5, spalte 1). Molekylvektene for begge reseptorformene er betydelig høyere enn den som ble funnet for den store rhinovirusreseptoren (90 kD) .

Da reseptorproteinene i begge gruppene oppviser en molekylvekt på ca. 450 kD i sin naturlige form, er det ikke usannsynlig at deres oppbygging av enkeltenheter foregår på liknende måte. Den virkelige molekylvekten kan allikevel avvike fra den som er bestemt ved gelpermeasjonskromatografi, hvilket skyldes den lille forskjellen i proteinenes retensjonsvolum i dette høye molekularvektområdet. Picornavirusstrukturen viser en dyp kløft (canyon) som ligger omkring de femdobbelte aksene for den ikosahedrale symmetrien og som muligens inneholder reseptor bindingssetene (19) . Det blir antatt at reseptoren fra den store rhinovirus reseptorgruppen og reseptoren for Coxsackie B virusgruppen binder virusene over de femdobbelte aksene (2 0). Spørsmålet om reseptoren fra den lille gruppen er en pentamer, forblir ubesvart, da molekylvekten for enkeltenhetene er svært høy sammenliknet med reseptoren fra den store gruppen.

Ved hjelp av sentrifugering i sukkergradient var det mulig å bestemme sedimentasjonskonstanten for reseptoren. For dette formålet ble reseptor renset på L. culinaris påsatt på en sukkergradient og sentrifugert. Aktivitetsmaksimum ble funnet i den posisjon av gradienten som tilsvarer en sedimentasjonskonstant på 28,4 S (fig. 2).

I forforsøkene var det blitt fastslått at reseptoren ikke lenger kunne elueres fra en kromatografikolonne med anionutbytter. Da reseptoren er ufølsom overfor neuraminidase, ble sialinsyren fjernet fra glykoproteinet for å nedsette ionevekselvirkningen med søylematerialet. Prøven ble deretter påsatt på en mono Q kolonne (Pharmacia), og reseptoren eluert med en NaCl-gradient. Bindingsaktiviteten kunne påvises som en bred topp ved omlag 250 mM NaCl (fig. 3).

Rensingen av reseptorene ifølge oppfinnelsen er også mulig ved en kombinasjon av de kromatografiske rensningstrinnene på forskjellige kromatografimaterialer.

De kjemiske egenskapene og de strukturelle kravene til reseptoren ifølge oppfinnelsen for den virale bindingen ble funnet ved hjelp av enzymer og kjemiske reagenser (tabell 1) .

Trypsinbehandling ødelegger bindingsaktiviteten fullstendig. Dette stemmer overens med allerede kjente resultater fra enzymatisk behandling av celleoverflater (14), og hentyder på reseptorens proteinkarakter.

Behandling av den solubiliserte reseptoren med neuraminidase førte reproduserbart til en svak økning av bindingsaktiviteten. Denne behandlingen fører muligens til en bedre tilgjengelighet av den regionen på reseptormolekylet som utgjør målet for virusinteraksjonen. Herav følger at sialinsyren ikke er nødvendig for virusbindingen.

Ditiotreitol (DTT) ødelegger bindingsaktiviteten, hvilket tyder på deltakelse av disulfidbroer ved opprettholdelse av den riktige foldingen av proteinet. Den overraskende høye molekylvekten, bestemt ved gelpermeasjonskromatografi og gradientsentrifugering, tyder på en oligomer struktur av reseptormolekylet. Følsomheten overfor DTT kunne tyde på at intermolekylære disulfidbroer er nødvendige for sammenbindingen av de hypotetiske enkeltenhetene.

Behandling med jodacetamid reduserer bindingsaktiviteten bare lite, og tyder på at frie sulfhydrylgrupper ikke er nødvendige for en effektiv binding.

I nærvær av etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) ved inkuberingen av nitrocellulosefiltrene med <35>S-merket virus kunne ikke fastslåes noen binding. Dette stemmer overens med tidligere undersøkelser som viste nødvendigheten av tilstedeværelsen av toverdige kationer for interaksjonen av rhinovirus med celleoverflaten (12).

Konkurransebindingsundersøkelser mellom serotypepar ble anvendt for å innordne de humane rhinovirus i de to reseptorklassene (10, 1). I den foreliggende oppfinnelsen ble derfor innsatt HRV2 og HRV49 som representanter for den lille reseptorgruppen og HRV89 som representant for den store reseptorgruppen ved konkurranseeksperimenter for å finne spesifisiteten for reseptorene ifølge oppfinnelsen. Nitrocellulosefiltrene med immobiliserte reseptorer ble inkubert med merket HRV2 i nærvær av et omlag 2 0 gangers overskudd av enten HRV2 eller HRV89. Som vist i tabell II ble bindingen massivt undertrykket i nærvær av ikke-merket HRV2, men ikke påvirket av HRV89. For å bekrefte disse resultatene ble forsøkene gjentatt med merket HRV49 under anvendelse av HRV2 og HRV89 som konkurrenter. Igjen er det åpenbart at HRV2 massivt reduserer bindingen, mens HRV89 ikke har noen innflytelse.

Skjønt HRV2 og HRV89 binder seg til forskjellige reseptorer, viser deres kapsidproteiner overraskende stor likhet (5). En detaljert struktursammenlikning mellom HRV2 og HRV14, basert på røntgenstrukturanalysen av HRV14 er nettopp blitt utført (2). Både HRV14 og HRV89 binder seg til reseptoren i den store RVRG. Det kan derfor ventes at man vil finne en Cluster av konserverte aminosyrer på det hypotetiske reseptorbindingssetet. Tidligere har det allikevel ikke vært mulig å oppdage et enkelt mønster av konservative aminosyrer innenfor Canyon-regionen.

Først ved den foreliggende oppfinnelsen er det mulig å fremstille reseptorer for den lille RVRG i en hovedsakelig ren form.

Først ved reseptorene ifølge oppfinnelsen er det mulig, målrettet å undersøke virus/reseptorvekselvirkningen. Av særlig betydning herved er lokaliseringen av de områdene på reseptorene som til slutt er ansvarlige for den virale virkningen. Ved kjennskap til disse områdene skulle det være mulig å fremstille stoffer som er spesifikt rettet mot disse områdene, for således muligens å oppnå en blokkering av reseptorene for flere forskjellige rhinovirus.

Gjenstand for den foreliggende oppfinnelsen er også de reseptorene som kan fremstilles fra de naturlige reseptorene ved behandling med reduksjonsmidler, og som eksempelvis lar seg rense ved elektroforetiske metoder. Eksempelvis kan disse enkeltenhetene anvendes til fremstilling av polyklonale og/eller monoklonale antistoffer som kan anvendes preparativt, diagnostisk og/eller terapeutisk på liknende måte som de tilsvarende antistoffene mot de naturlige reseptorene. Også reseptorenkeltenhetene kan anvendes på liknende måte som de naturlige reseptorene.

De naturlige reseptorene og/eller deres enkeltenheter som kan modifiseres ved målrettet enzymatisk behandling. Som det ble vist i den foreliggende oppfinnelsen, ødelegger behandlingen med trypsin bindingsaktiviteten for reseptorene ifølge oppfinnelsen, mens neuraminidase forårsaket en svak økning i aktiviteten. Det er derfor tenkbart og mulig for fagmannen å overprøve på ikke oppfinnsom måte at bestemte enzymer og/eller kjemiske reagenser fører til reseptorer som enten er forbedret i sin virkning og/eller er bedre appliserbare og anvendbare og/eller oppviser forbedret stabilitet, sammenliknet med de naturlige reseptorene. Disse modifikasjonene kan eksempelvis føre til at deler av proteinkjeden blir fraskilt, utskåret og/eller at proteinkjeden blir oppskåret i alle eller enkelte underenheter av de naturlige reseptorene.

Ved siden av disse modifikasjonene er det dessuten mulig å overføre de naturlige reseptorene eksempelvis ved styrt reduksjon enten fullstendig eller delvis i underenhetene. Disse mer eller mindre store underenhetene lar seg også sammenbinde ved eksempelvis målrettet oksydasjon til mer eller mindre store enheter, som er omordnet i forhold til de naturlige reseptorene.

Reduksjonsmidler som er egnet til oppspalting av disulfidbroer er eksempelvis tiolforbindelser, som tiofenol, 4-nitrotiofenol, 1,4-butanditiol og spesielt 1,4-ditiotreitil. Reduksjonen utføres fordelaktig i et vandig alkalisk medium, eksempelvis i den fortynnete vandige løsningen av et alkalimetallhydroksyd, f.eks. natriumhydroksyd, av et alkalimetallkarbonat, f.eks. natriumkarbonat eller av en organisk base, spesielt av et trilaverealkylamin, f.eks. trietylamin, ved romtemperatur.

Oksydasjonsmiddel som er egnet til ny sammenbinding av desulfidbindinger i de reduserte polypeptidene er f.eks. luft-oksygen, som ledes gjennom en vandig løsning av polypeptidet, og som i dette tilfellet ble tilsatt en katalytisk mengde av et overgangsmetallsalt, f.eks. jern(III)sulfat, jern(III)klorid eller kopper(II)sulfat; jod, også i form av kaliumjodid-adduktet KJ3, som fortrinnsvis anvendes i alkoholisk, f.eks. metanolisk, eller vandig-alkoholisk, f.eks. vandig metanolisk løsning; kaliumheksacyanoferrat(III) i vandig løsning; 1,2-dijodetan eller azodikarbonsyredimetylester eller -dietylester, som bringes til reaksjon i vann eller i en blanding bestående av vann og en med vann blandbar alkohol, f.eks. metanol. Oksydasjonen utføres spesielt ved romtemperatur.

Fraskillingen av reagensene, spesielt av saltene og oksydasjons- henholdsvis reduksjonsmidlene og deres følgeprodukter fra den ønskede forbindelsen, skjer etter i og for seg kjente metoder, eksempelvis ved

molekylvektsfiltrering, f.eks. på Sephadex eller Biogel.

Samtlige modifikasjoner lar seg anvende på liknende måte som de naturlige reseptorene ifølge oppfinnelsen.

Reseptoren ifølge oppfinnelsen er løselig, slik.at den lett kan håndteres og anvendes.

Det er imidlertid også mulig å binde reseptorene til en fast bærer, og anvende dem i denne.formen for diagnostiske og preparative formål. Som bærere kommer alle vanlige faste bærere som polystyrol, glass, dekstran, men også biologiske membraner og lipidvesikler på tale.

Dessuten er det mulig å binde vanlige markører til reseptorene, og anvende dem diagnostisk i denne form.

Dersom reseptorene ifølge oppfinnelsen blir bundet til en bærer, kan de anvendes såvel diagnostisk som også preparativt til binding av det virale proteinet, eksempelvis ved hjelp av den såkalte affinitetskromatografien. Diagnostisk kan et viralt protein oppfanges på vanlig måte av en reseptor som er bundet til en bærer, f.eks. ved hjelp av antistoffer eller merkete antistoffer. Som merking kommer eksempelvis radioaktiv merking, et enzym eller en fluoriserende gruppe på tale.

Av svært stor betydning er anvendelsen av reseptorene ifølge oppfinnelsen in vitro til fremstilling av polyklonale og/eller monoklonale antistoffer som virker spesifikt mot de reseptorene som befinner seg i cellemembranene. Slike antistoffer kan til gjengjeld anvendes først og fremst diagnostisk for fremstilling og bestemmelse av reseptorene på celler eller cellebiologisk materiale.

De åpner dermed fullstendig nye veier og muligheter.

Forklaring til figurene

Fig. 0 Solubilisering av reseptorene med forskjellige overflateaktive stoffer (A: naturlig virus, B:

denaturert virus).

Fig. 1 Gelpermeasjonskromatografi av den solubiliserte reseptoren på en Superose 6 HR 10/3 0 kolonne. Membraner ekvivalent med 10<8> celler ble solubilisert i OG (15 mM natriumfosfat pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 (PBS) med 1% oktylglukosid påsatt på en 1 ml L. culinaris kolonne, og det adsorberte materialet eluert med 1 M a-D-metylglukosid i OG. Eluatet ble konsentrert i et lite Centricon-rør til 0,5 ml og påsatt på Superose-kolonnen. Kolonnen ble fremkalt med 0,2 ml/min OG, og fraksjoner på 0,5 ml ble oppsamlet. Bindingsaktiviteten for de enkelte

fraksjonene, stillingene for de merkete proteinene (bestemt i et spesielt eksperiment) og ekstinksjonen ved 280 nm er vist. Fig. 2 Sukkergradientsentrifugering av den solubiliserte reseptoren. Materialet som var eluert fra en L. culinaris kolonne ble konsentrert (se forklaring til fig. 1) og oppdelt på en 10-4 0% sukkergradient i OG. Bindingsaktiviteten for fraksjonene (0,4 ml), stillingen for de merkete proteinene katalase (Cat) og aldolase (Aid) såvel som ekstinksjonen ved 280 nm er vist. Fig. 3 Mono Q anionbytterkromatografi. Fraksjonene 14-16

fra gelpermeasjonskromatografien (fig. 1) ble behandlet med neuraminidase og materialet oppdelt ved hjelp av FPLC på mono Q. Bindingsaktiviteten for de enkelte fraksjonene (0,5 ml), ekstinksjonen ved 280 nm og forløpet for gradienten er vist.

Fig. 4 Påvisning av reseptoren på Western Blots. Virusbindingsaktiviteten for mono P anionbytterkolonnen ble påsatt på en Superose 6 HR 10/30 kolonne. Fraksjoner på 1,2 ml ble oppsamlet. Proteinene ble forfulgt som A280 , stillingene for de merkete proteinene (tyroglo-bulin, 670k; apoferritin 440, ; /3-amylase, 200k) er også vist (a). Proteinene i fraksjonene fra Superose-kolonnen ble konsentrert og påsatt på tre 6% SDS-polyakrylamidgeler. Én gel ble farget med Coomassie-blått (b), proteinene fra den andre og tredje gelen ble overført på nitrocellulosemembraner (c, d). Blotten ble inkubert med <35>S-merket HRV2 i fravær av (c) eller i nærvær av et overskudd av umerket HRV2 (d) ; stillingene for de merkete proteinene (2-makroglobulin, 180k; /3-galaktosidase, 116k; fruktose-6-fosfatkinase, 84k) og for reseptorbåndene er markert med piler.

Fig. 5 Autoradiografi av Western Blots som ble oppnådd fra de samlede fraksjonene med virusbindingsaktivitet fra Superose-kolonnen (se fig. 4). Disse blots ble inkubert med <35>S-merket HRV2. Prøvene ble før påsettingen på gelen inkubert med SDS ved romtemperatur, spor 1; prøven ble kokt i SDS, spor 2; prøven ble inkubert med 10 mM ditriotreitol, spor 3; en blot identisk med spor 1 ble inkubert med <35>S-merket HRV2 i nærvær av 10 mm EDTA, spor 4; eller ble inkubert med <35>S-merket HRV2, som var blitt oppvarmet til 56 °C i 10 minutter, spor 5.

Materialer

l-0-n-oktyl-/?-p-glukopyranosider, Tween 40 og 3-(3-kjolamidopropyl)-dimetylammonium-l-propansulfonat (CHAPS) kom fra Sigma, N-tetradecyl-N,N-dimetylammonium-3-propansulfonat (Zwittergen 3-14) fra Serva. De andre overflatestoffene kom fra Merck, trypsin fra Miles, <35>S-metionin (1350 Ci/mmol) fra Amersham.

Eksempel 1:

Fremstilling av virus

HRV2, HRV49 og HRV89 ble dyrket og renset i det vesentlige som beskrevet i HeLa-cellesuspensjons (13). Som eksempel er utført her dyrkingen, isoleringen og rensingen av

HRV2 .

HeLa-celler (stamme HeLa-Ohio, 03-147, Flow Laboratories, England) ble dyrket i suspensjon ved 37°C. Suspensjonsmediet (Thomas, D.S., Conant, R.M. og Hamparian, V.U., 1970, Proe. Soc. Exp. Biol. Med. 133, 62-65; Stott, E.J. og Heath, G.F., 1970, J. gen. Virol, 6, 15-24) besto av en Joklik-modifikasjon av MEM for Suspensjon (Gibco 072-1300) og 7% hesteserum (Seromed 0135). Inokulasjonstettheten var 5-10 x 10<*> celler/ml, volumet 500 ml. Suspensjonen ble sentrifugert ved en celletetthet på 1 x 10<6> celler/ml under sterile betingelser ved 3 00 g i 10 min. Supernatanten ble suget av og cellene resuspendert i 100 ml infeksjonsmedium (Joklik-modifikasjon av MEM for suspensjonskultur med 2% hesteserum og 2 mM MgCl2) • Ved flere gangers forsiktig oppsuging i en 20 ml's pipette ble cellene fordelt homogent i infeksjonsmediet. Deretter ble fyllt opp til 500 ml. Derpå ble cellesuspensjonen bragt til 34°C og infisert med HRV2 (to ganger Plaque-renset) ved en multiplisitet på 0,1 virus/celle. HRV2-stammen ble levert av American Type Culture Collection (ATCC VR-482 og VR-1112). Den anvendte stammen ble nøytralisert med antiserum mot HRV2 (American Type Culture Collection, Cat.No. ATCC VR-1112

AS/GP).

Som kontrollserum tjente et antiserum mot HRV7 (Cat.No. ATCC VR-1117 AS/GP), som viste ingen nøytralisering. Etter 60 timer ved 34°C ble viruset høstet. Virus ble utvunnet såvel fra cellene, henholdsvis cellefragmentene, som fra mediet.

For dette formålet ble mediet fraskilt og avsuget fra de infiserte cellene og cellefragmentene ved sentrifugering i 10 minutter ved 1500 g. Bunnfallet ble frosset inn ved -70"C.

Cellebunnfallene fra 12 1 suspensjonskultur ble slått sammen, resuspendert i 40 ml TM-buffer (20 mM Tris/HCl, pH 7,5, 2 mM MgCl2) , plassert på is i 15 minutter, deretter brutt opp i Dounce homogenisator og blandingen sentrifugert i 3 0 minutter ved 6000 g. Bunnfallet ble deretter ennå en gang vasket i 10 ml TM-buffer. Begge supernatantene ble slått sammen og sentrifugert i 3 timer ved 110.000 g for å pelletere viruset. Viruspelleten ble deretter tatt opp i 10 ml KTMP-buffer (50 mM KCl, 50 mM Tris/HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl2, 2 mM merkaptoetanol, 1 mM puromycin, 0,5 mM GTP) og etter tilsetning av 150 yig DNase I (Sigma, ribunukleasefri) inkubert 1 time på is.

Fra infeksjonsmediet ble viruset utfelt under omrøring ved 4°C med polyetylenglykol 6000 (PEG 6000; Merck) ved en konsentrasjon på 7% og 450 mM*NaCl (Korant, B.D., Lonberg-Holm, K., Noble, J. og Stasny, J.T. 1972, Virology 48, 71-86). Etter 4 timer ved lav temperatur ble viruset sentrifugert fra i 30 min ved 1500 g, bunnfallet resuspendert i 10 ml KTMP-buffer, som inneholdt 75 iiq DNase I, blandingen inkubert 1 time på is og deretter innfrosset ved -70°C.

Virussuspensjonene som var utvunnet fra cellene og fra mediet, ble forenet, inkubert 5 minutter ved 37°C, avkjølt ved tilsetning av 60 ml kald TE-buffer (10 mM Tris/HCl, pH 7,4, 1 mM EDTA) og deretter ultralydbehandlet i 5 min i isbad.

Deretter ble sentrifugert i 3 0 min ved 6000 g. Til supernatanten ble tilsatt 920 ml TE-buffer som inneholdt 7% PEG 6000 og 450 mM NaCl, forsiktig omrørt ved 4°C i 4 timer, og det oppståtte bunnfallet pelletert i 30 min ved 6000 g. Bunnfallet ble på nytt tatt opp i 100 ml TM-buffer, viruset utfelt som ovenfor ved tilsetning av PEG 6000 og NaCl og pelletert. Bunnfallet ble resuspendert i 40 ml TM-buffer, suspensjonen sentrifugert i 30 min ved 6000 g, og viruset ble pelletert i 3 timer ved 110.000 g. Bunnfallet ble løst i 1 ml TM-buffer, etter tilsetning av 50 /ig DNase I inkubert i 1 time ved 4"C og deretter tilsatt 1 ml TE-buffer. For ytterligere rensing ble virussuspensjonen sentrifugert på sakkarosegradienter (10-3 0% w/w i TE-buffer) i 4 timer ved 4°C ved 110.000 g. Ved hjelp av ekstinksjonen ved 260 nm tok man ut de fraksjonene som inneholdt viruset og fortynnet dem med TM-buffer, slik at sluttkonsentrasjonen av sakkarose ble 10%. Deretter ble sentrifugert i 8 timer ved 85.000 g. Viruspelleten ble tatt opp i 1 ml TM-buffer og oppbevart ved

-70°C. For overprøving av renheten av viruspreparatet ble gjennomført en elektroforese på en 12,5 prosentig polyakrylamidgel i nærvær av 0,1% natriumdodecylsulfat

(Laemmli, U.K., 1970 Nature (London) 277, 680-685) og proteinbåndene farget med Coomassie-briljantblått.

Eksempel 2:

Fremstilling av 35 S- metioninmerket humant rhinovirus serotype 2

( HRV2)

2 HeLa-cellemonolag i 165 cm<2> petriskåler ble infisert med en MOI (Multiplicity of Infection) på 40 med HRV2 i 1 time ved 34°C i metioninfritt MEM-medium (Gibco) med 2% dialysert føtalt kalveserum (Flow). Cellene ble vasket to ganger med PBS og inkubasjonen fortsatt ved 34°C i friskt medium. Etter 3 timer ble tilsatt til hvert monolag 1 mCi <35>S-metionin (1350 Ci/mmol, Amersham) og videre inkubert i tilsammen 24 timer. Mediet av infiserte celler og cellefragmenter ble fraskilt og avsuget ved sentr i fuger ing i 10 min ved 1500 g. Bunnfallet ble frosset inn ved -70°C i 5 ml 10 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 7,5 (Tris/EDTA) og tint opp igjen. Supernatant og frosset/opptint bunnfall ble slått sammen og sentrifugert i 30 min ved 45.000 g. Supernatanten fra denne sentrifugeringen ble sentrifugert i 2 timer ved 140.000 g. Viruspelleten ble resuspendert i 300 ul Tris/EDTA, og viruset ble renset som ovenfor over en 10-30% sakkarosegradient. De enkelte fraksjonene fra gradienten ble analysert ved hjelp av SDS-elektroforese i 12% polyakrylamidgeler. De rene virusfraksjonene ble slått sammen og lagret i nærvær av 1% BSA (bovint serum albumin) ved 4°C i maksimalt 4 uker.

For å fjerne virus med forandret kapsidstruktur fra preparatene fra eksempel 1 og eksempel 2, ble 2 0 fil immunoadsorbans, som inneholdt monoklonale antistoffer mot C-determinantene, eksempelvis mAK 2G2, inkubert med det rensete viruset i 3 0 min og pelletert før de virale prøvene ble fj ernet.

Fremstilling av immunoadsorbansen

Sta<p>hvlococcus aureus (BRL)-celler ble suspendert til en 10% w/w suspensjon i vann. Cellene ble vasket to ganger med PBS, tilsatt 1/5 vol. kaninunge-anti-mus IgG serum (Behring); suspensjonen ble inkubert 1 time ved romtemperatur. Cellene ble vasket to ganger med PBS og på nytt inkubert 1 time med 1/5 vol. mus-ascites-væske som inneholdt monoklonale antistoffer mot C-determinantene (f.eks. mAK 2G2). Etter to gangers vasking ble pelletert, pelleten resuspendert i PBS (10% W/W) og tilsatt til preparatene med det radioaktive virus.

Eksempel 3:

Solubiliserinq av reseptoren fra HeLa- celler

HeLe-celler (stamme HeLa-Ohio, 03-147, Flow Laboratories, England) ble dyrket i suspensjon ved 37°C. Suspensjonsmediet (Thomas, D.C., Conant, R.M. og Hamparian, V.U., 1970, Proe. Soc. Exp. Biol. Med. 133, 62-65; Stott, E.J. og Heath, G.F., 1970, J. gen. Virol, 6, 15-24) besto av en Joklik-modifikasjon av MEM for suspensjon (Gibco 072-1300) og 7% hesteserum (Seromed 0135). Inokulasjonstettheten var 5-10 x 10<*> celler/ml, volumet 500 ml. Suspensjonen ble sentrifugert ved en celletetthet på 1 x 10<6> celler/ml under sterile betingelser ved 300 g i 10 min. Supernatanten ble suget av og cellene vasket to ganger med fosfatbuffret koksaltløsning (PBS). 10<9> celler ble suspendert i 20 ml isotonisk buffer (10 mM HEPES-KOH, pH 7,9, 140 mM KCL, 1,5 mM MgCl2, 0,5 mM EDTA, 0,2 mM fenylmetylsulfonylfluorid) og brutt opp ved lav temperatur med 200 støt i en 50 ml Dounce homogenisator. Cellekjerner ble frasentrifugert ved sentrifugering i 3 min ved 1000 g. Membranene ble deretter videre renset ved hjelp av to-fasemetoden (3). Membraner tilsvarende 2 x IO<8> celler/ml ble tatt opp i PBS og lagret i flytende nitrogen. For solubilisering ble 2 x IO<8> celleekvivalenter suspendert 1 ml 1% oktylglukosid i PBS (OG) og uløselig materiale fraskilt ved sentrifugering ved 80.000 gil time. Supernatanten ble anvendt for kolonnekromatografien.

Eksempel 4:

Filterbindinqstest

De fraksjonene fra kolonnekromatografien som skulle undersøkes på aktivitet, ble påsatt i et Dot-blot-apparat (Bio-Rad) på en nitrocellulosemembran (BA85, Schleicher og Schull). Prøvene fikk sige inn ved romtemperatur. Deretter ble væskerestene suget av med svakt vannstrålevakuum og uspesifikke proteinbindingsseter avmettet med 2% storfeserumalbumin (BSA) i PBS ved 4°C over natten. Filtrene ble deretter inkubert i løpet av 1 time med IO<5> cpm <35>S-metioninmerket HRV2 i 1% Tween 40, 0,5% natriumdesoksycholat og 10 mM (3-(3-cholamidopropyl)-dimetylammonium 1-propansulfonat) i PBS. Membranene ble vasket to ganger med 2% BSA i PBS, tørket og de runde arealene som tilsvarte prøvene stanset ut; radioaktiviteten ble målt i en væskescintil-lasjonsteller.

Som spesifisitetskontroll ble HRV2 oppvarmet i 10 min til 56°C før inkubasjonen av nitrocellulosefiltrene (8). Etter denne behandlingen kunne man ikke lenger fastslå noen binding til en av prøvene (fig. IB). Herav ble avledet at bindingen av naturlig HRV2 til immobilisert materiale i virkeligheten må føres tilbake til en spesifikk interaksjon mellom viruset og reseptoren.

Eksempel 5;

Affinitetskromatografi på kolonner av Lens culinaris lectin

10<8> celleekvivalenter ble solubilisert som beskrevet og påsatt på en L. culinaris-kolonne (1 ml) som var ekvilibrert med OG. Kolonnen ble vasket med 5 ml OG og bundet materiale eluert med 2 ml 1 M a-D-metylglukosid i OG. Bindingstesten viste at nesten 100% av bindingsaktiviteten kunne gjenvinnes, mens derimot omlag 90% av totalproteinet var blitt fjernet.

Eksempel 6:

Gelpermeasjonskromatografi

Eluatet fra L. culinaris-kolonnen ble konsentrert med et lite Centricon-rør (unntak 30 kD) til 0,5 ml, og oppdelt på en Superose 6 HR 10/30 kolonne (ekvilibrert med OG buffer) med hjelp av FPLC (Pharmacia). Ved sammenlikning med merkete proteiner kunne man bestemme molekylvekten for den aktive reseptoren til 450 kD. Samtidig kunne en større del av de forurensende proteinene fraskilles (fig. 1) .

Eksempel 7:

Sentr i f uerer ing på sukkergradient

Reseptor renset på L. culinaris (som ovenfor) ble påsatt på en sukkergradient (10-40% i OG) og sentrifugert i 8 timer ved 38 krpm ved 4°C. Aktivitetsmaksimum ble funnet i den gradientposisjonen som tilsvarer sedimentasjonskonstanten på 28,4 S. Posisjonene for de merkete proteinene ble bestemt i en annen gradient (fig. 2). På grunn av tilstedeværelsen av overflateaktive stoffer sedimenterte markørene ved beregnete sedimentasjonskoeffisienter på 15,0 S og 21,9 S (7,3 S og 1,3 S ved fravær av overflateaktive stoffer).

Eksempel 8;

Anion- utbvtterkromatografi

I forforsøk var det blitt fastslått at reseptoren ikke lenger kunne elueres fra mono Q HR 5/5 kolonner (Pharmacia). Derfor ble reseptor som var forrenset over L. culinaris og gelpermeasjon behandlet med 1 U neuraminidase/mg protein i 60 min ved 37°C for å fjerne de sterkt sure neuraminsyregruppene. Prøven ble deretter fortynnet til det todobbelte med 10 mM natriumfosfatbuffer pH 7, 1% oktylglukosid og påsatt på en mono Q kolonne. Kolonnen ble fremkalt med en gradient på 0-1 M NaCl i den samme bufferen. Bindingsaktiviteten kunne påvises som en bred topp ved omlag 250 mM NaCl (fig. 3).

Eksempel 9:

Isolering og rensing av reseptoren

Plasmamembraner fra 2 x 10<9> HeLa-celler ble løst i løpet av 10 min ved romtemperatur i 5 ml PBS, som inneholdt 1% w/v l-0-n-oktyl-£-D-glukopyranosid og 0,01% w/v av hver av L-a-p-tosyl-L-lysinklormetylketon (TLCK), L-l-tosylamid-2-fenyletyl-klormetylketon (TPCK) og fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF)

(alle fra Sigma). Uløselig materiale ble frasentrifugert i løpet av 3 0 min ved 3 0 krpm i Beckmann 65 fastvinkelrotor.

Supernatanten ble påsatt på en 25 ml L. culinaris lektinkolonne, som var ekvilibrert med OG (PBS, 1% w/v oktylglukosid), og det bundne materialet eluert med 5 ml OG, som inneholdt 1 M a-metylglukosid. Eluatet ble mettet til 50% med et like stort volum av mettet ammoniumsulfatløsning. Det utfelte materialet ble løst i 2 ml buffer A (10 mM TRIS-HC1 (pH 7,5), 5 mM EDTA, 1% w/v oktylglukosid), og sprøytet inn i en mono P anionbytterkolonne som var koblet til et FPLC-system (Pharmacia).

Proteinene ble adskilt ved hjelp av en gradient på 0-100% buffer B (som buffer A, men inneholdende 1,5 M NaCl). De fraksjonene som inneholdt virusbindingsaktivitet ble forenet, konsentrert med et lite Centricon-rør til 0,5 ml og oppdelt på en Superose 6 kolonne, som var ekvilibrert med OG, som inneholdt 5 mM EDTA. Proteinkonsentrasjonen ble fulgt som ekstinksjon ved 280 nm (fig. 4a).

Fraksjonene fra denne kolonnen ble konsentrert til 50

/il, bragt opp til 0,1% w/v SDS, og alikvoter adskilt på tre 6% polyakrylamidgeler som inneholdt 5 mM EDTA (21). De oppdelte proteinene i gelen ble deretter enten farget med Coomassie-blått (fig. 4b) eller elektroforetisk overført på en nitrocellulosemembran (22) som var inkubert med 4 x IO<5> cpm<35>S-merket HRV2 (se ovenfor). Nitrocellulosen ble tørket og autoradiografert (fig. 4c). Som kontroll på en spesifikk binding ble en identisk fremstilt nitrocellulosereplika inkubert i nærvær av et 20 gangers overskudd av umerket HRV2 (fig. 4d). Det ble fastslått at fraksjonene 5 og 7 fra Superose-kolonnen inneholdt materiale som var istand til å binde HRV2, når det var blitt overført på nitrocellulose.

Autoradiografien viste noen bånd med en tilsynelatende molekylvekt større enn 300 kD i tillegg til en posisjon som tilsvarer omlag 120 kD, sammenliknet med merkete proteiner som ble fremkalt på den samme gelen (fig. 4c). Bare disse 120 kD båndene som inneholder overskudd av ikke-merket virus, forsvinner i kontrollen (fig. 4d) og viser dermed spesifikk vekselvirkning mellom dette proteinet og HRV2. Polyakrylamidgelen som inneholder identiske prøver og var blitt farbet med Coomassie-blått, viste et meget svakt bånd i en posisjon som tilsvarer de radioaktive båndene på Wester-blottet. Disse båndene finner man utelukkende i de prøvene fra fraksjonene 6 og 7 som viste virusbindingsaktivitet (fig. 4b) .

Eksempel 10:

Bindinqstester

Fremstillingen på nytt av en aktiv reseptor avhenger av milde betingelser; koking i SDS ødelegger f.eks. aktiviteten irreversibelt (sammenlikn fig. 5, spalte 1 og 2). Dersom reseptorpreparatet ble inkubert med 10 mM ditiotreitol før påsettingen på gelen, kunne ingen binding observeres (fig. 5, spalte 3). Da de spesifikke vekselvirkningene av rhinovirus med deres reseptorer er avhengig av at toverdige kationer er tilstede (12), ble blotten fra en prøve som var identisk med den som var påsatt på spor 1 (fig. 5) , inkubert med virus i nærvær av EDTA. Under disse betingelsene kunne ingen binding observeres (fig. 5, spalte 4).

Som ytterligere test ble inkubasjonen av nitrocellulose-membranen gjennomført med HRV2 oppvarmet til 56°C. Denne behandlingen fører til strukturelle forandringer av det virale kapsidet som umuliggjør en binding av virus på HeLa-celleoverflaten (23) . Som man kan se i fig. 5, spalte 5, inntreffer under disse betingelsene ingen binding.

Filterne ble inkubert som beskrevet med et 20 gangers overskudd av ikke-merket virus.

Bibliografi

1. Abraham, G., og Colonno, R.J. (1984). Many rhinovirus serotypes share the same cellular receptor. J. Virol. 51, 340-345. 2. Blaas, D., Kuechler, E., Vriend, G., Arnold, E., Griffith, J.P., Luo, M., Rossmann, M.G. (1987). Comparison of three-dimensional structure of two human rhinoviruses (HRV2 og HRV14). Proteins (under trykking). 3. Brunette, D.M., og Till, J.E., (1971). A rapid method for the isolation of L-cell surface membranes using an aqueous two-phase polymer system. J. Membr. Biol. 5, 215-224 . 4. Colonne, R.J., Callahan, P.L., og Long, W.J. (1986), Isolation of a monoclonal antibody that blocks attachment of the major group of human rhinoviruses. J. Virol. 57, 7-12. 5. Duechler, M., Skern, T., Sommergruber, W., Neubauer, Ch., Gruendler, P., Fogy, I., Blaas, D. og Kuechler, E.

(1987). Evolutionary relationships within the human

rhinovirus genus; comparison of serotypes 89, 2 and 14.

Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A (under trykking).

6. Fox, J.P. (1976). Is a rhinovirus vaccine possible?

American J. Epidemiol. 103. 345-354.

7. Krah, D.L., og Crowell, R.L. (1985). Properties of the desoxycholate-solubilezed HeLa cell plasma membrane receptor for binding group B coxsackieviruses. J. Virol. 53: 867-870. 8. Lonberg-Holm, K., og Yin, F.H. (1973). Antigenic determinants of infective and inactivated human rhinovirus type 2. J. Virol. 12, 114-123. 9. Lonberg-Holm, K., og Whiteley, N.M. (1976. Physical and metabolic requirements for early interaction of polievirus and human rhinovirus with HeLa cells. J. Virol. 19, 857-870. 10. Lonberg-Holm, K., Crowell, R.L., and Philipson, L. (1976). Unrelated animal viruses share receptors. Nature 259, 679-681. 11. Melnick, J.L. (1980). Taxonomy of Viruses. Proe. Med. Virol. 26, 214-232. 12. Noble-Harvey, J., og Lonberg-Holm, K. (1974). Sequential steps in attachment of human rhinovirus type 2 to HeLa

cells. J. Gen. Virol..25, 83-91.

13. Skern, T., Sommergruber, W., Blaas, D., Pieler, Ch., og Kuechler, E. (1984). The sequence of the polymerase gene of

human rhinovirus type 2. Virology 136. 125-132.

14. Stott, E.J., og Heath, G.F. (1970). Factors affecting the growth of rhinovirus 2 in suspension cultures of L132 cells.

J. gen. Virol. 6, 15-24.

15. Stott, E.J., Killington, R.A. (1972). Rhinoviruses. Ann.

Rev. Microbiol. 26, 503-525.

16. Young, N.M., Leon, M.A., Takahashi, T., Howard, I.K., og

Sage, H.J. (1971). Studies on a phytohemagglutinin from the lentil. III. Reaction of Lens culinaris hemagglutinin with polysaccharides, glycoproteins, and lymphocytes, J. Biol. Chem. 271, 1596-1601. 17. Tomassini, J.E. og Colonno, R.J. (1986). Isolation of a receptor protein involved in attachment of human rhinoviruses. J. Virol. 58, 290-295. 18. Kohler, G. og Milstein, C. (1975). Continuous cultures of fused celles secreting antibody of predefined specificity.

Nature (London) 256, 495-497.

19. Rossmann, M.G., Arnold, E., Erickson, J.W., Frankenberger, E.A., Griffith, J.P., Hecht, H-J., Johnson, J.E., Kamer, G., Luo, M., Mosser, A.M., Rueckert, R.R., Sherry, B.A., & Vriend, G. (1985). Structure of a common cold virus, human

rhinovirus 14 (HRV14), Nature (London) 317, 145-154.

20. Mapoles, J.E., Krah, D.L. & Crowell, R.L. (1985). Purifica-tion of a HeLa cell receptor protein for group B coxsackieviruses. Journal of Virology 55, 560-566. 21. Laemmli, U.K. (1979). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature (London) 277, 680-685. 22. Burnette, W.N. (1981). Western blotting: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate - poly-acrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radio-graphic detection with antibody and radioiodinated protein

A. Analytical Biochemistry 112, 195-203.

23. Lonberg-Holm, K. & Yin, F.H. (1973). Antigenic determinants of infective and inactivated human rhinovirus type 2. Journal of Virology 9, 29-40.

Claims (11)

1. Reseptor med bindingsaktivitet for den minste gruppen av rhinovirus for anvendelse in vitro karakterisert ved at molekylvekten, bestemt ved gelpermeasjonskromatografi, utgjør omlag 450 kD; sedimentasjonskonstanten, bestemt ved sukkergradientsentrifugering i nærvær av overflateaktive stoffer, tilsvarer omlag 28,4 S; den blir bundet av Lens culinaris lektin; at den ikke blir bundet av heparin-sefarose; den binder seg irreversibelt til en anionbytter; dens bindingsaktivitet ikke ødelegges av neuraminidase; den består av underenheter som er assosiert ved intermolekylære disulfidbroer; den oppviser ikke noen binding til rhinovirus i nærvær av EDTA; og jodacetamid påvirker bare lite bindingsaktiviteten til rhinovirus.

2. Reseptorunderenhetfiølge krav 1, karakterisert ved at den kan fremstilles ved fullstendig reduksjon fra reseptoren ifølge krav 1.

3. Reseptor ifølge krav 1, karakterisert ved at den kan fremstilles ved målrettet reduksjon av reseptoren ifølge krav 1.

4. Reseptor ifølge krav 1, karakterisert ved at den kan fremstilles ved målrettet oksydasjon av minst to av reseptorunderenhetene ifølge krav 2.

5. Fremgangsmåte til fremstilling av reseptorer ifølge krav 1, med bindingsaktivitet for rhinovirus tilhørende den minste gruppen, karakterisert ved at a. membraner blir isolert og renset fra celler, fortrinnsvis HeLa-celler, b. reseptorene i membranene blir solubilisert med overflateaktive stoffer, fortrinnsvis Triton-X100, CHAPS, Zwittergent, oktylglukosid eller DOC, spesielt foretrekkes oktylglukosid, c. de uløselige bestanddelene blir fjernet og d. reseptorene blir renset ved kromatografi, fortrinnsvis på en kolonne bestående av Concanavalin-A-, resin-sefarose- eller Lens culinaris-lektin.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at reseptorene etter behandling med neuraminidase blir kromatografert over en anionbytterkolonne, fortrinnsvis over en Mono Q kolonne.

7. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 5 eller 6, karakterisert ved at det i tilslutning til den første kromatografiske rensingen blir gjennomført en andre kromatografisk rensing på en Superose-kolonne.

8. Fremgangsmåte til fremstilling av reseptorunder-enhetene ifølge krav 2, karakterisert ved at reseptoren ifølge krav 1 reduseres målrettet.

9. Fremgangsmåte til fremstilling av reseptoren ifølge krav 1, karakterisert ved at minst to av reseptorunderenhetene ifølge krav 2 målrettet oksyderes.

10. Anvendelse in vitro av reseptorene ifølge et av kravene 1-4, - til kvalitativ og/eller kvantitativ påvisning av rhinovirus, hvorved reseptorene fortrinnsvis kan være bundet til en fast bærer; - til analytisk karakterisering eller rensing av rhinovirus; - til fremstilling av polyklonale og/eller monoklonale antistoffer.

11. Prøvesett til bestemmelse av rhinovirus, karakterisert ved at det inneholder reseptorer ifølge et av kravene 1-4.