NO172350B

NO172350B - plasmid stabilization

Info

Publication number: NO172350B
Application number: NO84841936A
Authority: NO
Inventors: Soeren Molin; Kenn Axoe Gerdes
Original assignee: Benzon Pharma As
Priority date: 1982-09-16
Filing date: 1984-05-15
Publication date: 1993-03-29
Also published as: BR8307518A; NO841936L; NO172350C

Description

Oppfinnelsen vedrører et plasmid som replikerer i gram-negative bakterier, og stabilisering av plasmider som er nyttige på området rekombinant-DNA-teknologi for fremstilling av gener . og deres produkter. The invention relates to a plasmid which replicates in gram-negative bacteria, and the stabilization of plasmids which are useful in the field of recombinant DNA technology for the production of genes. and their products.

Den fortsatte opprettholdelse av de fleste naturlige plasmider, selv i fravær av seleksjonstrykk (faktorer som sikrer vekst av bare de organismer som huser plasmidene; et eksempel på slike er et antibiotikum i næringsmediet i tilfellet av et plasmid som bærer et gen som formidler resistens til antibio-tikumet) , antyder at plasmidopprettholdelsesfunksjoner er blitt utviklet for å sikre det fortsatte nærvær av disse ekstrakromosomale elementer med høy effektivitet. Plasmidopprettholdelses-funksjonene består primært av replikeringsgenene inklusive deres kontrollkretser som regulerer plasmidkonsentrasjonen i cellen. The continued maintenance of most natural plasmids, even in the absence of selection pressure (factors that ensure the growth of only those organisms harboring the plasmids; an example of such is an antibiotic in the nutrient medium in the case of a plasmid carrying a gene that confers resistance to the antibiotic -ticumet), suggests that plasmid maintenance functions have evolved to ensure the continued presence of these extrachromosomal elements with high efficiency. The plasmid maintenance functions primarily consist of the replication genes including their control circuits that regulate the plasmid concentration in the cell.

I voksende celler overvåker replikeringskontrollsystemet antall plasmidkopier og korrigerer avvik fra gjennomsnittet ved å øke eller nedsette sannsynligheten for plasmidreplikering. Imidler-tid kan intet replikeringskontrollsystem forhindre forekomst av celler med svært få eller bare én kopi av plasmidet, og fra slike celler er muligheten for dannelse av en plasmidfri dattercel-le innlysende. Dette problem er naturligvis størst for plasmider med lavt kopitall. Videre vil en passiv fordeling av plasmidmolekyler ved celledeling uunngåelig resultere i en viss frekvens av plasmidfrie celler. Siden tapet av et plasmidmolekyl fra en celle er irreversibelt, vil konsekvensene av en slik ustabil situasjon være at hele populasjonen til slutt blir plasmidfri. In growing cells, the replication control system monitors the number of plasmid copies and corrects deviations from the average by increasing or decreasing the probability of plasmid replication. However, no replication control system can prevent the occurrence of cells with very few or only one copy of the plasmid, and from such cells the possibility of forming a plasmid-free daughter cell is obvious. This problem is naturally greatest for low copy number plasmids. Furthermore, a passive distribution of plasmid molecules during cell division will inevitably result in a certain frequency of plasmid-free cells. Since the loss of a plasmid molecule from a cell is irreversible, the consequences of such an unstable situation will be that the entire population eventually becomes plasmid-free.

Ved siden av en vilkårlig fordeling av plasmider ved celledeling kan andre faktorer influere på tapsraten fra en kultur av celler som dyrkes i fravær av seleksjon for opprettholdelse av plasmidet. Eksempelvis krever noen plasmider et spesifikt rekombinasjonssystem for oppløsning av to nylig replikerte molekyler (Austin et al., Cell 25, 1981, ss. 729-36). I fravær av oppløsning vil det danne seg multimerer (låst inn i hverandre) , og på denne måte kan selv et plasmid med høyt kopitall frem-tre som et plasmid med lavt kopitall ved fordelingsnivået til datterceller, siden sannsynligheten for å utvikle plasmidfrie celler vil øke med økende antall plasmidmolekyler som er låst inn i hverandre i multimere strukturer. Et annet fenomen som ofte observeres i rekombinant-DNA-teknologi er omdannelse av en stabil kloningsvektor til et ustabilt hybridplasmid som et re-sultat av innsettelse av et DNA-fragment, hvis nærvær enten for-årsaker nedsettelse i plasmidkopitall eller foranlediger et skadelig produkt som interfererer negativt med cellevekst. Besides an arbitrary distribution of plasmids during cell division, other factors can influence the rate of loss from a culture of cells grown in the absence of selection for maintenance of the plasmid. For example, some plasmids require a specific recombination system for the resolution of two newly replicated molecules (Austin et al., Cell 25, 1981, pp. 729-36). In the absence of resolution, multimers will form (locked into each other), and in this way even a plasmid with a high copy number can appear as a plasmid with a low copy number at the level of distribution to daughter cells, since the probability of developing plasmid-free cells will increase with increasing numbers of plasmid molecules locked into each other in multimeric structures. Another phenomenon often observed in recombinant DNA technology is the transformation of a stable cloning vector into an unstable hybrid plasmid as a result of the insertion of a DNA fragment, the presence of which either causes a decrease in plasmid copy number or induces a deleterious product which negatively interferes with cell growth.

I alle slike tilfeller inntreffer plasmid-segregering og -tap med en frekvens (høy eller lav) som ikke lett kan kontrol-leres utenfra. In all such cases, plasmid segregation and loss occur at a frequency (high or low) that cannot be easily controlled from the outside.

Stabiliteten til naturlige plasmider, og spesielt til plasmider med lavt kopitall, antyder at i tillegg til replikeringskontrollsystemet eksisterer det et annet sett av opprettholdel-sesfunksjoner som tar aktivt del i en ordnet fordeling av plas-midmolekylene ved celledeling. Slike funksjoner er blitt betegnet fordelingsfunksjoner, og studier, f.eks. Meacock et al.; Cell 20, 1980, ss. 529-42, NordstrSm et al.> Plasmid 4, 1980, ss. 332-49, Seelke et al., Plasmid 7, 1982, ss. 163-79, har nå vist at disse i det minste delvis kodes for av plasmidene selv (i par-regioner). Således har visse plasmid-delesjonsmutanter mistet sin stabile opprettholdelse eller arv til tross for sin normale vill-type-replikeringsoppførsel, hvilket indikerer at en plasmid-spesifisert funksjonssikrende stabilitet er blitt fjernet (kfr.Nordstrom et al., op. eit.). The stability of natural plasmids, and especially of plasmids with a low copy number, suggests that in addition to the replication control system there exists another set of maintenance functions that take an active part in an orderly distribution of the plasmid molecules during cell division. Such functions have been termed distribution functions, and studies, e.g. Meacock et al.; Cell 20, 1980, pp. 529-42, NordstrSm et al.> Plasmid 4, 1980, pp. 332-49, Seelke et al., Plasmid 7, 1982, pp. 163-79, have now shown that these are at least partially coded for by the plasmids themselves (in par regions). Thus, certain plasmid deletion mutants have lost their stable maintenance or inheritance despite their normal wild-type replication behavior, indicating that a plasmid-specific functional stability has been removed (cf. Nordstrom et al., op. eit.).

Da mange av de plasmider som anvendes som vektorer i rekombinant-DNA-teknologi er blitt fratatt en stor mengde DNA sammenlignet med vill-typeopphavsplasmidet, er de utsatt for å bli ustabilt nedarvet. Dette stiller et alvorlig problem siden ustabilitet hos et plasmid til slutt vil resultere i fullstendig tap av plasmidet fra cellene, og vil i ethvert tilfelle redusere det relative utbytte av plasmid-kodede genprodukter. Dette problem er spesielt uttalt i produksjon i stor skala av genprodukter hvor vekst av mikroorganismer under seleksjonstrykk, f. eks. et antibiotikum, normalt ikke er gjørlig og ofte i det minste uønsket fra et miljøsynspunkt, og hvor mikroorganismene dyrkes i et stort antall generasjoner. Vektorer som bare er til stede i noen få kopier pr. celle vil høyst sannsynlig bli ustabilt nedarvet og derfor gå tapt fra cellene. Selv plasmider som ordinært har et relativt høyt kopitall som sikrer en rela-tiv stabilitet hos plasmidet har vært kjent for å bli ustabile når DNA-fragmenter som bærer gener som ikke er naturlig relatert til plasmidet innsettes deri. Since many of the plasmids used as vectors in recombinant DNA technology have been stripped of a large amount of DNA compared to the wild-type parent plasmid, they are susceptible to being unstablely inherited. This poses a serious problem since instability of a plasmid will eventually result in complete loss of the plasmid from the cells, and will in any case reduce the relative yield of plasmid-encoded gene products. This problem is particularly pronounced in large-scale production of gene products where growth of microorganisms under selection pressure, e.g. an antibiotic, is normally not feasible and often at least undesirable from an environmental point of view, and where the microorganisms are cultivated for a large number of generations. Vectors that are only present in a few copies per cell will most likely be unstablely inherited and therefore lost from the cells. Even plasmids which ordinarily have a relatively high copy number which ensures a relative stability of the plasmid have been known to become unstable when DNA fragments carrying genes which are not naturally related to the plasmid are inserted therein.

Foreliggende oppfinnelse vedrører plasmider som bærer et innsatt gen eller innsatte gener som ikke naturlig er relatert til plasmidet og som i tillegg bærer et innsatt DNA-fragment som øver en fordelende funksjon. Betegnelsen "innsatt" skal be-ty at genet eller genene eller DNA-fragmentet er blitt innført i plasmidet ved ett stadium under konstruksjonen av det endelige plasmid. Det henvises i denne forbindelse til krav 1. The present invention relates to plasmids which carry an inserted gene or inserted genes which are not naturally related to the plasmid and which additionally carry an inserted DNA fragment which performs a distributing function. The term "inserted" shall mean that the gene or genes or DNA fragment has been introduced into the plasmid at one stage during the construction of the final plasmid. In this connection, reference is made to requirement 1.

I foreliggende sammenheng betegner uttrykket "en fordelende funksjon" en funksjon som sikrer en ordnet fordeling av plasmidets molekyler ved celledeling og som kodes for av en region i et plasmid som, avhengig av den type av plasmid som uttrykker funksjonen, kan omfatte et eller flere gener. Som omtalt ovenfor, finnes slike regioner i naturlig forekommende, eller vild-type-, plasmider, men plasmider som uttrykker en Par<+->fenotype, dvs. på hvilken de fordelende gener er til stede, og som også bærer et eller flere innsatte gener som ikke naturlig er relatert til plasmidet, menes å være nye. I denne sammenheng defineres plasmider som naturlig forekommende ekstrakromosomale elementer i mikroorganismer, nemlig elementer som det er mulig å isolere som sådanne, eller derivater derav. In the present context, the expression "a distributing function" denotes a function which ensures an orderly distribution of the plasmid's molecules during cell division and which is coded for by a region in a plasmid which, depending on the type of plasmid which expresses the function, may comprise one or more genes . As discussed above, such regions are found in naturally occurring, or wild-type, plasmids, but plasmids that express a Par<+->phenotype, i.e. on which the distributing genes are present, and which also carry one or more inserted genes not naturally related to the plasmid are considered novel. In this context, plasmids are defined as naturally occurring extrachromosomal elements in microorganisms, namely elements that can be isolated as such, or derivatives thereof.

Plasmidene i henhold til oppfinnelsen kan anvendes som klonings- eller produksjonsvektorer på området rekombinant-DNA-teknologi for det formål å oppnå et stort utvalg av produkter for tekniske eller medisinske formål direkte eller indirek-te formidlet av det eller de innsatte gener, spesielt polypepti-der og proteiner eller fragmenter derav, enzymer, samt et antall ikke-proteinholdige produkter av reaksjoner med enzymer, produkter med lav molekylvekt, f.eks. hormoner, samt nukleinsyrer; produkter av eukaryotiske, spesielt pattedyr-, gener er av spesiell interesse. The plasmids according to the invention can be used as cloning or production vectors in the field of recombinant DNA technology for the purpose of obtaining a large selection of products for technical or medical purposes directly or indirectly mediated by the inserted gene(s), especially polypeptide there and proteins or fragments thereof, enzymes, as well as a number of non-proteinaceous products of reactions with enzymes, low molecular weight products, e.g. hormones, as well as nucleic acids; products of eukaryotic, especially mammalian, genes are of particular interest.

I overensstemmelse med en foretrukken utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er fordelingsfunksjonen en som, av natur, uttrykkes av en region av vill-typeresistensplasmidet RI, og derfor i det følgende referert til som en Rl- par-region♦ In accordance with a preferred embodiment of the present invention, the distribution function is one which, by nature, is expressed by a region of the wild-type resistance plasmid RI, and therefore hereinafter referred to as an Rl-par region♦

I forbindelse med oppfinnelsen er en slik region blitt funnet å forårsake delvis eller full stabilitet hos ikke bare ustabile Rl-miniplasmider som bærer et eller flere gen som ikke naturlig er relatert til plasmidet, men også hos hyppig segre-gerende plasmider som ikke er relatert til plasmid Ri som bærer et eller flere gen som ikke naturlig er relatert til plasmidet. Et annet eksempel på en spesielt verdifull fordelingsfunksjon er den som finnes på vild-typeplasmidet F (Seelke et al.> op.eit.) som også medfører en høy grad av stabilitet til resipientplasmidet. I det følgende vil det primært bli henvist til Ri Par-funks jonen, selv om det må forstås at mange av de fenomener som er assosiert med Ri Par-funksjonen også vil ha anvendelse på andre Par-funksjoner, og at den generelle idé ved foreliggende oppfinnelse i sitt brede omfang ikke er begrenset til Ri Par-funks jonen. In connection with the invention, such a region has been found to cause partial or full stability in not only unstable R1 miniplasmids carrying one or more genes not naturally related to the plasmid, but also in frequently segregating plasmids not related to plasmid Ri carrying one or more genes not naturally related to the plasmid. Another example of a particularly valuable distribution function is the one found on the wild-type plasmid F (Seelke et al.> op.eit.) which also entails a high degree of stability for the recipient plasmid. In the following, reference will primarily be made to the Ri Par function, although it must be understood that many of the phenomena associated with the Ri Par function will also apply to other Par functions, and that the general idea of the present invention in its broad scope is not limited to the Ri Par funks ion.

Det er tidligere blitt indikert at fordelingsfunksjonen til plasmid Ri øves av det såkalte EcoRl-A-fragment (kfr. Nord-str6m et al., Plasmid 4, 1980, ss. 332-49). Under forskningens forløp som førte til foreliggende oppfinnelse er det overraskende funnet at det EcoRjhA-fragment som har en lengde på ca. 19 kb (19 000 basepar) omfatter to, og bare to, distinkte regioner som medfører en Par<+->fenotype til resipientplasmidet. Disse regioner er beliggende i hver ende av EcoRl-A-fragmentet og ingen annen DNA-sekvens i EcoRl-A-fragmentet er for tiden antatt å ha noen plasmidstabiliserende funksjon. For de her omtalte formål er de to regioner blitt betegnet henholdsvis par-region A og par-region B, forkortet som henholdsvis parA og parB. It has previously been indicated that the distribution function of plasmid Ri is exercised by the so-called EcoRl-A fragment (cf. Nordstr6m et al., Plasmid 4, 1980, pp. 332-49). During the course of the research that led to the present invention, it has surprisingly been found that the EcoRjhA fragment, which has a length of approx. 19 kb (19,000 base pairs) comprises two, and only two, distinct regions that confer a Par<+-> phenotype to the recipient plasmid. These regions are located at either end of the EcoRl-A fragment and no other DNA sequence in the EcoRl-A fragment is currently thought to have any plasmid stabilizing function. For the purposes discussed here, the two regions have been designated par-region A and par-region B, abbreviated as parA and parB respectively.

Da det er fordelaktig å operere med så små DNA-fragmenter som mulig, fordi små fragmenter er lettere å innsette i plasmidet og de resulterende plasmider er lettere å transformere til vertsceller, vedrører ett aspekt av foreliggende oppfinnelse plasmider som bærer et innsatt DNA-fragment som er kortere enn EcoRl-fragmentet i plasmid Ri og inneholder en Ri par-region. Dette innsatte DNA-fragment omfatter normalt, som sin hovedkom-ponent, Ri par-region A-region, Ri par-region B-region eller både Ri par-region A og Ri par-region B. Dette betyr at vesentlig alt DNA-fragment som er innsatt i vertsplasmidet utgjøres av en av eller begge par-regionene, og resten av DNA på fragmentene er til stede primært for å tilveiebringe egnede restrik-sjonsseter, hvilket forsyner DNA-fragmentene med de ønskede ender som er lett kompatible med et tilsvarende eller kompatibelt restriksjonssete på resipientplasmidet. Slike ender kan også tilveiebringes ved hjelp av koblere. Det er imidlertid viktig å huske på at det DNA-fragment som omfatter par-region A og det DNA-fragment som omfatter par-region B.kan innføres separat og sekvensielt i det samme plasmid som så vil være fenotypisk iden-tisk med et plasmid i hvilket fenotypen ParA<+>f ParB<+> er blitt etablert ved innsettelse av par-region A og par-region B på det samme DNA-fragment. Hvis det f.eks. er ønskelig ytterligere å stabilisere et plasmid som allerede bærer en par-region, f .eks. p_arB-regionen, kan plasmidet bli avgrenset med et passende re-striks jonsenzym og et DNA-fragment som har ender som er forlikelige med dette restriksjonssete og som bærer den annen par-region, f.eks. parA-regionen, kan så bli innsatt. Den omvendte pro-sess, dvs. innsettelse, på lignende måte, av en parB-region på et plasmid som allerede bærer en parA-region, kan også anvendes. Since it is advantageous to operate with as small DNA fragments as possible, because small fragments are easier to insert into the plasmid and the resulting plasmids are easier to transform into host cells, one aspect of the present invention relates to plasmids carrying an inserted DNA fragment which is shorter than the EcoRl fragment in plasmid Ri and contains an Ri pair region. This inserted DNA fragment normally comprises, as its main component, Ri par region A region, Ri par region B region or both Ri par region A and Ri par region B. This means that essentially all DNA fragment inserted into the host plasmid consists of one or both of the paired regions, and the remainder of the DNA on the fragments is present primarily to provide suitable restriction sites, providing the DNA fragments with the desired ends that are readily compatible with a corresponding or compatible restriction site on the recipient plasmid. Such ends can also be provided by means of couplers. However, it is important to bear in mind that the DNA fragment comprising par-region A and the DNA fragment comprising par-region B can be introduced separately and sequentially into the same plasmid, which will then be phenotypically identical to a plasmid in which the phenotype ParA<+>f ParB<+> has been established by the insertion of par-region A and par-region B on the same DNA fragment. If it e.g. is desirable to further stabilize a plasmid which already carries a pair region, e.g. p_arB region, the plasmid can be delimited with an appropriate restriction enzyme and a DNA fragment having ends compatible with this restriction site and carrying the second par region, e.g. the parA region, can then be inserted. The reverse process, i.e. insertion, in a similar manner, of a parB region on a plasmid already carrying a parA region, can also be used.

I overensstemmelse med dette er interessante plasmider slike hvor det innsatte DNA-fragment som omfatter Ri par-region A og Ri par-region B har en lengde som ikke overstiger ca. 6 kb, spesielt ikke over ca. 4 kb, mer spesielt ikke over 3 kb. Når det innsatte DNA-fragment inkluderer Ri par-region A, vil det normalt ha en lengde som ikke overstiger ca. 4 kb > spesielt ik-ke over 2,5 kb, mer spesielt ikke over ca, 2 kb. Når det innsatte DNA-fragment omfatter Ri par-region B, vil det normalt ha en lengde som ikke overstiger ca. 2 kb, spesielt ikke over ca. In accordance with this, interesting plasmids are those in which the inserted DNA fragment comprising Ri par region A and Ri par region B has a length that does not exceed approx. 6 kb, especially not over approx. 4 kb, more especially not over 3 kb. When the inserted DNA fragment includes Ri par region A, it will normally have a length not exceeding approx. 4 kb > especially not over 2.5 kb, more especially not over approx. 2 kb. When the inserted DNA fragment comprises Ri par region B, it will normally have a length that does not exceed approx. 2 kb, especially not over approx.

1,5 kb, mer spesielt ikke over ca. 1 kb. Preferansen for små DNA-fragmenter av de grunner som er angitt ovenfor bør imidlertid ikke utelukke den mulighet å oppnå plasmidstabilitet ved å innsette hele EcoRl-A-fragmentet; dette kan f.eks. være aksepta-belt hvis størrelsen på plasmidet som skal stabiliseres er mindre kritisk. Hvis fragmentet innsettes i sin helhet, kan det 1.5 kb, more especially not over approx. 1 kb. However, the preference for small DNA fragments for the reasons stated above should not preclude the possibility of achieving plasmid stability by inserting the entire EcoRl-A fragment; this can e.g. be acceptable if the size of the plasmid to be stabilized is less critical. If the fragment is inserted in its entirety, it can

være fordelaktig for klassifiseringsformål å forsyne DNA-fragmentet med et gen som formidler antibiotisk resistens. Hvis imidlertid av en eller annen grunn det er ønskelig å redusere størrelsen på EcoRl-A-fragmentet, kan dette gjøres på forskjellige måter, f.eks. ved partiell restriksjon av EcoRl-A-fragmentet med restriksjon-enzymet Pstl, eller ved å kutte ut hver be advantageous for classification purposes to provide the DNA fragment with a gene that conveys antibiotic resistance. However, if for some reason it is desired to reduce the size of the EcoR1-A fragment, this can be done in various ways, e.g. by partial restriction of the EcoRl-A fragment with the restriction enzyme PstI, or by cutting out each

RI par-region fra det store fragment, og overføre hver region sekvensielt til det samme DNA-fragment som så kan innsettes i det plasmid som skal stabiliseres. RI pair region from the large fragment, and transfer each region sequentially to the same DNA fragment which can then be inserted into the plasmid to be stabilized.

De plasmider som stabiliseres i overensstemmelse med prin-sippene ved foreliggende oppfinnelse kan enten være plasmider som har en naturlig forbindelse med den fordelende region som innsettes, f.eks. Rl-miniplasmider som stabiliseres ved hjelp av en innsatt RI par-region (Rl-miniplasmider er fjernet for meget av det opprinnelige Ri-DNA og inneholder følgelig vanligvis ikke i seg selv en RI pareregion), eller de kan være plasmider som ikke har noe naturlig forhold til den fordelende funksjon. Det er interessant å merke seg at effektive fordelingsfunksjoner som er nyttige i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse er i stand til å sikre en tilfredsstillende stabilitet ikke bare for plasmider som de naturlig er relatert til, så som når det gjelder stabilisering av Rl-miniplasmider med en Ri par-region, men også hos plasmider som fordelingsfunksjonen ikke er naturlig relatert til. Et eksempel på sistnevnte er innset-telsen av en Ri par-region i et ikke-Rl plasmid, f.eks. et pMBl-plasmid eller et derivat derav, f.eks. et pBR322-plasmid eller et derivat derav (disse plasmider er vanligvis stabile, men er tilbøyelige til å bli ustabile når et eller flere gener som naturlig ikke er relatert til plasmidet, innsettes). Et annet eksempel er anvendelse av en Ri par-region for stabilisering av visse plasmid-typer som, i det minste i ett stadium under dyrkningen av bakterier som huser plasmider, har et lavt kopitall, f.eks. et kopitall på 0,5-5 kopier pr. celle, f.eks. plasmider med bredt vertsområde og lavt kopitall (plasmider som har evne til å replikere i mange forskjellige vertsstammer eller -arter; denne klasse inkluderer de såkalte "shuttle"-vektorer som har evne til å replikere i to eller flere typer av mikroorganismen) og derivater derav, f.eks. RK2. Bortsett fra RI inkluderer andre plasmider fra inkompatibilitetsgruppen IncFII som krever stabilisering f.eks. R100 og R6. Anvendelse av en Ri par-region for stabilisering av ustabile plasmid-F-derivater ligger også innen rammen for foreliggende oppfinnelse. The plasmids that are stabilized in accordance with the principles of the present invention can either be plasmids that have a natural connection with the dividing region that is inserted, e.g. Rl miniplasmids that are stabilized by an inserted RI pair region (Rl miniplasmids have too much of the original Ri DNA removed and therefore usually do not contain an RI pair region themselves), or they may be plasmids that have no natural relationship to the distributive function. It is interesting to note that efficient distribution functions useful in accordance with the present invention are able to ensure a satisfactory stability not only for plasmids to which they are naturally related, such as in the case of stabilization of R1 miniplasmids with an Ri par region, but also in plasmids to which the distribution function is not naturally related. An example of the latter is the insertion of a Ri par region in a non-Rl plasmid, e.g. a pMB1 plasmid or a derivative thereof, e.g. a pBR322 plasmid or a derivative thereof (these plasmids are usually stable, but are prone to become unstable when one or more genes naturally unrelated to the plasmid are inserted). Another example is the use of a Ri par region for the stabilization of certain plasmid types which, at least at one stage during the cultivation of bacteria harboring plasmids, have a low copy number, e.g. a copy number of 0.5-5 copies per cell, e.g. broad host range and low copy number plasmids (plasmids that have the ability to replicate in many different host strains or species; this class includes the so-called "shuttle" vectors that have the ability to replicate in two or more types of the microorganism) and derivatives thereof , e.g. RK2. Apart from RI, other plasmids from the incompatibility group include IncFII which require stabilization e.g. R100 and R6. Use of a Ri par region for stabilizing unstable plasmid F derivatives is also within the scope of the present invention.

En type av plasmider for hvilke en stabilisering A type of plasmid for which a stabilization

ved hjelp av foreliggende oppfinnelse er viktig, er kondi-sjonelle "runaway"-replikeringsplasmider, dvs. plasmider som, når vertsmikroorganismer som huser plasmidene dyrkes under visse betingelser, har et konstant lavt plasmidkopitall, og som, når mikroorganismene som huser plasmidet dyrkes under visse forskjellige betingelser, taper sin replikeringskontroll slik at plasmidkopitallet øker eksponensielt inntil vertscellen opphører å vokse. "Runaway"-replikeringsplasmider for hvilke en slik stabilisering er spesielt vital, er "run-away"-replikeringsplasmider med et kopitall som ikke overstiger ca. 3-5 kopier pr. celle, og spesielt slike plasmider hvis kopitall ikke overstiger ca. 0,5-1 kopi pr. celle (tallet 0,5 skal forstås å bety at frekvensen av replikering er mindre enn én pr. cellesyklus) når de mikroorganismer som huser plasmidene dyrkes under disse betingelser som sikrer et slikt lavt plasmidkopitall og som, når vertsmikroorganismene dyrkes under visse forskjellige betingelser sikrer et vesentlig økt plasmidkopitall, har et kopitall i området minst ca. 500-1000 kopier pr. celle. by means of the present invention is important, are conditional "runaway" replication plasmids, i.e. plasmids which, when host microorganisms harboring the plasmids are grown under certain conditions, have a constant low plasmid copy number, and which, when the microorganisms harboring the plasmid are grown under certain conditions different conditions, lose their replication control so that the plasmid copy number increases exponentially until the host cell ceases to grow. "Runaway" replication plasmids for which such stabilization is particularly vital are "runaway" replication plasmids with a copy number not exceeding about 3-5 copies per cell, and especially such plasmids whose copy number does not exceed approx. 0.5-1 copy per cell (the number 0.5 should be understood to mean that the frequency of replication is less than one per cell cycle) when the microorganisms harboring the plasmids are grown under those conditions which ensure such a low plasmid copy number and which, when the host microorganisms are grown under certain different conditions, ensure a significantly increased plasmid copy number, has a copy number in the range of at least approx. 500-1000 copies per cell.

Det lave plasmidkopitall er under visse betingelser (typisk en lav temperatur, f.eks. ca. 30°C) ønskelig når plasmider anvendes som vektorer for innsettelse av fremmede gener som koder for produkter som er delvis toksiske eller letale for vertscellen, slik som på grunn av den lave replikeringsrate hos plasmidet ved f.eks. en lav temperatur, blir genene bare uttrykt i små mengder, om i det hele tatt, slik at cellene forblir uskadet i utbredelsesstadiet til kulturen. Imidlertid resulterer, i plasmider med et så ekstremt lavt kopitall som det som er angitt ovenfor under utbredelsesstadiumbetingelser, så som voksende celler ved lav temperatur, tapet av en par-region i tap av et plasmid fra den mikrobielle populasjon med en frekvens på ca. 1 % pr. generasjon for plasmider med et kopitall som ikke overstiger 3-5 kopier pr. celle når disse dyrkes under betingelser som sikrer et så lavt kopitall. Tapsfrekvensen for plasmider med et kopitall som ikke overstiger ca. 0,5-1 kopi pr. celle er ca. 5%/celle/generasjon. Det er innlysende at uten noen fordelingsfunksjon for å stabilisere dem ville plasmidene gå tapt fra cellene før cellene hadde nådd en slik densitet i næringsmediet at det ville være økonomisk å indusere <n>runaway<n->replikering; dette er spesielt tilfelle ved produksjon i stor skala som krever mange hundre generasjoner med cellevekst for å nå produksjons-størrelseskultur. The low plasmid copy number is under certain conditions (typically a low temperature, e.g. approx. 30°C) desirable when plasmids are used as vectors for the insertion of foreign genes that code for products that are partially toxic or lethal to the host cell, such as on due to the low replication rate of the plasmid by e.g. a low temperature, the genes are expressed only in small amounts, if at all, so that the cells remain undamaged in the propagation stage of the culture. However, in plasmids with such an extremely low copy number as that indicated above under propagation stage conditions, such as growing cells at low temperature, the loss of a pair region results in the loss of a plasmid from the microbial population at a frequency of about 1% per generation for plasmids with a copy number that does not exceed 3-5 copies per cell when these are grown under conditions that ensure such a low copy number. The loss frequency for plasmids with a copy number that does not exceed approx. 0.5-1 copy per cell is approx. 5%/cell/generation. It is obvious that without any distribution function to stabilize them, the plasmids would be lost from the cells before the cells had reached such a density in the nutrient medium that it would be economical to induce <n>runaway<n->replication; this is especially the case in large-scale production that requires many hundreds of generations of cell growth to reach production-size culture.

En slik "runaway"-replikering kan gjøres kondisjonelt ved innsettelse av en regulerbar promoter oppstrøms for det eller de native replikeringskontrollgener i plasmidet (en detaljert beskrivelse av dette fenomen finnes i vår samtidige søknad nr. 84.1935. Plasmider som har en <M>runaway"-replikerings-oppførsel kan være av mange forskjellige typer, men foretrukne "runaway"-replikeringsplasmider er plasmider av Rl-type. Such "runaway" replication can be made conditional by the insertion of a regulatable promoter upstream of the native replication control gene(s) in the plasmid (a detailed description of this phenomenon can be found in our concurrent application no. 84.1935. Plasmids having a <M>runaway" -replication behavior can be of many different types, but preferred "runaway" replication plasmids are plasmids of the R1 type.

I foreliggende beskrivelse skal betegnelsen "stabilitet" In the present description, the term "stability" shall

(og beslektede termer) menes en tapsfrekvens for plasmidet fra vertscellen på mindre enn 2 x 10 -4 pr. celle pr. generasjon. (and related terms) means a loss frequency for the plasmid from the host cell of less than 2 x 10 -4 per cell per generation.

Det er faktisk mulig å oppnå plasmider som er så stabile som vild-typeplasmider, dvs. med en tapsfrekvens på mindre enn 3 x 10 ^ pr. celle pr. generasjon, hvilket tilsvarer nivået for mutasjonsrate for gener, ved inkorporering av en Par-funksjon i plasmidet. Sistnevnte tapsfrekvens's (LF) verdi er innlysende når plasmider stabiliseres av både Ri par-region A og Ri par-region B, f.eks. som når hele EcoRl-A-fragmentet er blitt innsatt i plasmidene. Indeed, it is possible to obtain plasmids which are as stable as wild-type plasmids, i.e. with a loss frequency of less than 3 x 10 ^ per cell per generation, which corresponds to the level of mutation rate of genes, by incorporating a Par function into the plasmid. The latter loss frequency (LF) value is obvious when plasmids are stabilized by both Ri par region A and Ri par region B, e.g. as when the entire EcoRl-A fragment has been inserted into the plasmids.

Som nevnt ovenfor, er imidlertid Par<+->fenotypen av plasmid RI, blitt lokalisert til hver separat par-region på EcoRl-A-fragmentet. As mentioned above, however, the Par<+> phenotype of plasmid RI has been localized to each separate par region on the EcoRl-A fragment.

Det er funnet at hver av disse par-regioner utøver en stabiliserende effekt på ustabile plasmider, hvilket kan defineres som et plasmid som mangler en stabiliserende, eller fordelende, funksjon. Slike plasmider som fenotypisk er Par går vanligvis tapt fra vertscellen med høyere eller lavere frekvens; således går f.eks. plasmid Rl-derivater som er fjernet fra par-regionen, tapt fra vertscellen med en frekvens på ca. 1,5 x 10 -2 pr. celle pr. generasjon. Likeledes går plasmid pl5-derivater, som er Par — tapt med en frekvens på ca. 1 x 10 —2/celle/generasjon, og noen plasmid pMBl (pBR322)-derivater (f.eks. det som er beskrevet i eksempel 3.3) kan gå tapt med en frekvens på ca. 6 x 10 ^ I celle/generasjon. Motsatt har Rl-plasmider som er stabilisert med enten parA eller parB alene en LF-verdi på ca. 10 -4 pr. celle pr. generasjon, tilsvarende en 100 gangers stabilisering når et DNA-fragment som bærer en av disse par-regioner innsettes i en ustabil vektor; tallene for et tilsvarende pl5-derivat er It has been found that each of these pair regions exerts a stabilizing effect on unstable plasmids, which can be defined as a plasmid lacking a stabilizing, or distributing, function. Such plasmids that are phenotypically Par are usually lost from the host cell at a higher or lower frequency; thus e.g. Plasmid R1 derivatives removed from the par region are lost from the host cell at a frequency of approx. 1.5 x 10 -2 per cell per generation. Likewise, plasmid pl5 derivatives, which are Par — are lost at a frequency of approx. 1 x 10 -2 /cell/generation, and some plasmid pMB1 (pBR322) derivatives (eg that described in Example 3.3) can be lost at a frequency of approx. 6 x 10 ^ I cell/generation. Conversely, R1 plasmids that are stabilized with either parA or parB alone have an LF value of approx. 10 -4 per cell per generation, corresponding to a 100-fold stabilization when a DNA fragment carrying one of these pair regions is inserted into an unstable vector; the numbers for a corresponding pl5 derivative are

-4 -6 -4 -6

ca. 8 x 10 (Par A+) , 1 x 10 (Par B+), og tallene for et tilsvarende pMBl-derivat er 5 x 10~<5> (Par B+). Plasmider som bærer både par A- og par B-regionen har en LF-verdi på tilnærmet 10 <6> pr. celle pr. generasjon, eller en 10<4> gangers stabilisering. For lett henvisning er resultatene for stabiliserte og ustabile replikoner fra forskjellig opprinnelse vist i tabell 1. Dette indikerer at hver par-region virker uavhengig av den annen, at p_ar-r eg ionene er tilnærmet like effektive med hensyn til å stabilisere minst Ri- og pl5-plasmider og at deres virkning eller effekt er kumulativ. Dette funn kan benyttes ved bestemmelse av den grad som et ustabilt plasmid trenger å bli stabilisert til. Hvis en mindre drastisk stabilisering kreves, dvs. hvis det anslås at plasmidet som skal stabiliseres ikke er overdrevent ustabilt (med en LF-verdi på mindre enn 10 -2/celle/generasjon), kan det være tilstrekkelig å innsette et DNA-fragment som inneholder én av par-regionene i den hensikt å oppnå tilfredsstillende stabilitet, dvs. å forhindre et gradvis tap av plasmidet fra en populasjonsproduksjon i stor skala av bakterier over flere hundre generasjoner. På den annen side, hvis plasmidet er svært ustabilt (med en LF-verdi på about. 8 x 10 (Par A+), 1 x 10 (Par B+), and the figures for a corresponding pMB1 derivative are 5 x 10~<5> (Par B+). Plasmids carrying both the par A and par B region have an LF value of approximately 10 <6> per cell per generation, or a 10<4>-fold stabilization. For easy reference, the results for stabilized and unstable replicons from different origins are shown in Table 1. This indicates that each par region acts independently of the other, that the p_ar-r reg ions are approximately equally effective in stabilizing at least Ri- and pl5 plasmids and that their action or effect is cumulative. This finding can be used when determining the degree to which an unstable plasmid needs to be stabilized. If a less drastic stabilization is required, i.e. if it is estimated that the plasmid to be stabilized is not excessively unstable (with an LF value of less than 10 -2 /cell/generation), it may be sufficient to insert a DNA fragment which contains one of the pair regions in order to achieve satisfactory stability, i.e. to prevent a gradual loss of the plasmid from a large-scale population production of bacteria over several hundred generations. On the other hand, if the plasmid is highly unstable (with an LF value of

-2 mer enn 10 ), kan det være nødvendig eller i det minste fordelaktig å innsette begge par-regioner i den hensikt å sikre eks-trem stabilitet hos plasmidene. -2 more than 10), it may be necessary or at least advantageous to insert both pair regions in order to ensure extreme stability of the plasmids.

Disse målbare LF-verdier kan benyttes når plasmider av hvilke som helst av de typer som er definert ovenfor skal anvendes som vektorer ved produksjon av genprodukter, og bør - - således inneholde minst ett gen som ikke har et naturlig forhold til plasmidet. Et ytterligere aspekt ved oppfinnelsen er således - i henhold til krav 12 - en fremgangsmåte for fremstilling av et gen-produkt av plasmid-DNA hvor bakterier som huser et par-stabilisert plasmid med hvilke som helst av de ovenfor beskrevne karakteristikker dyrkes og genproduktet av plasmidet innhøstes fra den bakterielle kultur. Kultiveringen utføres i og for seg passende ved å anvende konvensjonelle teknikker inklusive konvensjonelle næringsmedier som er kjent for å være optimale for de bakteriearter som kommer på tale. Det er verd å merke seg at på grunn av stabiliseringen trenges ikke en spesifikk sammensetning av næringsmediet. Dessuten utføres innhøstingen av genproduktet i overensstemmelse med velkjente metoder tilpasset iden-titeten og egenskapene til det spesielle genprodukt som fremstil-les, egenskapene til vertsbakterien osv. Dyrkningen fortsettes i minst 100 generasjoner for bakteriene; ved produksjon i stor skala kan antall cellegenerasjoner som trenges for å utbre bakteriene overstige 100 generasjoner. Under disse omstendigheter vil LF-verdien til plasmidet bli selektert slik ved nærvær av en pagregion deri at tapet av plasmidet er mindre enn 2 x 10 -4/celle/generasjon. Denne LF-verdi vil vanligvis være oppnåelig ved hjelp av én par-region alene. I noen tilfeller foretrekkes det imidlertid å oppnå LF-verdier for plasmidet på mindre enn 10 ^/celle/generasjon, spesielt mindre enn 5 x 10 ^/celle/generasjon. These measurable LF values can be used when plasmids of any of the types defined above are to be used as vectors in the production of gene products, and should - - thus contain at least one gene that does not have a natural relationship with the plasmid. A further aspect of the invention is thus - according to claim 12 - a method for producing a gene product of plasmid DNA where bacteria harboring a pair-stabilized plasmid with any of the characteristics described above are cultivated and the gene product of the plasmid is harvested from the bacterial culture. The cultivation is carried out appropriately in and of itself by using conventional techniques including conventional nutrient media which are known to be optimal for the bacterial species in question. It is worth noting that, due to the stabilization, a specific composition of the nutrient medium is not needed. Moreover, the harvesting of the gene product is carried out in accordance with well-known methods adapted to the identity and properties of the particular gene product being produced, the properties of the host bacteria, etc. Cultivation is continued for at least 100 generations for the bacteria; in large-scale production, the number of cell generations needed to propagate the bacteria can exceed 100 generations. Under these circumstances, the LF value of the plasmid will be selected such that in the presence of a pag region therein, the loss of the plasmid is less than 2 x 10 -4/cell/generation. This LF value will usually be achievable using one pair region alone. In some cases, however, it is preferred to achieve LF values for the plasmid of less than 10 2 /cell/generation, especially less than 5 x 10 2 /cell/generation.

Selv om disse svært lave LF-verdier i noen tilfeller kan være oppnåelige ved innsettelse av bare én par-region (spesielt Ri par-region B), vil de vanligvis trenge nærvær av begge Ri par-regioner. Although these very low LF values may in some cases be achievable by inserting only one pair region (especially Ri pair region B), they will usually require the presence of both Ri pair regions.

Det er en spesiell fordel ved plasmidene i henhold til oppfinnelsen at ingen spesielle mutanter eller stammer trenges for å sikre plasmidopprettholdelse. Således kan hvilke som helst av arter og stammer av bakterier som har evne til å huse et slikt plasmid anvendes, feks. gram-negative bakterier. Et spesifikt eksempel på en bakterie i hvilken plasmider i henhold til foreliggende oppfinnelse har evne til å replikere og opprettholde sin stabilitet er Escherichia coli. It is a particular advantage of the plasmids according to the invention that no special mutants or strains are needed to ensure plasmid maintenance. Thus, any of the species and strains of bacteria capable of harboring such a plasmid can be used, e.g. gram-negative bacteria. A specific example of a bacterium in which plasmids according to the present invention have the ability to replicate and maintain their stability is Escherichia coli.

Som nevnt, utgjøres i alt vesentlig alt av det DNA-fragment som innsettes i vertsplasmidet av en av to par-regioner, og resten av DNA er til stede for å tilveiebringe passende restrik-sjonsseter for innsettelse i et kompatibelt restriksjonssete på resipientplasmidet. Det innsatte DNA-fragment omfattende RI par-region A og Ri par-region B bør, i henhold til dette prinsipp, As mentioned, substantially all of the DNA fragment inserted into the host plasmid is made up of one of two paired regions, and the rest of the DNA is present to provide suitable restriction sites for insertion into a compatible restriction site on the recipient plasmid. The inserted DNA fragment comprising RI pair region A and Ri pair region B should, according to this principle,

ha en lengde som ikke overstiger ca. 6 kb, spesielt ikke over ca. 4 kb, mer spesielt ikke over 3 kb. Når DNA-fragmentet inkluderer Ri par-region A, vil det normalt ha en lengde som ikke overstiger ca. 4 kb, spesielt ikke over 2,5 kb, mer spesielt ikke over ca. 2 kb. Når DNA-fragmentet omfatter Ri par-region B vil det normalt ha en lengde som ikke overstiger ca. 2 kb, spesielt ikke over ca. 1,5 kb, mer spesielt ikke over ca. 1 kb. Det er overraskende funnet at slike små, og derfor lett innsettbare, DNA-fragmenter har bevart sin stabiliserende funksjon, da parA-regionen, ved restriksjonsenzymkartlegging, er blitt innsnevret ned til en region med en lengde på ca. 1800 bp (basepar), og parB-regionen er blitt innsnevret til ca. 900 bp. Det er mulig at genet eller genene faktisk tilveiebringer en Par<+->fenotype som er enda mindre. have a length that does not exceed approx. 6 kb, especially not over approx. 4 kb, more especially not over 3 kb. When the DNA fragment includes Ri par region A, it will normally have a length that does not exceed approx. 4 kb, especially not over 2.5 kb, more especially not over approx. 2 kb. When the DNA fragment comprises Ri par region B, it will normally have a length that does not exceed approx. 2 kb, especially not over approx. 1.5 kb, more especially not over approx. 1 kb. It has surprisingly been found that such small, and therefore easily inserted, DNA fragments have preserved their stabilizing function, as the parA region, by restriction enzyme mapping, has been narrowed down to a region with a length of approx. 1800 bp (base pairs), and the parB region has been narrowed to approx. 900 bp. It is possible that the gene or genes actually confer an even smaller Par<+->phenotype.

Et alvorlig problem ved konstruksjon av hybdridplasmider med en Par<+->fenotype har vært mangelen på en hurtig og enkel metode for klassifisering for denne fenotype. Generelt kan de riktige hybridplasmider bli identifisert ved den Par<+->fenotype som resulterer i høy stabilitet av plasmidet under vekst av plasmidet uten seleksjonstrykk. Imidlertid er denne type klassifisering brysom, og i alle fall er det bare relevant hvis opphavsplasmidet er ustabilt nedarvet. Alternative klassifiseringsme-toder er nå utviklet, hvilket fremgår av det følgende. A serious problem in the construction of hybrid plasmids with a Par<+> phenotype has been the lack of a rapid and simple method of classification for this phenotype. In general, the correct hybrid plasmids can be identified by the Par<+> phenotype that results in high stability of the plasmid during growth of the plasmid without selection pressure. However, this type of classification is cumbersome, and in any case it is only relevant if the parent plasmid is unstable inherited. Alternative classification methods have now been developed, which is evident from the following.

a) Klassifisering for innsettelse av parA-t—fragmenter a) Classification for insertion of parA-t fragments

Hvis to forskjellige plasmider (fra separate uforlikelig-hetsgrupper) som begge bærer p_arA+-regionen er til stede i den samme celle, vil de fordrive hverandre med en viss frekvens (Lnkompatibilitet), mest sannsynlig fordi de konkurrerer om forde-lingsapparaturen i cellen. Denne type par-formidlet inkompatibili-tetsfenotype kan utnyttes ved klassifisering på par-h<y>brider♦ If two different plasmids (from separate incompatibility groups) both carrying the p_arA+ region are present in the same cell, they will displace each other with some frequency (Lncompatibility), most likely because they compete for the distribution apparatus in the cell. This type of pair-mediated incompatibility phenotype can be exploited by classification on pair hybrids♦

For eksempel kan et ParA<+->plasmid transformeres til en Alac For example, a ParA<+->plasmid can be transformed into an Alac

E. coli stamme (f.eks. CSH50) som huser et annet plasmid som bærer lac-genene og parA<+->regionen. Normalt vil det innkommende plasmid utøve par<+->formidlet inkompatibilitet mot det residerende ParA<+->plasmid. På grunn av Lac<+->fenotypen til det residerende plasmid påvises en slik inkompatibilitet lett hvis transformanter utvelges på basis av en resistensmarkør som ba-re finnes på det innkommende plasmid, mens nærvær eller fravær av det residerende plasmid registreres på indikatorsubstrater, f.eks. McConkey-laktoseplater. Replikkutplatingskolonier fra slike plater til nye lignende plater vil avsløre endog lave ni-våer av avskaffelse fra det residerende plasmid som farveløse kolonier som viser forekomst av Lac~-celler. En ytterligere stabilitetstest eller en mer utstrakt inkompabilitetstest kan kreves for å teste egenskapene til potensielle parA<+->hybridplasmider. På denne måte er det mulig - ved å involvere den riktige (forlikelige) kombinasjon av innkommende og residente plasmider - hurtig å klassifisere på innsettelse av Inc<+> (Par<+>)-fragmenter i ethvert plasmid hva enten det er ustabilt eller stabilt. E. coli strain (eg CSH50) harboring another plasmid carrying the lac genes and the parA<+->region. Normally, the incoming plasmid will exert Par<+->mediated incompatibility against the resident ParA<+->plasmid. Due to the Lac<+-> phenotype of the resident plasmid, such incompatibility is easily detected if transformants are selected on the basis of a resistance marker found only on the incoming plasmid, while the presence or absence of the resident plasmid is recorded on indicator substrates, e.g. e.g. McConkey Lactose Plates. Replica plating colonies from such plates to new similar plates will reveal even low levels of elimination from the resident plasmid as colorless colonies showing the presence of Lac~ cells. An additional stability test or a more extensive incompatibility test may be required to test the properties of potential parA<+->hybrid plasmids. In this way, it is possible - by involving the right (compatible) combination of incoming and resident plasmids - to quickly classify on the insertion of Inc<+> (Par<+>) fragments in any plasmid whether it is unstable or stable .

b) Klassifisering på innsettelse av parB<+->fragmenter b) Classification on the insertion of parB<+->fragments

Siden det også er blitt vist at to urelaterte plasmider Since it has also been shown that two unrelated plasmids

som begge bærer parB<+->reqionen er inkompatible med hverandre, passer den samme klassifiseringsstrategi som beskrevet for konstruksjon av p_arA<+->hybrider på konstruksjonene av parB<+->hybrider. that both carry the parB<+->reqion are incompatible with each other, the same classification strategy as described for the construction of p_arA<+->hybrids applies to the constructions of parB<+->hybrids.

c) Klassifisering på innsettelse av p_arA+-, B+-fragmenter c) Classification on insertion of p_arA+, B+ fragments

Ved siden av å ha potensialet angående avskaffelse av både Next to having the potential regarding the abolition of both

parA+ og p_arB+-hybridpla smider i overensstemmelse med de ovenstå-ende beskrivelser, tillater EcoRl-A-fragmentet med Tn5-inset-telsen en direkte seleksjon (Km ) for plasmider som bærer parA+, parB+-fragmentet. således, til tross for den store størrelse på fragmentet, selekteres det lett for endog svært få hybrider. Et mindre DNA-fragment omfattende begge par+-regioner vil naturligvis også utøve inkompabilitet mot både parA<+-> og parB<+->plasmider. parA+ and p_arB+ hybrid plasmids in accordance with the above descriptions, the EcoRl-A fragment with the Tn5 insert allows a direct selection (Km ) for plasmids carrying the parA+, parB+ fragment. thus, despite the large size of the fragment, it is easily selected for even very few hybrids. A smaller DNA fragment comprising both par+ regions will naturally also exert incompatibility against both parA<+-> and parB<+-> plasmids.

Det henvises til tegningen, hvor: Reference is made to the drawing, where:

Fig. 1-5 og 7-17 viser restriksjonskart for plasmidene Figs 1-5 and 7-17 show restriction maps for the plasmids

som er beskrevet i eksemplene, as described in the examples,

Fig. 6 viser et detaljert kart (ikke trukket opp i måle-stokk) for Pstl-D-fragmentet fra Ri, og Fig. 18 viser stabilitetskurver av forskjellige typer av replikon som bærer forskjellige par-regioner sammenlignet med Par -replikoner. Fig. 6 shows a detailed map (not drawn to scale) of the Pstl-D fragment from Ri, and Fig. 18 shows stability curves of different types of replicon carrying different Par regions compared to Par replicons.

I figurene 1-5 og 7-17 er det vist lineære restriksjonskart for de plasmider som er beskrevet i eksemplene, hvor fenotypene og genotypene av plasmidene er indikert over den horisontale linje som betegner opphavsplasmidet. Således representerer parA én av regionene til plasmid Ri som sikrer plasmidopprettholdelse, parB representerer den annen region i plasmid Ri som sikrer plasmidopprettholdelse; icel representerer et gen som formidler immunitet til colicin El; ori eller oriV representerer opprinnelsen til plasmidreplikering, bla representerer et gen som koder for resistens overfor ampicillin; IR representerer en invertert gjentagelsesstruktur på Tn5; Km representerer kana- Figures 1-5 and 7-17 show linear restriction maps for the plasmids described in the examples, where the phenotypes and genotypes of the plasmids are indicated above the horizontal line denoting the plasmid of origin. Thus parA represents one of the regions of plasmid Ri which ensures plasmid maintenance, parB represents the other region of plasmid Ri which ensures plasmid maintenance; icel represents a gene that mediates immunity to colicin E1; ori or oriV represents the origin of plasmid replication, bla represents a gene encoding resistance to ampicillin; IR represents an inverted repeat structure of Tn5; Km represents cana-

R R R R

mycin-resistens; Cm representerer kloramfenikolresistens; Ap representerer ampicillinresistens; Tc p representerer tetracyklin-resistens; repA representerer et gen som koder for et protein som kreves for Rl-replikering; lacZ, lacY og lacA representerer det innsatte lac-operon for hvilket lacZ koder for 8-galaktosidase, lacY koder for permease og lacA koder for transacetylase; repA- lacZ' representerer en fusjon mellom repA- og lacZ-genene; copB representerer et gen som koder for et polypeptid som re-presserer transkripsjon fra repA-promoteren (i Rl-plasmider); copA representerer et gen som koder for et RNA-molekyl som in-hiberer translasjon av RepA-RNA; clg^ representerer et gen som koder for en temperaturfølsom X-repressor som kontrollerer XPR-promoteraktivitet; Pdeo representerer deo-promoteren. Pilen betegner retningen på transkripsjonen og "trianglene" betegner innsettelser av DNA. De skraverte arealer og blanke arealer betegner innsatte gener; den stiplete linje betegner en stryk-ning . mycin resistance; Cm represents chloramphenicol resistance; Ap represents ampicillin resistance; Tc p represents tetracycline resistance; repA represents a gene encoding a protein required for R1 replication; lacZ, lacY and lacA represent the inserted lac operon for which lacZ codes for 8-galactosidase, lacY codes for permease and lacA codes for transacetylase; repA-lacZ' represents a fusion between the repA and lacZ genes; copB represents a gene encoding a polypeptide that represses transcription from the repA promoter (in R1 plasmids); copA represents a gene that codes for an RNA molecule that inhibits translation of RepA RNA; clg^ represents a gene encoding a temperature-sensitive X repressor that controls XPR promoter activity; Pdeo represents the deo promoter. The arrow denotes the direction of transcription and the "triangles" denote insertions of DNA. The shaded areas and blank areas denote inserted genes; the dashed line denotes a deletion.

Under den horisontale linje er setene for restriksjonsenzymer vist i hvilke E betegner EcoRl; P betegner Pstl; B^ betegner Below the horizontal line, the sites of restriction enzymes are shown in which E denotes EcoRl; P denotes Pstl; B^ denotes

BamHI med unntagelse av i figurene 1 og 5 hvor, utenfor BamHI with the exception of in Figures 1 and 5 where, outside

Tn5 DNA, den betegner Ball; H1 betegner Hpal; Ev betegner EcoRV; B2 betegner Bglll; S1 betegner Sali; H3 betegner Hindlll, og C betegner Clal. Tn5 DNA, it denotes Ball; H1 denotes HpaI; Ev denotes EcoRV; B2 denotes Bglll; S1 denotes Sali; H3 denotes HindIII, and C denotes ClaI.

I fig. 6 er Pstl-D-fragmentet kartlagt videre; tallene over den horisontale linje indikerer antall basepar mellom re-striks jonssetene . Under den horisontale linje er setene for re-striks jonsenzymene vist i hvilke R1 betyr Rsal; P betyr Pstl; In fig. 6, the Pstl-D fragment is mapped further; the numbers above the horizontal line indicate the number of base pairs between the re-stress ion sites. Below the horizontal line, the sites for the re-strict ion enzymes are shown in which R1 means Rsal; P stands for Pstl;

og betyr Hpal. and means Hpal.

I fig. 18 er stabilitetskurver vist for Ri-, pl5- og pBR322-derivatene som er konstruert og testet i eksemplene. In fig. 18, stability curves are shown for the Ri, p15 and pBR322 derivatives constructed and tested in the Examples.

Hver kurve representerer gjennomsnittet av minst to flytende kulturer som er fulgt i mer enn 100 generasjoner. Det fremgår av figuren at plasmider som inneholder både parA og parB er ekstremt stabilt nedarvet, hvilket også er tilfelle hos plasmider som inneholder parB alene og med mini-Rl-plasmider stabilisert med parA alene. Each curve represents the average of at least two liquid cultures followed for more than 100 generations. It appears from the figure that plasmids containing both parA and parB are extremely stably inherited, which is also the case with plasmids containing parB alone and with mini-Rl plasmids stabilized with parA alone.

Det fremgår av kurvene for Par -plasmider at innledningsvis avtar frekvensen av plasmidbærende celler eksponensielt, som ventet, på grunn av en konstant tapsrate. I senere stadier viser frekvensen av plasmidbærende celler seg å avta hurtigere (antydet med heltrukne linjer) på grunn av en noe hurtigere vekstrate hos plasmidfrie celler. Den stiplete linje indikerer kurven som er justert med hensyn til denne hurtigere vekstrate for å vise den aktuelle tapsfrekvens. It appears from the curves for Par plasmids that initially the frequency of plasmid-bearing cells decreases exponentially, as expected, due to a constant loss rate. In later stages, the frequency of plasmid-carrying cells is shown to decrease more rapidly (indicated by solid lines) due to a somewhat faster growth rate of plasmid-free cells. The dashed line indicates the curve adjusted for this faster growth rate to show the current rate of loss.

I motsetning til dette går plasmider som er fenotypisk Par" tapt med en frekvens på 1,5 x 10 /celle/generasjon for Rl-plas--2 -3 mider, 1 x 10 /celle/generasjon for pl5-plasmider og 6 x 10 /celle/generasjon for noen pBR322-plasmider, og et eksempel på dette er beskrevet i eksempel 3.3. Faktisk er tapsfrekvensene for pl5 Par - og pBR322 Par -derivatene overraskende høye når kopitallene til disse vektorer betraktes. For eksempel er kopitallet for pl5 av størrelsesorden 15-20 pr. celle, hvilket forut-sier en tapsrate på 10 —9/celle/generasjon hvis binominell fordeling av plasmidene antas. Ikke desto mindre forklares den ob-serverte høye tapsrate lett ved det faktum at pl5-replikoner danner recA-avhengige kointegrater, antagelig på grunn av mangelen på en loxP-1ignende oppløsningsfunksjon (Austin et al., In contrast, plasmids that are phenotypic Par" are lost at a frequency of 1.5 x 10 /cell/generation for R1 plasmids, 2-3 mides, 1 x 10 /cell/generation for pl5 plasmids, and 6 x 10 /cell/generation for some pBR322 plasmids, and an example of this is described in Example 3.3. In fact, the loss frequencies for the pl5 Par and pBR322 Par derivatives are surprisingly high when the copy numbers of these vectors are considered. For example, the copy number of pl5 of of the order of 15-20 per cell, which predicts a loss rate of 10 -9 /cell/generation if binomial distribution of the plasmids is assumed.Nevertheless, the observed high loss rate is easily explained by the fact that pl5 replicons form recA- dependent cointegrates, presumably due to the lack of a loxP-1ignifying resolution function (Austin et al.,

Cell 25, 1981, ss.729-36). Også pBR322-derivater er kjent for Cell 25, 1981, pp. 729-36). Also pBR322 derivatives are known

å danne kointegrater, og når kopitallet avtar på grunn av f.eks. store, klonede fragmenter, blir resultatet en betydelig ustabilitet. to form cointegrates, and when the copy number decreases due to e.g. large, cloned fragments, the result is significant instability.

MATERIALER OG METODER MATERIALS AND METHODS

Den 3tamme av Escherichia coli K-12 som ble brukt, var CSH50 (A pro- lac, rpsL; se J. Miller: "Experiments in Molecular Genetics", Cold Spring Harbor, New York, 1972). Flere plasmider og bakteriofager ble brukt (tabell 2). The strain of Escherichia coli K-12 used was CSH50 (A prolac, rpsL; see J. Miller: "Experiments in Molecular Genetics", Cold Spring Harbor, New York, 1972). Several plasmids and bacteriophages were used (Table 2).

De eksperimentelle teknikker som ble brukt var standardtek-nikker som anvendes på områdene mikrobiell genetikk (J. Miller: "Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor, New York, 1972) og genetisk manipulasjon (Davis, Botstein og Roth: "A Manual for Genetic Engineering, Advanced Bacterial Genetics", Cold Spring Harbor, New York, 1980). The experimental techniques used were standard techniques used in the fields of microbial genetics (J. Miller: "Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor, New York, 1972) and genetic manipulation (Davis, Botstein and Roth: "A Manual for Genetic Engineering, Advanced Bacterial Genetics", Cold Spring Harbor, New York, 1980).

Alle celler ble dyrket i LB-medium (Bertani,"J. Bact" 62, 1951, s. 293) med 0,2 % glukose og 1 ug/ml tiamin, eller A+B-minimal^mediumy (Clark og Måløe,"J. Mol. Biol.", 23, 1967, s. 99) supplert med 0,2 % glukose og 1 % kasaminosyrer. De plater som ble anvendt var LA-plater inneholdende LB-medium og 1,5 % agar. All cells were grown in LB medium (Bertani, "J. Bact" 62, 1951, p. 293) with 0.2% glucose and 1 µg/ml thiamine, or A+B minimal^mediumy (Clark and Måløe, "J. Mol. Biol.", 23, 1967, p. 99) supplemented with 0.2% glucose and 1% casamino acids. The plates used were LA plates containing LB medium and 1.5% agar.

McConkey-laktose-indikatorplater ble fremstilt som anbefalt av produsenten, og X-gal-plater ble fremstilt ved tilsetning av 20-40 u<g>/ ml av 5-brom-4-klor-indolyl-/3-D-galaktosid til A+B-minimal-medium supplert med 0,2 % glukose og 1 nq/ ml tiamin. McConkey lactose indicator plates were prepared as recommended by the manufacturer, and X-gal plates were prepared by adding 20-40 µg/ml of 5-bromo-4-chloro-indolyl-/3-D-galactoside to A+B minimal medium supplemented with 0.2% glucose and 1 nq/ml thiamine.

Fysikokjemikalske metoder Physicochemical methods

Det ble fremstilt klare lysater i henhold til den metode som er beskrevet av Clewell og Helinski, "Proe. Nati. Acad. Sei.", USA 62, 1969, ss. 1159-66. Clear lysates were prepared according to the method described by Clewell and Helinski, "Proe. Nati. Acad. Sei.", USA 62, 1969, p. 1159-66.

Fremstilling i liten skala av plasmid-DNA ble utført ved metoden til Birnboim et al., "Nucl. Acids Res." 7, 1979, ss. 1513-23. Small-scale preparation of plasmid DNA was carried out by the method of Birnboim et al., "Nucl. Acids Res." 7, 1979, pp. 1513-23.

Fremstilling i stor skala og analyse av plasmid-DNA ble utført ved anvendelse av farvestoff-oppdrifts-densitetgradient-sentrifugering i henhold til Stougaard og Molin, "Anal. Bio-chem." 118, 1981, s. 181. Large-scale production and analysis of plasmid DNA was performed using dye-buoyancy-density gradient centrifugation according to Stougaard and Molin, "Anal. Bio-chem." 118, 1981, p. 181.

Polyakrylamidgel-elektroforese og agarosegel-elektroforese av DNA-preparater ble utført i det vesentlige som beskrevet av Molin og Nordstr6m, "Methods in Plasmid Biology", Odense Universitet 1982. Polyacrylamide gel electrophoresis and agarose gel electrophoresis of DNA preparations were performed essentially as described by Molin and Nordstr6m, "Methods in Plasmid Biology", Odense University 1982.

Restriksjonsendonukleasene ble anvendt i overensstemmelse med de forskrifter som er tilveiebragt av produsenten ved 37°C. Dobbelte og tredobbelte digereringer ble utført ved å starte med det enzym som krever den laveste saltkonsentrasjon og deretter justere med ytterligere puffer før tilsetning av det neste enzym, re med ytterligere puffer før tilsetning av det neste enzym. The restriction endonucleases were used according to the instructions provided by the manufacturer at 37°C. Duplicate and triplicate digestions were performed by starting with the enzyme requiring the lowest salt concentration and then adjusting with additional buffer before adding the next enzyme, again with additional buffer before adding the next enzyme.

Behandling med exonuklease Ba131 ble utført som følger: 0,1 enhet av Bal31 ble tilsatt til 50 pg lineær DNA, og det ble tatt prøver ved 1', 2', 4', 8', 16', 32' og 60' til 60 mM EDTA, ekstrahert med fenol, etanol-utfelt og resuspendert i 20 ul TE puffer. Halvparten av de 20 Ml ble digerert med det aktuelle restriksjonsenzym utsatt for agarosegelelektroforese for å bestemme gjennomsnittsstørrelsen på de fjernede DNA-fjerninger. Til den annen halvpart ble den aktuelle kobler tilsatt og bland-ingen ligert i 48 timer med et overskudd av T4 DNA-ligase. Treatment with exonuclease Ba131 was performed as follows: 0.1 unit of Bal31 was added to 50 pg of linear DNA, and samples were taken at 1', 2', 4', 8', 16', 32' and 60' to 60 mM EDTA, extracted with phenol, ethanol-precipitated and resuspended in 20 µl TE buffer. Half of the 20 µl was digested with the appropriate restriction enzyme subjected to agarose gel electrophoresis to determine the average size of the removed DNA fragments. To the other half, the appropriate linker was added and the mixture was ligated for 48 hours with an excess of T4 DNA ligase.

Ligering av avgrenset plasmid-DNA ble utført som anbefalt av produsenten med unntagelse av "blunt end"-ligering, hvor et overskudd av T4 DNA-ligase og ATP ble tilsatt. Ligation of capped plasmid DNA was performed as recommended by the manufacturer with the exception of "blunt end" ligation, where an excess of T4 DNA ligase and ATP was added.

Mikrobiologiske metoder Microbiological methods

Fordelingstest I: Konstruksjon av Lac<+->vektorer gjorde det mulig å bestemme Par<+->fenotypen av et plasmid simpelthen Distribution test I: Construction of Lac<+->vectors made it possible to determine the Par<+->phenotype of a plasmid simply

ved å streke opp på ikke-selektive McConkey-laktose-plater eller X-Gal-plater. Bakterier (A lac) som huser disse plasmider formidler en Lac<+->fenotype som lett registreres som farvede kolonier på indikatorplatene, mens plasmidfrie celler har en Lac - fenotype og fremtrer som farveløse kolonier. by streaking on non-selective McConkey-lactose plates or X-Gal plates. Bacteria (A lac) harboring these plasmids convey a Lac<+-> phenotype which is easily registered as colored colonies on the indicator plates, while plasmid-free cells have a Lac - phenotype and appear as colorless colonies.

Fordelingstest II: (Anvendt for Lac -plasmider): En koloni fra en selektiv plate (en plate inneholdende et antibiotikum) ble streket opp på en annen selektiv plate. Fra denne plate ble én koloni streket opp på en LA-plate slik at det skul-le danne seg enkeltkolonier. Fra LA-platen ble tilnærmet 10 kolonier suspendert i 1 ml av 0,9 % av NaCl til en fortynning henholdsvis 10 og 10 . 0,1 ml av de 10 - og 10 - fortynninger ble bredt ut på LA-plater. Fra disse plater ble resistensmønsteret for 50 kolonier (200 kolonier hvis svak ustabilitet forventes) testet på de aktuelle selektive plater. Tapsfrekvensen (LF-verdi) beregnes deretter på basis av føl-gende formel: Distribution test II: (Used for Lac plasmids): A colony from a selective plate (a plate containing an antibiotic) was streaked onto another selective plate. From this plate, one colony was streaked onto an LA plate so that single colonies would form. From the LA plate, approximately 10 colonies were suspended in 1 ml of 0.9% NaCl to a dilution of 10 and 10 respectively. 0.1 ml of the 10 - and 10 - dilutions were spread on LA plates. From these plates, the resistance pattern of 50 colonies (200 colonies if slight instability is expected) was tested on the relevant selective plates. The loss frequency (LF value) is then calculated on the basis of the following formula:

hvor v er frekvensen hos plasmid-bærende celler og hvor det antas at én koloni vokser i 27 generasjoner. Iboende i denne metode er en stor statistisk fluktuasjon. Fordelingstest III: Kvantitative målinger av stabiliteten til Lac<+-> og Lac~-plasraider. Én komplett koloni ble tatt fra en selektiv plate og resuspendert i 1 ml av 0/9 % av NaCl til 8 —3 en konsentrasjon av 10 celler/ml. 2x0,1 ml av 10 -fortynningen ble anvendt for å inokulere 2x10 ml av LB-medium, og in-okuleringen ble utført ved 30°C under rysting. Ved en celle-densitet på ca. 5 x 10 o celler/ml ble kulturene fortynnet 10 4 og 10 5 ganger. 0,1 ml av 10 4 -fortynningen (5 x 10 3 celler) ble anvendt for å inokulere 10 ml friskt LB-medium, og 0,4 ml av 10^-fortynningen ble bredt ut på McConkey-laktose-plater, og platene ble inokulert ved 30°C natten over. Fortynningen fra 5 x 10 8 /ml til 5 x 10 2/ml tilsvarer 20 generasjoners vekst (2^°), så endringen i frekvensen til plasmidbærende celler fra én fortynning til den neste tilsvarer den som inntreffer under 20 generasjoners vekst. Mer generelt kan LF-verdien beregnes som følger: hvor og v2 er frekvensen til plasmidbærende celler etter henholdsvis g^ og g2 generasjoner, og LF er tapsfrekvensen pr. celle pr. generasjon. Det følger derfor at og where v is the frequency of plasmid-carrying cells and where it is assumed that one colony grows for 27 generations. Inherent in this method is a large statistical fluctuation. Distribution test III: Quantitative measurements of the stability of Lac<+-> and Lac~ plasraiders. One complete colony was taken from a selective plate and resuspended in 1 ml of 0/9% NaCl to a concentration of 10 cells/ml. 2x0.1 ml of the 10 dilution was used to inoculate 2x10 ml of LB medium, and the inoculation was carried out at 30°C with shaking. At a cell density of approx. At 5 x 10 o cells/ml, the cultures were diluted 10 4 and 10 5 times. 0.1 ml of the 10 4 dilution (5 x 10 3 cells) was used to inoculate 10 ml of fresh LB medium, and 0.4 ml of the 10 4 dilution was spread on McConkey lactose plates, and the plates were inoculated at 30°C overnight. The dilution from 5 x 10 8 /ml to 5 x 10 2 /ml corresponds to 20 generations of growth (2^°), so the change in the frequency of plasmid-bearing cells from one dilution to the next corresponds to that occurring during 20 generations of growth. More generally, the LF value can be calculated as follows: where and v2 are the frequency of plasmid-bearing cells after g^ and g2 generations, respectively, and LF is the loss frequency per cell per generation. It therefore follows that and

Ved anvendelse av denne formel unngås feil på grunn av fluktu-asjoner i antall inokulerende celler ved tiden null. En mer bekvem tilnærmelse av denne formel er Using this formula avoids errors due to fluctuations in the number of inoculating cells at time zero. A more convenient approximation of this formula is

Plasmider som menes å bære en innsatt p_ar-region klassifisert ved benyttelse av den observasjon at to ellers kompatible replikoner som bærer den samme par-region er inkompatible med hverandre, hvilket fører til tap av en av de to i fravær av seleksjonstrykk. Testen utføres ved transformering av plasmidet som skal testes til en bakteriestamme som bærer et annet plasmid, som selekterer for begge plasmider på dobbelte selektive plater. Etter utstrekning på en dobbelt selektiv plate Plasmids thought to carry an inserted p_ar region classified using the observation that two otherwise compatible replicons carrying the same par region are incompatible with each other, leading to the loss of one of the two in the absence of selection pressure. The test is performed by transforming the plasmid to be tested into a bacterial strain carrying another plasmid, which selects for both plasmids on double selective plates. After spreading on a double selective plate

(en plate som inneholder to forskjellige antibiotika) ble uforlikeligheten målt enten kvalitativt eller kvantitativt. (a plate containing two different antibiotics) the incompatibility was measured either qualitatively or quantitatively.

For den kvalitative inkompabilitetstest ble en koloni fra den dobbelte selektive plate streket opp på en LA-plate for å danne enkeltkolonier. Ca. 10 kolonier fra denne plate ble resuspendert i 1 ml av 0,9 % NaCl og fortynnet til henholdsvis IO og 10 . 0,1 ml av 10 - og 10 -fortynningene ble bredt ut på LA-plater. Fra disse plater ble 50 kolonier (eller 200 kolonier hvis svak inkompabilitet ble forventet) testet på de aktuelle selektive plater. Hvis et Lac<+->plasmid var inkludert i testen, ble McConkey-laktose-indikatorplater anvendt isteden-for replikkutplating på selektive plater. I tilfellet av Lac<+->plasmider ble klassifiseringen således utført ved transformering av mistenkte Par<+->plasmider til en stamme som allerede huset et Par<+->hybridplasmid som formidlet en Lac<+->fenotype. Plasmid-inkompabilitet, og følgelig bevis på en spesifikk Par<+->fenotype av det innkommende plasmid påvises lett ved klassifisering på Lac -kolonier i McConkey-plater, hvilket viser at det residerende Par<+->plasmid var blitt destabilisert. Et eksempel på denne klassifiseringsprosess er beskrevet i eksempel 4. For the qualitative incompatibility test, a colony from the double selective plate was streaked onto an LA plate to form single colonies. About. 10 colonies from this plate were resuspended in 1 ml of 0.9% NaCl and diluted to 10 and 10 respectively. 0.1 ml of the 10 and 10 dilutions were spread on LA plates. From these plates, 50 colonies (or 200 colonies if slight incompatibility was expected) were tested on the appropriate selective plates. If a Lac<+->plasmid was included in the test, McConkey lactose indicator plates were used instead of replica plating on selective plates. Thus, in the case of Lac<+->plasmids, classification was performed by transforming suspected Par<+->plasmids into a strain that already harbored a Par<+->hybrid plasmid that conveyed a Lac<+->phenotype. Plasmid incompatibility, and consequently evidence of a specific Par<+-> phenotype of the incoming plasmid, is readily demonstrated by sorting on Lac colonies in McConkey plates, showing that the resident Par<+-> plasmid had been destabilized. An example of this classification process is described in example 4.

Kvantitative inkompabilitetsmålinger ble utført ved måling av tapfrekvensene for Lac<+->plasmider etter etablering av hetero-plasmidpopylasjoner som beskrevet ovenfor. LF-verdiene ble målt som beskrevet under "Fordelingstest III". Quantitative incompatibility measurements were performed by measuring the loss frequencies for Lac<+> plasmids after establishment of hetero-plasmid populations as described above. The LF values were measured as described under "Distribution test III".

Genetiske teknikker Genetic techniques

Transformasjon av bakterier ble gjort i henhold til Transformation of bacteria was done according to

Cohen et al., "Proe. Nati. Acad. Sei." USA 62, 1972, ss. 2110-2114, med den modifikasjon at når en lavtransformasjons-frekvens var forventet, ble behandlingen av de kompetente celler med DNA på is forlenget flere timer, og etter varmesjokk ble cellene igjen avkjølt på is i 5-30 minutter. Denne behandling økte transformasjonsfrekvensen signifikant. Cohen et al., "Proe. Nati. Acad. Sei." USA 62, 1972, p. 2110-2114, with the modification that when a low transformation frequency was expected, the treatment of the competent cells with DNA on ice was extended several hours, and after heat shock the cells were again cooled on ice for 5-30 minutes. This treatment significantly increased the transformation frequency.

Infeksjon med bakteriofagen X ble utført ved dyrking av Infection with the bacteriophage X was carried out by cultivation of

10 ml kulturer natten over i LB-medium supplert med 0,2 % malt-ose (for å indusere malB-proteinet som er X-reseptoren) under rysting. Cellene ble vasket med 0,9 % NaCl og resuspendert i 2 ml 0,01 M MgSO, og inkubert i 1 time. Fortynninger av X-sus-0 -1 -2 10 ml cultures overnight in LB medium supplemented with 0.2% maltose (to induce the malB protein which is the X receptor) with shaking. The cells were washed with 0.9% NaCl and resuspended in 2 ml of 0.01 M MgSO, and incubated for 1 hour. Dilutions of X-sus-0 -1 -2

pensjonen (10 , 10 ,10 ) ble laget og 0,1 ml av fagfortynnin-gen ble anvendt for å infisere 0,2 ml av suspensjonen av utsul-0 -1 -2 the pension (10 , 10 ,10 ) was made and 0.1 ml of the phage dilution was used to infect 0.2 ml of the suspension of utsul-0 -1 -2

tede celler. 10 -, 10 - og 10 -fortynningene av infeksjons-blandingene ble utbredt på selektive plater. ted cells. The 10, 10 and 10 dilutions of the infection mixtures were spread on selective plates.

For å transposere plasmider med Tn5 (Km ) hvis kilde var fagen X b221::Tn5, som var blitt fratatt tilknytningsstedet, slik at den var uegnet til å lysogenisere, ble en suspensjon av .fagen anvendt for å infisere celler som huset plasmidet på hvilket transposisjon var ønsket. Infeksjonen ble utført som beskrevet ovenfor, og kanamycinresistente celler ble selektert. To transpose plasmids with Tn5 (Km ) whose source was phage X b221::Tn5, which had been stripped of its attachment site, rendering it incapable of lysogenizing, a suspension of the phage was used to infect cells harboring the plasmid on which transposition was desired. The infection was performed as described above, and kanamycin-resistant cells were selected.

R R

Flere tusen Km -kolonier ble oppsamlet, og 0,1 ml av en 10 fortynning av disse ble anvendt for å inokulere 100 ml LB-medium. Kulturen ble dyrket natten over og plasmid-DNA fremstilt av denne blanding av celler og anvendt for transformering av E. coli K12 stamme CSH50 for kanamycinresistens. Several thousand Km colonies were collected, and 0.1 ml of a 10 dilution of these was used to inoculate 100 ml of LB medium. The culture was grown overnight and plasmid DNA prepared from this mixture of cells and used to transform E. coli K12 strain CSH50 for kanamycin resistance.

EKSEMPEL 1 EXAMPLE 1

Innsettelse av Tn5 (Km p) i EcoRl-A-fragmentet fra_Rl Insertion of Tn5 (Km p) into the EcoRl-A fragment from_Rl

Celler av E.coli K-12 stamme CSH50 som huser plasmid pKNl84, et plasmid som består av plasmid pSF2124 og 19 kb EcoRl-A-fragmentet (som bærer parA- og parB-regionene) fra plasmid RI (Nordstrom et al., Plasmid 4, 1980, s. 322), ble infisert som beskrevet under "Materialer og metoder" med en suspensjon av bakteriofagen Ab211::Tn5. Etter selektering med hensyn på kanamycin-resistens på LA-plater inneholdende 200 Mg/ml av kanamycin, ble kolonier oppsamlet og blandet. 0,1 ml av en 10 - 2-fortynning av disse ble anvendt for å inokulere 100 ml LB-medium. Kulturen ble dyrket natten over og plasmid-DNA fremstilt fra kulturen anvendt for å transformere E.coli K-12 stamme CSH50 ved selektering på kanamycinresistens på plater som inneholdt 200 Mg/ml kanamycin. Cells of E.coli K-12 strain CSH50 harboring plasmid pKN184, a plasmid consisting of plasmid pSF2124 and the 19 kb EcoRl-A fragment (carrying the parA and parB regions) from plasmid RI (Nordstrom et al., Plasmid 4, 1980, p. 322), were infected as described under "Materials and Methods" with a suspension of the bacteriophage Ab211::Tn5. After selection for kanamycin resistance on LA plates containing 200 Mg/ml of kanamycin, colonies were collected and mixed. 0.1 ml of a 10 - 2 dilution of these was used to inoculate 100 ml of LB medium. The culture was grown overnight and plasmid DNA prepared from the culture used to transform E.coli K-12 strain CSH50 by selection for kanamycin resistance on plates containing 200 Mg/ml kanamycin.

På denne måte ble et plasmid, pOUl, funnet som formidler resistens overfor kanamycin og har en innsettelse av fag DNA In this way, a plasmid, pOU1, was found which conveys resistance to kanamycin and has an insertion of phage DNA

som tilsvarer ca. 5 kb (5000 basepar). Plasmidet hadde en molekylvekt/størrelse på 34 kb målt ved fremstilling av plasmid-DNA og analyse på agarosegeler, og følgende fenotyp: Km R , Ap R, ParB<+.>which corresponds to approx. 5 kb (5000 base pairs). The plasmid had a molecular weight/size of 34 kb measured by preparation of plasmid DNA and analysis on agarose gels, and the following phenotype: Km R , Ap R, ParB<+.>

Plasmid-DNA ble fremstilt fra pOUl og plasmidet kartlagt med restriksjonsenzymer ved rensing av plasmid-DNA, spalte det med restriksjonsenzym(er) og analyse av de resulterende fragmenter ved hjelp av agarosegel-elektroforese (kfr. fig. 1). På denne måte ble A::Tn5-fragmentet som var innsatt i EcoRl-A-fragmentet til pKNl84 identifisert som bærende det gen som koder for Km p, og lokaliseringen av fragmentet ble bestemt som vist i Plasmid DNA was prepared from pOU1 and the plasmid mapped with restriction enzymes by purifying the plasmid DNA, cleaving it with restriction enzyme(s) and analyzing the resulting fragments by agarose gel electrophoresis (cf. Fig. 1). In this way, the A::Tn5 fragment inserted into the EcoRl-A fragment of pKN184 was identified as carrying the gene encoding Km p, and the localization of the fragment was determined as shown in

fig. 1. Plasmid pOUl ble anvendt for ytterligere analyse og plasmidkonstruksjoner. fig. 1. Plasmid pOU1 was used for further analysis and plasmid constructions.

Stammen av E.coli CSH50/pOUl er deponert i den tyske kolleksjon av mikroorganismer (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Grisebachstrasse 8, D-3400 GSttingen, i det følgende forkortet til DSM), under tilgjengelighetsnummer 2712. The strain of E.coli CSH50/pOUl is deposited in the German Collection of Microorganisms (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Grisebachstrasse 8, D-3400 GSttingen, hereinafter abbreviated to DSM), under accession number 2712.

EKSEMPEL 2 EXAMPLE 2

Konstruksjon av et plasmid som er nyttig for kloning av par<+->fragmenter Construction of a plasmid useful for cloning par<+->fragments

Plasmid pJL99 (Light & Molin, Mol. Gen. Genet. 184, 1981, ss.56-61) bærer en fusjon mellom repA-genet fra plasmid Ri og lac-operonet; plasmidet formidler en Lac<+->fenotype. Det PstI-Sali-fragment som bærer repA - lac-fusjonen ble kuttet ut fra pJL99 og innsatt i pGA46 som er et pl5-replikon (An & Friesen, J. Bact. 140, 1979, ss.400-407) for å konstruere plasmid, pJL124. Et kart over plasmidet er vist i fig. 2. Plasmid pJL124 formidler også en Lac<+->fenotype på McConkey-laktose-indikatorplater, men det viste seg at innsettelse av DNA-fragmenter med liten eller ingen promoter-aktivitet i Pstl-setet til pJLl24 interferer med aktiviteten til repA-promoteren på en slik måte at disse hybrider ikke lenger viser seg som Lac<+> på McConkey-laktose-indikatorplater. Imidlertid er, på de mer sensitive X-gal-indikatorplater, transformantkolonier Lac<+>, hvilket indikerer at ekspresjon av S-galaktosidase er redusert, men ikke helt undertrykt i hybridene. Derfor kan pJL124 anvendes for å klone Pstl-fragmenter siden hybridplasmider lett påvises på McConkey-laktose-indikatorplater som Lac""-transformanter. Videre, siden pJL124 er et pl5-replikon og således ustabil, hvilket lett påvises da celler fra hvilke plasmidet er gått tapt danner farveløse kolonier på laktose-indikatorplater uten seleksjonstrykk, kan Pstl-fragmenter som har evne til å stabilisere pJL124 klassifiseres for på X-gal-plater. Plasmid pJL99 (Light & Molin, Mol. Gen. Genet. 184, 1981, pp.56-61) carries a fusion between the repA gene from plasmid Ri and the lac operon; the plasmid conveys a Lac<+->phenotype. The PstI-Sali fragment carrying the repA - lac fusion was excised from pJL99 and inserted into pGA46 which is a pl5 replicon (An & Friesen, J. Bact. 140, 1979, pp.400-407) to construct plasmid, pJL124. A map of the plasmid is shown in fig. 2. Plasmid pJL124 also conveys a Lac<+->phenotype on McConkey lactose indicator plates, but insertion of DNA fragments with little or no promoter activity into the Pstl site of pJL124 was found to interfere with the activity of the repA promoter in such a way that these hybrids no longer show up as Lac<+> on McConkey lactose indicator plates. However, on the more sensitive X-gal indicator plates, transformant colonies are Lac<+>, indicating that expression of S-galactosidase is reduced but not completely suppressed in the hybrids. Therefore, pJL124 can be used to clone Pstl fragments since hybrid plasmids are readily detected on McConkey lactose indicator plates as Lac"" transformants. Furthermore, since pJL124 is a pl5 replicon and thus unstable, which is easily demonstrated when cells from which the plasmid has been lost form colorless colonies on lactose indicator plates without selection pressure, Pstl fragments capable of stabilizing pJL124 can be classified for on X- crazy plates.

Programmet for å isolere Pstl - par<+->fragmenter består således av følgende trinn: 1) Ligering av pJLl24 avgrenset med Pstl og Pstl-fragmenter fra et annet plasmid. 2) Transformering til CSH50 ved utplating på McConkey-laktose-plater som inneholder kloramfenikol. 3) Testing av kloner som viser seg som Lac på McConkey-laktoseplater for stabil nedarving av Lac<+->fenotype på X-gal-indikatorplater (kfr. "Materialer og metoder"). The program for isolating Pstl - par<+->fragments thus consists of the following steps: 1) Ligation of pJL124 bounded by Pstl and Pstl fragments from another plasmid. 2) Transformation to CSH50 by plating on McConkey-lactose plates containing chloramphenicol. 3) Testing clones showing as Lac on McConkey lactose plates for stable inheritance of Lac<+->phenotype on X-gal indicator plates (cf. "Materials and Methods").

Stammen E. coli CSH50/pJLl24 er deponert i DSM under tilgjengelighetsnummer 2760. The strain E. coli CSH50/pJL124 has been deposited in DSM under accession number 2760.

EKSEMPEL 3 EXAMPLE 3

Stabilisering av ustabile plasmider med parA- og parB-regionene Stabilization of unstable plasmids with the parA and parB regions

1. Mini-Rl-replikon. 1. Mini-Rl replicon.

Plasmid pOU71 (DSM tilgjengelighetsnr. 2471) , et "runaway"-replikeringsderivat av plasmid pKNl562 som omfatter basisreplikonet til plasmid Ri, \PR-promoteren og cIg57-repressorgenet fra fag EDA4, det gen som koder for B-laktamase fra Tn3-transposonet og et unikt EcoRl-sete (en detaljert beskrivelse av konstruksjonen av pOU71 finnes i vår samtidige søknad nr. 84.193 5, ble avgrenset med EcoRl, og EcoRl-A::Tn5-fragmentet fra pOUl (kfr. eksempel 1) ble innsatt, fulgt av ligering og transformering av E. coli stamme CSH50, ved selektering av kanamycinresistente celler på LA-plater inneholdende 50 jug/ml kanamycin. Plasmid pOU71 (DSM Accession No. 2471), a "runaway" replication derivative of plasmid pKN1562 comprising the basic replicon of plasmid Ri, the \PR promoter and the cIg57 repressor gene from phage EDA4, the gene encoding B-lactamase from the Tn3 transposon and a unique EcoRl site (a detailed description of the construction of pOU71 can be found in our copending application No. 84,193 5) was flanked by EcoRl, and the EcoRl-A::Tn5 fragment from pOUl (cf. Example 1) was inserted, followed by ligation and transformation of E. coli strain CSH50, by selecting kanamycin-resistant cells on LA plates containing 50 µg/ml kanamycin.

Transformantene ble klassifisert med hensyn på "runaway"-replikeringsfenotyp av pOU71 ved oppstreking på LA-plater inneholdende 50 Mg/ml kanamycin og inkubering ved 42°C. Celler som inneholdt "runaway"-replikeringsplasmider opphører til slutt å vokse under disse betingelser. På denne måte ble plasmid POU71-184 identifisert, som hadde en størrelse på 25,5 kb og følgende fenotype: ParA<+>, ParB<+>, Ap R , Km R. The transformants were classified for the runaway replication phenotype of pOU71 by streaking on LA plates containing 50 µg/ml kanamycin and incubation at 42°C. Cells containing "runaway" replication plasmids eventually cease to grow under these conditions. In this way, plasmid POU71-184 was identified, which had a size of 25.5 kb and the following phenotype: ParA<+>, ParB<+>, Ap R , Km R .

Plasmidet ble kartlagt med restriksjonsenzymer som beskrevet i eksempel 1 (kfr. fig. 3). Fra restriksjonskartet fremgår det at EcoRl-A::Tn5-fragmentet var innsatt korrekt i EcoRl-setet til pOU71. The plasmid was mapped with restriction enzymes as described in example 1 (cf. fig. 3). From the restriction map it appears that the EcoRl-A::Tn5 fragment was inserted correctly into the EcoRl site of pOU71.

Celler som huser plasmidet ble dyrket på LA-plater i 100 generasjoner uten seleksjonstrykk, dvs. uten å bli dyrket på plater som inneholdt et antibiotikum; ved bestemmelse i henhold til den fremgangsmåte som er beskrevet i "Materialer og metoder" Cells harboring the plasmid were grown on LA plates for 100 generations without selection pressure, ie without being grown on plates containing an antibiotic; by determination according to the procedure described in "Materials and methods"

(fordelingstest II), ble cellene ikke observert å tape plasmidet, mens pOU71 gikk tapt fra celler som ble dyrket under lignende betingelser med en frekvens på 1 % pr. generasjon. Det ble således bestemt at pOU71-184 nedarves stabilt med en tapsfrekvens på ca. 10 ^/celle/generasjon. (distribution test II), the cells were not observed to lose the plasmid, while pOU71 was lost from cells grown under similar conditions at a frequency of 1% per generation. It was thus determined that pOU71-184 is stably inherited with a loss frequency of approx. 10 ^/cell/generation.

Stammen av E.coli CSH50/pOU71-184 deponeres i DSM under tilgjengelighetsnummer 2763. The strain of E.coli CSH50/pOU71-184 is deposited in DSM under accession number 2763.

2. pl5-replikon 2. pl5 replicon

Plasmid pJL124 (kfr. eksempel 2), som er et par~-pl5-replikon, ble spaltet med restriksjonsenzymet Pstl og blandet med plasmid pKNl84 (kfr. eksempel 1) som var blitt delvis avgrenset med Pstl fulgt av ligering. Den blandede ligering ble transformert til E.coli stamme CSH50 under selektering for kloramfenicol-resistens på McConkey-laktose-indikatorplater inneholdende 50 ug/ml kloramfenicol. Plasmid pJL124 (cf. Example 2), which is a par~-pl5 replicon, was digested with the restriction enzyme PstI and mixed with plasmid pKN184 (cf. Example 1) which had been partially delimited with PstI followed by ligation. The mixed ligation was transformed into E.coli strain CSH50 under selection for chloramphenicol resistance on McConkey lactose indicator plates containing 50 µg/ml chloramphenicol.

Celler som huser pJL124 som bærer et eller flere Pstl-fragmenter (kfr. eksempel 2) ble testet på stabil nedarving av Lac<+->fenotypen på X-gal-plater. Ett av de stabilt nedarvede plasmider viste seg å inneholde både parA- og p_arB-regionen.. Dette plasmid, pOU2, har en størrelse på 24 kb og følgende fenotype: CmR, Lac<+>, ParA<+>, ParB<+>. Cells harboring pJL124 carrying one or more Pstl fragments (cf. Example 2) were tested for stable inheritance of the Lac<+> phenotype on X-gal plates. One of the stably inherited plasmids was found to contain both the parA and p_arB regions. This plasmid, pOU2, has a size of 24 kb and the following phenotype: CmR, Lac<+>, ParA<+>, ParB<+> .

Plasmidet ble kartlagt med restriksjonsenzymer som beskrevet i eksempel 1 (kfr. fig. 4). Fra restriksjonskartet fremgår det at et Pstl-fragment er blitt fjernet fra EcoRl-A-fragmentet. The plasmid was mapped with restriction enzymes as described in example 1 (cf. fig. 4). From the restriction map it appears that a Pstl fragment has been removed from the EcoRl-A fragment.

Celler som huser plasmidet ble dyrket på X-gal-plater i 100 generasjoner uten seleksjonstrykk, og det ble bestemt at pOU2 er stabilt nedarvet med en LF-verdi på mindre enn 10 6/celle/generasjon i kontrast til pJLl24 som gikk tapt fra cellene med en frekvens på 0,5-1 % celle/generasjon. Cells harboring the plasmid were grown on X-gal plates for 100 generations without selection pressure and it was determined that pOU2 is stably inherited with an LF value of less than 10 6 /cell/generation in contrast to pJLl24 which was lost from the cells with a frequency of 0.5-1% cell/generation.

Stammen E.coli CSH50/pOU2 er deponert i DSM under tilgjen--gelignetsnummer 2713. The strain E.coli CSH50/pOU2 has been deposited in DSM under accession number 2713.

3. pMBl-replikon 3. pMB1 replicon

Plasmid pFl403-ll (kfr. tabell 2) er et ustabilt nedarvet derivat av pBR322 (et pMBl-replikon) som bærer en fusjon mellom et gen fra plasmid F og lac-operonet. Plasmidet formidler en Ap p, Lac<+->fenotype. EcoRl-A:;Tn5-fragmentet fra plasmid pOUl (eksempel 1) ble innsatt i det unike EcoRl-sete i plasmid PF1403-11 umiddelbart oppstrøms for genfusjonen fulgt av ligering og transformering til E.coli stamme CSH50 som selekterer for Ap R på plater inneholdende 50 Mg/ml ampicillin, Km R på plater inneholdende 50 Mg/ml kanamycin og Lac<+> på McConkey-laktose-indikatorplater. Plasmid pF1403-11 (cf. Table 2) is an unstable inherited derivative of pBR322 (a pMB1 replicon) which carries a fusion between a gene from plasmid F and the lac operon. The plasmid conveys an Ap p, Lac<+->phenotype. The EcoRl-A:;Tn5 fragment from plasmid pOU1 (Example 1) was inserted into the unique EcoRl site in plasmid PF1403-11 immediately upstream of the gene fusion followed by ligation and transformation into E.coli strain CSH50 which selects for Ap R on plates containing 50 Mg/ml ampicillin, Km R on plates containing 50 Mg/ml kanamycin and Lac<+> on McConkey lactose indicator plates.

Det resulterende plasmid pOUlO ble kartlagt med restriksjonsenzymer som beskrevet i eksempel 1 (kfr. fig. 5), og innsettel-sen av EcoRl-A;:Tn5-fragmentet ble verifisert. Plasmidet hadde en størrelse på 34 kb og følgende fenotype: Km R , Ap R, Lac<+, >ParA<+>, ParB<+>. The resulting plasmid pOU10 was mapped with restriction enzymes as described in Example 1 (cf. Fig. 5), and the insertion of the EcoR1-A;:Tn5 fragment was verified. The plasmid had a size of 34 kb and the following phenotype: Km R , Ap R, Lac<+, >ParA<+>, ParB<+>.

Plasmidet ble testet på stabil nedarving som beskrevet i eksempel 3.1. Det ble således vist at pOUlO er stabilt nedarvet med en LF-verdi på mindre enn 10 ^/celle/generasjon, mens pF1403-ll gikk tapt fra cellene med en frekvens på 6 x 10 —3 pr. generasjon. The plasmid was tested for stable inheritance as described in example 3.1. It was thus shown that pOUlO is stably inherited with an LF value of less than 10 ^/cell/generation, while pF1403-ll was lost from the cells at a frequency of 6 x 10 -3 per generation.

Stammen E. coli CSH50/pOUlO deponeres i DSM under tilgjengelighetsnummer 2714. The strain E. coli CSH50/pOUlO is deposited in DSM under accession number 2714.

EKSEMPEL 4 EXAMPLE 4

Kloning av Pstl-fragmenter fra det EcoRl-A-fragment som stabiliserer pJL124 Cloning of Pstl fragments from the EcoRl-A fragment stabilizing pJL124

EcoRl-A-fragmentet ble avgrenset med et antall restriksjonsenzymer, og det resulterende fysikalske kart er vist i fig. 1. Som det fremgår av denne figur, er fragmentet sammensatt av mange Pstl-fragmenter. I den hensikt å redusere størrelsen på det fragment som formidler Par<+->fenotypen, ble det forsøkt å subklone par-regioner som muligens ble båret på et eller flere av Pstl-fragmentene i klassifiseringsvektoren pJL124 (kfr. eksempel 2). Analyse av et antall kloner med den korrekte fenotype - Lac" på McConkey-laktoseplater og stabil nedarving i fravær av seleksjonstrykk - viste at Pstl-D-fragmentet (kfr. fig. 1) formidlet denne fenotype. Intet annet enkelt- Pstl-fragment var i stand til å stabilisere pJLl24. Den region som er ansvarlig for stabilisering av pJLl24 beliggende i 1,8 kb Pstl-fragmentet ble betegnet parB. The EcoR1-A fragment was delimited with a number of restriction enzymes and the resulting physical map is shown in Fig. 1. As can be seen from this figure, the fragment is composed of many Pstl fragments. In order to reduce the size of the fragment mediating the Par<+->phenotype, an attempt was made to subclone par regions which were possibly carried on one or more of the Pstl fragments in the classification vector pJL124 (cf. example 2). Analysis of a number of clones with the correct phenotype - Lac" on McConkey lactose plates and stable inheritance in the absence of selection pressure - showed that the Pstl-D fragment (cf. Fig. 1) conveyed this phenotype. No other single Pstl fragment was able to stabilize pJL124 The region responsible for stabilizing pJL124 located in the 1.8 kb Pstl fragment was designated parB.

For å analysere Pstl-D-fragmentet videre ble fragmentet klonet inn i det unike Pstl-sete i bla-genet til pBR322 hvilket resulterte i pOU93 (kfr. fig. 7; plasmidet er deponert i DSM under tilgjengelighetsnummeret 2724). Restriksjonskartlegging av dette plasmid viste at Pstl-D-fragmentet inneholder tre Rsal-seter (kfr. fig. 6). Rsal utvikler "blunt ends", og det 900 bp store Rsal-fragment ble derfor innsatt i Smal-setet til plasmid pHP34 (Prentki et al., Gene 17, 1982, ss. 189-96) på følgende måte: pOU93 ble avgrenset med Rsal og blandet med pHP34 avgrenset med Smal fulgt av ligering. Ligeringsblandin-gen ble transformert til E.coli stamme CSH50 som allerede huset plasmid pOU94 (et pl5-derivat som fenotypisk er Lac<+> og ParB<+>, kfr. fig. 8; plasmidet er deponert i DSM under tilgjengelighetsnummer 2725) , og det selekterer for ampicillin-resistens på plater inneholdende 50 Mg/ml ampicillin. To analyze the Pstl-D fragment further, the fragment was cloned into the unique Pstl site in the bla gene of pBR322 resulting in pOU93 (cf. Fig. 7; the plasmid is deposited in DSM under accession number 2724). Restriction mapping of this plasmid showed that the Pstl-D fragment contains three RsaI sites (cf. Fig. 6). RsaI develops "blunt ends", and the 900 bp RsaI fragment was therefore inserted into the SmaI site of plasmid pHP34 (Prentki et al., Gene 17, 1982, pp. 189-96) in the following way: pOU93 was delimited with RsaI and mixed with pHP34 capped with SmaI followed by ligation. The ligation mixture gene was transformed into E.coli strain CSH50 which already harbored plasmid pOU94 (a pl5 derivative which is phenotypically Lac<+> and ParB<+>, cf. fig. 8; the plasmid is deposited in DSM under accession number 2725), and it selects for ampicillin resistance on plates containing 50 Mg/ml ampicillin.

På grunn av uforlikeligheten som uttrykkes av parB<+->regioner som bæres på forskjellige plasmider, går pOU94 tapt når et annet plasmid som fenotypisk er ParB<+>, innføres i celler fra E.coli, hvilket således gjør det mulig å selektere for korrekte innsettelser og transformanter ved oppstreking av cellene på McConkey-plater og klassifisering for farveløse kolonier (Lac ). Ett slikt uforlikelig plasmid pHP34-derivat som ble funnet å inneholde det 900 bp store Rsal-fragment ble betegnet pOU13. Plasmidet hadde en størrelse på 5,3 kb og følgende fenotype: Because of the incompatibility expressed by parB<+> regions carried on different plasmids, pOU94 is lost when another plasmid that is phenotypically ParB<+> is introduced into E.coli cells, thus allowing selection for correct insertions and transformants by streaking the cells on McConkey plates and grading for colorless colonies (Lac ). One such mismatched plasmid pHP34 derivative found to contain the 900 bp RsaI fragment was designated pOU13. The plasmid had a size of 5.3 kb and the following phenotype:

Tc<R>, ApR, ParB<+.>Tc<R>, ApR, ParB<+.>

Plasmidet ble kartlagt med restriksjonsenzymer som beskrevet i eksempel 1 (kfr. fig. 9). Kartleggingen viste at Rsal-fragmentet er blitt omdannet til et 900 bp stort EcoRl-fragment da Smal-setet til pHP34 er flankert av to EcoRl-seter. The plasmid was mapped with restriction enzymes as described in example 1 (cf. Fig. 9). The mapping showed that the RsaI fragment has been converted into a 900 bp EcoRl fragment as the SmaI site of pHP34 is flanked by two EcoRl sites.

Stammen av E.coli CSH50/pOU13 er deponert i DSM under tilgjengelighetsnummer 2716. The strain of E.coli CSH50/pOU13 has been deposited in DSM under accession number 2716.

Det 900 bp store EcoRl-fragment fra pOUl3 ble innsatt i EcoRl-setet til pOUlOl, et Ap R / Cm R-"runawayn-mini-Rl-derivat The 900 bp EcoRl fragment from pOUl3 was inserted into the EcoRl site of pOUlOl, an Ap R / Cm R runaway mini-Rl derivative

(en detaljert beskrivelse av konstruksjonen av pOUlOl finnes i tidligere nevnte søknad nr. 84.1935 med et unikt EcoRl-sete i cat-genet (det gen som koder for Cm<R>), for å konstruere plasmid pOU14 (a detailed description of the construction of pOUlOl can be found in previously mentioned application no. 84.1935 with a unique EcoRl site in the cat gene (the gene that codes for Cm<R>), to construct plasmid pOU14

SR SR

som har en størrelse på 8,2 kb og følgende fenotype: Cm , Ap , ParB<+>. which has a size of 8.2 kb and the following phenotype: Cm , Ap , ParB<+>.

Plasmidet ble kartlagt med restriksjonsenzymer som beskrevet i eksempel 1 (kfr. fig. 10). The plasmid was mapped with restriction enzymes as described in example 1 (cf. fig. 10).

Plasmidet ble testet på stabil nedarving som beskrevet i eksempel 3.1. Det ble således vist at, ved 30°C, er p0U14 stabilt nedarvet med en LF-verdi på mindre enn 1 x 10 <4>/celle/- generasjon, mens pOUlOl går tapt fra cellene med en frekvens på The plasmid was tested for stable inheritance as described in example 3.1. It was thus shown that, at 30°C, p0U14 is stably inherited with an LF value of less than 1 x 10 <4>/cell/generation, while pOUlOl is lost from the cells at a frequency of

1 % pr. generasjon. 1% per generation.

Stammen av E.coli CSH50/pOU14 deponeres i DSM under tilgjengelighetsnummer 2717. The strain of E.coli CSH50/pOU14 is deposited in DSM under accession number 2717.

EKSEMPEL 5 EXAMPLE 5

Stabilisering av mini-Rl-plasmider med parB-fragmentet Stabilization of mini-Rl plasmids with the parB fragment

Plasmid pOU90, et "runaway"-replikeringsderivat av pKNl562 som omfatter basisreplikonet til plasmid Ri, APR-promoteren og clgc^-repressoren fra fag EDX4, det gen som koder for B-laktamase fra Tn3-transposonet og EcoRl-A-fragmentet fra pKN184 (en detaljert beskrivelse av konstruksjonen av pOU90 finnes i søknad nr. 84.1935, i hvilket derivat EcoRl-A-fragmentet fra pKN184 er blitt innsatt, ble avgrenset med Sali og ligert for å produsere plasmid pOU61. Plasmidet ble transformert til E.coli stamme CSH50 ved selektering for en Lac~-fenotype på McConkey-plater. Plasmid pOU90, a "runaway" replication derivative of pKN1562 comprising the basic replicon of plasmid Ri, the APR promoter and the clgc^ repressor from phage EDX4, the gene encoding B-lactamase from the Tn3 transposon and the EcoR1-A fragment from pKN184 (a detailed description of the construction of pOU90 can be found in application no. 84.1935, in which derivative the EcoRl-A fragment from pKN184 has been inserted, delimited with SalI and ligated to produce plasmid pOU61. The plasmid was transformed into E.coli strain CSH50 by selection for a Lac~ phenotype on McConkey plates.

pOU61 ble kartlagt med restriksjonsenzymer som beskrevet i eksempel 1 (kfr. fig. 11). Fra restriksjonskartet fremgår det at pOU61 bærer den 3,6 kb store høyre ende av EcoRl-A-fragmentet inneholdende parB-regionen. Plasmidet har en størrelse på 10 kb og følgende fenotype: ParB<+>, Ap<R>, Lac". Plasmidet ble testet på stabil nedarving som beskrevet i eksempel 3.1. pOU61 was mapped with restriction enzymes as described in example 1 (cf. Fig. 11). From the restriction map, it appears that pOU61 carries the 3.6 kb right end of the EcoRl-A fragment containing the parB region. The plasmid has a size of 10 kb and the following phenotype: ParB<+>, Ap<R>, Lac". The plasmid was tested for stable inheritance as described in example 3.1.

Det ble således vist at pOU61 er stabilt nedarvet med en LF-verdi på mindre enn 1 x 10 4/celle/generasjon. It was thus shown that pOU61 is stably inherited with an LF value of less than 1 x 10 4 /cell/generation.

Stammen av E.coli CSH50/pOU61 deponeres i DSM under til-gjenge lighetsnummer 2723. The strain of E.coli CSH50/pOU61 is deposited in DSM under accession number 2723.

EKSEMPEL 6 EXAMPLE 6

Stabilisering av plasmid pF1403-ll med parB-fragmentet Stabilization of plasmid pF1403-ll with the parB fragment

Plasmid pOUl (kfr. eksempel 1) ble kuttet med Sali og blandet med plasmid pFl403-ll som også var blitt avgrenset med Sali fulgt av ligering og transformering til E. coli stamme CSH50, ved selektering for ampicillinresistente kolonier på McConkey-laktose-indikatorplater. Noen av disse Lac<+->kloner ble klassifisert for stabil nedarving av Lac<+->fenotype på McConkey-plater, som beskrevet i "Materialer og metoder". Plasmid pOU1 (cf. example 1) was cut with SalI and mixed with plasmid pF1403-ll which had also been delimited with SalI followed by ligation and transformation into E. coli strain CSH50, by selection for ampicillin-resistant colonies on McConkey-lactose indicator plates. Some of these Lac<+->clones were graded for stable inheritance of the Lac<+->phenotype on McConkey plates, as described in “Materials and Methods”.

De stabilt nedarvete plasmider ble kartlagt med restriksjonsenzymer som beskrevet i eksempel 1 (kfr. fig. 12) . Fra restriksjonskartet fremgår det at de bærer Sali-fragmentet til pOUl på hvilket parB-regionen er beliggende. Det plasmid som består av pF1403-ll og Sali-fragmentet fra pOUl ble betegnet P0U12. Det hadde en størrelse på 16 kb og følgende fenotype: Par B<+>, Lac<+>, Ap . pOU12 var stabilt nedarvet med en LF-verdi på mindre enn 5 x 10 ^/celle/generasjon. The stably inherited plasmids were mapped with restriction enzymes as described in example 1 (cf. fig. 12). From the restriction map it appears that they carry the SalI fragment of pOU1 on which the parB region is located. The plasmid consisting of pF1403-11 and the SalI fragment from pOU1 was designated P0U12. It had a size of 16 kb and the following phenotype: Par B<+>, Lac<+>, Ap . pOU12 was stably inherited with an LF value of less than 5 x 10 ^/cell/generation.

Stammen av E. coli CSH50/pOUl2 deponeres i DSM under til-gjenge lighetsnummer 2715. The strain of E. coli CSH50/pOU12 is deposited in DSM under accession number 2715.

EKSEMPEL 7 EXAMPLE 7

Stabilisering av p! 5- plasmider med parA- fragmentet Stabilization of p! 5- plasmids with the parA fragment

Plasmid pMC903 (Casadaban et al., J. Bact. 14 3, 1980, s.971) ble kuttet med EcoRl, og EcoRl-fragmentet fra plasmid pOU43 (kfr. fig, 13, DSM tilgjengelighetsnummer 2720) som bærer parA-regionen ble innsatt, fulgt av ligering og transformering til E. coli stamme CSH50. Det resulterende plasmid ble betegnet pOU45 og hadde en størrelse på 13,4 kb og følgende fenotype: ParA<+>, Lac", Ap R , Km R. Plasmid pMC903 (Casadaban et al., J. Bact. 14 3, 1980, p.971) was cut with EcoRl, and the EcoRl fragment from plasmid pOU43 (cf. Fig, 13, DSM accession number 2720) carrying the parA region was inserted, followed by ligation and transformation into E. coli strain CSH50. The resulting plasmid was designated pOU45 and had a size of 13.4 kb and the following phenotype: ParA<+>, Lac", Ap R , Km R.

Plasmidet ble kartlagt med restriksjonsenzymer som beskrevet i eksempel 1 (kfr. fig. 14). Fra restriksjonskartet fremgår det at parA-regionen var blitt innsatt i lac-operonet som derved blir inaktivert. The plasmid was mapped with restriction enzymes as described in example 1 (cf. fig. 14). From the restriction map, it appears that the parA region had been inserted into the lac operon, which is thereby inactivated.

Ved testing på stabilitet som beskrevet i "Materialer og metoder", ble plasmidet funnet å være stabilt nedarvet med en LF-verdi på 8 x 10 —4/celle/generasjon, mens pMC903 har en LF-verdi på 1 %/celler/generasjon. When tested for stability as described in "Materials and Methods", the plasmid was found to be stably inherited with an LF value of 8 x 10 -4/cell/generation, while pMC903 has an LF value of 1%/cells/generation .

Stammen av E. coli CSH50/pOU4 5 deponeres i DSM under tilgjengelighetsnr. 2721. The strain of E. coli CSH50/pOU4 5 is deposited in DSM under accession no. 2721.

EKSEMPEL 8 EXAMPLE 8

Stabilisering av mini-Rl-plasmider med parA-regionen Stabilization of mini-Rl plasmids with the parA region

EcoRl-fragmentet fra pOU43 ble innsatt i et mini-Rl-plasmid, pOU82 (DSM nr. 2482) , som omfatter basisreplikonet fra plasmid Ri, XPR-promoteren og cl-repressorgenet fra fag EDX4, det gen som koder for 6-laktamase fra Tn3-transposonet, deo-promoteren og aminoterminalenden til lacZ-genet fra pVHl424 og resten av lac-operonet fra pSKSl04 (en detaljert beskrivelse av konstruksjonen av pOU82 finnes i søknad nr. 84.1935. The EcoRl fragment from pOU43 was inserted into a mini-Rl plasmid, pOU82 (DSM no. 2482), which comprises the basic replicon from plasmid Ri, the XPR promoter and the cl repressor gene from phage EDX4, the gene that codes for 6-lactamase from The Tn3 transposon, the deo promoter and the amino terminus of the lacZ gene from pVH1424 and the rest of the lac operon from pSKS104 (a detailed description of the construction of pOU82 can be found in application no. 84.1935.

Plasmid p0U82 formidler Ap R og Lac +-fenotypene og har et unikt EcoRl-sete nyttig for kloning av EcoRl-fragmenter. Dette plasmid går tapt med en frekvens på 1 % pr. generasjon i fravær av selsksjonstrykk. Plasmid p0U82 conveys the Ap R and Lac + phenotypes and has a unique EcoRl site useful for cloning EcoRl fragments. This plasmid is lost at a rate of 1% per generation in the absence of cell division pressure.

Et plasmid i hvilket det 2,4 kb store EcoRl-fragment var blitt innsatt i én orientering ble betegnet pOU47. Plasmidet hadde en størrelse på 14 kb og følgende fenotype: ParA"1", Lac + , Ap . A plasmid into which the 2.4 kb EcoRl fragment had been inserted in one orientation was designated pOU47. The plasmid had a size of 14 kb and the following phenotype: ParA"1", Lac + , Ap .

pOU4 7 ble kartlagt med restriksjonsenzymer som beskrevet i eksempel 1 (kfr. fig. 15) . pOU4 7 was mapped with restriction enzymes as described in example 1 (cf. fig. 15).

Stammen av E. coli CSH50/pOU4 7 deponeres i DSM under tilgjengelighetsnr. 2722. The strain of E. coli CSH50/pOU4 7 is deposited in DSM under accession no. 2722.

Det EcoRl-fragment som bærer parA-regionen ble videre redusert med 400 bp ved hjelp av exonukleasen Bal31; fjerningspro-sessen ble utført som beskrevet i "Materialer og metoder" ved anvendelse av det unike BamHI-sete i pOU4 7. Det plasmid som ble konstruert ble betegnet pOU4 72. Plasmidet hadde en størrelse på 13 kb og følgende fenotype: ParA<+>, Lac<+>, Ap<R>. The EcoRl fragment carrying the parA region was further reduced by 400 bp using the exonuclease Bal31; the removal process was performed as described in "Materials and Methods" using the unique BamHI site in pOU4 7. The plasmid constructed was designated pOU4 72. The plasmid had a size of 13 kb and the following phenotype: ParA<+> , Lac<+>, Ap<R>.

pOU4 72 ble kartlagt med restriksjonsenzymer som beskrevet pOU4 72 was mapped with restriction enzymes as described

i eksempel 1 (kfr. fig. 16). Fra restriksjonskartet fremgår det at pOU4 72 bærer det 2,0 kb store EcoRl-fragment utviklet ved Bal31-fjerningen. in example 1 (cf. fig. 16). From the restriction map it appears that pOU4 72 carries the 2.0 kb EcoRl fragment developed by the Bal31 removal.

Ved testing på stabilitet som beskrevet i "Materialer og metoder", ble plasmidet funnet å være stabilt nedarvet, hvilket betyr at hele parA-regionen inneholdes i det 2,0 kb store EcoRl-fragment. When tested for stability as described in "Materials and Methods", the plasmid was found to be stably inherited, meaning that the entire parA region is contained in the 2.0 kb EcoRl fragment.

Stammen av E.coli CSH50/pOU4 72 deponeres i DSM under tilgjengelighetsnr. 2726. The strain of E.coli CSH50/pOU4 72 is deposited in DSM under accession no. 2726.

EKSEMPEL 9 EXAMPLE 9

Konstruksjon av et mini-Rl-plasmid som bærer parA-regionen Construction of a mini-Rl plasmid carrying the parA region

Plasmid pOU90 (kfr. eksempel 5) ble spaltet med BamHI og delvis med Sau3A for å fjerne en del av EcoRl-A-fragmentet, idet de 6 kb helt til venstre ble beholdt, fulgt av ligering. Det resulterende plasmid, pOU91, ble transformert til E. coli stamme CSH50. pOU91 har en størrelse på 18,75 kb og følgende fenotype: Par<*>, Ap<R>, Lac<+.> Plasmidet ble kartlagt med restriksjonsenzymer som beskrevet i eksempel 1 (kfr. fig. 17). ;Plasmidets stabilitet ble bestemt ved å dyrke celler inneholdende pOU91 (og, som kontroll, celler inneholdende pOU82) på McConkey-plater uten seleksjonstrykk ved 30°C i 25 generasjoner; de celler som ble transformert med pOU91 utviklet røde kolonier (Lac<+>), mens celler som ble transformert med pOU82 utviklet både røde og hvite kolonier, hvilket indikerer at under den seleksjonsfrie periode var pOU82 blitt tapt fra noen av cellene. ;Stammen av E. coli CSH/pOU91 deponeres i DSM under tilgjengelighetsnr. 2483. ;EKSEMPEL 10 ;Konstruksjon av et parA<+>, parB<+->mini-Rl-plasmid ;Plasmid pOU82 (kfr. eksempel 8) kuttes med EcoRl, og EcoRl-fragmentet fra pOU43 (kfr. eksempel 7 og fig. 13) som bærer parA-regionen innsettes. Dette EcoRl-fragment fjernes fra de 500 bp som er helt til venstre, inklusive ett EcoRl-sete, ved hjelp av exonukleasen Bal31. I det unike EcoRl-sete i dette plasmid innsettes EcoRl-fragmentet fra pOU13 (kfr. eksempel 4 og fig. 9). Det resulterende plasmid, som formidler en. ParA<+>, ParB<+->fenotype, kan deretter bli transformert til E. Coli stamme CSH50 som allerede bærer plasmid pOU94, og klassifiseres for i det vesentlige som beskrevet i eksempel 4 med unntagelse av at pOU82-derivatet formidler en svak Lac<+->fenotype hvilket betyr at kolonier av celler som huser dette plasmid bare vil være røde i senteret og farveløse ved kantene når de dyrkes på McConkey-laktose-indikatorplater. ;EKSEMPEL 11 ;Konstruksjon av et parA+, parB+-mini-Rl-plasmid ;Plasmid pOU61 (kfr. eksempel 5) kuttes med EcoRl, og EcoRl-fragmentet fra pOU43 som bærer parA-regionen innsettes, fulgt av ligering. Det resulterende plasmid, som formidler en ParA<+>, ParB<+->fenotype, kan deretter bli transformert til E. coli stamme som CSH50 som allerede bærer plasmid pOU2, og klassifiseres på en måte som tilsvarer den metode som er beskrevet i eksempel 4. Kolonier av celler som huser det Ønskede plasmid vil fremstå som farveløse kolonier (Lac~) på McConkey-laktose-plater. ;(I hele foreliggende beskrivelse og i kravene, der hvor par", Par", par<*> eller Par<+> ikke er spesifikt angitt, betegner uttrykkene par og Par ekspresjon av en fordelingsfunksjon). Plasmid pOU90 (cf. example 5) was digested with BamHI and partially with Sau3A to remove part of the EcoR1-A fragment, keeping the 6 kb at the far left, followed by ligation. The resulting plasmid, pOU91, was transformed into E. coli strain CSH50. pOU91 has a size of 18.75 kb and the following phenotype: Par<*>, Ap<R>, Lac<+.> The plasmid was mapped with restriction enzymes as described in example 1 (cf. fig. 17). ;Plasmid stability was determined by growing cells containing pOU91 (and, as a control, cells containing pOU82) on McConkey plates without selection pressure at 30°C for 25 generations; the cells transformed with pOU91 developed red colonies (Lac<+>), while cells transformed with pOU82 developed both red and white colonies, indicating that during the selection-free period pOU82 had been lost from some of the cells. ;The strain of E. coli CSH/pOU91 is deposited in DSM under accession no. 2483. ;EXAMPLE 10 ;Construction of a parA<+>, parB<+->mini-Rl plasmid ;Plasmid pOU82 (cf. example 8) is cut with EcoRl, and the EcoRl fragment from pOU43 (cf. example 7 and fig .13) carrying the parA region is inserted. This EcoRl fragment is removed from the 500 bp on the far left, including one EcoRl site, using the exonuclease Bal31. In the unique EcoRl site in this plasmid, the EcoRl fragment from pOU13 is inserted (cf. example 4 and fig. 9). The resulting plasmid, which conveys a. ParA<+>, ParB<+->phenotype, can then be transformed into E. Coli strain CSH50 already carrying plasmid pOU94, and classified essentially as described in Example 4 with the exception that the pOU82 derivative conveys a weak Lac <+->phenotype meaning that colonies of cells harboring this plasmid will only be red in the center and colorless at the edges when grown on McConkey lactose indicator plates. ;EXAMPLE 11 ;Construction of a parA+, parB+-mini-Rl plasmid ;Plasmid pOU61 (cf. example 5) is cut with EcoRl, and the EcoRl fragment from pOU43 carrying the parA region is inserted, followed by ligation. The resulting plasmid, which conveys a ParA<+>, ParB<+->phenotype, can then be transformed into E. coli strain such as CSH50 already carrying plasmid pOU2, and classified in a manner corresponding to the method described in Example 4. Colonies of cells harboring the desired plasmid will appear as colorless colonies (Lac~) on McConkey lactose plates. ;(In the entire present description and in the claims, where par", Par", par<*> or Par<+> is not specifically stated, the expressions par and Par denote the expression of a distribution function).

Claims

1. Plasmid, which replicates in Gram-negative bacteria, characterized in that it carries one or more inserted genes that do not naturally occur in the plasmid, and that it is stabilized by an inserted DNA fragment that is shorter than 19 kb, and that includes ( a) RI pair region A, or a pair region that renders the stabilized plasmid incompatible with an otherwise compatible plasmid comprising RI pair region A, (b) RI pair region B, or a pair region that renders the stabilized plasmid incompatible with an otherwise compatible plasmid comprising RI pair region B, or (c) both (a) and (b).

2. Plasmid as stated in claim 1, characterized in that the inserted DNA fragment comprising RI pair region A and RI pair region B has a length that does not exceed 3 kb.

3. Plasmid as stated in claim 1, characterized in that the inserted DNA fragment comprising RI pair region A has a length that does not exceed 2 kb.

4. Plasmid as stated in claim 1, characterized in that the inserted DNA fragment comprising RI pair region B has a length that does not exceed 1 kb.

5. Plasmid as stated in claim 1, characterized in that it is a pl5 plasmid or a derivative thereof, or a promiscuous plasmid with a high copy number, or a derivative thereof.

6. Plasmid as stated in claim 1, characterized in that it is unstablely inherited due to the fact that it carries a DNA fragment comprising one or more genes that are not naturally associated with the plasmid.

7. Plasmid as stated in claim 6, characterized in that it is a pMB1 plasmid or a derivative thereof, e.g. a pBR322 plasmid or a derivative thereof.

8. Plasmid as stated in claim 1, characterized in that, at least in one stage during the cultivation of bacteria containing the plasmid, it has a low copy number.

9. Plasmid as stated in claim 8, characterized in that it has a copy number of approx. 0.5-5 copies per cell.

10. Plasmid as stated in claim 8 or 9, characterized in that it is selected from among plasmids of the incompatibility group IncFII, including RI and derivatives thereof; F and derivatives thereof; and low copy number promiscuous plasmids, and derivatives thereof.

11. Plasmid as stated in claim 8 or 9, characterized in that it is a conditional "runaway" replication plasmid.

12. Method for producing a gene product of plasmid DNA, characterized in that bacteria containing a plasmid according to any of claims 1 to 11 are cultivated for at least 100 generations of the bacteria, the loss of the plasmid being less than 2 x 10 "<4>/cell/generation, and the gene product of the plasmid is recovered from the bacterial culture.

13. Method as stated in claim 12, characterized in that the loss of the plasmid is less than 10"<5>/cell/generation.

14. Method as stated in claim 13, characterized in that the loss of the plasmid is less than 5 x 10"<6>/cell/generation.