NO170891B - Fremgangsmaate ved isolering av nukleinsyrer - Google Patents

Description

Ved isolering av nukleinsyrer som f.eks. desoksyribonukleinsyre (DNA) eller ribonukleinsyre (RNA), fra biologisk vev eller celler f.eks. for forskningsformål eller for diagnos-tiske formål, må disse skilles fra de øvrige vev eller cellebestanddeler, som f.eks. proteiner, lipider o.s.v. For dette formål kan først et vevs- eller celleekstrakt bli fremstilt, hvorfra nukleinsyrene kan bli fraskilt i et to-fasesystem (Mainvaring et al., i "Nucleic Acid Biochemistry and Molecular Biology", Blackwell Scientific Publications Oxford (GB), s. 75-76 [1982]). De følgende to metoder er de mest anvendbare og de kan også bli kombinert (Maniatis et al., i "Molecular Cloning - A Laboratory Manual ", Cold Spring Harbor Laboratory, s. 458-460 [1982]). Ved den ene metode anvender man et vann/fenol-to-fasesystem hvor proteiner og peptider i den organiske fase enten blir felt ut eller oppløst mens nukleinsyrer i den vandige fase blir holdt tilbake såfremt en bestemt saltkonsentrasjon og nøytral pH blir opprettholdt. Med den andre metode dreier det seg om en kloroform/isoamylalkohol eller kloroform/- oktanol-metode hvor nukleinsyrene eventuelt blir tilbake i den vandige fase mens denaturerte andre makromolekyler blir utskilt i grensesjiktet mellom fasene.

Vesentlig for isoleringen av nukleinsyrer ifølge disse metoder med to-fasesystemer er det at de vandige og organiske faser først blir grundig blandet og derpå må de igjen bli adskilt. For å oppnå en raskere faseadskillelse blir de fortrinnsvis sentrifugert. Ved isolasjonen av ikke aktiv kromosomal desoksyribonukleinsyre (DNA) må det i tillegg bli passet på at DNA ved blandingen ikke blir brutt opp i små bruddstykker via skjærekrefter.

Etter faseadskillelsen blir den organiske fase fjernet og om nødvendig blir den vandige fase på nytt ekstrahert med et likt volum fenol, kloroform/isoamylalkohol eller kloroform/- oktanol. Ekstraksjonen av den vandige fase med den organiske fase blir utført inntil nukleinsyrene kan bli felt ut i ren form med alkohol (f.eks. etanol eller isopropanol) fra den vandige fase. I alle fall betinger ekstraksjonen av nukleinsyrer på den ovenfor beskrevne måte ved flere gangers blanding og sentrifugering lang utføringstid.

Det er nå funnet at nukleinsyrene overraskende også kan bli isolert ved en enkel felling med et vannløselig keton fortrinnsvis med aceton fra et fortrinnsvis protease-behandlet celle- eller vevsekstrakt. De utfelte nukleinsyrer kan fraskilles ved filtrering eller sentrifugering. De således isolerte nukleinsyrer kan om nødvendig bli vasket flere ganger med alkohol fortrinnsvis med 70% v/v etanol i vann. Eventuelt kan nukleinsyrepresipitatet også før vaskingen med alkohol nok engang bli oppløst i vann eller en bufferløsning f.eks. i STET-buffer inneholdende 8 % sakkarose, 5% triton x-100, 50 itiM etylendiamintetraeddik-syre-dinatriumsalt (EDTA) og 50 mM tris/ HCL (pH 8,0), og til slutt på nytt bli utfelt med aceton.

Oppfinnelsen angår således en fremgangsmåte ved isolering av nukleinsyrer fra et vandig celle- eller vevsekstrakt, som er særpreget ved at nukleinsyrene blir utfelt og adskilt slik som angitt i krav l<*>s karakteriserende del. ;Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen egner seg for isolering av nukleinsyrer fortrinnsvis av høymolykylær DNA fra et celle- eller vevsekstrakt av pro- eller eukaryoter. Det høymolekylære DNA kan være kromosomalt eller ekstrakromosomalt DNA. Eksempler på ekstrakromosomalt DNA er plasmid-DNA, virus-DNA eller mitrokondrielt DNA. ;Celle- og vevsekstrakter kan bli fremstilt ved at celle-eller vevstrukturen blir brutt ned enten mekanisk, kjemisk eller enzymatisk. Med dette kan kjente metoder innen biokjemien bli brukt (sammenlign f.eks. Mahler et al., Biologial Chemistry, New York, s. 389-403 [1969] Harper & Row , New York). Eventuelt kan også subcellulære fraksjoner som f.eks en cytoplasma- eller en cellekjerne-fraksjon fungere som utgangsmateriale . For å hindre DNA-nedbrytning av nukleaser kan disse bli brutt ned med detergenter (f.eks triton x-100, natriumdodecylsulfat (SDS), o.s.v.) fortrinnsvis med SDS, og proteinene innebefattende nukleasene kan nedbrytes av proteaser (f.eks. pronase, proteinase K eller andre uspesifikke proteinaser som er aktive i nærvær av detergenter) (reaksjonsbetingelser se Maniatis et al., supra). ;Proteinasebehandlingen kan gjennomføres ved romtemperatur eller ved en annen temperatur. Fortrinnsvis blir det arbeidet ved en annen temperatur som er optimal for akti-viteten til proteasen, d.v.s ved anvendelse av proteinase K eller pronase ved en temperatur på en ca 37"C til 45°C.Proteinase K er også fremdeles aktiv ved en temperatur på 65°C (Maniatis et al., supra, s. 85). Det således erholdte celle-eller vevsekstrakt kan eventuelt bli fortynnet og nukleinsyrene bli felt ut ved tilsetning av vannløselig keton, fortrinnsvis aceton. For å fremskaffe fellingen av nukleinsyrene, må det bli anvendt en minste-mengde av vannløselig keton. For det andre må mengden vannløselig keton ikke være så stor eller vann-andelen ikke være så liten at ytterlige bestandeler av celle- eller vevsekstrakt f.eks. peptider, proteiner o.s.v. blir utfelt. Den optimale mengde vannløselig keton som er nødvendig for felling av nukleinsyrene, men ikke av de andre bestandeler av celle- eller vevsekstraktet, kan lett finnes av fag-mannen. Fortrinnsvis blir nukleinsyrene, spesielt desoksy-ribonukleinsyrene, felt ut ved tilsetning av et overskudd på minst 60% vandig aceton utregnet fra volumet til celle-eller vevsekstraktet. Spesielt foretrukket er tilsetningen av 10 volumdeler 70% vandig aceton. F.eks. kan en del av celle- eller vevsekstrakt inneholde ca 0,6 til 300 pg DNA i 0,5 til 3 ml STET-buffer bli tilsatt 10 deler av en minst 60%ig fortrinnsvis 70%ig aceton/vannløsning (v/v). Isteden-for aceton kan også et lignende vannløslig keton som f.eks. 2-butanon, 2-pentanon, 3- pentanon eller 3-metylcyclo-pentanon bli anvendt. Foretrukne ketoner er imidlertid ;dimetylketon eller aceton. ;For økning av løsligheten til cellebestandelene som ikke er nukleinsyrer, kan den vandige acetonløsningen eventuelt inneholde ytterlige organiske løsningsmidler forutsatt at utfellingen av nukleinsyrene ved en slik tilsetning ikke blir hemmet. F.eks. bevirker tilsetningen av inntil 0,1 volumdeler fortrinnsvis 0,05 volumdeler dimetylformamid eller formamid til den vandige aceton løsning en økning av løsligheten av små peptider. Dårlig vannløselige peptider blir derved holdt i løsning og nukleinsyrene blir utfelt i renere form. For det andre medvirker tilsetningen av dimetylformamid en mer langsom utfelling. Dette har til følge at nukleinsyrene felles ut i enda renere form. Ved fellingen av nukleinsyrer fra fortynnet løsning kan eventuelt tilsetningen av dimetylformamid eller formamid bli sløyfet for ikke å forlenge fellingen av nukleinsyrene for sterk. ;Utfellingen av nukleinsyrer følger spontant etter tilsetning av acetonløsning. Eventuelt kan beholderen som inneholder blandingen bli beveget forsiktig f.eks. med en ristende bevegelse. ;Beholderen som blir anvendt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, bør minst være resistent mot de anvendte løsningsmidler i løpet av varigheten til fremgangsmåten, og fortrinnsvis blir beholdere av glass,"teflon" eller polypro-pylen anvendt. ;De utfelte nukleinsyrer kan filtreres av eller bli fjernet på annen måte f.eks. ved sentrifugering og avsluttende fjerning av det overstående fra løsningen. ;Ut fra kravene om renhet kan nukleinsyrene enten bli anvendt direkte eller bli underkastet en ytterligere opprenskning. For ytterligere opprenskning kan nukleinsyrene på nytt bli oppløst i en bufferløsning og på nytt bli utfelt som ovenfor beskrevet med alkohol f.eks. med etanol eller isopropanol som besekrevet av Maniatis et al. (supra, s. 461-4 62). Fellingen kan bli gjentatt en eller flere ganger. De utfelte nukleinsyrer kan til slutt bli vasket med alkohol, fortrinnsvis med 70%ig etanol (v/v) i vann, og eventuelt nok en gang med absolutt alkohol f.eks. etanol og eventuelt bli tørket i vakuum eller under en lett nitrogenstrøm. Eventuelt kan nukleinsyrene også bli dialysert for ytterlig opprenskning (f.eks. mot lOmM tris/HCl (pH 7,8), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). ;Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen blir fortrinnsvis utført ved romtemperatur eller i et kjølerom (f.eks. ved 4'C). ;DNA som blir isolert med fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, er stabilt også ved lengre inkubasjon ved romtemperatur eller ved 37°C. Det kan også bli spesifikt spaltet med restriksjonsenzymer og er biologisk aktivt. ;For bestemmelse av renheten av den erholdte nukleinsyre kan forholdet til UV-absorpsjon ved bølgelengder på 260 nm og 280 nm bli målt. ;De følgende figurer og de etterfølgende eksempler illus-trerer forskjellige utførelseformer av foreliggende oppfinnelse, men skal på ingen måte bli betraktet som be-grensende. ;Fig. 1 ;DNA, hvert fra N x IO<6> celler (muse monozyt-makrofageelle-linje j774A.l. ATCC Nr. TIB 67), som på forhånd hadde blitt merket i løpet av 2 timer med [<3>H]-tymidin (5 Ci/mmol, l jiCi/ml kulturmedium, 6 x IO<5> celler/ml) , ble enten utfelt direkte med iskald trikloreddiksyreoppløsning på "Whatman" GF/C filter eller isolert ifølge eksempel 1. Det relative utbyttet ble bestemt ved måling av radioaktiviteten (cpm) av det på filteret utfelte (x) eller ifølge metode 1 isolerte DNA ( ).Det viser seg at DNA fra et celletall i området fra 1 x IO<6> til 1,6 x IO<7> kan bli isolert praktisk talt kvantitativt med metoden ifølge oppfinnelsen. ;Fig. 2 ;DNA, hvert fra N x IO<6> celler (muse monocytt-makrofagcelle-linje ;J774A.1, ATCC Nr. TIB 67) ble isolert ifølge eksempel 1 og den erholdte mengde DNA (optisk tetthet ved 260nm = OD260) ble tegnet opp, avhengig av celleantallet (N x IO<6>) som ble satt inn ved ekstraksjonen. ;Eksempel 1 ;1 x IO<7> celler fra en B-cellelinje ble lysert i et polypro-pylenrør (Falcon 2059, 17 x 100 mm) ved tilsetning av 1 ml lyseringsbuffer (50 mM Tris/HCl (pH 9-10), lOOmM EDTA, 1% SDS). Proteinene ble fordøyet ved tilsetning av 100 pl av en 20 mg/ml pronaseoppløsning i løpet av 90 minutter ved 37°C. Tilslutt ble, ved romtemperatur, 10 ml oppløsning P bestående av 95 volumprosent 70% aceton i vann (v/v) og 5 volumprosent dimetylformamid (DMF) tilsatt. Blandingen ble så godt blandet ved skakende bevegelser av rørene i løpet av 5 minutter ved romtemperatur. Ved dette dannet de ellers lange DNA kjeder en liten klump. DNA materialet ble filtrert av og derpå vasket først 3 ganger med 70%ig etanol i vann og derpå 2 ganger med absolutt etanol. DNA materialet ble tørket med en nitrogenstrøm og tilslutt oppløst i 1,0 ml vann. Utbytte: 100 jag, <A>26o/<A>280 = 1/8- Det isolerte DNA var stabilt i løpet av flere dager (agarose-gelelektroforese ifølge Maniatis et al., supra, s. 150-161). ;Eksempel 2 ;100 ml av en overnattings-kultur av e.coli K 802 (ATCC Nr. 33526) inneholdene plasmid pAG60 (Traunecker, Immunol. Methds, 3, 55-67 [1985]) ble sentrifugert ved 4000 g i løpet ;av 10 minutter ved 4'C og cellene i sedimentet ble lysert ifølge metoden til Maniatis et al. (supra, s. 89-91). Cellelysater (2 ml) ble tilsatt 10 ml løsning P og DNA isolert som i eksempel 1. Utbytte: 200 >ig, A26o/<A>280 = l/83-Det isolerte DNA var stabilt over flere dager og lar seg spalte med forskjellige restriksjonsenzymer. ;Eksempel 3 ;DNA fra 1,5 x IO<7> celler av en makrofag-tumorcellelinje ble, som beskrevet i eksempel 1, felt ut under anvendelse av 3 forskjellige sammensetninger av oppløsning P. ;Forsøk A: Løsning P = 70% aceton i vann (v/v) ;Forsøk B: Løsning P = 95 volumprosent 70% aceton i vann ;(v/v) og 5 volumprosent dimetylfomamid Forsøk C: Løsning P = 95 volumprosent 70% aceton i vann ;(v/v) og 5 volumprosent formamid. ;Tilslutt ble DNA filtrert av og vasket 3 ganger enten med 70% etanol eller med 70% isopropanol. Det tørkede DNA ble oppløst i l ml TE-buffer (20 mM tris/HCl (pH 7,6), 2mM EDTA). Det viste seg at i alle forsøk kunne DNA-materialet bli isolert praktisk talt kvantitativt og var fordøybart med restriksjonsenzymer (f.eks. med EcoRl). DNA-materialet var stabilt i løpet av minst 18 timer ved inkubasjon ved 4°C, ved romtemperatur og ved 37<*>C, noe som tyder på at det isolerte DNA er fritt for nukleaser.

Claims (8)

1. Fremgangsmåte ved isolering av nukleinsyrer fra vandige celle- eller vevsekstrakter, karakterisert ved at den omfatter: (a) å behandle et vandig celle- eller vevsekstrakt med et overskudd på minst 60 volum%, basert på volumet av celle-eller vevsekstraktet, av et vannoppløselig keton for å felle ut nukleinsyrene; og (b) å isolere de utfelte nukleinsyrer fra ekstraktet.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at nukleinsyrene er deoksyribonukleinsyrer.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det vannoppløselige keton er aceton, 2-butanon, 2-pentanon, 3-pentanon og/eller 3-metylcyklopentanon.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det vannoppløselige keton er aceton.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det vandige celle-eller vevsekstrakt behandles med et overskudd på minst 60% vandig aceton basert på volumet av celle- eller vevsekstraktet.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det vandige celle-eller vevsekstraktet behandles med 10 volumdeler av 70% vandig aceton basert på volumet av celle- eller vevsekstraktet .

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det vandige celle-eller vevsekstraktet behandles med et overskudd på minst 60% av vandig aceton basert på volumet av celle- eller vevsekstraktet, og hvor den vandige acetonoppløsning ytterligere omfatter 0,05 til 0,1 volumdeler dimetylformamid, formamid eller et lignende aprotisk polart oppløsnignsmiddel.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det vandige celle-eller vevsekstraktet behandles med 10 volumdeler av 70% vandig aceton basert på volumet av celle- eller vevsekstraktet, samt hvor den vandige acetonoppløsning ytterligere omfatter 0,05 til 0,1 volumdeler dimetylformamid, formamid eller et lignende aprotisk polart oppløsnings-middel.