NO169820B - Fremgangsmaate for fremstilling av en mastittvaksine - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av en mastittvaksine omfattende det eller de antifagocytiske in vivo-antigener som fremstilles av en pseudokapselproduserende stamme av S. aureus, effektiv ved immunisering av drøvtyggere overfor intra-mamma angrep av S. aureus og andre arter av slekten Staphylococcus, og det særegne ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er

(i) dyrking av en pseudokapselproduserende stamme av S.aureus in vitro i et nærende vekstmedium forsterket ved tilsetning av melk, melkemyse eller en annen melkekomponent inneholdende en aktiv bestanddel som finnes i melken eller melkemysen, idet denne aktive bestanddel er i stand til å indusere fremstilling av det eller de antifagocytiske

pseudokapsulære antigener når S. aureus dyrkes in vitro, (ii) deretter inaktiveres bakteriene, og eventuelt (iii) tilsettes et hjelpestoff som fremmer fremstillingen av IgG2 subtype antistoff.

Disse og andre trekk ved oppfinnelsen fremgår av patentkravene.

Mastitt (eller jurbetennelse) er en tilstand som rammer omtrent 25 % av det australske melkefeet, og som er angitt å koste industrien omtrent 50.000.000 dollar hvert år i tapt melkepro-duksjon, frasortering, antibiotika og kostbare behandlinger av bestandene av melkefeet.

Tradisjonelt behandles sykdommen, ved tilsynekomsten av kliniske symtomer, ved infusjon av antibiotika som er aktive mot den infeksiøse organismen Staphylococcus aureus, men en slik behandling er langt fra ideell. Bortsett fra å være mer helbredende enn preventiv, har man økonomiske hensyn slik som nødvendigheten av identifisering og individuell behandling av de berørte dyrene og uhensiktsmessigheten av antibiotikakonta-minert melk til menneskebruk eller videreforedling. Et ytterligere problem er den økende utvikling av antibiotikaresi-stente stammer av S.aureus. Man har derfor vendt oppmerksom-heten mot muligheten av å immunisere dyr overfor infeksjonen.

Man har utført en rekke forsøk med systematisk å immunisere drøvtyggere mot mastittpatogener ved anvendelse av vanlig fremstilte vaksiner som tilføres enten subkutant eller intra-muskulært. Drepte bakterieceller (Derbyshire (1960b)), iso-lerte bakteriecellevegger (Singleton et al. 1967), toksoider, (Minett 1939), drepte celletoksoide preparater (Bracewell og Pattison 1958) er alle blitt utprøvet med og uten immunologiske hjelpestoffer (Derbyshire 1961a). I noen av disse eksperi-mentene har man oppnådd en viss grad av beskyttelse, men totalt sett har resultatene vært skuffende. Sett på bakgrunn av de fremragende resultater for andre systemisk gitte bakterielle vaksiner i drøvtyggere (f.eks. Clostridiale vaksiner, Brucella abortus stamme 19), har det uheldige utfallet for mastittvaksiner generelt blitt tillagt effek-tiviteten av blodmelkebarrieren i å forhindre alle unntatt små mengder av sirkulerende antistoffer i å nå frem til melken (Lascelles og McDowell 1974).

I litteraturen har man hatt rapporter som (til tross for eks-perimentelle begrensninger i hvert tilfelle) er svært inte-ressante pga. den åpenbare suksessen som ble oppnådd ved immunisering av sauer (Bridre 1907) og geiter (Derbyshire

1961b) med levende S.aureus vaksiner (gitt subkutant). I begge disse undersøkelsene ble det rapportert at de vaksinerte dyrene var meget resistente overfor påfølgende intra-mamma angrep med virulent S.aureus. Senere undersøkelser har bekreftet den beskyttende evnen til levende S.aureus vaksine i hunnsauer (Watson and Lee 197 8) og forklart noen av mekanismene som trolig er involvert. Levende S.aureus vaksiner stimulerte syntesen av betydelige mengder IgG2 antistoff som er cytofile for nøytrofiler, og man har direkte bevis for at dette antistoff øker den spesifikke fagocytiske kapasiteten for nøytrofiler overfor S.aureus under in vitro-forhold (Watson 1975b, 1976). I motsetning til levende stafylokokkvaksiner som

hovedsakelig stimulerer syntesen av IgG2 (Kennedy et al 1981, Kennedy og Watson 1982), stimulerer drepte stafylokokkvaksiner som er gitt sammen med oljeaktige hjelpestoffer, produksjonen av hovedsakelig IgG^ antistoff (Yokomizo og Isayama 1978, Kennedy og Watson 1982). Således er i det minste en mulig grunn til de relativt dårlige resultatene med drepte S.aureus vaksiner ved profylakse av stafylokokkmastitt, at de ikke stimulerer syntesen av tilstrekkelige mengder av undergruppen av IgG som formidler beskyttelse gjennom sin opsoniske aktivitet. Videre har nylige studier i ikke-diende hunnsauer vist at en levende S.aureus vaksine var overlegen en drept vaksine med hensyn på å fremme en økende nøytrofil respons i mammakjertelen overfor et påfølgende intra-mamma angrep med levedyktige stafylokokker av en heterolog stamme (Colditz og

Watson 1982a, 1982b). Den levende vaksinen resulterer derfor i at flere nøytrofiler er tilstede etter noen få timers infeksjon og disse cellene er "bevæpnet" med cytofilt IgG2 som øker deres fagocytiske kapasitet overfor stafylokokker. Det gjenstår å bestemme om levende stafylokokkvaksiner kan beskytte mot de ulike S.aureus stammene som kan forårsake mastitt, skjønt nylige forsøk har tilveiebragt oppløftende resultater etter angrep med homologe eller heterologe stammer i både hunnsauer og kviger (Watson og Kennedy 1981, Watson 1984a). Australsk patentansøkning nr. 85929/82 omfatter en levende vaksine som er effektiv ved immunisering av drøvtyggere overfor intra-mamma angrep med homologe eller heterologe stammer av S.aureus, som er fremstilt ved svekkelse av en katalase- og koagulasepositiv stamme av S.aureus av drøvtyggeropprinnelse, ved en rekke overføringer inntil man observerer tap av hemolytisk aktivitet.

Det har i en årrekke vært kjent at de metaboliske og antigeniske egenskapene hos patogene mikroorganismer kan være svært forskjellige ved dyrking in vivo sammenlignet med dyrking in vitro ved standard laboratorieforhold (Beining og Kennedy 1963). In vivo-dyrket S.aureus, som er isolert fra kliniske mastittilfeller, er mer virulent og har vanligvis en antifagocytisk pseudokapsel i motsetning til den samme stafylo-kokkstammen som er dyrket in vitro (Watson Prideaux 1979,

Watson 1982, Norcross og Opdebeek 1983). Disse trekkene tilveiebringer en ytterligere forklaring med hensyn på suksessen med levende S.aureus vaksiner. Organismer som er dyrket i laboratorier og drept med hensyn på vaks.ne vil xkk. inneholde immunogeniske mengder av antifagocytiske pseudo-kapsulsre antigener og derfor er antistoffet som er dannet som "sjon på slike vaksiner ikke rettet mot disse beskyttende antigenene. I motsetning vil in vivo-formering av stafylokokker som er gitt i form av levende vaksme sikre fremsti-lingen av disse "in vivo"-pseudokapsulære antigenene og dannelse av antistoff overfor disse antigenene i dyret.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for fremstilling av en drept vaksine som er

istand til å frembringe virkningsfull immunitet overfor stafylokokkmastitt.

I en større sammenheng tilveiebringer den foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstillin<g> av en en are<p>t vaksine som er effektiv ved immunisering av

drøvtyggere overfor intra-mamma angrep av S.aureus og andre stammer av slekten av Staphylococcus, som omfatter det antifagocytiske in vivo-antigen (antigener) fremstilt ved hjelp av en pseudokapselproduserende stamme av S.aureus.

Som omtalt i det foregående, har man funnet (Watson og Prideaux 1979, Watson 1982) at in vivo-dyrket S.aureus har en forsterket virulens som sannsynligvis skyldes, i det minste delvis, ekspresjonen av antifagocytisk in vivo-antigen som er en egenskap hos pseudokapselproduserende stammer av S.aureus. Generelt er S.aureus ikke en innkapslet bakteriespecies, men innkapslede stammer, som er unntak fra denne regelen, er imidlertid kjent. Dannelsen av en kapsel ved hjelp av slike stammer, når de dyrkes under vanlige laboratorieforhold, kan lett vises ved hjelp av etablerte og vanlig anvendte teknikker (India ink testen - Butt 1936) som identifiserer stammene som innkapslet S.aureus. Stammer av S.aureus som danner en pseudokapsel kan skilles fra slike innkapslede stammer ved at de pseudokapselproduserende stammene er negative overfor India ink testen når de dyrkes under vanlige laboratorieforhold (in vitro) eller ved in vivo-forhold. Når de imidlertid dyrkes under in vivo-forhold eller isoleres fra et klinisk material, vil de produsere en substans på utsiden av celleveggen som i varierende grad er beskrevet som "pseudokapsel" eller "glycocalyx" (Caputy og Casterton, 1982). I de studier som er omtalt i det foregående, har man beskrevet et ytterligere antigen (antigener) i in vivo-dyrket S.aureus som ikke er tilstede når den samme stammen dyrkes under in vitro-betingelser, idet dette ytterligere antigen er identifisert som "in vivo-antigen (antigener)" og utgjør en del av pseudokapselen. Som beskrevet tidligere (Watson 1982), er "in vivo-antigen (antigener)" ikke den samme substansen som det ekstracellulære slimet som fremstilles av S.aureus under visse betingelser, og kan heller ikke sees som en kapselstruktur. Selv om den nøyaktige naturen av "in vivo-antigen (antigener)" ikke ennå er blitt konstatert, er det generelt akseptert at pseudokapselen overveiende er polysakkarider. Man antar imidlertid at minst en vesentlig komponent av pseudokapselen av natur er protein eller glycoprotein, noe som er basert på absorpsjonen ved en bølgelengde på 280 mu, farging av bånd i polyakrylamidgeler og positiv reaksjon med biuretreagens. Et viktig trekk i sammenheng med den foreliggende oppfinnelse er at man tilveiebringer en drept vaksine som omfatter dette in vivo-antigenet (antigener).

Mens man har oppdaget at in vivo-antigen (antigener) er tilstede i pseudokapselmaterialet i en rekke pseudokapselstammer av S.aureus (Watson 1982), vil, i en spesiell foretrukket ut-førelses form av denne oppfinnelsen, den drepte vaksinen omfat-te in vivo-antigen (antigener) som er avledet fra en spesiell stamme som er isolert fra et akutt tilfelle av sauemastitt og identifisert som stamme JG80. Stamme JG80 oppfyller alle krav med hensyn på en drøvtyggermastittstamme av S.aureus i overensstemmelse med "Bergeys Manual of Determinative Bacteriology". Denne stammen er Gram-positiv med druelignende klaser av kuleformede celler, og er karakterisert ved runde, glatte fløtefargede kolonier på blodagar. I tillegg er den både katalase- og koagulasepositiv, og er istand til å produsere syre fra mannitol. Stamme JG80 er en dårlig produsent av a-hemolysin og er en meget sterk produsent av B-hemolysin.

I en foretrukket utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse omfatter vaksinen også et hjelpestoff, i særdeleshet et hjelpestoff som fremmer dannelsen av IgG2 subtypeantistoff. Man har funnet at dekstransulfat er et spesielt effektivt hjelpestoff for anvendelse i vaksinen som fremstilles ved oppfinnelsen og at det i betydelig grad øker den beskyttende immunresponsen. Dette antas å skyldes det faktum at dekstransulfat er en sterkt virkende stimulator av IgG2 antistoff overfor stafylokokkcelleoverflateantigener, idet, som tidligere omtalt, tilstedeværelsen av IgG2 på den nøytro- \ file membran resulterer i økt fagocytose av S.aureus organismer i mammakjertelen hvor nøytrofiler er den viktigste forsvars-mekanismen overfor bakterieinfeksjon.

Som bemerket over, vil stammer av S.aureus som produserer en pseudokapsel når de dyrkes i laboratoriet og drepes for vaksine ikke inneholde det antigeniske material som etterstrebes fremstilt ved den foreliggende oppfinnelse, og den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer derfor en fremgangsmåte for fremstilling av dette antigeniske material ved å utgå fra en ny dyrkingsmetode for de pseudokapselproduserende stammene av S.aureus, som i virkeligheten muliggjør dyrking under "simulerte" in vivo-betingelser.

Sett ut fra en slik synsvinkel for den foreliggende oppfinnelse, har man tilveiebragt en metode for dyrking av en pseudokapselproduserende stamme av S.aureus som går ut på at organismer av ovennevnte stamme av S.aureus dyrkes in vitro i et næringsrikt vekstmedium som er blitt styrket ved tilsetning av melk, melkesyre eller andre melkekomponenter.

Ut fra denne spesielle synsvinkelen for den foreliggende oppfinnelse, er en foretrukket tilsetning til dyrkningsmediumet steril melkemyse, f.eks. etter tilsetning av osteløype, for å styrke mediumet. Den nøyaktige naturen av melken eller melkekomponenten, slik som melkemyse, som er effektiv i styrking av mediumet for å muliggjøre "simulerte" in vivo-betingelser, er ikke kjent. Foreløpige undersøkelser med hensyn på dette synes å indikere at laktosen i den styrkende tilsetningen ikke er den avgjørende faktor i sauemelkemyse for induksjon av in vivo-antigen (antigener) i en in vitro-kultur. Disse undersøkelsene har fastslått at mens anvendelse av laktose alene som et tilsetningsmiddel foranlediger syntesen av en pseudokapsel i en in vitro-kultur, (skjønt den ikke er så effektiv som melkemyse i dette tilfellet), synes laktose ikke å foranledige syntesen av in vivo-antigen (antigener) i det hele tatt.

Når foreliggende oppfinnelse betraktes ut fra dette synspunkt, har man derfor funnet at en styrking av næringsmediumet for vekst ved tilsetning av, f.eks., melkemyse muliggjør in vitro-dyrking av S.aureus på en slik måte at "in vivo-antigen (antigener) " som normalt bare settes i forbindelse med in vivo-kulturer av disse organismene, fremstilles under in vitro-betingelser. For å redusere eller unngå risikoen av autoimmune reaksjoner, er det foretrukket tilrådelig å anvende melkemyse fra en "fremmed" drøvtyggerart, dvs. at for fremstilling av en vaksine for anvendelse i storfe, er det tilrådelig å anvende

saue- eller annen ikke-bovin melkemyse.

Dyrkingen av den pseudokapselproduserende stammen under "simulerte" in vivo-betingelser resulterer i dannelse av in

vivo-antigen (antigener) som del av pseudokapselen som beskrevet ovenfor. Inaktivering av bakterien kan utføres ved hjelp av en rekke kjente midler, f.eks. ved tilsetning av et baktericid slik som formalin etterfulgt av lagring mellom 2°C og 8°C i minst 24 timer. Etter inaktivering av bakterien vil man foretrukket separere cellene fra supernatanten, f.eks. ved

sentrifugering, og cellene oppslemmes deretter i et passende

sterilt bufret medium. Den endelige vaksinen kan også inneholde andre kjente vaksinekomponenter, slik som bakterio-stater.

Idet den vesentlige komponenten av vaksinen i overensstemmelse med oppfinnelsen er in vivo-antigen (antigener) komponenten som er beskrevet i det foregående, foretrekker man at vaksinen enten også omfatter en toksoid komponent som er basert på exotoksiner slik som a- og S-hemolysiner utskilt av S.aureus i en kultursupernatant, eller at en slik toksoid komponent til-føres samtidig med vaksinen fremstilt i overensstemmelse med oppfinnelsen. Det vesentligste toksinet i en slik toksoid komponent er toksinet B-hemolysin, et toksin som produseres av de fleste drøvtyggermastittstammene av S.aureus i en in vitro-kultur. Etter dyrking av bakterien, f.eks. i minst 36 timer i en anriket næringsvæske, kan toksinene lett høstes ved sentrifugering til separate celler og supernatant, etterfulgt av konsentrering av supernatanten ved lyofilisering og toksoi-disering ved kjente metoder, f.eks. med formalin. S.aureus JG80 som er beskrevet i det ovennevnte, er en meget sterk produsent av B-hemolysin, og er en foretrukket stamme for fremstilling av den toksoide komponenten når den dyrkes under betingelser som favoriserer utskillelse av exotoksiner, spesielt ved dyrking under anvendelse av en anriket næringsvæske .

Det vil være gunstig at S.aureus, i tillegg til B-hemolysin, også utskiller andre ekstracellulære produkter slik som enzymer og andre hemolysiner (a-, f- og 6-hemolysiner), og alle slike andre ekstracellulære produkter kan toksoidiseres og innlemmes i den toksoide komponenten som er beskrevet over.

Innlemmelsen av den toksoide komponenten som beskrevet heri, enten i selve vaksinen eller i vaksinasjonskuren, er spesielt fordelaktig for å tilveiebringe en beskyttelse overfor meget toksigene stammer av S.aureus. Således, idet vaksinen fremstilt ved oppfinnelsen som er basert på in vivo-antigen (antigener) tilveiebringer en god beskyttelse når det gjelder lave til moderate toksigene stammer, er beskyttelsen overfor selv høye toksigene stammer vesentlig når den toksoide komponenten er inkludert. Foretrukket er den toksoide komponenten kombinert med in vivo-antigen (antigener) komponenten i en kombinert vaksine. Serologiske undersøkelser har vist at der ikke er noen betydelig forskjell i antistofftitrene overfor in vivo-antigenet (antigener) eller B-hemolysinet når komponenten tilføres samtidig men på separate anatomiske steder (f.eks. for å unngå uønskede påvirkninger mellom lesjonene som er indusert av hver komponent) eller sammen.

Vaksinen fremstilt ved oppfinnelsen kan tildannes slik at den omfatter en "depot"-komponent for å øke retensjonen av det antigeniske material på tilføringsstedet. F.eks. kan mineral-olje tilsettes i tillegg til det foretrukne hjelpestoff, som er dekstransulfat, for å tilveiebringe denne depoteffekten.

Måten vaksinen tilføres på er ikke kritisk, og man kan f.eks. anvende subkutan, intra-kutan og intra-muskulær injeksjon. Vaksinen kan også tilføres intra-mammalt, om ønsket sammen med antibiotika, endelig vil det være ønskelig for den fagkyndige på området at vaksinen fremstilt i overensstemmelse med oppfinnelsen kan kombineres med vaksiner for andre bakterie-slekter for å tilveiebringe en eneste "bredspektret" vaksine.

Oppfinnelsen skal nå beskrives under henvisning til spesifikke eksempler på fremstilling av vaksinen ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen, og anvendelsen derav.

A. FREMSTILLING AV VAKSINE

1. Staphyloccocus aureus (Stamme JG80) ble dyrket fra en utgangskultur i 24 timer i 1 liter "Oxoid" næringsvæske hvortil man hadde tilsatt 10 % (v/v) steril sauemelkemyse. Kulturen ble dyrket ved 37°C med rysting på en bevegelig rysteinnretning. Etter dyrking i 24 timer, ble det tilsatt formalin til en endelig konsentrasjon på 1 % (v/v) og kulturen ble deretter holdt ved 4°C i 24 timer. Cellene ble deretter fjernet ved sentrifugering ved 7000 rpm (en time, 4°C) og supernatanten ble fjernet. Cellene ble resuspendert i steril fosfatbufret 0,9% saltløsning med pH 7,2 og justert til en konsentrasjon på 10<10>/ml spektro-fotometrisk. Tiomersal ble tilsatt til en endelig konsentrasjon på 0,015 % (w/v). Like før vaksinasjonen av dyrene ble dekstransulfat (molvekt = 500.000) (Pharmacia Fine Chemicals) tilsatt til denne vaksinen i en konsentrasjon på 50 mg/ml. Suspensjonen ble rystet kraftig i

omtrent 30 minutter. Denne vaksinen er "Cl".

I det foregående er "v" anført for volumm og "w" for vekt i samsvar med vanlig nomenklatur for volum- henholdsvis vekt-angivelser. 2. Staphyloccocus aureus (stamme JG80) ble dyrket fra en utgangskultur i 48 timer i 1 liter "Oxoid Brain-Heart Infusion" væske. Kulturen ble dyrket ved 37°C og rystet forsiktig på en orbital rysteinnetning. Kulturen ble sentrifugert ved 7.000 rpm i en time ved 4°C, og 800 ml av supernatanten ble konsentrert ved lyofilisering til et volum på 100 ml. Det ble tilsatt 1 ml formalin og prepa-ratet fikk stå ved romtemperatur i minst fire timer. Dette toksoidet ble deretter frosset (-16°C) i 10 ml prøvemengder og opptint like før bruk. Dette er vaksinen "Tl".

B. VAKSINASJON

Syv førstegangsfødende australske Illawarra Shorthorn kviger ble vaksinert omtrent tre uker etter fødselen. Syv like kviger var ikke-vaksinerte kontroller.

Vaksine Cl ble gitt i form av en 1 ml dose subkutant på baksiden av det venstre bakbenet omtrent 50 cm over hasen. Vaksine Tl ble også gitt i form av en 1 ml dose subkutant

på samme stedet på det høyre bakbenet.

To uker senere ble den samme vaksinasjonskuren gjentatt henholdsvis ved siden av de første stedene.

C. UTPRØVNING

Tre uker etter den andre vaksinasjonen ble alle kvigene smittet ved infusjon av omtrent 1000 kolonidannende enheter av S.aureus (stamme Newbould 305) inn i den fremre venstre spenen. Ulike målinger ble utført før og etter bakterieangrepet for å måle effekten av vaksinasjonen på angrepet.

Data som er vist i tabellene 1, 2 og 3 indikerer at vaksina-sjonsprotokollen viser en vesentlig grad av beskyttelse fra angrepsorganismene.

Resultatene fra lignede forsøk i hunnsauer (smittet med

S. aureus stamme JG80 eller Newbould 305) og kuer (smittet med S. aureus stamme 32V) er vist i henholdsvis tabellene 4, 5, 6 og 7.

I det følgende angis en oversikt over litteraturhenvisninger relatert til de anførte steder i beskrivelsen.

LITTERATURHENVISNINGER:

1. Beining, P.R. og Kennedy, E.R. (1963), J. Bact. 8J5 : 73 2. 2. Bracewell, C.D., og Pattison, I.H. (1958), J. comp. Path. 68 : 121. 3. Bridre. J. (1907), Bull. Soc. Cent. Med. Vet. 61 : 500.' 4. Butt, E.M., Bonynge, C.W. og. Joyce, R.L. (1936), J. Inf. Diseases. 58 : 5-9. 5. Caputy, G.G. og Casterton, J.w. (1982), Infect. Immun. 36 : 75 9. 6. Colditz,; I.G. og Watson, D.L. (1982a), Res. Vet. Sei. 33 : 146. 7. Colditz, I.G. og Watson, D.L. (1982b), Microbiol. Immunol. 26 : 1171. 8. Derbyshire, J.B. (1960b), J. comp. Path 7 0 : 222. 9. Derbyshire, J.B. (1961a), J. comp. Path. 7J. 146. 10. Derbyshire, J.B. (1961b), Res. vet. Sei. 2 : 112. 11. Kennedy, J.W., Watson, D.L. og Bennell, M.A.

(1981), Vet. Immunol. Immunopathol. 2 : 367 . 12. Kennedy, J.W. og Watson, D.L. (1982), Aust. J. exp. Biol. Med. Sei . 60 : 64 3 . 13. Lascelles, A.K. og McDowell, G.H. (1984), Transplant Rev. 19 : 170.

14. Minett, F.C. (1939), J. comp. Path. 5_2 : 167.

15. Norcross, N.L. og Opdebeeck, J.P. (1983), Vet. Microbiol. 8 : 397. 16. Singleton, L., Ross, G.W., Stedman, R.A. and Chanter, K.V. (1967), J. comp. Path. 77 : 279.

17. Watson, D.L. (1975), Res. vet. Sei. 19_ : 288.

18. Watson, D.L. (1976), Immunology 31 : 159.

19. Watson, D.L. (1982), Res. vet. Sei 32 : 311.

20. Watson, D.L. (1984), J. Dairy Sei 67 : 2608.

21. Watson, D.L. og Lees, C.G. (1978), Aust. vet. J. 54 : 374. 22. Watson, D.L. o<g>' Prideau, J.A. (1979), Microbiol. Immunol. 2 3,: 543. 23. Watson, D.L. og Kennedy, J.W. (1981), Aust. vet. J. 57 309. 24. Yokomizo, Y. og Isayama, Y. (1978), Microbiol. Immunol. 2:1.

Claims (4)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en mastittvaksine omfattende det eller de antifagocytiske in vivo-antigener som fremstilles av en pseudokapselproduserende stamme av S. aureus, effektiv ved immunisering av drøvtyggere overfor intra-mamma angrep av S. aureus og andre arter av slekten Staphylococcus, karakterisert ved(i) dyrking av en pseudokapselproduserende stamme av S.aureus in vitro i et nærende vekstmedium forsterket ved tilsetning av melk, melkemyse eller en annen melkekomponent inneholdende en aktiv bestanddel som finnes i melken eller melkemysen, idet denne aktive bestanddel er i stand til å indusere fremstilling av det eller de antifagocytiske pseudokapsulære antigener når S. aureus dyrkes in vitro, (ii) deretter inaktiveres bakteriene, og eventuelt (iii) tilsettes et hjelpestoff som fremmer fremstillingen av lgG2 subtype antistoff.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det som pseudokapsel-produserende stamme av S.aureus anvendes stammen JG80.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 eller 2, karakterisert ved at steril melkemyse tilsettes til det nærende vekstmedium.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 - 3, karakterisert ved at det som hjelpestoff anvendes dekstransulfat.