NO168305B - Heterocykliske forbindelser - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremstilling av imidazo-pyridaziner med cytotoksisk aktivitet.

Forskning innen kreftkjemoterapiområdet har medført produksjon av en mengde antisvulstmidler, som har forskjellig virksomhetsgrad. Vanlige klinisk anvendte midler innbefatter adriamycin, aktinomycin D, metotrexat, 5-fluoruracil, cis-platinum, vinkritisin og vinblastin. De til nå tilgjengelige antisvulstmidlene er kjent for å ha forskjellige ulemper, såsom toksisitet imot friske celler og resistens mot visse svulsttyper.

I tillegg til å ha antisvulstaktivitet, er vinkristin en hemmer av mikrotubefunksjonen. Andre forbindelser som har mikrotubehemmende aktivitet og som er blitt rapportert å være potensielle antisvulstmidler er nocodazol, tubulazol og NSC-181928;

Ingen av disse forbindelsene er derimot enda blitt prøvet klinisk.

Det er fortsatt nødvendig med nye og forbedrede anti-svulstmidler .

Det er nå funnet en ny klasse imidazopyridazinderivater som utviser potent anti-svulstaktivitet.

Foreliggende oppfinnelse vedrører en analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive forbindelser

hvori

R<1> står for en fenylgruppe, eventuelt med 1-4 substituenter valgt fra Cj^alkyl, C1_4alkoksy, C1_4alkoksy substituert med <C>1_2alkoksy eller med C1_2alkoksy C1_2alkoksy, fenyl, halogen, mono-Ci_4alkylamino og di-Ci_4<a>lkylamino,

naftyl eventuelt substituert med Ci_4alkoksy,

pyridyl, furyl, tienyl eller en C3_6alkylgruppe;

R<2> står for

fenyl; eller

C-j^alkyl, nevnte C^.^alkyl er eventuelt substituert med C1_4alkoksy, hydroksy, halogen, morfolin, CF3 eller amino, idet nevnte amino er eventuelt substituert med en eller to

<C>1_4-alkylgrupper;

R<3> står for et hydrogenatom eller en C1_4alkylgruppe;

X står for et oksygen- eller svovelatom eller en gruppe -CH2-;

Y står for en gruppe CH2 eller -CH2-CH2-;

eller

X og Y står sammen for gruppen -CH=CH-;

eller et salt eller fysiologisk funksjonelt derivat derav, kjennetegnet ved at man

(A) omsetter et pyridazinderivat med generell formel (II): (hvori R<1>, X og Y er som definert i krav 1) med en forbindelse med generell formel (III):

(hvori R<2> og R<3> er som definert ovenfor og Z står for et halogenatom);

(B) omsetter en forbindelse med formel (VI):

der R<1>, X og Y er som definert ovenfor med en hensiktsmessig alkohol R<2>OH, der R<2> er som definert ovenfor,

(C) omsetter en forbindelse med formel (VII)

med et haloformat med formelen Hal-CC^R<2> hvori R<2> er som

definert ovenfor;

idet hvilken som helst av reaksjonene (A) - (C) blir etterfulgt om ønskelig av alkylering av en forbindelse med formel (I) der R<3> er hydrogen for å tilveiebringe en forbindelse med formel (I) der R<3> er C^_4alkyl.

Eksempler på egnede heterocykliske ringer innbefatter tienyl-, furyl- og pyridylringer.

Hvis ikke noe annet er Indikert, kan alkylgruppene R<*> og R<2 >som er tilstede i den generelle formelen (I) være rett eller forgrenede kjedealkylgrupper.

Visse forbindelser med formel (I) kan danne salter. Forbindelsene (I) som inneholder en basisk aminogruppe kan danne salter med syrer, og forbindelser som Inneholder en sur gruppe kan danne salter med baser.

Egnede syreaddisjonssalter innbefatter de som blir dannet fra saltsyre, hydrobromsyre, salpetersyre, perklorsyre, svovel-syre, sitronsyre, vinsyre, fosforsyre, melkesyre, benzosyre, glutaminsyre, oksalsyre, asparaginsyre, pyrodruesyre, eddiksyre, ravsyre, fumarsyre, melkesyre, oksaleddiksyre, isetionsyre, stearinsyre, ftalsyre, metansulfonsyre, p-toluensulfonsyre, benzensulfonsyre, laktobionsyre og glukuronsyre. Egnede basesalter innbefatter uorganiske basesalter såsom alkalimetall (f.eks. natrium- og kalium-salter) og alkaliske Jordmetaller (f.eks. kalsiumsalter); organiske basesalter f.eks. fenyletylbenzylamin, dibenzyl-etylendiamin, etanolamin og dietanolsalter; og aminosyre-salter f.eks. lysin og arginin. Saltene vil fortrinnsvis være farmasøytisk akseptable..

En spesielt foretrukket gruppe av forbindelser med formel (I) er de hvori R<1> står for en fenylgruppe og kan være substituert med 1 til 4 substituenter valgt fra C1_4~alkoksy (f.eks. metoksy eller etoksy), C1_4~alkyl (f.eks. metyl, etyl, n-propyl, i-propyl, n-butyl eller t-butyl), og halogen (f.eks. brom eller klor).

R<2> står for en C^_4~alkylgruppe (fortrinnsvis metyl eller etyl);

R<3> står for hydrogen eller metyl; og

Y-X står for -C^O-gruppen; og

salter og fysiologisk funksjonelle derivater derav.

Spesielt foretrukne forbindelse fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse på basis av deres aktivitet, innbefatter: metyl-N-[6-(3,4,5-trimetoksybenzyloksy)imidazo[l,2-b]pyridazin-2-yl]karbamat,

metyl-N-[6-(3,5-dimetoksybenzyloksy)lmldazo[l,2-b]pyridazin-2-yl]karbamat,

metyl-N-[6-(2,5-dimetoksybenzyloksy)Imidazo[l,2-b]pyridazin-2-yl]karbamat,

metyl-N-[6-(1-naftylmetyloksy)lmidazo[l,2-b]pyridazin-2-yl]karbamat,

metyl-N-[6-(3-metylbenzyloksy)lmldazo[l,2-b]pyrldazin-2-yl]karbamat,

metyl-N-[6-(2,3-dimetoksybenzyloksy)lmldazo[l,2-b]pyrldazin-2-yl]karbamat,

metyl-N-[6-(2,5-dlmetylbenzyloksy)imldazo[l,2-b]pyrldazin-2-yl]karbamat,

etyl-N-[6-(2,5-dimetoksybenzyloksy)lmidazo[l,2-b]pyridazin-2-yl]karbamat,

etyl-N-[6-(3,4,5-trimetoksybenzyloksy)imidazo[l,2-b]pyridazin-2-yl]karbamat,

metyl-N-metyl-N-[6-(3,4,5-trimetoksybenzyloksy)imidazo-[1,2-b]pyridazin-2-yl]karbamat,

metyl-N-[6-(2-brom-3,4,5-trimetoksybenzyloksy)imidazo[l,2-b]-pyridazin-2-yl]karbamat,

n-propyl-N-[6-(3,4,5-trimetoksybenzyloksy)imidazo[l,2-b]pyridazin-2-yl]karbamat,

n-butyl-N-[6-(3,4,5-trimetoksybenzyloksy)imidazo[l,2-b]pyridazin-2-yl]karbamat,

2-metoksyetyl-N-[6-(3,4,5-trimetoksybenzyloksy)imidazol-[1,2-b]pyridazin-2-yl]karbamat,

metyl-N-[6-(3,5-dimetoksy-4-etoksybenzyloksy)imidazo[l,2-b]-pyridazin-2-yl]karbamat og

fysiologisk funksjonelle derivater derav.

I tillegg til de ovenfor beskrevne egenskapene, har flere av de foretrukne forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen vist at de utviser aktivitet mot en mengde humane svulst-cellelinjer in vitro (DLD-1 human tykktarmkarsinoma, WiDr human tykktarmadenokarsinoma, HCT-116 human tykktarmkarsinoma og A549 human lungekarsinoma) og som indikerer at forbindelsene har en vidspektret anti-svulstaktivitet.

En spesielt foretrukket forbindelse på basis av dets aktivitet er metyl-N-[6-(3,4,5-trimetoksybenzyloksy)imidazo-[1,2-b]pyridazin-2-yl]karbamat, og fysiologisk funksjonelle derivater derav. Denne forbindelsen har vist å utvise god aktivitet mot forskjellige murine svulster in vivo (B16 melanoma og L1210 leukemia). Den har også en fordelaktig god aktivitet in vivo mot P388-stammer som er resistent mot de fleste klinisk anvendte anti-svulstmidler innbefattende cyklofosfamid, metotrexat, aktinomycin D, vinkristin, adriamycin, 5-fluoruracil, cis-platinum, bis-klornitrosourea og amsacrin. Det er antatt at adriamycin, vinkristin og aktinomycin D-resistente svulster til og med er resistente til en mengde anti-svulstmedikamenter.

Uten å være bundet til noen teori, er det antatt at visse forbindelser fremstilt I henhold til oppfinnelsen virker som pro-medikamenter. Forbindelsene med formel (I) hvori R<3> er en alkylgruppe har dermed høyere aktivitet in vivo enn det som ville være ventet på basis av deres in vitro-aktivitet, og det er antatt at de blir omdannet In vivo til en forbindelse med formel (I) hvori R<1> er hydrogen.

Den generelle fremgangsmåten (A) kan hensiktsmessig bli utført i et aprotisk oppløsningsmiddel, såsom dimetylformamid, 1,3-dimetylImidazolidinon eller heksametylfosforamid, og ved en ikke-ekstrem temperatur, f.eks. ved mellom 50-120°C.

Forbindelser med formel (II) hvori X og Y sammen står for-CH-CH-gruppen kan bli fremstilt fra en forbindelse med formel (IX) ved påfølgende reaksjoner med et halogenerende middel såsom fosfortriklorld og ammoniakk.

Forbindelser med formel (IX) kan bli fremstilt ved omsetning av et hensiktsmessig arylaldehyd R^HO med 3-oksopentansyre (laevulinsyre) i nærvær av en base i vannholdig alkohol etterfulgt av reaksjon med hydrazin under sure betingelser for å tilveiebringe en forbindelse med formel (X):

som kan bli dehydrogenert f.eks. ved anvendelse av selendioksyd i en alkohol f.eks. etanol for å tilveiebringe en forbindelse med formel (IX). <

Når det er ønskelig å fremstille forbindelser med formel (II) hvori X og Y begge er metylengrupper, må etenylbestanddelen i forbindelsen med formel (IX) eller (X) først bli redusert, f.eks. ved katalytisk hydrering ved anvendelse av f.eks. palladium-på-trekull.

Forbindelser med formel (III) kan bli fremstilt ved omsetning av korresponderende halogenacetamid med formel (XI):

med oksalylklorid, og en alkohol, R<2->OH, i henhold til velkjente fremgangsmåter.

Den generelle fremgangsmåten (C) kan bli utført ved oppvarming av en forbindelse (VI) til en temperatur i området 80 til 150°C, eventuelt i nærvær av et oppløsningsmiddel, og omsetning med en alkohol R<2>0H.

Egnede oppløsningsmidler innbefatter inerte organiske oppløsningsmidler såsom hydrokarboner f.eks. benzen eller toluen. Alternativt kan alkoholen R<2>0H i seg selv virke som et oppløsningsmiddel.

Det er antatt at fremgangsmåte (C) forløper via et isocyanat-derivatmellomprodukt med formel (XII):

Acyl-azidderivater med formel (VI) kan bli fremstilt fra de korresponderende karboksylsyrene ved dannelse av et aktivert syrederivat, (f.eks. et syrehalogenid såsom syreklorid som er dannet ved omsetning med et halogenerende middel såsom oksalylklorid, tionylklorid eller fosforpentaklorid) etterfulgt av omsetning med et azid, f.eks. et alkalimetall-azid, fortrinnsvis i en vannholdig eteroppløsning f.eks. vannholdig dioksan. Karboksylsyrederivater som korresponderer med forbindelsene (VI) kan i seg bli fremstilt ved omsetning av en forbindelse med formel (II) med etylbrompyruvat ved anvendelse av analoge betingelser som den generelle fremgangsmåten (A) ovenfor, for å tilveiebringe en ester, etterfulgt av hydrolyse for å tilveiebringe den ønskede syren.

Forbindelser med formel (VII) kan i seg selv bli fremstilt fra en forbindelse med formel (I) ved fjerning av en -Celle-gruppe, (fortrinnsvis en labil gruppe såsom t-butoksy-karbonyl) under sure betingelser (ved f.eks. anvendelse av en eventuelt halogenert karboksylsyre såsom maursyre, klorform-syre eller trifluoreddiksyre), eventuelt i et oppløsnings-middel, f.eks. et halogenert hydrokarbon slik som diklormetan.

Omdanning av en forbindelse med formel (I) til en annen forbindelse med formel (I) i henhold til den generelle fremgangsmåten kan bli f.eks. oppnådd ved erstatning av en forestrende gruppe R<2> i forbindelsen med formel (I) med en annen R<2->gruppe ved oppvarming av en forbindelse (I) med en hensiktsmessig alkohol i nærvær av en base, f.eks. et alkalimetallalkoKsyd såsom kalium-t-butoksyd, ved en temperatur i området 50 til 180°C. Et slikt esterutbytte kan bli utført som et separat reaksjonstrinn, men det kan også bli utført i løpet av forløpet til reaksjonen mellom en forbindelse med formel (IV) med en forbindelse (V) i henhold til den generelle fremgangsmåten (B).

Forbindelsene med formlene (II - VII) er mellomprodukter.

Forbindelser fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse er nyttige for behandling av svulster. De kan bli anvendt til behandling av forskjellige kreftformer innbefattende leukemi, lymfomer, sarkomer og faste svulster.

Oppfinnelsen vil nå bli illustrert ved følgende eksempler.

Alle temperaturer er i °C.

Proton-kjernemagnetisk resonansspektra ble tilveiebragt i en "Bruker AH200 FT NMR"- eller "Bruker HFX90 FT NMR"-maskin.

Følgende forkortelser blir anvendt til fremstillingene og eksemplene.

DME - dimetoksyetan

DMEU - 1,3-dimetyl-2-imidazolidon

LAH - litiumaluminiumhydrid

FREMSTILLING AV MELLOMPRODUKTER

Mellomprodukt 1

3- amino- 6-( 3. 4. 5- trlmetoksybenzyloksy) pyrldazln 3,4,5-trimetoksybenzylalkohol (Aldrich, 19,82 g, 0,1 mol), løst opp i DME (20 ml), ble tilsatt i løpet av 15 min. til en suspensjon bestående av kalium-t-butoksyd (11,22 g, 0,1 mol) i DME (80 ml) med omrøring under N2 og avkjøling i et is-bad. Etter 0,5 t. ble blandingen behandlet med 3-amino-6-klorpyri-dazin ("Heiv. Chim. Acta." 1954, 37, 121, J. Druey, Kd. Meier og K. Eichenberger) (12,95 g, 0,1 mol) og etter 1,5 t. ble den oppvarmet under tilbakestrømning i 3 t. Blandingen ble avkjølt og filtrert og det filtrerte faste stoffet ble vasket med eter. Filtratet ble fordampet under vakuum for å tilveiebringe en olje som var fordelt mellom etylacetat og vann. Den organiske fasen ble vasket med vann, tørket (Na2S04) og fordampet for å tilveiebringe en olje (A) som ble kromatografert på silisiumoksydgel eluerende med 556 metanol-kloroform. Eluerte fraksjoner ble slått sammen for å

tilveiebringe en olje (B) som ble triturert med kloroform og diisopropyleter for å tilveiebringe tittelforbindelsen som et off-white faststoff (9,44 g), sm.p. = 142-144°;

NMR SH (CDCI3): 6,87 (1H, JAB 8,8 Hz, 5-H), 6,78 (1H, <J>AB 8,8 Hz, 4-H), 6,72 (2H, s, PhH), 5,38 (2H, s, CH2), 4,45 (2H, br s, NH2), 3,87 (6H, s, OMe) og 3,84 (3H, s, OMe).

Mellomprodukt 2

3- amlno- 6-( 2. 5- dimetoksybenzyloksy) pyridazln

2,5-dimetoksybenzylalkohol (30,6 g, 0,182 mol) i DME (20 ml) ble satt til kalium-t-butoksyd (20,38 g, 0,182 mol) i DME (60 ml) med omrøring under N2 og avkjøling i et is-bad. Etter 0,5 t., ble blandingen behandlet med 3-amino-6-kloropyridazin og etter 1,5 t. ble den oppvarmet under tilbakestrømning i 5 t., deretter avkjølt og filtrert. Filtratet ble fordampet under vakuum og fordelt mellom etylacetat og vann. Den organiske fasen ble vasket med vann, tørket (Na2S04) og fordampet for å tilveiebringe et faststoff (A) som ble omkrystallisert fra toluen for å tilveiebringe et faststoff (B). Denne ble kromatografsert på silisiumoksydgel, eluerende med 5% metanol-kloroform for å tilveiebringe tittelforbindelsen som et hvitt faststoff (27 g), sm.p. - 94-94,5°.

NMR SH (CDCI3): 7,05 (1H, m, PhH), 6,90-6,73 (4H, m, ArH), 5,42 (2H, s, CH2), 4,5 (2H, brs, NH2) og 3,78 og 3,75 (6H, s, OMe ).

Mellomproduktene 3 til 12

Følgende forbindelser ble fremstilt fra den hensiktsmessige alkoholen ved bruk av den generelle fremgangsmåten beskrevet for mellomproduktene 1 og 2: (3) 3-amino-6-(1-naftylmetyloksy)pyridazin, sm.p. 143-144°, NMR SH (d6-DMS0): 8,00 (3H, m, naft H), 7,55 (4H, m, naft H), 6,97 (1H, JAB 8,8 Hz, 4-H), 6,89 (1H, JAB8,8 Hz, 5-H), 6,00 (2H, s, CH2) og 5,80 (2H, s, NH2).

(Fra 1-naftylmetanol, Aldrich)

(4) 3-amino-6-(3-metoksybenzyloksy)pyridazin, sm.p. 55-60°, NMR SH (d6-DMS0): 7,38 (1H, dd, J 8-4 Hz, PhH), 7,13-6,89 (5H, m, ArH), 6,05 (2H, s, NH2), 5,35 (2H, s, CH2) og 3,82 (3H, s, OMe). (5) 3-amlno-6-(3,5-dimetoksybenzyloksy)pyridazln, sm.p. 89-92° ,

NMR SH (d6-DMSO): 6,88 (1H, JAB 8,8 Hz, 5-H), 6,75 (1H, JAB 8,8 Hz, 4-H), 6,62 (2H, d, 2'-H og 6'-H), 6,42 (1H, t, 4'-H), 5,35 (2H, s, CH2), 4,53 (2H, br.s, NH2) og 3,75 (6H, s, OMe).

(6) 3-amino-6-(3-metylbenzyloksy)pyridazin,

NMR SH (d6-DMS0): 7,40-7,10 (4H, m, PhH), 6,90 (2H, JAB 8,8 Hz, 4-H og 5-H), 5,91 (2H, br.s., NH2), 5,17 (2H, s, CH2) og 2,31 (3H, s, Me); M/Z 215 (M<+>, 30*): 198 (9), 123 (23), 111 (31) og 105 (100 ). (7) 3-amino-6-(3-dimetylaminobenzyloksy)pyridazin, sm.p. 127-129°,

NMR SH (d6-DMS0): 7,25 (1H, t, 5'-H), 7,00 (1H, JAB 8,8 Hz, 4-H), 6,92 (1H, JAB 8,8 Hz, 5-H), 6,90-6,70 (3H, m, 2'-, 4'- og 6'-H), 5,95 (2H, s, CH2), 5,30 (2H, br.s, NH2) og 2,98 (6H, s, NMe2).

(Fra 3-dimetylaminobenzylalkohol, fremstilt ved LAH-reduksjon av 3-dimetylaminobenzosyre, Aldrich). (8) 3-amino-6-(2-metoksybenzyloksy)pyridazin, sm.p. 166-168° ,

NMR SH (CDC13): 7,8 (1H, dd, J 6,7 og 2,2 Hz, PhH), 7,30 (1H, dd, J 6,6 og 2,2 Hz, PhH), 6,98 (1H, dt, J 6,6 Hz, PhH), 6,92 (1H, d, J 6,6 Hz, PhH), 6,90 (1H, JAB 8,8 Hz, 5-H), 6,78 (1H, JAB 8,8 Hz, 4-H), 5,5 (2H, s, CH2), 4,42 (2H, br.s, NH2) og 3,87 (3H, s, OMe). (9) 3-amino-6-[3,5-dimetoksy(4 -me toksye toksymetoksy )-benzyloksy]pyridazin, sm.p. 110-114",

NMR SH (CDCI3): 6,88 (1H, JÅB 8,8 Hz, 5-H), 6,78 (1H, JAB 8,8 Hz, 4-H), 6,7 (2H, 5,2'- og 6'-H), 5,35 (2H, s, CH2), 5,2 (2H, s, CH2), 4,49 (2H, br.s, NH2), 4,05 (2H, m, CH2), 3,85 (6H, s, OMe), 3,61-3,51 (2H, m, CH2) og 3,35 (3H, s, OMe).

(10) 3-amlno-6-(3-klorbenzyloksy)pyrldazin,

NMR SH (d6-DMS0): 7,51-7,32 (4H, m, PhH), 6,91 (2H, JAB 8,8 Hz, 4H og 5-H), 5,92 (2H, br.s, NH2) og 5,34 (2H, s, CH2);

M/Z 235 (M<+>, 68*): 218 (10), 125 (65) og 97 (100). (11) 3-amino-6-(2-tienylmetyloksy)pyridazin, sm.p. 101-103°, NMR SH (d6-DMS0): 7,52 (1H, d, 5'-H), 7,20 (1H, d, 3'-H); 7,02 (1H, dd, 4'-H), 6,94 og 6,85 (2H, JAB 8,8 Hz, 4-H og 5-H), 5,95 (2H, s, CH2) og 5,50 (2H, s, NH2). (12) 3-amlno-6-(3,4,5-trimetoksybenzyltlo)pyridazin ble fremstilt i henhold til fremgangsmåten beskrevet for mellomproduktene 1 og 2 ved anvendelse av 3,4,5-trimetoksybenzyltiol og 3-amino-6-klorpyridazin for å tilveiebringe produktet, sm.p. 143-146°,

NMR SH (CDCI3): 7,07 og 6,63 (2H, JAB 8,8 Hz, 4-H og 5-H), 6,6 (2H, s, PhH), 4,63 (2H, br.s, NH2), 4,44 (2H, s, CH2), 3,85 (6H, s, OMe) og 3,84 (3H, s, OMe).

Mellomprodukt 13

2- metoksvetvl- N- kloracetvlkarbamat

Fremgangsmåten beskrevet av R.J. Bochis et al., "J. Med. Chem.", 1978, 21, 235 ble fulgt for å tilveiebringe tittelforbindelsen, sm.p. 97-99°.

NMR SH (d6-DMS0); 11,07 (1H, br.s, NH), 4,56 (25i, s, C1CH2), 4,28 (2H, m, C0'0CH2), 3,62 (2H, m, CH20Me) og «T,34 (3H, s, Me ).

Følgende mellomprodukter med formel (III) er kjent fra litteraturreferansene Indikert:

Mellomproduktene 20 - 32

Følgende forbindelser ble fremstilt ved den generelle fremgangsmåten beskrevet for mellomproduktene (1) og (2), ved anvendelse av hensiktsmessig alkohol som utgangsstoff.

Mellomprodukt 20

3- amlno- 6-( 2, 3- dlmetoksvbenzvloksv) pyrldazln Fra 2,3-dimetoksybenzylalkohol (Aldrich) for å tilveiebringe tittelforbindelsen, sm.p. 103-106°,

NMR SH (CDC13): 7,12-7,05 (2H, m, 5' og 6<*>H), 6,91 (1H, m, 4'H), til 6,85 (1H, JAB<9> Hz, 5H), 6,77 (1H, JAB<9> Hz, 4H), 5,50 (2H, s, ArCH2), 4,50 (2H, brs, NH2) og 3,89 (6H, s, OCH3).

Mellomprodukt 21

3- amino- 6-( 3. 5- dimetoksy- 4- etoksvbenzvloksv) pyrldazln

Fra 3,5-dimetoksy-4-etoksybenzylalkohol for å tilveiebringe tittelforbindelsen, sm.p. 169-171°,

NMR SH (CDCI3): 6,89 (1H, <J>AB 8,8 Hz, 5H), 6,79 (1H, JAB 8, Hz, 4H), 6,70 (2H, s, ArH), 5,38 (2H, s, ArCH2), 4,48 (2H, brs, NH2), 4,06 (2H, q, J 7 Hz, CH2CH3), 3,88 (6H, s, OCH3) og 1,38 (3H, t, J 7 Hz, CH2CH3).

3,5-dimetoksy-4-etoksybenzylalkohol ble fremstilt som følger:

a) 3. 5- dlmetoksv- 4- etoksvbenzaldehvd

En blanding bestående av syringaldehyd (50 g, 0,275 mol),

etyljodid (85,8 g, 0,55 mol) og kaliumkarbonat (151,7 g, 1,09 mol) i DMF (60 ml) ble omrørt og varmet ved 60-70° i 6 t. Blandingen ble avkjølt og fordampet under vakuum og

deretter behandlet med vann og ekstrahert med dietyleter. Ekstraktene ble tørket (Na2S04) og fordampet for å tilveiebringe tittelforbindelsen (59 g) som et hvitt faststoff, ren ved TLC, og anvendt uten videre rensing.

b) 3. 5- dimetoksv- 4- etoksybenzvlalkohol

Produktet fra den tidligere reaksjonen (59 g, 0,28 mol)

ble løst opp i metanol-etanol (600 ml, 1:1) og behandlet med natriumborhydrid (10,8 g, 0,285 mol) porsjonsvis over 1 t. Blandingen ble omrørt i 24 t. ved omgivelsestempe-ratur og deretter sakte behandlet med vann (50 ml) for å tilveiebringe en utfelling. Blandingen ble fordampet for å fjerne organiske oppløsningsmidler, behandlet med vann (300 ml) og ekstrahert med kloroform. Ekstraktene ble tørket (Na2S04) og fordampet for å tilveiebringe et hvitt faststoff som ble omkrystallisert fra eter for å tilveiebringe tittelforbindelsen (26 g) som hvite nåler.

Mellomprodukt 22

3- amino- 6-( 2- t- butvlbenzvloksv) pvridazin

Fra 2-t-butylbenzylalkohol for å tilveiebringe tittelforbindelsen, sm.p. 147-149°,

NMR SH DMSO): 7,4 (2H, m, ArH ), 7,28 (2H, m, Arh ); 6,9 (1H, <J>AB, 8 Hz, 4H), 6,5 (1H, JAB, 8 Hz, 5H), 6,0 (2H, brs, NH2), 5,5 (2H, s, CH2), 1,4 (9H, s, Me3).

(Alkohol fremstilt ved LAH-reduksjon av 2-t-butylbenzosyre; M. Crawford og F.H.C. Stewart, "J. Chem. Soc", 1952, 4444 ).

Mellomprodukt 23

3- amlno- 6-( 2- etylbenzyloksy) pyrldazln

Fra 3-etylbenzylalkohol.

Alkohol fremstilt fra 2-etylbenzosyre (M. Crawford og F.H.C. Stewart, "J. Chem. Soc", 1952, 4444 ) ved reduksjon med LAH.

Mellomprodukt 24

3- amlno- 6-( 2. 5- dlmetylbenzyloksy) pyrldazin

Fra 2,5-dimetylbenzylalkohol for å tilveiebringe tittelforbindelsen, sm.p. 109-111'C.

Alkohol fremstilt ved LAH-reduksjon av 2,5-dimetylbenzosyre (Aldrich).

Mellomprodukt 25

3- amlno- 6-( 3. 4. 5- trlmetylbenzyloksy) pyridazin Fra 3,4,5-trimetylbenzylalkohol.

Alkohol fremstilt ved LAH-reduksjon av 3,4,5-trimetylbenzo-syre (G.H. Kosolapoff, "J. Am. Chem. Soc", 69. 1652, 1947 ).

Mellomprodukt 26

3- amino- 6-( 2- fenvlbenzyloksy) pyrldazln

Fra 2-fenylbenzylalkohol.

Alkohol fremstilt ved LAH-reduksjon av 2-fenylbenzosyre (Aldrich).

Mellomprodukt 27

3- amino- 6-( 3- dletvlaminobenzyloksy) pyridazln

Fra 3-dietylaminobenzylalkohol for å tilveiebringe tittelforbindelsen, sm.p. 115-118°C.

SH (DMSO): 7,15 (lH,t, 5'H), 6,95 (1H, JAB, 8 Hz, 4H), 6,85 (1H, JAB, 8 Hz, 5H), 6,75 (1H, brs, 2'H), 6,65 (2H, m, 4'H + 6<*>H), 5,9 (2H, s, NH2), 5,25 (2H, s, CH20), 3,3 (4H, kvad. 2xCH2N), 1,05 (6H,t, 2xMe).

Alkohol fremstilt ved LAH-reduksjon av 3-dletylaminobenzosyre (P. Grless, "Chem. Ber.", 5, 1041, 1872).

Mellom<p>rodukt 28

3- amlno- 6-( 3- metvlamlnobenzvloksv) pyrldazln

Fra 3-metylaminobenzylalkohol for å tilveiebringe tittelforbindelsen som en gummi.

SH (DMSO): 7,1 (1H, t, 5<»>H), 6,95 (1H, JAB, 8 Hz, 4H), 6,85 (1H, JAB, 8 Hz, 5H), 6,6 (2H, m, 2ArH), 6,45 (1H, d, ArH), 5,95 (2H,s, NH2), 5,65 (1H, brs, NH), 5,2 (2H, s, CH20), 2,65 (3H, s, MeN).

Alkohol fremstilt ved LAH-reduksjon av 3-metylaminobenzosyre (J. Houben og W. Brassert, "Chem. Ber.", 43, 209, 1910).

Mellomprodukt 29

3- amino- 6-( 3- metoksv- l- naftvimetoksv) pvrldazln Fra 3-metoksy-l-naftylmetanol for å tilveiebringe tittelforbindelsen, sm.p. 167-170°C.

SH (DMSO); 7,95 (2H, 2d, 2ArH), 7,40 (3H, m, 3ArH), 7,30 (1H, s, 2'H), 7,0 (1H, JAB, 8 Hz, 4H), 6,90 (1H, JAB, 8 Hz, 5H), 6,00 (2H, s, NH2), 5,75 (2H, s, CH20), 3,90 (3H, s, OMe).

Alkohol fremstilt ved LAH-reduksjon av 3-metoksy-l-naftoin-syre (R. Lesser og G. Gad, "Chem. Ber.", 58B, 2551 - 9, 1925 ).

Mellomprodukt 30

3- amlno- 6- r2-( 3. 4. 5- trimetoksyfenyl) etoksy" lpyrldazin Fra 2-(3,4,5-trimetoksyfenyl)etanol for å tilveiebringe en olje.

SH (DMSO): 6,95 (1H, JAB, 8 Hz , 4H), 6,90 (1H, JAB, 8 Hz, 5H), 6,60 (2H, s, 2ArH), 6,25 (2H, brs, NH2), 4,45 (2H, t, CH20), 3,75 (6H, s, 3MeO og 5MeO), 3,58 (3H, s, 4MeO), 3,0 (2H, t, CH2).

Alkohol fremstilt ved LAH-reduksjon av 3,4,5-trimetoksyfenyl-eddiksyre (Aldrich).

Mellomprodukt 31

3- amlno- 6-( 2- pyridylmetoksy) pyridazln

Fra 2-pyridylmetanol (Aldrich) for å tilveiebringe tittelforbindelsen, sm.p. 114-115".

NMR SH (d6-DMS0): 8,65 (1H, d, 6'-H), 7,85 (1H, tr av d, 5'-H), 7,55 (1H, d, 3<*->H), 7,45 (1H, m, 4 *-H), 7,10 (1H, JAB, 8,8 Hz, 4-H), 6,95 (1H, JAB, 8,8 Hz, 5-H), 6,05 (2H, s, NH2), 5,45 (2H, s, CH2).

Mellomprodukt 32

3- amino- 6-( 2- furfuryloksy) pyridazin

Fra furfurylalkohol for å tilveiebringe tittelforbindelsen, sm.p. 96-99° .

NMR SH (d6-DMS0): 7,70 (1H, d, 5'-H), 6,90 (1H, JAB 8,8 Hz, 4- H), 6,85 (1H, JAB 8,8 Hz, 5-H), 6,60 (1H, d, 4'-H), 6,50 (1H, s, 3'-H), 5,95 (2H, s, NH2), 5,30 (2H, s, CH2).

Eksempel 1

Metyl- N- T 6-( 3. 4. 5- tr imet oksybenzvloksy Umldazon . 2- blpvri-dazin- 2- yllkarbamat

Mellomprodukt 1 (29,1 g, 0,1 mol), og metyl-N-kloracetylkarbamat (15,15 g, 0,1 mol) ble oppvarmet ved 100° i 3 t. med omrøring under N2 i tørr 1,3-dimetyl-2-imidazolidinon (DMEU)

(100 ml). Blandingen ble avkjølt, helt inn i isavkjølt natriumbikarbonatoppløsning og filtrert for å tilveiebringe et faststoff som ble vasket med vann. Det faste stoffet ble løst opp i 5* metanol-kloroform og eluert gjennom florosil. Fordamping ga et faststoff som ble omkrystallisert fra dimetylformamid og vann for å tilveiebringe tittelforbindelsen som et hvitt pulver (14 g), sm.p. 217-220°C.

NMR (SH (d6-DMS0): 10,36 (1H, br.s, NH), 7,87 (1H, JAB 8,8 Hz, 8-H), 7,85 (1H, s, 3-H), 6,87 (1H, JAB 8,8 Hz, 7-H), 6,85 (2H, s, PhH), 5,25 (2H, s, CH2), 3,79, 3,70 og 3,56 (2H, s, OMe).

Eksempel 2

Etyl- N~ r6-( 2. 5 - dlmetoksvbenzvloksv Umidazofl . 2- blpyridazin-2- yllkarbamat

Mellomprodukt 2 (2,61 g, 10 mmol), 2,6-lutidin (1,04 g, 10 mmol) og etyl-N-kloracetylkarbamat (1,66 g, 10 mmol) ble oppvarmet ved 100" i 3 t. med omrøring under N2 i tørr DMEU (10 ml). Blandingen ble avkjølt og filtrert og det faste stoffet ble vasket med vann og eter og deretter sendt gjennnom florosil, og eluering med 5* metanol-kloroform. Fordamping av eluatet ga et faststoff som ble omkrystallisert fra dimetylformamid og vann for å tilveiebringe tittelforbindelsen som et hvitt pulver (1,26 g), sm.p. 210-211''.

NMR SH (d6-DMS0): 10,24 (1H, br.s, NH), 7,85 (2H, M, 3-H og 8-H), 7,10-6,86 (4H, m, 7-H og PhH), 5,27 (2H, s, CH2Ar), 4,17 (2H, q, J 6,6 Hz, CH2CH3), 3,78 og 3,73 (6H,s, OMe) og 1,27 (3H,t, J 6,6 Hz, CH2CH3).

Eksempel 3

Me tyl - N - f 6-( 2 . 5- dimetoksybenzyloksy ) imidazo[" l . 2- blpvridazln-2- vllkarbamat Mellomprodukt 2 (12,0 g, 0,046 mol), 2,6-luticir; (4,92 g, 0,046 mol) og metyl-N-kloracetylkarbamat (6,97 g, 0,046 mol) ble oppvarmet med omrøring under N2 ved 100° i 4 t. i tørr DMEU (46 ml). Blandingen ble satt til isvann og deretter filtrert for å gi et faststoff som ble omkrystallisert fra dimetylformamid og vann for å tilveiebringe tittelforbindelsen som et lysebrunt pulver (2,46 g), sm.p. 228-230°.

NMR SH (d6-DMS0): 10,30 (1H, br.s, NH), 7,88 (1H, JAB 8,8 Hz, 8-H), 7,85 (1H, s, 3-H), 7,12-6,85 (4H, m, ArH), 5,32 (2H, s, CH2) og 3,79, 3,72 og 3,69 (9H, s, OMe).

Eksemplene 4 til 22

Følggende forbindelser ble fremstilt ved anvendelse av den generelle fremgangsmåten beskrevet i eksemplene 1-3 ved omsetning av 3-amino-6-substituert pyridaziner med hensiktsmessige kloracetylkarbamater.

(4 ) n-propyl-N-[6-( 3 ,4 , 5-trimetoksybenzyloksy )imidazo[l ,2-b]pyridazin-2-yl]karbamat, sm.p. 174-175°,

NMR SH (d6-DMS0): 10,25 (1H, br.s, NH), 7,87 (1H, JÅB 8,8 Hz, 8-H), 7,85 (1H, s, 3-H), 6,87 (1H, JAB 8,8 Hz, 7-H), 6,85 (2H, s, PhH), 5,26 (2H, s, CH2Ar), 4,07 (2H, t, J 6 Hz, CH2CH2CH3), 3,80 (6H, s, OMe), 3,68 (3H, s, OMe), 1,55 (2H, dt, J 6 Hz, CH2CH2CH3) og 0,94 (3H, t, J 6 Hz, CH2CH2CH3).

( 5 ) n-buty 1 - N- [6 - ( 3 , 4 , 5-tr imetoksybenzyloksy )lmidazo[l,2-b]pyridazin-2-yl]karbamat, sm.p. 185-187°,

NMR SH (d6-DMS0): 10,23 (1H, br.s, NH), 7,85 (1H, JAB 8,8 Hz, 8-H), 7,8 (1H, s, 3-H), 6,86 (1H, JAB 8,8 Hz, 7-H), 6,65 (2H, s, PhH), 5,27 (2H, s, CH2Ar), 4,12 (2H, t, J 6 Hz, CH2CH2CH2CH3), 3,80 (6H, s, OMe), 3,67 (3H, s, OMe), 1,61 (2H, m, CH2CH2CH2CH3), 1,38 (2H, m, CH2CH2CH2CH3) og 0,92 (3H, t, J 6 Hz, CH2CH2CH2CH3). (6) n-propyl-N- [6-(2 , 5-dimetoksybenzyloksy)imidazo[1,2-b]pyridazin-2-yl]karbamat, sm.p. 199-200°,

NMR SH (d6-DMS0): 9,93 (1H, br.s, NH), 7,87 (2H, m, 3-H og 8-H), 7,17-6,89 (4H, m, 7-H og PhH), 5,42 (2H, s, CH2Ar), 4,17 (2H, t, J 6 Hz, CH2<C>H2CH3), 3,85 og 3,80 (6H, s, OMe), 1,73 (2H, dt, J 6 Hz, CH2CH2CH3) og 1,04 (3H, t, J 6 Hz, CH2CH2CH3).

(7 ) etyl - N- [6 - ( 3 , 4 , 5-trimetoksybenzyloksy )imidazo[l ,2-b]pyridazin-2-yl]karbamat, sm.p. 204-206",

NMR SH (d6-DMS0): 10,25 (1H, br.s, NH), 7,85 (1H, JAB 8,8 Hz, 8-H), 7,83 (1H, s, 3-H), 6,85 (1H, JAB<8,>8 Hz, 7-H), 6,64 (2H, s, PhH), 5,27 (2H, s, CH2Ar), 4,15 (2H, q, J 6 Hz, CH2CH3), 3,28 (6H, s, OMe), 3,16 (3H, s, OMe) og 1,25 (3H, t, J 6 Hz, CH2CH3). (8) 2-metoksyetyl-N-[6-(3,4,5-trimetoksybenzyloksy)imidazol-[1,2-b]pyridazin-2-yl]karbamat, sm.p. 183-185°,

NMR SH (d6-DMSO): 10,36 (1H, br.s, NH), 7,85 (1H, JAB 8,8 Hz, 8-H), 7,83 (1H, s, 3-H), 6,85 (1H, JAB 8,8 Hz, 7-H), 6,84 (2H, s, PhH), 5,26 (2H, s, CH2Ar), 4,25 (2H, m, C0CH2), 3,79 (6H, s, OMe), 3,18 (3H, s, OMe), 3,08 (2H, m, CH2OMe) og 3,32 (3H, s, CH2OMe). (9) metyl-N-[6-(1-naftylmetyloksy)imidazo[l,2-b]pyridazin-2-yl]karbamat, sm.p. 243-246°,

NMR SH (d6-DMSO): 10,05 (1H, br.s, NH), 8,25-7,55 (9H, m, naft H og 3-H og 8-H), 6,92 (1H, JAB 8,8 Hz, 7-H), 5,92 (2H, s, CH2) og 3,80 (3H, s, OMe).

(10 ) Me ty 1 - N- [ 6 -(2-metoksybenzyloksy)imidazo[l,2-b]pyri -

dazin-2-yl]karbamat, sm.p. 241-243°,

NMR SH (d6-DMS0): 10,1 (1H, br.s, NH), 7,92 (1H, s, 3-H), 7,65 (1H, JAB 8,8 Hz, 8-H), 7,45 (lH,d, J 7 Hz, PhH), 7,35 (1H, dd, J 7 Hz, PhH), 6,95 (2H, m, PhH), 6,72 (1H, JAB 8,8 Hz, 7-H), 5,36 (2H,s, CH2), 3,89 (3H, s, OMe) og 3,77 (3H, s, OMe). (11) Metyl-N- [6-(3,5-dimetoksybenzyloksy)imidazo[1,2-b]pyridazin-2-yl]karbamat, sm.p. 236-238°,

NMR SH (d6-DMS0): 10,30 (1H, br.s, NH), 7,88 (1H, JAB 8,8 Hz, 8-H), 7,82 (1H, s, 3-H), 6,90 (1H, JAB 8,8 Hz, 7-H), 6,66 (2H, d, J 0,9 Hz, 2'-H og 6'-H), 6,46 (1H t, J 0,9 Hz, 4'-H), 5,36 (2H, s, CH2), 3,78 (6H, s, OMe) og 3,70 (3H, s, OMe). (12) Metyl-N-[6-(3-metylbenzyloksy)imidazo[l,2-b]pyridazin-2-yl]karbamat, sm.p. 205-208°,

NMR SH (d6-DMS0): 9,95 (1H, br.s, NH), 7,85 (1H, s, 3-H), 7,80 (1H, JAB 8,8 Hz, 8-H), 7,30 (3H, m, 2<*->H, 4<*->H og 6'-H), 7,15 (1H, m, 5'-H), 6,82 (1H, JAB 8,8 Hz, 7-H), 5,80 (2H, s, CH2), 3,72 (3H, s, OMe) og 2,34 (3H, s, Me).

(13 ) t-Butyl-N-[6-(3 , 4 -1 r imet oksybenzyloksy)imidazo[1,2-b] -

pyridazin-2-yl]karbamat, sm.p. 191,5-192,5°,

NMR SH (d6-DMS0): 9,95 (1H, br.s, NH), 7,85 (1H, JAB 8,8 Hz, 8-H), 7,79 (1H, br.s, 3-H), 6,87 (1H, JAB 8,8 Hz, 7-H), 6,86 (2H, s, PhH), 5,25 (2H, s, CH2), 3,79 (6H, s, OMe), 3,68 (3H, s, OMe) og 1,50 (9H, s, t-Bu).

(14 ) metyl-N- [6-( 3 , 4 , 5-tr imet oksybenzyloksy) imidazo [1,2-b] -

pyridazin-2-yl]karbamat, sm.p. 221-223°,

NMR SH (d6-DMS0): 10,51 (1H, br.s, NH), 8,11 (1H, 3, 3-H), 7,87 (1H, JAB 8,8 Hz, 8-H), 7,17 (1H, JAB<8,>8 Hz, 7-H), 6,88 (2H, s, PhH), 4,49 (2H, s, CH2), 3,83 (6H, s, OMe) og 3,70 (3H, s, OMe).

(15 ) Metyl-N- [6- (d ime ty lami nobenzyloksy) imidazo [1,2-b]pyridazin-2-yl]karbamat, sm.p. 200-203°,

NMR SH (d6-DMS0): 10,05 (1H, br.s, NH), 7,93 (1H, s, 3-H), 7,90 (1H, JAB 8,8 Hz, 8-H), 7,30 (1H, t, 5'-H), 6,95-6,80 (4H, 2'-H, 6'-H og 7-H), 5,40 (2H, s, CH2), 3,78 (3H, s, OMe) og 2,98 (6H, s, NMe2). (16) Metyl-N-[6-(3-metoksybenzyloksy)imidazo[l,2-b]pyridazin-2-yl]karbamat, sm.p. 184-189,5°,

NMR SH (CDC13): 10,55 (1H, br.s, NH), 8,02 (1H, s, 3-H), 7,75 (1H, JAB 8,8 Hz, 8-H), 7,32 (1H, dd, J 7,5 Hz, 5'-H), 7,07 (2H, m, ArH), 6,88 (1H, dd, J 7,5 og 2 Hz, ArH), 6,70 (1H, JAB 8,8 Hz, 7-H), 5,34 (2H, s, CH2), 3,88 og 3,83 (6H, s, OMe). (17) Etyl-N-( 6-benzyl ok sy imidazo[l , 2-b] pyr idazin-2-yl] - karbamat, sm.p. > 211° (dekomp.),

NMR SH (d6-DMS0): 10,25 (1H, br.s, NH), 7,87 (1H, JAB 8,8 Hz, 8-H), 7,72 (1H, s, 3-H), 7,57-7,37 (5H, m, Ph), 5,35 (2H, s, CH2Ar), 4,15 (2H, q, J 6 Hz, CH2CH3) og 1,27 (3H, t, J 6 Hz, CH2CH3). (18) Metyl -N-(6-n-buty11iolmidazo[1,2-b]pyridazin-2-yl]-karbamat, sm.p. 170-171",

NMR SH (d6-DMS0): 10,40 (1H, br.s, NH), 7,94 (1H, s, 3H), 7,76 (1H, JAB<8,>8 Hz, 8-H), 7,06 (1H, JAB 8,8 Hz, 7-H), 3,72 (3H, s, OMe), 3,18 (2H, t, J 6 Hz, CH2S), 1,68 (2H, m, CH2CH2S), 1,44 (2H, m, CH2CH2CH2S) og 0,93 (3H, t, J 6 Hz, CH3CH2CH2S).

(19 ) Metyl -N- ( 6-benzyl 11 o imi dazo [1,2-b]pyridazin-2-yl] -

karbamat, sm.p. 223-225° (dekomp.),

NMR SH (d6-DMS0): 10,42 (1H, br.s, NH), 7,99 (1H, s, 3-H), 7,77 (1H, JAB 8,8 Hz, 8-H), 7,52-7,20 (5H, m, Ph), 7,07 (1H, JAB 8,8 Hz, 7-H), 4,45 (2H, s, CH2) og 3,68 (3H, s, OMe). (20) Metyl-N- [6-(3,5-dimetoksy-4-(metoksyetoksy)benzyloksy)-imidazo[l,2-b]pyridazin-2-yl]karbamat, sm.p. 149-150°, NMR SH (CDCI3): 9,58 (1H, br.s, NH), 8,02 (1H, br.s, 3-H), 7,75 (1H, JAB<8,>8 Hz, 8-H), 6,75 (1H, JAB 8,8 Hz, 7-H), 6,70 (2H, s, 2'-H og 6'-H), 5,29 (2H, s, CH2), 5,18 (2H, s, CH2), 4,08-3,91 (2H, m, CH2), 3,85 (9H, s, OMe), 3,6-3,4 5 (2H, m, CH2) og 3,35 (3H, s, OMe). (21) Metyl-N- [6-(3-klorbenzyloksy)Imidazo[1,2-b]pyridazin-2-yl]karbamat, sm.p. 268-270°,

NMR SH (d6-DMS0): 10,32 (1H, br.s, NH), 7,87 (1H, JAB 8,8 Hz, 8-H), 7,83 (1H, s, 3-H), 7,61 (1H, s, 2'-H), 7,53-7,41 (3H, m, PhH), 6,91 (1H, JAB 8,8 Hz, 7-H), 5,38 (2H, s, CH2) og 3,68 (3H, s, OMe). (22) Metyl-N-[6-(2-1ienylmetylimidazo[l,2-b]pyridazin-2-yl]karbamat, sm.p. 207-209°,

NMR SH (d6-DMS0): 10,38 (1H, br.s, NH), 7,85 (1H, s, 3-H), 7,82 (1H, JAB 8,8 Hz, 8-H), 7,58 (1H, d, 5'-H), 7,30 (1H, d, 3'-H), 7,05 (1H, t, 4 ' -H) , 6,82 (1H, JAB 8,8 Hz, 7-H), 5,56 (2H, s, CH2) og 3,66 (3H, s, OMe).

Eksempel 23

2. 2. 2- tr i fluoretyl- N- f6-( 3. 4. 5- trimetoksvbenzyloksy) imidazo-[" 1. 2— bl pyr idazin- 2- yllkarbamat

a) Etyl- 6-( 3. 4. 5- trimetoksybenzyloksy) imidazori.2-bl - pyrldazln- 2- karboksylat

Etylbrompyruvat (117 g, 0,6 mol) ble satt til 3-amino-6-(3,4,5-trimetoksy)pyridazin (174,6 g, 0,6 mol) og 2,6-lutidin (62,4 g, 0,6 mol) i tørr DMF (600 ml) med omrøring under N2. Blandingen ble oppvarmet ved 100° i 3 t., avkjølt og konsentrert under vakuum og deretter behandlet med vann og filtrert for å tilveiebringe et brunt faststoff som ble vasket med vann og eter. Det faste stoffet ble krystallisert fra DMF og vann for å tilveiebringe tittelforbindelsen som et krystallinsk faststoff (88 g), sm.p. 159-163° .

NMR SH (CDClg): 8,31 (1H, s, 3H), 7,84 (1H, JAB 8,8 Hz, 8H), 6,82 (1H, JAB 8,8 Hz, 7H), 6,70 (2H, s, ArH), 5,30 (2H, s, CH2Ar), 4,45 (2H, q, J 7 Hz, 0CH2CH3), 3,88 (6H, s, 0CH3), 3,86 (3H, s, OCH3) og 1,44 (3H, t, J 7 Hz, CH3).

b ) 6- ( 3 . 4 . 5- tr imet oksybenzyloksy) imi dazo [" 1. 2- b1pyridazln- 2-karboksylsyre

Produktet fra trinn (a) (1,94 g, 5 mmol) ble oppvarmet under tilbakestrømming med omrøring med natriumhydroksyd-oppløsning (1 ml, 10 M, 10 mmol), vann (9 ml) og metanol (5 ml) i 20 min. Blandingen ble avkjølt og surgjort med fortynnet saltsyre og filtrert for å tilveiebringe et faststoff som ble tørket ved 60° under vakuum for å tilveiebringe tittelforbindelsen som et pulver (1,5 g), sm.p. 224-226°C (dekomp.).

NMR SH (d6-DMS0): 8,56 (1H, s, 3H), 8,07 (1H, JAB 8,8 Hz, 8H), 7,05 (1H, JAB 8,8 Hz, 7H), 6,88 (2H, s, ArH), 5,29 (2H, s, CH2Ar), 3,82 (6H, s, 0CH3), 3,68 (3H, s, 0CH3) og 3,32 (1H, br.s, C02H).

c ) 6 - ( 3 . 4 . 5- trimetoksybenzyloksy) Imidazo fl . 2- b1pyrldazln- 2-karboksvlsyre

Oksalylklorid (0,13 ml, 1,5 mmol) ble satt til produktet fra trinn (b) (0,36 g, 1 mmol) og pyridln (0,079 g, 1 mmol) i tørr benzen (5 ml) med omrøring under N2. Blandingen ble oppvarmet under tilbakestrømming i 3 t., avkjølt, og fordampet under vakuum for å tilveiebringe et grått faststoff: Dette faststoffet ble behandlet med dioksan (10 ml), vann (10 ml) og natriumazid (overskudd) og kraftig omrørt over natt ved romtemperatur. Blandingen ble filtrert og det faste stoffet tørket under vakuum for å tilveiebringe tittelforbindelsen som et pulver (0,29 g), sm.p. > 139°

(dekomp.),

NMR SH (CDCI3): 8,35 (1H, s, 3H), 7,85 (1H, JAB 8,8 Hz, 8H), 6,85 (1H, JAB 8,8 Hz, 7H), 6,70 (2H, s„ i;rH), 5,31 (2H, s, CH2Ar), 3,90 (6H, s, 0CH3) og 3,88 (33?.'" s, 0CH3).

d) 2. 2. 2- trlfluoretvl- N- r6-( 3. 4. 5- trimetoksybenzyloksy )-imi dazo r 1. 2- b " I pyr i dazin- 2- yll karbamat

Produktet fra trinn (c) (2,3 g, 6 mmol), 2,2,2-trifluor-etanol (ca. 3 ml) og toluen (60 ml) ble oppvarmet med omrøring under N2 ved tilbakstrømming helt til TLC viste fullstendig reaksjon (ca. 2 t.).

Blandingen ble avkjølt over natt og filtrert for å tilveiebringe et faststoff som ble vasket med eter og tørket for å tilveiebringe tittelforbindelsen som et pulver (0,43 g), sm.p. 205-210°C (dekomp.).

NMR SH (d6-DMS0): 10,81 (1H, br.s, NH), 7,88 (1H, JAB 8,8 Hz, 8H), 7,85 (1H, s, 3H) , 6,90 (1H, JAB 8 Hz, 7H), 6,85 (2H, s, ArH), 5,25 (2H, s, CH2Ar), 4,83 (2H, q, J 9 Hz, CH2CF3), 3,76 (6H, s, 0CH3) og 3,65 (3H, s, 0CH3).

Eksempel 24

2- hydroksyetyl- N- r6-( 3. 4. 5- trimetoksybenzyloksy) imi dazo-fl. 2- b~ lpyridazln- 2- yl~| karbamat

En lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel 23(d) ble fulgt med unntagelse av at råproduktet ble kromatografert på Si02 eluerende med 5* metanol-kloroform med påfølgende omkrystallisering fra DMF-vann for å tilveiebringe tittelforbindelsen som et pulver, sm.p. 193-195°,

NMR SH (d6-DMS0): 10,35 (1H, br.s, NH), 7,85 (1H, JAB 8,8 Hz, 8H), 7,83 (1H, s, 3H), 6,86 (1H, JAB 8,8 Hz, 3H), 6,84 (2H, s, ArH), 5,25 (2H, s, CH2Ar), 4,82 (1H, t, J 4 Hz, 0H), 4,15 (2H, m), 3,80 (6H, s, 0CH3) og 3,66 (5H, m, 0CH2 og 0CH3).

Eksempel 25

2-( 1- morf ollno) etyl- N- 6-( 3. 4. 5- trimetoksybenzyloksyUmidazo-n. 2- blpyridazin- 2- yllkarbamat

En lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel 23(d) ble fulgt med unntagelse av at råproduktet ble kromatografert på Si02 eluerende med 5* metanol-kloroform og kokt med litt etanol for å tilveiebringe tittelforbindelsen som et pulver, sm.p. 161-162°,

NMR SH (d6-DMS0): 10,30 (1H, br.s, NH), 7,88 (1H, s, 3H), 7,85 (1H, <J>AB 8,8 Hz, 8H) , 6,87 (1H, JAB 8,8 Hz, 7H), 6,85 (2H, s, ArH), 5,26 (2H, s, CH2Ar), 4,22 (2H, t, J 5 Hz, C0'0CH2), 3,80 (6H, s, 0CH3), 3,68 (3H, s, 0CH3), 3,58 (4H, m, CH20CH2), 2,59 (2H, t, J 5 Hz, C0*0CH2CH2N) og 2,45 (4H, m, CH2NCH2).

Eksempel 26

Metvl- N- rN- metvl- 6-( 3. 4. 5- trimetoksybenzyloksy) imidazofl . 2- blpyridazln- 2- yl~ lkarbamat

Natrimhydrid (1,26 g, 60*. 31,5 mmol) ble porsjonsvis tilsatt til en omrørt suspensjon av metyl-N-[6-(3,4,5-trimetoksybenzyloksy )imidazo[l ,2-b]pyridazin-2-yl]karbamat (9,51 g, 24,5 mmol) i DMEU (100 ml) under N2 ved romtemperatur. Blandingen ble behandlet med jodmetan (4,9 g, 2,15 ml, 35 mmol) og etter en time til ble blandingen behandlet med molare ekvivalenter av natriumhydrid og jodmetan. Etter 2 timer ble blandingen helt inn i vann (100 ml) og filtrert for å tilveiebringe et hvitt faststoff som ble kromatografert på S102 eluerende med 2% metanol-kloroform. Produktet ble omkrystallisert fra DMF og vann for å tilveiebringe tittelforbindelsen som et hvitt pulver (8,29 g), sm.p. 177-178°C,

NMR SH (d6-DMS0): 8,04 (1H, s, 3H), 7,96 (1H, JAB 8,8 Hz, 8H), 6,92 (1H, JAB 8,8 Hz, 7H), 6,86 (2H, s, ArH), 5,25 (2H, s, CH2), 3,79 (9H, s, 0CH3), 3,68 (3H, s, C0'0CH3) og 3,42 (3H, s, NCH3).

Eksempel 27

Metyl- N- rN- etyl- 6-( 3. 4. 5- trimetoksvbenzyloksy) ImidazoTl. 2- blpyridazin- 2- yllkarbamat

En lignende fremgangsmåte som beskrevet i eksempel 26 ble fulgt til å tilveiebringe tittelforbindelsen som et hvitt faststoff, sm.p. 153-155° ,

NMR (SH (d6-DMSO): 8,04 (1H, s, 3H), 7,96 (JAB 8,8 Hz, 8H), 6,92 (1H, JAB 8,8 Hz, 7H), 6,86 (2H, s.ArH), 5,25 (2H, s, ArCH2), 3,90 (2H, q, CH2CH3), 3,78 (9H, s, ArOCH3) , 3,66 (3H, s, NCH3) og 1,19 (3H, t, CH2CH3).

Eksempel 28

2. 3- dihvdroksvpropyl- N- r6-( 3. 4. 5- trlmetoksybenzyloksy)-imidazoTl. 2- blpvridazln- 2- vllkarbamat

Produktet i eksempel 23(c) ble omsatt med solketal ved anvendelse av en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel 23(d) med unntagelse av at den rå blandingen ble fordampet under vakuum og når reaksjonen mellom acylazid og solketal var fullført og deretter oppvarmet ved 60-70°C i 0,5 timer med fortynnet saltsyre og etanol. Reaksjonsblandingen ble nøytralisert med natrium-bikarbonatoppløsning, fordampet under vakuum og kromatografert på Si02 eluerende med 7% metanol-kloroform for å tilveiebringe tittelforbindelsen som et hvitt faststoff, sm.p. 175-176°C

NMR SH (d6-DMS0): 10,28 (1H, brs, NH), 7,88 (1H, JAB 8,8 Hz, 8H), 7,86 (1H, s, 3H), 6,87 (1H, JAB 8,8 Hz, 7H), 6,85 (2H, s, ArH), 5,28 (2H, s, ArCH2), 4,90 (1H, d, J 4 Hz, 2'-0H), 4,65 (1H, t, J 4 Hz, 1'-0H) , 4,20-4,0 (2H, m, C0-0CH2), 3,80 (6H, s, 0CH3), 3,80-3,70 (1H, m, HO-CH), 3,69 (3H, s, 0CH3) og 3,40 (2H, t, J 4 Hz, H0CH2 ).

Eksempel 29

2- dlmetvlaminoetyl- N- f 6 - ( 3. 4. 5- trlmetoksybenzyloksy)-imldazori. 2- blpyrldazin- 2- yllkarbamat

Produktet ifølge eksempel 23(c) ble omsatt med (2-dimetyl-amino)etanol ved anvendelse av en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel 23(d) med unntagelse av at råproduktet ble kromatografert på Si02 eluerende med 5* metanol-kloroform for å tilveiebringe et faststoff som ble vasket med etanol og tørket for å tilveiebringe tittelforbindelsen som et hvitt pulver, sm.p. 185-186°C.

NMR SH (d6-DMSO): 10,32 (1H, brs, NB), 7,88 (1H, JAB 8,8 Hz, 8H), 7,85 (1H, s, 3H), 6,89 (1H, JAB 8,8 Hz, 7H), 6,85 (2H, s, ArH), 5,77 (2H, s, ArCH2), 4,60 (2H, t, J 4 Hz, C0*0CH2), 3,80 (6H, s, 0CH3), 3,69 (3H, s, 0CH3), 2,50 (2H, t, CH2N) og 2,21 (6H, s, NMe2).

Eksempel 30

Fenyl- N- f6-( 3. 4. 5- tr ime t oksybenzyloksy) Imi dazo Tl. 2- blpyri-dazln- 2- yllkarbamat

Produktet ifølge eksempel 23(c) ble omsatt med fenol ved anvendelse av en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksempel 23(d) med unntagelse av at råproduktet ble kromatografert på Si02 eluerende med 5* metanol-kloroform for å tilveiebringe et faststoff som ble vasket med aceto-nitril og tørket for å tilveiebringe tittelforbindelsen som et hvitt pulver, sm.p. 210-213<<,>C.

NMR 5H (CDCI3): 10,12 (1H, brs, NH), 8,05 (1H, s, 3H), 7,80 (1H, JAB 8,8 Hz, 8H), 7,55-7,15 (5H, m, Ph), 6,69 (2H, s, ArH), 6,67 (1H, JAB 8,8 Hz, 7H), 5,28 (2H, s, ArCH2) og 3,90 (9H, s, 0CH3).

Eksempel 31

3- amlno- 6-( 2- brom- 3. 4. 5- trimetoksybenzvloksy) pyridazln

a) 3-amino-6-(3,4,5-trimetoksybenzyloksy)pyridazin (mellomprodukt 1, 2,91 g, 10 mmol) i eddiksyre (20 ml) ble

dråpevis behandlet med en oppløsning bestående av brom (1,59 g, 10 mmol) i eddiksyre (2 ml) i løpet av 5 minutter. Etter 0,5 time ble blandingen filtrert for å tilveiebringe et faststoff i kremform som ble suspendert i vann og gjort basisk med natriumhydroksydoppløsning. Blandingen ble ekstrahert med kloroform og ekstrakten ble vasket med vann, tørket (Na2S04) og fordampet under vakuum

for å tilveiebringe et faststoff i kremform som ble omkrystallisert fra toluen for å tilveiebringe tittelforbindelsen (2,76 g) som nåler i kremform, sm.p. 160-161°C.

NMR SH (CDC13): 6,93 (1H, s, ArH), 6,91 (1H, JAB 8,8 Hz, 5H), 6,80 (1H, JAB 8,8 Hz, 4H), 5,49 (2H, s, CH2), 4,95 (2H, brs, NH2) , 3,91 (3H, s, 0CH3) , 3,90 (3H, s, OCH3) og 3,89 (3H, s, OCH3).

b ) MetvI- N- T6-( 2- brom- 3. 4. 5- trlmetoksybenzyloksy Hmldazo-n. 2- b] pyridazln- 2- yllkarbamat

En lignende fremgangsmåte som den som var beskrevet i eksemplene 1-3 ble fulgt for å tilveiebringe tittelforbindelsen som et hvitt pulver, sm.p. 218-219°C.

NMR SH (CDCI3): 9,45 (1H, brs, NH), 8,03 (1H, brs, 3H), 7,75 (1H, JAB 8,8 Hz, 7H), 5,40 (2H, s, ArCH2) og 3,96-3,86 (12H, m, 0CH3).

Eksemplene 32 - 35

De følgende forbindelsene ble fremstilt ved anvendelse av en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksemplene 1- 3: Eksempel 32

Metyl- N- f 6 -( 2. 3- dlmetoksybenzvloksyUmidazofl. 2- blpyridazln-2- yllkarbamat

Sm.p. 210-211°C,

NMR SH (d6-DMS0): 10,35 (1H, brs, NH), 7,86 (1H, JAB 8,8 Hz, 8H), 7,84 (1H, s, 3H), 7,10 (3H, s, PhH), 6,88 (1H, JAB 8,8 Hz, 7H), 5,35 (2H, s, CH2) og 3,86, 3,80 og 3,72 (9H, s, OCH3).

Eksempel 33

Metyl- N- f6-( 3. 5- dimetoksv- 4- etoksybenzyloksy) imidazofl. 2- blpyridazin- 2- yllkarbamat

Sm.p. 190-193'C,

NMR SH (d6-DMSO): 10,33 (1H, brs, NH), 7,88 (1H, JAB 8,8 Hz, 8H), 7,85 (1H, s, 3H), 6,88 (1H, JAB 8,8 Hz, 7H), 6,85 (2H, s, ArH), 5,77 (2H, s, ArCH2), 3,90 (2H, q, J 7 Hz, CH2CH3), 3,80 (6H, s, ArOCH3), 3,69 (3H, s, C0.0CH3) og 1,24 (3H, t, J 7 Hz, CH2CH3).

Eksempel 34

Metvl- N- [ b -( 2- t- butvlbenzvloksv ) im i dazo Tl . 2- blpyridazin- 2-yllkarbamat

Sm.p. 220-223°C,

NMR SH (d6-DMS0): 9,95 (1H, brs, NH), 7,85 (1H, s, 3H), 7,8 (1H, JAB 8 Hz, 8H), 7,5 (2H, m, ArH), 7,28 (2H, m, ArH), 6,8 (1H, JAB 8Hz, 7H), 5,5 (2H, s, CH2), 3,7 (3H, s, OMe), 1,4 (9H, s, Me3).

(Fra mellomprodukt 22).

Eksempel 35

Metvl- N- r6-( 2- etvlbenzvloksv) imidazori. 2- blpyridazin- 2-yllkarbamat

Sm.p. 190-191'C,

NMR SH (d6-DMS0): 9,95 (1H, brs, NH), 7,85 (1H, s, 3H), 7,8 (1H, JAB 8 Hz, 8H), 7,45 (1H, d, ArH), 7,3 (3H, m, ArH), 6,8 (1H, JAB 8 Hz, 7H), 5,4 (2H, s, 0-CH2), 3,7 (3H, s, OMe), 2,7 (2H, quad, CH2), 1,2 (3H, t, Me).

(Fra mellomprodukt 23).

Eksempel 36

n- propyl- N- r6-( 2. 5- dimetylbenzyloksy) imidazofl. 2- blpvridazin-2- yllkarbamat

Sm.p. 196-197°C,

NMR SH (d6-DMS0): 9,85 (1H, brs, NH), 7,85 (j.B4 s, 3H), 7,80 (1H, JAB 8Hz, 8H), 7,25 (1H, s, 6'H), 7,1 UH, 2d, 3'H og 4'H), 6,8 (1H, JAB 8 Hz, 7H), 5,35 (2H, s, 0CH2), 4,1

(2H, t, OCH2), 2,3 (6E, 2s, 2 x ArMe), 1,7 (2H, quad, CH2), 0,95 (3H, t, Me).

(Fra n-propylkloracetylkarbamat og mellomprodukt 24).

Eksempel 37

Metyl- N- T6-( 3. 4. 5- trlmetvlbenzyloksy) Imidazofl. 2- blpyridazin-2- yllkarbamat

Sm.p. 227-229°C,

NMR SE (d6-DMS0): 9,90 (1H, brs, NH), 7,85 (1H, s, 3H), 7,75 (1H, JÅB 8 Hz, 8H), 7,15 (2H, s, ArH), 6,80 (1H, JAB<8 >Hz, 7H), 5,25 (2H, s, 0CH2), 3,7 (3H, s, OMe), 2,28 (6H, s, 2 x ArMe), 2,15 (3H, s, ArMe).

(Fra mellomprodukt 25).

Eksempel 38

Metyl- N- f 6-( 2- fenylbenzyl oksy) imidazo fl. 2- b1 pyridazln- 2-<y>llkarbamat

Sm.p. 203-204'C,

NMR SH (d6-DMS0): 9,92 (1H, brs, NH), 7,75 (1H, JAB 8 Hz, 8H), 7,70 (1H, s, 3H), 7,4 (9H, m, 9ArH), 6,75 (1H, JAB 8 Hz, 7H), 5,3 (2H, s, 0CH2), 3,7 (3H, s, 0CH3).

(Fra mellomprodukt 26).

Eksempel 39

Metyl - N- f b -( 3- dietvlamlnobenzyloksy) imidazofl. 2- blpyridazin-2- yllkarbamat. hvdroklorid

Sm.p. 220-225°C,

NMR SH (d6-DMS0): 10,35 (1H, brs, NH), 7,9 (1H, JAB 8 Hz, 8H), 7,8 (1H, s, 3H), 7,6 (4H, m, 4 x ArH), 6,9 (1H, JAB 8 Hz, 7H), 5,4 (2H, s, CH20), 3,7 (3H, s, OMe), 3,5 (4H, brs, 2 x CH2N), 1,05 (6H, t, 2 x Me).

(Fra mellomprodukt 27).

Eksempel 40

Metvl- N- r6-( 3- met. vlamlnobenzvloksv ) imidazofl. 2- b] pyridazln- 2-yl1karbamat. hvdroklorid

Sm.p. 213-215°C (dek. ),

NMR SE (d6-DMS0): 10,4 (1H, brs, NE), 7,9 (1H, JAB 8 Hz, 8H), 7,85 (1E, s, 3E), 7,3 (4E, m, 4ArE), 6,9 (1E, JAB 8 Ez, 7E), 5,4 (2E, s, CE20), 3,7 (3E, s, OMe), 2,85 (3E, s, MeN).

(Fra mellomprodukt 28).

Eksempel 41

Etyl- N- T6-( 3- dlmetylaminobenzyloksy) imidazofl. 2- blpyridazin-2- yllkarbamat

Sm.p. 204-208°C,

NMR SE (d6-DMS0): 9,95 (1E, brs, NE), 7,85 (1E, s, 3E), 7,80 (1E, JAB 8 Ez, 8E), 7,2 (1H, t, 5'H), 6,85 (1E, JAB<8 >Ez, 7E), 6,75 (3E, m, 3ArE), 5,3 (2E, s, CE20), 4,2 (2H, quad, 0CH2), 2,9 (6H, s, Me2N), 1,25 (3H, t, Me).

(Fra mellomprodukt 7).

Eksempel 42

Etyl- N- T 6-( 1- naf ty Imet ok sy ) imi dazo fl . 2- bl pyr idaz ln- 2- yll-karbamat

Sm.p. 240-245°C

NMR SE (d6-DMS0): 10,0 (1E, brs, NE), 8,2 (1H, m, ArH), 8,05 (2H, m, 2ArH), 7,95 (1H, s, 3E), 7,90 (1E, JAB 8 Ez, 8E), 7,85 (1H, d, 2'H), 7,65 (3H, m, 3ArE), 6,90 (1H, JAB 8Ez, 7E), 5,95 (2H, s, CH20), 4,25 (2E, quad, 0CE2), 1,35 (3E, t, Me).

(Fra mellomprodukt 3).

Eksempel 43

n- propvl- N- r6-( 1- naftvlmetoksvUmldazoTl. 2- blpyrldazin- 2- vll-karbamat

Sm.p. 208-210°C,

NMR SH (d6-DMSO): 10,25 (1H, brs, NH), 8,15 (1H, m, ArH), 8,00 (2H, m, 2ArH), 7,90 (1H, s, 3H), 7,85 (1H, JAB 8Hz, 8H), 7,75 (1H, d, 2'H), 7,60 (3H, m, 3ArH), 6,85 (1H, JAB 8 Hz, 7H), 5,8 (2H, s, 0CH2), 4,1 (2H, t, 0CH2), 1,65 (2H, m, CH2), 0,9 (3H, t, Me).

(Fra mellomprodukt 3).

Eksempel 44

Metvl- N- r6-( 3- metoksy- l- naftylmetoksy) imidazori. 2- bl - pyrldazln- 2- yllkarbamat

NMR SH (d6-DMS0): 10,0 (1H, brs, NH), 8,1 (1H, d, ArH), 7,9 (2H, m, ArH + 3H), 7,85 (1H, JAB 8 Hz, 8H), 6,85 (1H, JAB 8 Hz, 7H), 5,8 (2H, s, CH20), 3,90 (3H, s, OMe), 3,7 (3H, s, OMe).

(Fra mellomprodukt 29).

Eksempel 45

Metyl- N- f6- r2-( 3 . 4 . 5- trlmetoksvfenvl ) etoksv! lmldazof 1. 2- bl-pyrIdazln- 2- yllkarbamat

Sm.p. 203-206°C,

NMR SH (d6-DMS0): 9,95 (1H, brs, NH), 7,80 (1H, s, 3H), 7,75 (1H, JAB 8 Hz, 8H), 6,8 (1H, JAB 8 Hz, 7H), 6,65 (2H, s, 2ArH), 4,5 (2H, t, CH20), 3,8 (6H, s, 3MeO, 5MeO), 3,7 (3H, s, OMe), 3,65 (3H, s, 4MeO), 3,0 (2H, t, CH2).

(Fra mellomprodukt 30).

Eksempel 46

Metyl- N- 6-( 3 . 4 . 5- trlmetoksyfenetyl Umidazofl. 2- blpyridazin-2- yllkarbamat

a) 4- okso- 6-( 3. 4. 5- trimetoksvfenetyl) heks- 5- ensyre

En oppløsning bestående av laevulinsyre (50 g, 0,43 mol) i vann (200 ml) ble satt til en blanding bestående av 3,4,5-trimetoksybenzaldehyd (85 g, 0,43 mol) i etanol (150 ml) og natriumhydroksydoppløsning (5*, 700 ml). Blandingen ble varmet med omfattende omrøring helt til aldehydet var oppløst og ble deretter helt på is (ca. 2 kg). Den ble deretter surgjort til pH 3-4 og latt stå over natt. Det krystallinske stoffet som ble dannet ble filtrert ut, tørket under vakuum og deretter omkrystallisert fra etanol for å tilveiebringe svakt gule krystaller (30,08 g), sm.p. 1887-189°C.

NMR SH (d6-DMS0): 7,57 (1H, d, <J>aIBI = 18»° Hz. CH)» 7,08 (2H, s, 2'H, 6'H), 6,91 (1H, d, JAB -= 18,0 Hz, CH), 3,83 (6H, s, 3'-MeO og 5'-MeO), 3,70 (1H, s, 4'MeO), 3,33 (1H, br. m, unres, C02H), 2,92 (2H, t, JA2B2 <=> 7»° Hz, CH2) og 2,5 0 (2H, t, <J>A2B2" 7'° Hz» CH2).

b ) 4. 5- dlhvdro- 6-( 3. 4. 5- trimetoksy- q- styrvi) pyridazln- 3( 2H) on 4-okso-6-(3,4,5-trimetoksyfenetyl)heks-5-ensyre (20 g, 0,068 mol) ble løst opp i iseddiksyre (240 ml) og deretter ble hydrazinhydrat (3,4 g, 0,068 mol) tilsatt. Blandingen ble oppvarmet under tilbakestrømming i 2,5 t, avkjølt og helt inn i vann (ca. 2 1). Etter henstand over natt, ble de dannede krystallene filtrert ved pumpen og tørket under vakuum for å tilveiebringe produktet (13,58 g). En del (3,5 g) ble omkrystallisert fra metanol og tilveiebragte svakt gule krystaller (3,18 g), sm.p. 173-175°C.

NMR SH (CDC13): 8,91 (1H, brs, NH), 6,82 (2H, s, CH, CH), 6,70 (2H, s, CH, CH), 3,89 (6H, s, 3'-MeO og 5'-MeO), 3,87 (3H, s, 4'MeO), 2,82 (2H, t, JAB = 9,0 Hz) og 2,56 (2H, t, <J>AB - 9,0 Hz).

c ) 4. 5- dihydro- 6-( 3. 4. 5- trlmetoksyfenetyl) pyrldazin- 3( 2H)- on 4 , 5-dihydro-6-(3 ,4,5-trimetoksy-a-styryl)pyridazin-3(2H)-on (5 g, 0,017 mol) ble hydrert (85°, 10 atm. H2) på

iseddiksyre (150 ml) i nærvær av 10* Pd/C-katalysator (0,25 g) helt til det nødvendige opptaket av hydrogen hadde oppstått. Blandingen ble deretter filtrert gjenno "Hyflo", og filtratet fordampet under vakuum ved 35". Gjenværende spor av iseddiksyre ble fjernet ved azeotro-pering med toluen og det brune faste stoffet (4,9 g) ble videre renset ved silisiumoksyd-gelkromatografI, med 1* metanol/diklormetan som elueringsmiddel. Fjerning av oppløsningsmidlet fra de hensiktsmessige fraksjonene tilveiebragte produktet som et hvitt faststoff (3,04 g), sm.p. 116-117'C.

NMR SH (CHC13): 8,46 (1H, s, br, NH), 6,43 (2H, s, 2'H, 6'H), 3,83 (6H, s, 3'MeO og 5'MeO), 3,81 (3H, s, 4'MeO), 2,84 (2H, t, JAB - 7 Hz, CH2), 2,61 (2H, t, JAB" 7Hz) og 1,95 (4H, m, part. res., CH2, CH2).

d) 6-( 3. 4. 5- trlmetoksvfenetvl) pyrldazin- 3( 2H)- on 4 , 5-dihydro-6-(3,4,5-trimetoksyfenetyl-pyridizan-3(2H)-on

(1,72 g, 5,93 mmol) og seleniumdioksyd (0,98 g, 8,83 mmol) ble tilbakestrømmet i etanol (80 ml) i 4,5 dager. Mer selendioksyd (0,5 g, 4,51 mmol) ble tilsatt og blandingen ble tilbakestrømmet i 5 dager til. Blandingen ble filtrert for å fjerne selen som var blitt separert og filtratet ble fordampet under vakuum for å tilveiebringe et brunt klebrig faststoff (2,21 g). Dette faste stoffet ble utsatt for flammekromatografi på silisiumoksyd med 1-2* metanoldiklormetan som elueringsmiddel. Kombinasjon av de hensiktsmessige fraksjonene ga produktet som et sand-brunt krystallinsk faststoff (1,43 g), sm.p. 122-124'C.

NMR SH (CDCI3): 11,64 (1H, brs, NH), 7,08 (1H, d, JAB - 6 Hz, HetCH), 6,89 (1H, d, JAB - 6 Hz, HetCH), 6,48 (2H,

s, 2'H, 6'H), 3,83 (9H, 2s, 3'MeO og 5'MeO) og 2,82 (4H, s, CH2-CH2).

e ) 3- klor- 6-( 3. 4. 5- trImetoksyfenetyl) pyrldazln

En blanding av 6-(3,4,5-trimetoksyfenetyl)pyrldazln-3(2H)-on (2,80 g, 9,65 mmol) og fosforoksyklorid (70 ml) ble oppvarmet ved 100"C ilt, avkjølt til romtemperatur og hydrolysert ved forsiktig, gradvis tilsetning av vann i løpet av 3 t, slik at temperaturen ikke var høyere enn 30° . Blandingen ble deretter gjort basisk til pH 12 ved tilsetning av natriumhydroksydoppløsning (10N, 700 ml) og deretter hensatt ved 4° over natt. Bunnfallet ble filtrert ved pumpen, vasket omhyggelig med vann for å fjerne uorganiske salter og resten på sintre ble tatt på i diklormetan. Etter tørking (natriumsulfat), tilveiebragte fjerning av oppløsningsmidlet et lysebrunt faststoff (2,84 g) som ble renset ved flammekronratografi på silisiumoksyd med 10* etylacetat/diklormetan som elueringsmiddel. Hensiktsmessige fraksjoner ble slått sammen for å tilveiebringe et hvitt faststoff (2,16 g), sm.p. 105-106°C.

NMR SH (CDC13): 7,38 (1H, d, JAB - 9 Hz, HetCH), 7,16 (1H, d, JAB - 9 Hz, HetCH), 6,37 (2H, s, 2'H, 6'H), 3,82 (9H, s, 3'MeO, 4'MeO og 5'MeO), 3,37 (2H, t, <J>A2B2 - 9 Hz, CH2), og 3,04 (2H, t, <J>A2B2 » 9 Hz, CH2).

f) 3- amino- 6-( 3. 4. 5- trimetoksyfenetyl) pyridazin 3-klor-6-(3,4,5-trimetoksyfenetyl)pyridazin (1,97 g, 6,38

mol) i metanolholdig ammoniakk (mettet, 800 ml) ble oppvarmet i en rustfri stålautoklav ved 150° I 65 t og dertter avkjølt. Blandingen ble deretter fordampet under vakuum for å tilveiebringe et mørkebrunt klebrig faststoff (2,84 g) som ble utsatt for f lammekr onrat ograf i på silisiumoksyd med 3* metanol/diklormetan som elueringsmiddel. Kombinasjon av de relevante fraksjonene tilveiebragte produktet som et hvitt faststoff (0,56 g), sm.p. 130-132°C.

NMR SH (CDCI3): 6,96 (1H, d, JAB - 9,0 Hz, HetCH), 6,67 (1H, br, d, JAB - 9,0 Hz, HetCH), 6,42 (2H, s, 2'H, 6'H), 4,74 og 1,98 (2H, brs, -NH2), 3,83 (9H, s, 3'MeO, 4'MeO), 3,13 (2H, part res m. , CH2) og 3,01 (2H part res. m., CH2).

g) Metvl- N- 6-( 3. 4. 5- trimetoksvfenetvl) lmldazori. 2- bl-pyridazln- 2- vi- karbamat

3-amlno-6-(3,4,5-trImetoksyfenetyl)pyridazln (0,50 g, 1,73 mmol) og metyl-N-kloracetylkarbamat (0,26 g; 1,74 mmol) ble oppvarmet 1 tørr heksametylfosforamid (destillert fra CaH2 under vakuum, 1 5ml) med omrøring i 4 t ved 100°C under nitrogen. Blandingen ble deretter avkjølt, helt inn i vann (150 ml), hvorpå et bunnfall ble dannet. Etter henstand over natt ble bunnfallet filtrert ut og tørket under vakuum for å tilveiebringe et kremfarget krystallinsk faststoff (0,53 g). Dette faste stoffet ble videre renset ved flammekromatografi (silisiumoksyd, 1-2* metanol/diklormetan som elueringsmiddel) og krystallisering fra etylacetat for å. tilveiebringe off-white krystaller (0,18 g), sm.p. 175-176°C.

NMR SH (CDCI3): 10,17 (1H, br.s, NH), 8,18 (1H, br.s, Het 3-H), 7,77 (1H, d, JAB -<1>0 Hz, Het CH), 6,85 (1H d, JAB - 10 Hz, HetCH), 6,42 (2H, s, 2'-H, 6<*->H), 3,88 (3H, s, C02Me) og 3,82 (9H, s, 3-MeO, 4'-MeO, 5'-Me0), 3,12 (2H, part. res. m, CH2) og 3,02 (2H, part. res. m, CH2).

Eksempel 47

Metyl- N- 6-( 3. 4. 5- trimetoksv- a- styrvlUmidazofl. 2- blpvridazin-2- ylkarbmat

a) 6-( 3. 4. 5- trimetoksy- a- styryl) pyridazln- 3( 2H)- on Forbindelsen ifølge eksempel 46(b) (10,0 g, 34,4 mmol) og

selendioksyd (10 g, 90,1 mmol) ble oppvarmet under tilbakestrømming i etanol (300 ml) i 80 t. Mer selendioksyd (10 g) ble tilsatt og tilbakestrømmingen ble fortsatt i 40 t til. Reaksjonsblandingen ble deretter

filtrert gjennom "Hyflo", fordampet og resten tørket under vakuum for å tilveiebringe et mørkebrunt klebrig faststoff (14,48 g). Dette ble deretter kromatografert på silisiumoksyd med 1-2* metanol/diklormetan. Kombinasjon av de hensiktsmessige fraksjonene, etterfulgt av krystallisering fra metanol tilveiebragt produktet som et sand-brunt faststoff (5,57 g), sm.p. 194-196°C.

NMR SH (CDC13): 11,95 (1H, br. s, NH), 7,66 (1H, d, <J>aibI - 10 Hz, Het CH), 7,10 (1H, d, JA2B2 - 18 Hz, CH), 7,01 (1H, d, <J>aibI" 10 Hz« HetCH), 6,92 (1H, d, <J>a2B2" 18 Hz, CH), 6,74 (2H, s, 2 *-H, 6'-H), 3,91 (6H, s, 3'-MeO, 5'-Me0) og 3,88 (3H, 4'-MeO).

b ) 3- klor- 6-( 3. 4. 5- trimetoksy- a- stvrvl) pyridazln 6-(3,4,5-trimetoksy-a-styryl)pyridazin-3(2H)-on (5,3 g, 0,018 mmol) i fosforoksyklorid (150 ml) ble oppvarmet ved 100° i 1,25 t. Blandingen ble deretter satt til vann (3 1) over 2 t, ved at temperatur ble holdt innenfor området 10-30°C. Blandingen ble deretter forsiktig gjort basisk til pH 10 med natriumhydroksydoppløsning (10N, 1,31). Etter henstand over natt, ble bunnfallet filtrert ut og tørket under vakuum for å tilveiebringe produktet som et sand-brunt faststoff (6,24 g). En del omkrystallisert fra etanol hadde sm.p. 162-163,5°C.

NMR SH (CDCI3): 7,64 (1H, d, JA1B1 - 10 Hz. He* CH), 7,54 (1H, d, <J>A2B2 = l8 Hz, CH), 7,48 (1H, d, <J>A1B1 - 10 Hz, Het CH), 7,27 (1H, d, JA2B2 = l8 Hz, CH), 6,82 (2H, s, 2'-H, 6'-H), 3,92 (6H, s, 3'-MeO og 5'-MeO) og 3,88 (3H, s, 4'-Me0).

c ) 3- amlno- 6-( trlmetoksy- a- styryl) pyrldazin 3-klor-6-(3,4 ,5-trimetoksy-a-styryl)pyridazin (5,5 g, 17,1 mmol) i metanolholdig ammoniakk (mettet, 800 ml) ble oppvarmet i en rustfri stålautoklav ved 150°C i 100 t og deretter avkjølt. Fjerning av oppløsningsmidlet og

kromatografi på silisiumoksyd (2* metanol/diklormetan) tilveiebragte produktet som et lysebrunt faststoff (1,58 g), sm.p. 139-142-C. NMR SH (CDCI3): 7,49 (1H, d, JaibI = 10 Hz» CH)» 7»24 (2H, 2 x superimposed d, JaibI » <J>A2B2 ™ (10 Hz • 2 x CH)» 6,75 (3H, d, superimposed on s, <J>a2B2 " 10 Hz» CH» 2'_H> 6'-H), 4,85 (2H, br.s, NH2), 3,92 (6H, s, 3-MeO og 5-MeO) og 3,87 (3H, s, 4-MeO). d) Me tvi- N- 6- ( 3 . 4 . 5- trimetoksy- a- styryl) imidazo fl. 2- bl pyr i-dazin- 2- yl- karbamat 3-amino-6-(3,4,5-trimetoksy-a-styryl)pyridazin (1,36 g, 4,72 mmol) og metyl-N-kloracetylkarbamat (0,68 g, 4,49 mol) ble varmet opp i tørr heksametylfosforamid (destillert fra CaH2 under vakuum 30 ml) med omrøring i 4 t ved 100°C. Blandingen ble deretter avkjølt og helt i vann (40 ml). Bunnfallet som ble dannet ble filtrert ut og tørket under vakuum for å tilveiebringe et gul-brunt faststoff (1,0 g). Dette ble kromatografert på silisiumoksyd for å tilveiebringe produktet som et svakt gult faststoff (0,4 g), sm.p. 217-219°C.

NMR SH (d6-DMS0): 10,49 (1H, br.s, NH), 7,99 (1H, s, Het,

3-H), 7,94 (2H, d, <J>aibI" 10 Hz• HetCH), 7,60 (2H, d, <J>A2B2 = 18 Hz, CH), 7,58 (2H, d, JaibI " 10 Hz, HetCH), 7,28 (2H, d, <J>A2B2 = 18 Hz» CH)• 7'04 (2H» s» 2'H' 6'H)» 3,87 (6H, s, 3<*->MeO og 5'-MeO), [3,72 (3H, s) og 3,70 (2H, s)] (C02Me og 4'-MeO).

Eksempel 48

Metvl- N- r6-( 3. 4. 5- trimetoksybenzvloksy) lmidazori. 2- bl - pyridazin- 2- yllkarbamat

6-(3,4 , 5-trimetoksybenzyloksy)imidazo[1,2-b]pyr idazin-2-karboksylsyreazid (eksempel 23C) (1,0 g, 2,6 mmol) ble oppvarmet under tilbakestrømming i 24 t i toluen (20 ml) og metanol (ca. 1,5 ml). Blandingen ble avkjølt og fordampet

under vakuum for å tilveiebringe et gult faststoff som ble omkrystallisert fra DMF og vann for å tilveiebringe tittel-produktet (1,05 g), sm.p. 213-215,,C og NMR identisk med produktet i eksempel 1.

Eksempel 49

Metvl- N- r6-( 3. 4. 5- trimetoksvbenzvloksv) Imidazo fl. 2- bl - pvrldazin- 2- vllkarbamat

a) 2- amlno- 6-( 3. 4. 5- trimetoksvbenzvloksv) lmldazori. 2- bl-pvridazln- trlfluoracetat

t-butyl-N-[6-(3 ,4 , 5-trimetoksybenzyloksy)imidazo[1,2-b]-pyridazin-2-yl]karbamat (eksempel 13, 0,43 g, 1 mmol) ble oppløst i diklormetan (2 ml) og behandlet med trifluoreddiksyre (1 ml). Etter 2 t ved romtemperatur ble blandingen fordampet under vakuum for å tilveiebringe en brun olje som ble triturert med dietyleter for å tilveiebringe tittelforbindelsen (0,25 g) som kremfaststoff, sm.p. 150-157°C,

NMR SH (d6-DMS0): 8,0 (1H, JAB 8,8 Hz, 8H), 7,48 (1H, s, 3H), 7,16 (1H, JAB 8,8 Hz, 7H), 6,44 (2H, s, CH2), 4,5 (brs, NH3), 3,89 (6H, s, OMe) og 3,75 (3H, s, OMe).

b) Metvl- N- 6-( 3. 4 . 5- trlmet oksybenzyloksy) imidazo I" 1.2-bl-pyrldazln- 2- vIlkarbamat

Produktet fra trinn (a) (1,0 g, 3,03 mmol) ble suspendert i diklormetan og rystet med fortynnet natriumhydroksyd-oppløsning. Den organiske fasen ble tørket (Na2S04) og fordampet for å tilveiebringe en brun olje som ble løst opp i diklormetan og behandlet, ved omrøring, med trietylamln (0,42 ml, 3,03 mmol), metylklorformat (0,23 ml, 3,03 mmol) og 4-dimetylaminopyridin (18 mg, 0,3 mmol). Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 17 t, deretter varmet under tilbakestrømming i 2 t og fordampet under vakuum. Det resulterende faste stoffet ble fordelt mellom kloroform og vann, den organiske fasen ble separert, tørket (Na2S04) og fordampet for å tilveiebringe et fast stoff som ble kromatografert på SIO2 og eluering med 2* metanol-kloroform. Produktet ble omkrystallisert fra DMF-H2O for å tilveiebringe tittelforbindelsen (0,27 g), sm.p. 210-212°C, NMR var identisk med produktet i eksempel 1.

Eksemplene 50 - 52

De følgende forbindelser ble fremstilt ved anvendelse av en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet i eksemplene 1-3: Eksempel 50

Metyl- N- f6-( 2. 5- dimetylbenzyloksv) imidazofl. 2- blpyridazin- 2-yllkarbamat

Sm.p. 208-209°C,

NMR SH (d6-DMS0): 10,05 (1H, br.s, NH), 7,95 (1H, JAB 8,8 Hz, 8H), 7,85 (1H, s, 3-H), 7,35 (1H, s, 6'-H ) , 7,20 (2H, JAB 8,8 Hz, 7H + d, 3' eller 4 *-H) , 6,90 (1H, d, 3' eller 4'-H), 5,90 (2H, s, CH2), 3,80 (3H, s, OMe), 2,4 (3H, s, Me), 2,35 (3H, s, Me).

(Fra mellomprodukt 24).

Eksempel 51

Metyl- N- f 6- ( 2- pyr i dy Imet oksy) Imi dazo fl. 2- bl pyr idaz in- 2- vll-karbamat

Sm.p. 231-233° (dek.)

NMR SH (d6-DMS0): 9,95 (1H, br.s, NH), 8,55 (1H, d, 6'-H), 7,85 (3H, m, 8-H + 3-H + 5'-H), 7,55 (1H, d, 3'-H), 7,35 (1H, m, 4'-H), 6,90 (1H, JAB 8,8 Hz, 7-H), 5,45 (2H, s, CH2), 3,70 (3H, s, OMe).

(Fra mellomprodukt 31).

Eksempel 52

Me tvi- N- T b ~( 2- f ur f ur vi oksy ) imi dazo f 1 . 2- bl pyr idaz in- 2- vll-karbamat

Sm.p. 220-224°C,

NMR SH (d6-DMSO): 10,05 (1H, br.s, NH), 7,95 (1H, s, 3-H), 7,90 (1H, JAB 8,8 Hz, 8-H), 7,75 (1H, brs, 5'-H), 6,90 (1H, JAB 8,8 Hz, 7-H), 6,75 (1H, d, 4 '-H), 6,55 (1H, br.s, 3'-H), 5,45 (2H, s, CH2), 3,80 (3H, s, OMe).

(Fra mellomprodukt 32).

BIOLOGISKE TESTRESULTATER

A. Tubulln- polvmerlsas. lonsanalvse

Materialer og metoder

1. Fremstilling av tubulin

a) Frisk hestehjerne -

b) Buffere:

pH 6,9 ved 23°C.

<*>MES •= 2(N-morfolino )etansulfonsyre

EGTA = etylenglykol-is(p-aminoetyleter)-N,N,N',N'-tetraeddlksyre

GTP ■= guanosintrif osf at

Alle manipuleringene blir utført ved 4°C hvis Ikke noe annet er oppgitt. Hestehjernen ble vasket i iskald BBG-buffer og hjernens hinner og blodkar ble fjernet. Etter veiing ble cerebral kortiser hakket opp, homogenisert i 75 ml BBG-buffer/100 g hjerne, sentrifugert ved 6500 g i 15 min. og etter fjerning av supernatanten, på ny sentrifugert ved 100.000 g i 75 min. Volumet av supernatanten (V izl) ble målt og V/10 ml 10 mM GTP (Li-salt) 1 H20 tilsatt. Blandingen blir inkubert i forseglede sentrifugerar (30 min., 34°C) i et rystevannbad for å polymerisere tubulin. Etter polymerisa-sjonen balanseres rørene og sentrifugeres ved 100.000 g (1 t ved 27°C) i en for-varmet rotor. Høy-hastighetpelleten blir resuspendert i V/4 ml BB-buffer og preparatet omrørt på is i 30 min. og sentrifugert ved 100.000 g (1 t ved 4°C) for å fjerne de kald-stabile mikrotubulene. Et likt volum BB2G-buffer blir satt til supernatanten som raskt blir frosset i 5 ml prøver i plastikk veiebegre som flyter på en fast C02/etanol-oppslemming, og lagret over natt ved -80°C. Etter ca. 18 timer blir de frosne tubulinprøvene tint, 10 mM GTP i H2O blir tilsatt for å tilveiebringe en final konsentrasjon på 1 mM, og det nye volum (V ml), blir målt. Polymerisasjon/- depolymerisasjonscyklusen blir gjentatt nøyaktig som ovenfor, men ved erstatning av W for V for å tilveiebringe tubulin som er gått gjennom to cykluser. 2 . Turbldimetriske analyse av tubulinpolymer 1 sas. 1 on Apparatur: Registrerende spektrofotometer med en 6-posisjon, termostat-tilknyttet kuvetteholder; full skala-avbøyning = 0,2 absorbansenheter.

I en 1 ml spektrofotometerkuvette blir 100 pl 10 mM GTP (Li-salt) laget i BB-buffer, 10 pl H20 eller DMSO - avhengig av valgte medikamentoppløsningsmiddel, BB-buffer og tubulln-preparatet blandet, slik at den endelige økningen i A35Qnm er 0,15 enheter etter 16 min. (omtrent 100 pl tubulinprep. eller 2,5 mg protein) i et endelig volum å 1 ml ved 37°C. Alle reagensene ble lagret på is.

Polymerisasjon blir initiert ved heving av temperaturen til 37°C og økningen i Å350nm til triplikatprøvene mot en referansekuvette blir målt. Referanseprøven innbefatter en lignende inkubasjonsblandingen enten uten tubulin eller med tilsetning av 1 mM Ca<2+>. Økningen over opprinnelig Ag50nm 10 min. etter fullføringen av lagfasen (kontrollpolymerisasjon er 80* fullført innenfor denne tiden) blir beregnet og uttrykt som en prosentandel av kontrollverdlen, for en mengde medikamentkonsentrasjon. Medlkamentkonsentrasjonen som er nødvendig for å tilveiebringe en 50* forandring (IC50) i kontrollverdlen blir bestemt.

Resultater

B. P338Di koloni-dannende analyse

Metode

I denne analysen, blir celler fra in vitro-tilpasset linje fra muselymfoidneoplasma, P388 først eksponert til fortynnede konsentrasjoner av testforbindelse i serie over en periode på 24 timer i kultur. Deretter, blir evnen som slike behandlede celler har til å danne enkelte kolonier over en periode på 14 dager etter resuspensjon I et semi-fast medikamentfritt medium bestemt.

Opprinnelige celler 1 log-vekst blir sådd ut i individuelle 25 cm<2> vevskulturflasker som hver inneholder et endelig volum på 5 ml Hepes-bufret RPMI 1640-kulturmedium supplementert med 10* føtalt kalveserum, antibiotika og testforbindelse. Alle forbindelsene er opprinnelig formulert i hensiktsmessig konsentrasjoner i DMSO, 25 pl som deretter blir satt til hver flaske. Alle forbindelsene blir evaluert ved konsentrasjoner som varierer i serier i fire ganger dekrementer fra en toppkonsentrasjon omtrent fire ganger større enn det som allerede som kjent hemmer proliferasjonen av disse cellene med omtrent 80 til 90* i den primære proliferative analysen.

Etter 24 timers utsetting for testforbindelsen, blir cellene telt og et kjent antall levende celler blir overført til et 15 ml sentrifugerør hvorpå 4 ml 0,25* lavtemperatur-geldan-nende agaroseoppløsning i fullstendig RPMI-vevskulturmedium blir tilsatt. Etter inkubasjon i 13 dager ved 37° C, 1 ml 1* p-jodnitrotetrazolium-fiolett blir tilsatt til toppen av hvert rør og trenger gjennom agarosen i 24 til 48 timer til. Dette fargestoffet blir metabolisert av de levende cellene og medfører produksjon av et uoppløselig rødt krystallinsk produkt som letter tellingen av koloniene. Prøver blir tatt fra hvert rør og antall kolonier som inneholder et minimum av 50 celler blir bestemt. Konsentrasjonen til forbindelsen som er nødvendig for å inhibere kolonidannelse ved 50* relativ til kontrollcellene inkubert under identiske betingelser, men i fravær av testforbindelsen blir bestemt.

Resultater

C. Lvmfocvtisk leukemi P388/ 0- test

Metode

CD2-Fi mus, av samme kjønn, som veler innen et 3 grams område rundt 20 g, ble anvendt for denne testen. Kontroll- og testdyr blir injisert intraperitonealt med en suspensjon på IO<6> levedyktige P388/0-svulstceller på dag 0. I hver test blir flere dosenivåer som omkranser LD20 f°r forbindelsen bestemt; hver dosenivågruppe inneholder 6 dyr. Testforbindelsene blir fremstilt enten i fysiologisk saltvann inneholdende 0,05* "Tween 80" eller destillert vann inneholdende 5* dekstrose og blir administrert intraperitonealt på dager 1, 5 og 9 relativt til svulstimplantatet. Dosene er på mg/kg basis i henhold til individuell dyrekroppsvekt. Dagen hvor døden for hvert dyr inntreffer blir ført opp og den gjennom-snittlige dagen hvor døden inntreffer blir bestemt for hver gruppe. Forskjellen mellom gjennomsnittlig overlevelsestid for behandlede grupper og kontrollgrupper blir uttrykt som n prosentvis økning i livslengde (% ILS).

Resultater

D. LD50 (mus)

Metode

Testforbindelsene blir fremstilt som beskrevet for lymfocyttleukemi P388/0-test (C) og administrert intraperitonealt ved forskjellige dosenivåer til grupper på 6 CD2-Fi~mus, av samme kjønn, som veier 20 ± 3 g, på dagene 1, 5 og 9. Musene blir observert i opptil 14 dager (fra dag 1), antall dødsfall i hver gruppe blir registrert og LD20 blir bestemt.

Resultater

E. Aktivitet mot medikament- reslstente svulster

Ved anvendelse av en lignende fremgangsmåte som lymfocyttleukemi P388/0-testen, ble forbindelsene i eksempel 1 beregnet mot P388/0-svulstene som var blitt gjort resistente til følgende standard, klinisk anvendte anti-svulstmidler:

bis-klornitrosourea (BCNU)

cyklofosfamid (CPA)

adriamycin (ADR)

aktinomycin D (ActD)

metotreksat (MTX)

5-fluoruracil (5FU)

cis-platinum (cis-Pt)k

vinkristin (VCR)

amsacrin (AMSA)

Resultater

F. In vitro- aktivitet mot humane svulstcellelin. ler Metode

Celler fra de humane svulstcellelinjene DLD-1, HCT-116, ViDr og A549 er utsatt for konsentrasjoner fortynnet i serie av testforbindelsene over en periode på 96 timer I kultur. Evnen som slike celler har til å prollferere i løpet av test-perioden blir bestemt.

Celler i log-vekst blir sådd på 96 brønn-multibrønns-kulturplater i 100 pl/brønn RPMI 1640-kulturmedium supplementert med 10* føtalt kalveserum, antibiotika og testforbindelse. Alle forbindelsene blir opprinnelig formulert ved hensiktsmessige konsentrasjoner i DMSO, hvor de endelige konsentrasjonene i dette oppløsningsmidlet er tyve ganger det som er nødvendig i platen. En endelig 1 i 10 fortynning i fullstendig medium blir derved utført før tilsetning av 100 pl til hver brønn i platen. Alle forbindelsene blir bestemt ved konsentrasjoner som varierer i serie i fire ganger dekrementer fra en toppkonsentrasjon som er fire ganger større enn det som man vet hemmer proliferasjonen av cellene fra muselymfoideneoplasma, P388D1 ved omtrent 80 til 90* i en primær proliferativ analyse.■<o>

Etter 96 timer blir proliferasjonen av cellene utsatt for testforbindelsen sammenlignet med ubehandlede kontrollceller ved anvendelse av en av to metoder: a) Kultursupernatantene blir aspirert og cellene fiksert og farget ved tilsetning av en oppløsning bestående av metylen-blå (5 g pr. liter 50* etanol:vann, 100 pl/brønn). Etter 30 minutter ved romtemperatur blir ubundet farge vasket av ved å senke platene ned i vann. Fargede celler blir løst opp over natt ved anvendelse av 1* "Sarkosyl"

(Sigma) i fosfat-bufret saltvann (100 pl/brønn). Absorbansene blir lest ved anvendelse av et "ELISA"-platespektro-fotometer ved en bølgelengde på 620 nm. IC5q er definert som den konsentrasjonen av medikamentet som reduserer

absorbansen til 50* i forhold til kontroll (medikament-frie) kulturer. Denne metoden blir anvendt for DLD-1-cellelinjen.

b) 20 pl MTT (5 mg/ml i PBS) ble satt til hver brønn. Etter en inkubasjonsperiode på 4 timer blir mediet fra hver

brønn sugd opp og erstattet med 200 pl DMSO for å løse formazankrystallene som ble dannet. Absorbansene ble lest ved hjelp av et "ELISA"-platespektrofotometer ved en bølgelengde på 540 nm. IC50 blir definert som den konsentrasjonen av medikamentet som reduserer absorbansen til 50* i forhold til kontroll (medikament-frie) kulturer. Denne metoden blir anvendt for WiDr-, ECT-116- og A549-celleinj ene.

G. In vlvo- aktlviet til forbindelse ifølge eksempel 1 mot

murine svulster

Ved anvendelse av en lignende prosedyre som lymfocyttleukemi P388/0-testen ble forbindelsen i eksempel 1 beregnet mot de murine svulstene B16, L1210 og M5076. En suspensjon av 10<6->svulstceller blir implantert intraperitonealt til kontroll-og testdyrene på dag 0. B16-svulstcellene blir administrert intraperitonealt som en 1:10 Brei av celler på dag 0. Testforbindelsen blir administrert intraperitonealt på dagene 1, 5 og 9. I B16- og M5076-testene er det 10 mus pr. behandlet gruppe og for L1210 er det 6 mus pr. behandlet gruppe. Dagen hvorpå hvert dyr dør blir registrert og % ILS (prosents økning i livslengden) blir beregnet. Resultatene er gitt i tabell 7. Formuleringseksempel

Forbindelsen med formel (I) blir finmalt og omhyggelig blandet med tilsetningsstoffene 1 pulverform, pregelatinisert kornstivelse og natriumstivelseglykolat. Pulvrene blir fuktet med renset vann for å danne granuler. Granulene blir tørket og blandet med magnesiumstearat. Formuleringen ble deretter komprimert til tabletter som omtrent veier 184 mg hver.

Claims (2)

1. Analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive forbindelser hvori R<1> står for en fenylgruppe, eventuelt med 1-4 substituenter valgt fra Cj^alkyl, Cj^alkoksy, C^_4alkoksy substituert med Ci_2alkoksy eller med C^_2alkoksy Ci_2alkoksy, fenyl, halogen, mono-Ci_4alkylamino og di-C^_4alkylamino, naftyl eventuelt substituert med Ci_4alkoksy, pyridyl, furyl, tienyl eller en C3_(,alkylgruppe; R<2> står for fenyl; eller C^.^alkyl, nevnte C^.^alkyl er eventuelt substituert med Cl_4alkoksy, hydroksy, halogen, morfolin, CF3 eller amino, idet nevnte amino er eventuelt substituert med en eller to C^_4-alkylgrupper; R<3> står for et hydrogenatom eller en Ci_4alkylgruppe; X står for et oksygen- eller svovelatom eller en gruppe -CH2-; Y står for en gruppe CH2 eller -CH2-CH2-; eller X og Y står sammen for gruppen -CH=CH-; eller et salt eller fysiologisk funksjonelt derivat derav, karakterisert ved at man (A) omsetter et pyridazinderivat med generell formel (II): (hvori R<1>, X og Y er som definert i krav 1) med en forbindelse med generell formel (III): (hvori R<2> og R<3> er som definert ovenfor og Z står for et halogenatom); (B) omsetter en forbindelse med formel (VI): der R<1>, X og Y er som definert ovenfor med en hensiktsmessig alkohol R<2>0H, der R<2> er som definert ovenfor, (C) omsetter en forbindelse med formel (VII) med et haloformat med formelen Hal-CO hvori R<2> er som definert ovenfor; idet hvilken som helst av reaksjonene (A) - (C) blir etterfulgt om ønskelig av alkylering av en forbindelse med formel (I) der R<3> er hydrogen for å tilveiebringe en forbindelse med formel (I) der R<3> er Ci_4alkyl.

2. Analogifremgangsmåte ifølge krav 1 for fremstilling av N-[6-(3,4, 5-trimetoksybenzyloksy)imidazo[1,2-b]pyridazin-2yl]kar-bamat eller et salt derav, karakterisert ved at man anvender tilsvarende substituerte utgangs-materialer.