NO166258B - Fremgangsmaate for konsentrering og paavisning av biomolekyler og -celler og en anordning for dette. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte og en anordning for å konsentrere og påvise biologiske substanser med affinitetsegenskaper.

Tidligere kjente metoder for å måle biologiske og biokjemiske materialer har vært utilfredsstillende, ettersom det ofte har vært vanskelig å konsentrere materialet for målingen. Forskjellige teknikker så som spin-tørking og ultrafiltrering for å oppnå en øket konsentrasjon av det biologiske og biokjemiske materiale som skal analyseres, har vært anvendt. Imidlertid viste det seg at flere molekyler ikke kunne konsentreres på en slik måte og eksempler på dette er antigener, nukleinsyrer, hormoner, enzymer, ligander osv. En alvorlig ulempe med disse teknikker er at også kontaminerende molekyler konsentreres og innvirker på påvisningen av det ønskede materiale.

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for separat konsentrering av biologiske og biokjemiske materialer med affinitetsegenskaper. Dette oppnås ved at en flytende prøve inneholdende substansen som skal påvises, hvilken substans viser affinitet overfor en annen substans, i en strøm passerer en fast overflate til hvilken overflate den andre substans, til hvilken den første substans som skal påvirkes viser affinitet,

er bundet slik at det oppnås en anrikning av substansen som skal påvises, og i forhold til væskevolumet i kontakt med den aktive overflate passerer et mange ganger større væskevolum overflaten, hvoretter det dannede komplekset, på nevnte faste overflate, av den første substansen som skal påvirkes og substansen hvortil den første substansen har affinitet,

markeres og avleses. Substansen som skal påvises og substansen til hvilken den første substans viser affinitet, består fortrinnsvis av antigen-antistoff, DNA-DNA, DNA-RNA, RNA-RNA, lektinreseptor og andre ligand-reseptorkombinasjoner. Avlesning kan foregå ved hjelp av forskjellige markører så som enzymer, radioaktivitet, laser osv.

Påvisningsprosessen ifølge foreliggende oppfinnelse kan automatiseres og ømfintligheten økes minst ti ganger sammenlignet med tidligere kjente metoder så som "enzyme-linked immunosorbent assay" (ELISA) mikroplater og ved radioimmuno-analyse (RIA) teknikker, immunofluorescens osv. (Voller, A., Bartlett, A., og Bidwell,D.E., "Enzyme immunoassays with

special reference to ELISA techniques", J. Clin. Pathol. 31. 507-520 (1978): Overby, L.R., og Mushawar, J.K., "Radioimmune assays",. s.39-70, i M.W. Rytel (ed.), Rapid diagnosis in infectious disease, CRC Press, Boca, Fla. (1979); Dahle, A.B., and Laake, M., "Diversity dynamics of marine bacteria studies by immunofluorescent staining on membrane filters", Appl. Environ. Microbiol. 43. 169-176 (1982).

Anordningen for utførelsen av fremgangsmåten er karakterisert ved en strøm over en fast overflate av en væskeprøve inneholdende substansen som skal påvises, hvilken viser affinitet overfor en annen substans, hvilken sistnevnte er bundet til den faste overflate, hvorved substansen som skal påvirkes anrikes.

Avhengig av strømningsforholdet og strømningstiden oppnås en betraktelig lavere grense for det påviselige nivå. Konsentrasjonen av bakterier og mengden av de bundede substanser er andre variable. Graden av bundet substans økes med øket spesifisitet.

Strømmengden må undersøkes hver gang og avhenger inter alia av strørrelsen til molekylene som skal påvises.

Den faste overflaten kan være enhver fast overflate som er immobilisert, men er fortrinnsvis hydrofob og består av polymere substanser så som glass, plastmateriale, metall, silikon osv. Bindingen til overflaten oppnås

1) ved passiv adsorbsjon til den hydrofobe overflate, eller

2) ved å immobilisere det spesifikke molekyl, f.eks. antistoff, enzym, antigen, til en fast fase ved adsorbsjon eller kovalent binding.

Den flytende prøve kan bestå av vann, vannbaserte systemer, f.eks. buffer, legemsvæsker, luftprøver sammenpakket i cyklon-medier, gjenoppslemmede faste prøver i egnede buffersystemer som inneholder substansen som skal påvises.

I bakteriemåling har det vist seg å være fordelaktig hvis prøven inneholder minst IO<3> bakterier pr. milliliter oppslemmet, men også så små mengder som IO<2> bakterier pr. milliliter kan påvises.

Konsentrasjonen av den ønskede substans kan reduseres hvis prøvens volum økes og likevel gir påviselige resultater.

Et ikke-begrensende eksempel på en anordning som brukes ifølge foreliggende oppfinnelse er vist i den vedlagte skjema-tiske oversikt av konsentrerings-prosessen ved hjelp av en immunologisk teknikk (fig.l).

En prøve (1) som f.eks. inneholder antigen pumpes med en pumpe (2) i et rør (3) til hvis innvendige flater antistoffer er bundet. Ved strømmen gjennom røret avsettes antigener på antistoffene og danner et kompleks som avleses ved forskjellige markører, f.eks. en fargereaksjon med alkalifosfataser.

Hittil brukte målemetoder så som de ovenfor nevnte ELISA-metoder har begrensninger med hensyn til laveste mengder påviselig antigen (sensitivitet). Forskjellige midler for å

øke konsentrasjonen direkte så som sentrifugering eller ultrafiltrering har som ovenfor angitt, vært brukt for å øke konsentrasjonen og sensitiviteten uten å gi tilfredsstillende resultater.

Antistoffer erholdt fra kaniner som hadde fått antigenet fra Francisella tularensis (kilden til tularemi) ble undersøkt med hensyn til deres evne til å gjenkjenne hele bakterier av F. tularensis . Det ble da funnet at antistoffene var bundet til bakteri-enes overflater og kunne brukes som et diagnostisk middel. Et målesystem ble utviklet basert på antistoffene hvori markøranti-stoffene ble affinitetsrenset mot antigenene og merket med alkalisk fosfatase.

Når det diagnostiske systemet ble undersøkt med hele bakterier av F. tularensis ved såkalt mikroplate-ELISA, fant man at den laveste mengde bakterier som tydelig kunne påvises ved metoden, var en konsentrasjon på 10 5 bakterier pr. milliliter (Fig. 2).

Konsentrering ved sentrifugering eller ultrafiltrering ga det samme resultat etter analyse (d.v.s. ingen økning ble oppnådd, ikke vist).

Undersøkelser av epidemier av tularemi hadde vist at F. tularensis kan foreligge i og spres ved vann og luft. Et behov for måling av vann og luft som inneholder ørsmå mengder av bakterier, er således oppstått. Et annet eksisterende behov er også å måle meget små prøver så som legemsvæsker.

Som ovenfor nevnt, har ELISA-metodene som har vært brukt vist seg å være utilfredsstillende etter som den laveste mengde bakterier som kan påvises ved metodene ligger innenfor en konsentrasjon på 10 5 bakterier pr. milliliter.

Derfor ble undersøkelser foretatt ved bruk av affiniteten av F. tularensis overfor spesifiserte antistoffer for å øke sensitiviteten av undersøkelsen.

Et overflate-antigen ble fremstilt som beskrevet av Sand-strøm, G., Tarnvik, A., Wolf-Watz, H., og Løfgren, S., "Prepara-tion of antigen from Francisella tularensis for demonstration of antibodies by the ELISA", FOA Report C 40179-B 3, Juni 1983, Umeå, Sverige.

Et overflate-antigen (Sandstrøm et al., Inf. Imm. 45, 101-106 (1984)) ble isolert, som immunisert på kanin ga spesifikke antistoffer mot F. tularensis (Sandstrøm, G., og Wolf-Watz, H., "Rapid identification of Francisella tularensis in water", FOA Report C 40188-B 3, November 1983, Umeå, Sverige.

Kanin sera.

Kaniner ble immunisert ved F. tularensis antigen som beskrevet av Sandstrøm, G., og Wolf-Watz, H., "Rapid identification of Francisella tularensis in water", FOA Report C 40188-B 3, November 1983, Umeå, Sverige.

Af f initetsrensinci og alkalisk f osf atasekooling til kaninantistoffer .

En levende vaksinestamme av F. tularensis ( F. tularensis LVS) ble fremskaffet av U.S. Army Medical Research Institute of Infections Diseases, Fort Detrick, Frederick, Md., USA. En villstamme av F. tularensis var, palaerctica (stamme SBL R45) ble fremskaffet av R. Møllby, The National Swedish Bacteriological Laboratory, Stockholm, Sverige.

Bakterier fra to stammer av F. tularensis ble dyrket på modifisert Thayer-Martin agar inneholdende Gc-mediumbase (36 g/l; Difco Laboratories, Detroit, Mich., USA), hemoglobin (10 g/l; Difco) og IsoVitalex (10 mg/l; BBL Microbiology Systems, Cockey-ville, Md., USA) ved 37°C i 5% C02 i luft. Bakteriepopulasjonen ble målt ved å telle levende bakterier.

Vaeskeundersøkelse:

Springvann ble justert til pH 5,0 ved bruk av 0,01M salt-syre. "Tween" 20 ble satt til hver prøve i en konsentrasjon på 0,05\. F. tula rensis bakterier ble oppslemmet i mengder på 0, 10 , 10<2>, 103, 104 og 10<5>/ml, henholdsvis, eller alternativt ble cyklonmedium tilført med 0,05\ "Tween" 20 (Olsson, T.r Stymne, S-, og Thore, A., Detektion av bakterieaerosoler med luminescensanalys av luftprover", FOA Report C 40061-B 2 (1977), Ursvik, Sverige.

Sammenlignin<g>seksem<p>el

Antigen - antistoff

Mikroplate ELISA ble utført i det vesentlige ifølge Voller et al., "Enzyme immuno assays with special reference to ELISA techniques", J. Clin Pathol.. 31, 507-520 (1978). Kaninantiserum mot F. tularensis-antigen fortynnet 100:1 (ELISA-styrke 1:5000) i

0,05M natrium bikarbonat-buffer pH 9,6 ble lagt på mikroplater (Flow Laboratories Svenska AB, Stockholm, Sverige). Bakterie-suspensjoner ble satt til mikroplatene som ble inkubert i en time ved 37°C. I det neste trinn ble en løsning av affinitetsrenset, alkalisk fosfatase merkede kaninantistoffer mot F. tularensis antigen påført 1 time ved 37°C. Reaksjonen utviklet seg ved tilsetning av substratet til enzymet, og absorbansen ved 405 nm ble målt. De således erholdte resultater er vist i figur 2 og tabell 2.

Eksempel.

Antigen - antistoff.

Fremgangsmåten ble utført i plastrør ("Tygon"; Noax AB, Stockholm, Sverige) forbundet med et peristaltisk pumpesystem (Technicon Corp., Ardesly, USA). Volumet av røret var 40 gl/cm rør. For hver måling ble 10 cm rør tilkoplet. Antiserum i stasjonær tilstand ble overtrukket natten over ved romtemperatur. Undersøkelsesprøver ble ført gjennom røret ved en strømnings-hastighet på 1,9 ml/min. (figur 3).

I noen eksperimenter var undersøkelsesprøvene stasjonære i røret, mens i andre undersøkelser ble en strøm frembrakt gjennom røret.

Etter vask ble stasjonær eksponering overfor alkaliske fosfatasemarkerte antistoffer utført ved 37°C i en time. Rørene ble koplet fra pumpesystemet og skåret fra hver side til en lengde på 5 cm, og substrat for alkalisk fosfatase ble tilsatt. Etter inkubering ved 37°C i 30 min. ble innholdet av hvert rør (200 pl) overført til brønnen i en mikroplate og absorbansen ved 405 nm ble målt. Prøvene ble undersøkt in triplo og middelverdi-ene ble beregnet.

Når undersøkelsesprøvene var stasjonære i røret, fikk man lavere ELISA-verdier i forhold til verdiene som oppnåddes når prøvene strømmet gjennom røret (figur 3).

Ved å bruke fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse fikk man en øket sensitivitet. Med en ubegrenset undersøkelses-prøve er det mulig å påvise ned til 10 2 F. tularenis pr. milliliter (figur 4). Levende tellinger av F. tularensis før og etter gjennomføringen gjennom røret viste ingen målbar reduksjon av bakterier.

Mulighetene for resirkulering av forskjellige volumer av undersøkelsesprøver som inneholder F. tularensis ble prøvet. Det minste volum som av praktiske grunner kunne resirkuleres, var en 5 ml prøve. Sensitiviteten ble øket minst 10 ganger (figur 5), generelt mellom 10 og 100 ganger i forhold til tiden i hvilken prøven ble resirkulert (figur 4). Ved å sirkulere 10 4 F. tularensis bakterier oppslemmet i 5, 15 og 50 ml væskeprøver i 18 timer fikk man økede verdier avhengig av mengden flytende prøve som undersøkes (tabell 1).

Når forskjellige volumer av prøven inneholdende F. tularensis fikk strømme gjennom røret som var overtrukket med spesifikke antistoffer mot F. tularensis, fikk man en anrikelse av bakterier i røret. Når større volumer ble ført gjennom røret, fikk man et platånivå (figur 3), antagelig på grunn av at alle antigen-avsetningspunkter allerede var opptatt og ingen ytterligere bakterier kunne fanges.

Lignende resultater erholdtes når F. tularensis ble sammen-trykket i cyklonen medier tilført med 0,05% "Tween" 20 (Olsson, T., Stymne, S., og Thore, A., "Detektion av bakterieaerosoler med luminescensanalys 1.Luminescensanalys av luftprover", FOA Report C 40061-B 2 (1977), Ursvik, Sverige.

Ligande- liqande- samvirke.

E. coli (HB101/pRHU845) agglutinerer A blod gjennom mannose-resistent hemagglutinering. Samvirke forekommer mellom en spesiell proteinstruktur hos bakterien overfor en Gal-NAc p (1 -» 3) Gal 2(1 4) Gal p ( 1 -» 4) GLC-ceramid reseptor på røde blodlegemer.

Et plastrør ("Tygon") ble belagt med fullstendig blod (A-blod). E. coli bakterier i konsentrasjoner fra 0 til 5.106 bakterier pr. milliliter ble kjørt gjennom rørsystemet. Deretter ble kaninantistoffer mot E. coli tilsatt. Så ble antikanin IgG merket med alkalisk fosfatase tilsatt i en time ved 37°C, og til slutt ble absorbansen ved 405 nm kontrollert ved tilsetning av substrat til alkalisk fosfatase. Ved å bruke denne metoden var det mulig å påvise E. coli ved forskjellige densiteter.

Nivået for påviselig F. tularensis LVS ble øket ved å bruke 3 4 5 væsken strømmende. Suspensjoner inneholdende 10 , 10 og 10 F. tularensis celler pr. milliliter ble ført gjennom et "Tygon" plastrør overtrukket med antistoffer mot F. tularensis. Strøm-ningshastigheten av prøvesuspensjonen var ca. 100 ml pr. 3 timer.

Ifølge denne fremgangsmåten ble mengden F. tularensis anriket, og det påviselige nivå ble lavere enn det påviselige nivå oppnådd med mikroplate ELISA.

Innflytelsen av "Tygon" plastrør ble undersøkt. ELISA målingen ble utført uten noen strøm i "Tygon" plastrøret. Fordelene ved strømmende væske ble vist også i denne prøven. Et lavere påviselig nivå oppnåddes sammenlignet med mikroplate

ELISA.

Forklaringer til figurer .

Fig. 1 -. Anrikning av rørveggene ved bruk av et strømsystem. Strømningshastigheten var 1,9 ml/min., og volumet 40 ijl/cm i røret. Prøven ble enten kjørt rett gjennom røret eller resirkulert. Målingen ble utført på samme måte som mikroplate ELISA målingen med hensyn til antigen og antistoff. Rørets lengde var 10 cm under prosessen, unntatt det siste trinn, da enzymsub-stratet ble tilsatt. Før tilsetningen ble røret skåret fra begge ender til en lengde på 5 cm. Fig. 2: ELISA ble utført i mikroplater. Mikroplatene ble preovertrukket med immunserum mot F. tularensis antigen ved romtemperatur natten over. Prøvene ble tilsatt etter vasking og fikk reagere 1 time ved 37°C. Affinitetsrensede anti- F. tularensis antistoffer merket med alkalisk fosfatase ble deretter tilsatt, og mikroplaten ble inkubert i 1 time ved 37°C. Enzym-substratet ble til slutt tilsatt, og reaksjonen kontrollert etter 30 min. ved bruk av et automatisk spektrofotometer. Angitte verdier er middelverdier ± standard avvik for 16 prøver. Fig. 3: Anrikning av F. tularensis på rørveggen ved bruk av forskjellige volumer vann inneholdende 10"<*> bakterier pr. milliliter. Prøvetiden var 3 timer. Angitte verdier er middelverdier standard avvik for 3 prøver. Fig. 4: Påvisningsnivået for forskjellige konsentrasjoner av F. tularensis var anhengig av volumet av prøven som gikk gjennom det preovertrukne "Tygon" rør. Etter 3 timer kunne 10 4 F. tularensis påvises.

For å oppnå et signifikant påvisningsnivå for så få som 10<2 >bakterier pr. milliliter, fikk ca. 4,5 liter prøve (tilsammen 4,5 x 10 5 bakterier) passere "Tygon" røret.

Prøvene viser at antigenet kan anrikes på den innvendige veggen av "Tygon" røret hvis røret er overtrukket med spesifikke antistoffer. Det er også tydelig at prøvetiden, d.v.s. anrik-ningstiden, avhenger av bakteriemengden i prøven som skal undersøkes.

Middelverdier ± standard avvik for 9-12 prøver.

Bakgrunnsverdiene (springvann uten F. tularensis) trekkes fra de angitte verdier.

Fig. 5: Påvisningsnivåer for F. tularensis når prøvene resirkuleres .

Målingene ble utført etter 3, 6, 18 og 24 timer. Angitte verdier er middelverdier ± standard avvik for 10-15 prøver.

Fig. 6: Absorbans ved 405 nm/100 min. ved forsøk med E. coli konsentrasjoner mellom 0 og 5.10 pr. milliliter. Prøven ble resirkulert i 3 timer. Volum = 5 milliliter. Angitte verdier er middelverdier for 3 prøver.

Identifikasjon av Shiqella dysenteriaeog Salmonella ty_ phimurium i vann ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.

(Rør-ELISA).

Materialer og fremgangsmåter

Bakterier og bakteriologiske metoder

Shiqella dysenteriae (ATCC Nr.2 73 45), Salmonella typhimurium (LT2), Escherichia coli 031 og Pseudomonas aeruginosa, (klinisk isolat) ble dyrket i næringsmedium (Oxoid, Limited Basingstoke, Hampshire, Great Britain) over natten og levedyktige tellinger (antallet levende bakterier) ble bestemt på næringsagar (Oxoid) plater.

Hyperimmunisering av kaniner

Før den første immunisering ble blod tappet og serum fremstilt som kontrollserum. Konsentrasjonen av antigen (drepte bakterier) var 10 9/ml gjennom hele immuniserings-skjemaet. Dag 1 ble 0,5 ml injisert intrakutant med Freund's fullstendige adjuvans (Difco Laboratories, Detroit, Mn., USA). Dag 3, 5 og 7 ble 2 x 0,5 ml gitt subkutant med Freund's fullstendige adjuvans. Dag 14 og 15 ble 0,5 ml og dag 18

2 x 0,5 ml injisert intramuskulært.

Til slutt ble o,5 ml gitt intramuskulært hver uke i

6 uker. Deretter ble blod tappet, serum (immunserum) ble fremstilt og lagret ved -70°C.

Rensing og konjugasjon av kaninserum

Immunserum ble felt (20 ml) med like deler mettet ammoniumsulfat. Fellingen ble oppløst i 1 ml PBS (fosfat-buffret vanlig salt) og ble dialysert natten over mot PBS. Den dialyserte antistoffløsning ble blandet (10:1) med bakterier i PBS. Blandingen ble inkubert ved 37°C i 1 time og ble deretter spinntørket ved 2000 opm i 10 minutter. Klumpene ble oppløst i 1 M glycin-HCl oH 2,8. Etter en inkubering på 3 timer ved romtemperatur ble løsningen spinntørket ved 2000 opm i 10 minutter. Supernatanten (som inneholder de spesifikke antistoffer) ble dialysert mot PBS i 12 timer.

Spesifikke antistoffer, renset fra immunserum (2 mg) i PBS ble blandet med 5 mg alkaliske fosfataser (Sigma Chemical Co., St.Louis, Mo., USA) ved romtemperatur. Blandingen ble dialysert i 18 timer mot PBS ved 4°C. Deretter ble glutar-aldehyd (25 volumprosent) tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 0,2 volumprosent etterfulgt av inkubering 1-2 timer ved romtemperatur. Dialyse mot PBS natten over ved 4°C ble foretatt, hvoretter dialysevæsken ble skiftet til 0,05 M Tris-HC1, pH 8,0 med 1 mM MgCl2 og dialysen fortsatte i 24 timer til ved 4°C. Til slutt ble 1 volumprosent kvegserum-albumin (Sigma) tilsatt. Konjugerte antistoffer ble lagret i et mørkt glass ved 4°C.

Rør- ELISA

"Tygon" rør (innvendig diameter 2,2 mm) ble fylt med _2

immunserum fortynnet 10 i 0,05 M natnumkarbonatbuf f er (3,47 g/l NaHC03, 1,18 g/l Na2C03), pH 9,6 og fikk stå natten over ved romtemperatur. Røret ble skåret i stykker med en lengde på 10 cm som ble forbundet med en pumpe (Ismatec SA, Mp 25 GJ4, Laboratoriumstechnik, Apparateban+ Elektronik, Zurich, Sveits) hvori de ble vasket i 154 mM NaCl løsning inneholdende 0,05 volumprosent Tween 20 og 0,5% kvegserum-albumin (Sigma). Prøver ble pumpet gjennom de forskjellige

rør ved romtemperatur i 3 timer etterfulgt av en ytterligere vask. Rørene ble løsnet fra pumpene og fylt med en løsning av konjugerte antistoffer. Inkuberingen ble utført i 1 time ved 37°C, hvoretter rørene ble vasket og skåret til en lengde på 5 cm. Rørene som ble fremstilt ble fylt med p-nitrofenyl-fosfatløsning (Sigma). Etter inkubering ved 37°C i 30 min. ble innholdet av rørene overført til mikrotiterplater og påvisningen ble foretatt ved hjelp av automatisk spektrofotometer (Titertech Multiscan, Flow Laboratories).

Mikrotiterplate - ELISA

ELISA ble utført hovedsaklig som forut beskrevet av Voller, A., Bertlett, A., og Bidwell, D.E.: Enzyme immunoassays, med spesiell henvisning til ELISA-teknikkene. J. Clin. Pathol. 31:507:520 (1978).

Behandling av vannprøver

Springvann ble tilsatt salter og vaskemiddel til de var lik de buffere som inngår i vanlig ELISA (Engvall, E., og Perlman, P.: Enzyme-linked immunosorbent assay. III. Kvantita-tiv måling av spesifikke antistoffer med enzym-merket artti-immunoglobulin i antigenbelagte rør. J. Immunol. 109:129-

135 (1972). Voller, A., Bartlett, A., og Bidwell, D.E.: Enzyme immunoassays, med spesiell henvisning til ELISA teknikkene. J. Clin. Pathol. 31:507-520 (1978).

Resultater og diskusjon

Identifikasjon av Shiqella dysenteria

Det var mulig å identifisere 10^/ml og mer S_;_ dysenteria (Fig. 7) med mikrotiterplate ELISA når bakteriene i vann-prøven ble inkubert ved romtemperatur i 3 timer. Dette nivå er litt høyere enn infeksjonsdosen som er 10 4 til 10 9/ml. For å forbedre sensitiviteten og eventuelt oppnå det lavere nivå

(10<4>/ml) ble rør-ELISA brukt.

Det var mulig å identifisere lavere nivåer av S_^ dysenteria ved rør-ELISA (fig. 8) sammenlignet med mikrotiterplate ELISA (fig. 7) ettersom rør-ELISA er en anriknings- og selek-sjonsmetode (Sandstrom, G. og Wolf-Watz, H.: Duct-ELISA. A manner to identify low contents Francisella tularensis. FOA rapport C 40202-B3 (1984). Man ser også fra figur 8 at denne teknikken har en større variasjon mellom de inngående verdier enn mikrotiterplate ELISA (figur 7). Dette skyldes sannsynlig-vis at antistoffene i forsøket ikke har den høyeste spesifitet. Bakterieproduktene må renses og brukes som et immunogen for å oppnå en så høy spesifitet som mulig. Rensing av bakterie-produkter fra Francisella tularensis (Sandstrom, G., Tarnvik, A., Wolf-Warz, H., og Lofgren, S.: Antigen from Francisella tularensis: Nonidentity between determinants participating in cell-mediated and humoral reactions. Infect. Immun. 7:101-106

(1984), brukt som et immunogen er med hell blitt brukt i rør-ELISA (Sandstrom, G., og Wolf-Watz, H.: Duct-ELISA. A manner to identify low contents Francisella tularensis. FOA rapport C 40202-B3 (1984). Det er ganske sannsynlig at det er mulig å identifisere bakterier på et nivå med den laveste infeksjons-dose med disse forbedringer.

Identifikasjon av Shiqella dysenteria i kontaminerte vannprøver

Når prøver tas av vann med forskjellige kvaliteter, kan problemer med kontaminanter også oppstå. Det er blitt vist at rør-ELISA kan brukes til å overvinne disse problemer (Sandstrom, G., og Wolf-Watz, H.: Duct-ELISA. A manner to identify low contents Francisella tularensis. FOA rapport C 40202-B3.

Når vannprøver ble kontaminert med P_;_ aeruginosa, E. coli og

S. typhimurium og identifikasjon av S^ dysenteriae ble foretatt med mikrotiterplate ELISA og rør-ELISA, viste det seg å være fordelaktig å bruke rør-ELISA (fig. 9). Også i dette hen-seende kunne en selektiv anrikning av bakterier i rør-ELISA systemet registreres.

Identifikasjon av Salmonella typhimurium

For å vise muligheten til å identifisere andre bakterier

i vann ble S_. typhimurium prøvet. Det var mulig å anrike og identifisere mer enn 10 ganger lavere nivåer ved rør-ELISA sammenlignet med mikrotiterplate ELISA (figur 10).

Claims (11)

1. Fremgangsmåte for å konsentrere og påvise biologiske substanser med affinitetsegenskaper, karakterisert ved at en flytende prove inneholdende substansen som skal påvises, hvilken substans viser affinitet overfor en annen substans, i en strøm passerer en fast overflate til hvilken overflate den andre substans, til hvilken den første substans som skal påvises viser affinitet, er bundet, slik at den oppnås en anrikning av substansen som skal påvises, og i forhold til væskevolumet i kontakt med den aktive overflate passerer et mange ganger større væskevolum overflaten, hvoretter det dannede komplekset, på nevnte faste overflate, av den første substansen som skal påvises og substansen hvortil den første substansen har affinitet, markeres og avleses.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at substansen som skal påvises og substansen til hvilken den første substans viser affinitet, består av antigen-antistoff, DNA-DNA, DNA-RNA, RNA-RNA, lektinreseptor og andre ligand-reseptorkombinasjoner.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at strømmen frembringes av en pumpe.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at strømmen uten å resirkuleres passerer den faste, aktive overflate.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at strømmen resirkuleres.

6. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1 til 5, karakterisert ved at strømningshastigheten fastlegges under hensyntagen til størrelsen av molekylet som skal påvises.

7. Anordning for påvisning av biologiske substanser med affinitetsegenskaper, karakterisert ved en strøm over en fast overflate av en væskeprøve inneholdende substansen som skal påvises, hvilken viser affinitet overfor en annen substans, hvilken sistnevnte er bundet til den faste overflate, hvorved substansen som skal påvises anrikes.

8. Anordning ifølge krav 7, karakterisert ved at den faste overflate er hydrofob.

9. Anordning ifølge krav 7, karakterisert ved at strømmen er frembragt av en pumpe.

10. Anordning ifølge krav 7 og 8, karakterisert ved at den faste overflate består av et polymert materiale, f.eks. glass, plastmateriale, metall eller silikon.

11. Anordning ifølge et av kravene 7, 8 og 9, karakterisert ved at den faste overflate består av et fleksibelt plastrør.