NO165944B - Fremgangsmaate ved fremstilling av ereksjons- og fruktbarhetsfremmende middel. - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte ved fremstilling av et ereksjons- og fruktbarhetsfremmende middel.

Lipidekstraktet fra kjertlene er funnet å ha egenskaper

som leder en til å forvente av gode grunner at de vil fremme ereksjon, sæduttømming, mobilitet av spermatozoer og deres evne til å gjennomtrenge protein og de kvinnelige reproduksjons-organer. Midlet kan derfor utgjøre en aktiv komponent i farmasøytiske preparater med dette indikasjonsområde.

Kjertlene til menn og hannpattedyr kalles Cowpers kjertler (også bulbo-uretrale kjertler) og består av parrede symmetriske sammensatte alveola kjertler med denne overensstemmelse, grågule eller lysebrune av farge og med størrelse av en vanlig haveert eller nyrebønne. Deres ekskresjonsrør er opptil 4 cm lange og munner i uretra umiddelbart nært det sted hvor uretra munner i corpus cavernosum penis. De homologe kjertler hos kvinner og hunndyr kalles Bartholinis kjertler og består av to grågule, runde eller ovale kjertler med størrelse som en vanlig haveert eller nyrebønne og ligger på ryggsiden av livmoråpningen. Ekskresjonsrøret er fra 1,5 til 2 cm langt og munner i introitus vagina. De tilsvarer direkte Cowpers kjertlene til hannartene. Kjertlenes funksjon er ikke helt ut forstått. Med hensyn til Cowpers kjertlene hos hanndyr, er det kjent at det totale ekstrakt av sekresjonen fra kjertlene koagulerer sæden. På denne måten dannes en slimklump som forhindrer tilbakeløp av sædvæsken etter sæduttømming. R.G. Hart, The mechanism of Cowpers secretion in coagulating eat semen. J.Reprod. Fert.

(1968), 17, 223-226. J.J. Gueze and J.W. Slot Synthesis and secretion of glycoproteins in rat bulgo-urethral (Cowper's) glands, Biology of reproduction 15, 118-125 (1976).

Den biologiske virkning av lipidfraksjonene fra kjertlene er ikke tidligere undersøkt. Følgelig er foreliggende oppdagelse av potensvirkningen til lipidfraksjoner på forskjellige deler av det urogenitale område av stor betydning for å bestemme kjertlenes funksjon. Lipidfraksjoner fra disse kjertler tatt fra menn eller kvinner, okser, galter, værer, sauer og kuer er blitt undersøkt, og ved underkastelse av farmakologiske under-søkelser funnet å ha omtrent de samme egenskaper som de som er beskrevet nedenunder.

Forskerne har således nå overraskende funnet i lipidfrak-sjonen fra kjertler fra de ovennevnte arter, en faktor som synes å påvirke både ereksjonen og sæduttømmingen samt sperma-tozoens bevegelighet og deres evne til å gjennomtrenge protein hos mennesker og dyr. Faktoren kunne synes å være en sterk peptidlipidpåvirker av prostaglandinlignende/leucotrienlignende type.

Et middel bestående av slike lipidfraksjoner tatt fra kjertler til mennesker og dyr trekker sammen gerbiltykktarm. Prostaglandiner og lignende substanser trekker sammen gerbiltykktarmen, og følgelig brukes sammentrekningen av gerbiltykktarmen som et kriterium på den biologiske aktiviteten til slike substanser. Undersøkelsen i forbindelse med dette utføres som følger:

Den øvre del av en tykktarm fjernet fra en gerbil oppslemmes

i et vanlig innvollsbad, det nedre festet er fastlåst, mens det øvre festet er forbundet med en sensor som registrerer sammentrekning og avslapning av innvollene under påvirkning av forskjellige substanser.

Da midlene trekker sammen gerbiltykktarm, er det gode

grunner til å anta at de inneholder prostaglandinlignende substanser. Imidlertid er ingen kjente prostaglandiner vist å være tilstede i slike lipidfraksjoner tatt fra kjertler som trekker sammen gerbiltykktarm, og hvilket er midler fremstilt ifølge oppfinnelsen (sammenlign eksemplet og figur 2, 3, 4 og 5, fra hvilket man kan se at det ikke har vært mulig å vise prostaglandinene PGi2 . PGE2 , PGF20(, PGA2 i slike lipidf raks joner fra kjertlene som slike som trekker sammen gerbiltykktarm ved anvendelse av kjente teknikker). Følgelig kan sammentrekningene av gerbiltykktarmen brukes som et kriterium på at faktoren med fruktbarhetsfremmende egenskaper foreligger i lipidekstraktet fra kjertlene.

Faktoren reagerer positivt med ninhydrin, hvilket tyder på

at den inneholder aminosyrer. Undersøkelser ved bruk av dispersiv røntgenanalyse (KEVEX) viser nærvær av svovel (S) i faktoren. Disse to forhold - den positive reaksjon overfor ninhydrin og nærvær av svovel - tyder på at det foreligger likheter mellom faktoren og leucotrinene. Leucotrinené trekker

imidlertid ikke sammen gerbiltykktarm. På den annen side trekker de ikke sterkt sammen uterusmuskulaturen slik midlet gjer.

Gasskromatografi-massespektroskopianalyse viser en

kompleks blanding, hvor imidlertid visse fragmenter tyder på nærvær av neurotransmittlignende substanser med en molekylvekt mellom 200-1000 m/e.

MNR (kjernemagnetisk resonans) av en fraksjon med høybio-logisk aktivitet har vist alle egenskapene til prostaglandinlignende substanser, så som: lang molekylkjede, nærvær av fettsyrer, en terminal CH3-gruppe.

Midlet har vært fremstilt ved vanlige metoder for ekstrak-sjon og separasjon av prostaglandiner. Således kan kjertlene først befris for proteiner, dvs etanolekstraksjon og resten så ekstraheres ved sur pH med dietyleter som oppløser lipider.

Ifølge foreliggende oppfinnelse

a) blir vev valgt fra gruppen omfattende pattedyrs Cowper's kjertler og Bartholini's kjertler dissekert; b) kjertelvevet finknuses; c) et væskeekstrakt fra kjertelvevet fjernes ved lipidløsnings-middelekstraksjon utført ved en sur pH, hvori lipidløsnings-middelet er valgt fra gruppen bestående av etylacetat eller metanol eller kombinasjonen derav; d) vann fra ekstraktet oppnådd fra trinn b) fjernes; e) løsningsmiddelet fra ekstraksjonstrinnet c) fordampes i et vannbad ved opptil ca. 40°C i et nitrogenmiljø, og f) ekstraktet fra trinn d) eller e) fraksjoneres ved revers-fase-HPLC, hvilket gir den biologisk aktive fraksjon som

fremkaller ereksjon hos dyr og mennesker.

Som lipidløsningsmiddel kan anvendes etylacetat, isopropanol, metanol, aceton, kloroform og blandinger derav, så som kloroform/metanol 2:1, vol/vol; etylacetat i blanding med isopropanol, metanol, aceton i varierende volumprosent med vann eller med ovenfor nevnte lipidløsningsmidler, fortrinnsvis metanol eller etylacetat/metanol 3:1, vol/vol, og pH justeres med en buffer til pH 3,5-5, fortrinnsvis til 4,5 med 0,1 M KH-ftalat. Vannet fjernes deretter på vanlig måte, f.eks. ved frysetørking. Ekstraktet kan også stå natten over i fryseren ved en temperatur under 0°C, og de dannede iskrystaller filtreres fra ved lave temperaturer under 0°C. Arbeidet utføres hensiktsmessig i et nitrogenmiljø for å beskytte mot oksyderende virkninger fra atmosfærisk oksygen. Prøven fordampes eventuelt deretter i et vannbad (40°C), fortrinnsvis i en nitrogengassatmosfære. Denne prøven kan brukes som ereksjonsfremmende substans. Prøven oppløses eventuelt i noen få milliliter av det ovenfor nevnte lipidløsningsmiddel, fortrinnsvis etylacetat, og lagres i et nitrogenmiljø ved -20°C.

Prøven kan også behandles ifølge kjente metoder som er vanlig ved separasjon av prostaglandiner, og de fraksjoner som trekker sammen gerbiltykktarm, isoleres. Separasjonen kan utføres ved kromatografi på kiselgel for eksempel, fortrinnsvis såkalt tørrkolonnekromatografi under eluering med blandinger av etylacetat, isooktan, etahol, vann, eddiksyre, kloroform, isopropanol og maursyre, (fortrinnsvis med etylacetat-isooktan-etanol-eddiksyre i forhold på 35:10:3:0,1:0,1) eller med kloroform-isopropanol-etanol-eddiksyre (45:5:0,5:0,3) vol/vol. De respektive fraksjoner kan så elueres ut med blandinger av kloroform og metanol, fortrinnsvis i et volmumetrisk forhold på 1:1.

Fraksjonene kan også separeres på kiselgelplater (TLC) eller ved å blande kromatografi med det samme eller modifisert løsningsmiddelsystem. De fraksjoner som trekker sammen gerbiltykktarm isoleres og lagres ved -20°C for ytterligere analyse. Disse fraksjoner kan brukes som ereksjons- og fruktbarhetsfremmende middel, fortrinnsvis etter inndamping til tørrhet. De kan også videre renses ved kromatografi, fortrinnsvis etter først å være inhdampet til tørrhet. Fraksjonene kan så renses ved kromatografi, fortrinnsvis på kiselgel, f.eks. ved høytrykksvæskekromatografi under eluering med blandinger av fosforsyre, acetonitril, metanol, fortrinnsvis fosforsyre-acetonitril-metanol i forhold 40:12:48.

Oppfinnelsen skal nå beskrives i nærmere detalj under henvisning til de vedlagte tegninger, hvor

Fig. 1 illustrerer en foretrukket fremgangsmåte for fremstilling av midlet ifølge eksemel I; Fig. 2 illustrerer U.V.-absorbsjonen som en funksjon av elueringsvolumet under høytrykksvæskekromatografi av prostaglandinstandarder, Fig. 3-5 illustrerer U.V.-absorbsjonen som funksjon av elueringsvolumet under høytrykksvæskekromatografi av fraksjonene , eig og ag henholdsvis, erholdt fra kromatografi på kiselgel Noelin DCC i eksempel I.

Eksempler på en foretrukket fremstillingsmetode ifølge oppfinnelsen er gitt i det følgende (sammenlign også oversikten i fig. 1).

Isolering

Faktoren isoleres fra kjertlene på følgende måte: Cowpers kjertler fjernes fra fruktbare hanner som nettopp er døde. Preparatet fryses øyeblikkelig ned til en temperatur på -20°C. Bartholinis kjertler fjernes fra fruktbare hunner som nylig er døde og de fremstilte preparater fryses øyeblikkelig ned til -20°C.

Ekstraks ion.

Lipidekstrakt ble tatt fra kjertlene i eksempel 1 ifølge den etterfølgende fremgangsmåte: 23,5 g Cowpeio kjertler og 16,1 g Bartholinis kjertler ble findelt og homogenisert hver for seg med en Ultraturrax i henholdsvis 60 ml og 20 ml etylacetat/metanol 3:1 vol/vol. pH ble justert med 0,1 M kaliumhydrogenftalat til 4,5.

Lipidekstraktet fikk stå natten over i en fryser, og vannkrystallene ble deretter filtrert fra ved en temperatur under 0°C. Prøven ble så konsentrert ved inndamping i et vannbad (40°C) i et nitrogenmiljø. Deretter fikk man 0,43 g fra Cowpers kjertler og 0,15 g fra Bartholinis kjertler. Prøven ble så lagret ved en temperatur på -20°C i en nitrogengass-atmosfære.

Separasjon og rensing.

Den biologiske faktor ble separert ved hjelp av en modifisert metode for tørrkolonnekromatografi som med hell skiller de bioaktive lipider fra de gjenværende substanser og ekstrakter. Det ble brukt en kolonne omfattende 10 (ti) teflonringer med en høyde på 2 cm og en innvendig diameter på 2,5 cm, tett pakket i et rør. Hver ring tilsvarte en fraksjon som strakte seg mellom to påfølgende desimal (Rf)-verdier. Kolonnen ble fylt med aktivert kiselgel Woelm DCC under vibrering. Hver av de forannevnte 0,43 g og 0,15 g prøver ble innført i en slik kolonne som sådanne og eluert i løsningsmiddelblandingen kloroform/isopropanol/etanol/maursyre i forhold på 45:5:0,5:0,3 vol/vol.

Løsningsmiddeltilførselen ble holdt konstant ved hjelp av utløpet av en skylletrakt plassert 1-2 cm over prøven. Løsnings-middelfrontens posisjon nær bunnen av kolonnen ble vist med et første akustisk varselsignal fra en elektrisk sensor. Slutt-punktet ble vist ved et andre signal. Et skrulokk øverst på røret ble så fjernet, slik at den innvendige oppdelte teflon-kolonne kunne skyves aksialt oppover ved hjelp av et stempel. Teflonringene ble lett skilt fra hverandre, en om gangen, under raskt skjærende bevegelser. Til slutt ble hver ring montert i ti spesielt anordnede teflonkolonner for samtidig eluering. De resulterende fraksjoner ble eluert med noen milliliter kloroform/metanol 1:1 vol/vol, og den biologiske aktiviteten ble undersøkt på gerbiltykktarm. Fraksjonene 4, 5 og 6 - ringene 4,5 og 6 talt fra toppen er heretter kalt alfa-4, alfa-5 og alfa-6 - ble funnet å sammentrekke gerbiltykktarm og hadde egenskapene som er vist i eksperimentene 1-7. Dette gjaldt begge de forannevnte fraksjoner fra Cowpers og Bartholinis kjertler. Fraksjonene ble dampet til tørrhet i et nitrogengassmiljø i et vannbad (40°C) og renset i henhold til det følgende, selvom dette rensetrinnet er fakultativt.

Høytrykksvæskekromatografi

( HPLC)- analvse

Fraksjonene alfa-4, alfa-5 og alfa-6 isolert fra respektive kjertler ble analysert ved høytrykksvæskekromatografi, kalt HPLC. Separasjon ble utført på en høytrykks 5 pm revers fasekolonne.

Et system omfattende en Consta Metric-111-HPLC-pumpe (Lab.Data Control) og en Consta Metric Spectromonitor III (LDC) variabel bølgelengdedetektor ble brukt. Detektoren ble koplet til en Rec-2-rekorder (Pharmacia) og en integrator (HP 3888 A). Kolonnesystemet omfattet en 49x4,6 mm LD forkolonne pakket med 40 pm partikkelformet revers fasemateriale (Pelliguar LC-18) og en 250x4,6 LD, Supelcosil LC-18 analytisk kolonne pakket med 5 pm kuleformede partikler.

Prostaglandiner eluert fra HPLC-systemet ble påvist ved absorbsjon i ultrafiolett. Ikke-derivatiserte prostaglandiner ble påvist ved 199,5 nm. Fraksjonene alfa-4, alfa-5 og alfa-6

inndampet til tørrhet og tatt fra Cowpers kjertler og Bartholinis kjertler henholdsvis fra tørrkolonnekromatografi ble alle oppløst i 2 ml absolutt etanol. 20 pl ble tatt ut for hver av disse 2 ml prøver. Fra Cowpers og Bartholinis kjertler ble 5 slike 20 ul

prøver behandlet i kolonnen for hver fraksjon alfa-4, alfa-5 og alfa-6. Et tre-komponent elueringsmiddel omfattende fosforsyre (0,1 M), acetonitril, metanol i forhold 40:12:48 ble brukt til å separere fraksjonene på kolonnen. Prøver ble så tatt systematisk fra kolonnen og analysert med hensyn til sammentrekningen av gerbiltykktarm. Fraksjonene med retensjonstider (RT) 3-6 og 12-15 fra fraksjon alfa-4, fraksjonene med retensjonstid 3-6 og 12-15 fra alfa-5 og de med retensjonstid 8-10 fra alfa-6 ble observert for sammentrekning av gerbiltykktarm. Dette gjelder alfa-4, alfa-5 og alfa-6 fra både Cowpers og Bartholinis kjertler.

Sammenlignet med en rekke prostaglandinstandarder, så som PGE2, PGI2 og PGE1( og også PGF2a og PGA2, kunne ingen av disse prostaglandinene observeres i blandingen (sammenlign figur 2, som illustrerer UV-absorbsjonen ved 199,5 nm som en funksjon av elueringsvolumet og retensjonstid på HPLC av disse standarder, med figur 3, 4 og 5 som illustrerer den samme kurve for fraksjonene , a,., a6 fra DCC. ) . Den biologiske aktiviteten ble funnet å være kompleks, imidlertid, når fraksjoneringen ble utført med HPLC. Den primære biologiske aktiviteten ble funnet i HPLC-fraksjonene alfa-4:12- 15, alfa-5:12-15 og alfa-6:8-10.

Gas skromatog rafi sk- massespektrometrisk analyse.

Denne analysen viste en kompleks blanding hvor, imidlertid, vasse fragmenter ble observert som tydet på nærvær av neurotrans-mitter-lignende substanser med en molekylvekt mellom 200-1000 m/c (alfa-6:8-10).

NMR- analvse.

NMR (kjernemagnetisk resonans) ble brukt til å undersøke fraksjon alfa-5: 12-15, en fraksjon med høy biologisk aktivitet - den viste alle egenskapene til prostaglandinlignende substanser så som lang kjede, nærvær av fettsyrer, endestående CH^ gruppe.

Eksempel 2

50 g Cowpers kjertler tatt fra døde menn ble homogenisert med 50 ml metanol i Ultraturrax. pH ble justert til 4,5 med 0,1 M kalium-hydrogenfosfat. Ekstraktet fikk stå natten over i en fryser, hvoretter iskrystaller ble filtrert fra ved en temperatur under 0°C. Prøven ble så konsentrert ved inndamping til tørrhet i en nitrogenatmosfære i et vannbad.

En rekke eksperimenter er vist nedenunder som illustrerer den biologiske virkningen av faktoren ifølge oppfinnelsen.

Eksperiment 1

Virkningen av faktoren på muskel-collagen-trabekler i corpora cavernosa fra mennesker og pattedyr (okse), virkningen på den glatte muskel i penisarteriene.

Ereksjonen av penis hos menn og hanndyr skyldes en over-fylling av det erektile vev i penisen, d.v.s. corpora cavernosa (svellingslegemer). Disse inneholder et svamplignende vev som omfatter collagen vevbunter og glatte muskelfibre som danner et utstrakt nettverk, det såkalte trabecula corpora cavernosa. Hulrommene som dannes kan raskt utvides og trekkes sammen, d.v.s. fylles og tømmes for blod. Ved en ereksjon slappes den glatte muskulatur i corpora cavernosa. I tillegg utvides arteriene som tilfører corpora cavernosa blod, d.v.s. penisarteriene. Ereksjon av penisen avsluttes, d.v.s. penisen slappes, på lignende måte ved tilsvarende kontraksjon av muskelfibrene i corpora cavernosa og penisarteriene.

Fremstilling .-

Et antall hanndyr ble slaktet og den heie penis fra hver fjernet og transportert til laboratoriet i en bufferløsning (Krebs løsning) ved en temperatur på +4°C. Deler av corpora cavernosa fra værer ble fjernet på lignende måte. Lange strimler som målte ca. 1,5 cm i lengde og ca. 4 cm i bredde ble skåret fra midtdelen av muskulaturen i trabekula-nettverket. På lignende måte ble en strimmel med lengde på 1,5 cm og en bredde på ca. 3 mm skåret fra muskulaturen til penisarterien. Disseksjonen var over i løpet av 1-2 timer etter slaktingen av dyret. Strimlene ble holdt i Krebs-løsningen i maksimalt 1 kalenderdag, og viste ikke noe tap av aktivitet i løpet av dette tidsrom.

Bioanalyse: Virkningen av faktoren på de isolerte muskelfibre ble studert ved hjelp av en Grass Force Deplacement Transducer koplet til en Grass-polygraf. PGE2 og PGF2a ble brukt som standard i denne undersøkelsen. Ved å unngå for sterkt strekk i festemidlene for det biologiske målesystem var det mulig å bibeholde spontan motilitet i vevet. Faktoren som stammet fra Cowpers kjertlene ble dryppet på de isolerte muskelfibre, hvorved man fikk en tydelig avslapning av muskelfibrene ved trabekula-nettverket fra penisen. Den samme reaksjon - om enn svakere - fikk man ved fraksjonen fra Bartholinis kjertler. PGE2 i en konsentrasjon på 50 ng/ml ga en lignende virkning, selvom den var ekstremt svak, mens PFG~ i tilsvarende konsentrasjon istedet ga en øket muskeltonus.

Faktoren fra Cowpers kjerteler ble dryppet på penisarterier oppslemmet i det biologiske analysesystem på lignende måte som de forannevnte muskelfibre. En tydelig avslapning av musklaturen observertes, når faktoren ble dryppet på penisarterien. På den annen side førte PGF?a, konsentrasjon 50 ng/ml og PGE2 i samme konsentrasjon, til sterk sammentrekning av penisarterien. Dette synes klart å vise at selvom de to typer prostaglandin som brukes primært motvirker ereksjon, fremskynder lipidfraksjonene fra kjertlene sterkt ereksjon.

Eksperiment 2.

Faktoren fra kjertlene sammentrekker uretra muskulaturen hos menn og hanndyr. Uretra omfatter et slim-membranrør, hvis hoveddel er omgitt av et muskelskikt med innvendige, langsgående muskulatur og utvendig tversgående skikt. Den er best utviklet i den bakre del av uretra. I den fremre del av uretra finnes det skråttgående muskelbunter. Ved operasjon på prostata i hannens genitalsystem fjernes det fra uretra i prostatadelen en del av uretra, som prepareres og lagres i en Krebs-buffer. I den biologiske analyseundersøkelse fremstilles strimler av muskler montert i den foran beskrevne biologiske analyseenhet med ekstrem ømfintlighet. En blanding av 0., (. 95%) og C02 (5\) ved 37°C ble satt til organbadet. Faktoren fra Cowpers kjertler ble dryppet på muskelstrimlene, hvorpå en tydelig sammentrekning av uretra muskulaturen observertes. Den samme virkning, om enn mindre utpreget, fikk man med faktoren fra Bartholinis kjertler. Begge faktorene ble ekstrahert fra kjertlene til mennesker. Resul-tatene er senere blitt bekreftet med uretra fra okse; PGF_ 2a førte til lignende sammentrekning av uretra muskulaturen, mens PGE2 avslappet muskulaturen. Sammentrekningen av uretra muskulaturen ved utsettelse for faktoren må fremskynde sæduttømmingsprosessen. Det er riktig at metoden for å måle denne funksjonen er indirekte, men på det nåværende tidspunkt foreligger ingen metode hvor funksjonen kan måles direkte på mennesker.

Eksperiment 3.

Faktoren fremmer bevegeligheten til spermatozoen. Det er kjent at E-type prostaglandiner ikke har noen virkning på spermatozo-bevegelighet. Prostaglandin F_ har muligens en tilbakeholdende virkning på spermatozo-bevegelighet. I forsøk utført av foreliggende oppfinnere på faktoren, ble bevegeligheten av spermatozoer studert under et mikroskop. I denne forbindelse ble Bartholinis kjertler og Cowpers kjertler henholdsvis oppløst i saltvann og satt til en løsning inneholdende aktive spermatozoer .

Det kunne vises at faktoren som stammet fra Bartholinis kjertler, ga en spesielt aktiv forsterkning av spermatozoenes bevegelighet. Faktoren som stammet, fra Cowpers kjertler ga en lignende, men mindre utpreget virkning i samme konsentrasjon. Saltvannet hadde ingen virkning. Spermatozoene fra mennesker, sau og okser tømmes etter sæduttømming i vagina og innrettes for å nå egget ved sin egen bevegelighet. Således er det gode grunner til å anta at faktoren letter aktiv bevegelse på spermatozoene gjennom vagina og livmorhulrommet.

Eksperiment 4.

Faktoren fremmer penetrering av spermatozoer gjennom frisk eggehvite. Et høneegg ble knust og eggehviten plassert på et mikroskopglass. Et kapilarrør ble så ført inn i eggehviten og eggehviten trukket opp. En spermatozoprøve ble plassert på hver av to objektglass, en med påført faktor og den andre uten faktor. Faktoren som stammet fra både Bartholinis kjertler og Cowpers kjertler fra mennesker ble brukt i de respektive undersøkelser. Rørene som inneholdt eggehvite ble plassert i spermatozoprøvene og fiksert med plasticin (modelleringsleire). Kapillarene ble plassert loddrett og objektglassene med kapillarene satt på, ble så plassert i et varmeskap. Spermatozoenes evne til å bevege seg gjennom eggehviten ble så studert under et mikroskop i tidsrom på 60, 120 og 180 minutter. Man så tydelig at faktoren som stammet fra Bartholinis kjertler øket spermatozoenes evne til å gå gjennom eggehviten; faktoren som stammet fra Cowpers kjertler hadde en lignende, om enn svakere virkning.

Spermatozoenes evne til å trenge gjennom proteinet i eggcellene er av stor betydning i forbindelse med befruktning.

Eksperiment 5 .

Faktoren koagulerer sæd (væsken spermatozoene er oppslemmet i). Fibrinolytiske enzymer i sæd gir fullstendig eller delvis væskedannelse av koagulerte spermatozoer. Det er kjent at totalekstraktet fra utskillelsen fra Cowpers kjertler fra okse og fra værer koagulerer sæd. Funksjonelt uttrykkt danner væske-formet sæd en koaguleringsklump som utgjør et viktig trekk i sæduttømmingsprosessen. Den forhindrer også tilbakeløp av sæd under uttømmings fasen, og fremmer således dyrenes fruktbarhet og er spesielt fremmende hos værer.

Faktorens evne til å koagulere spermatozoer illustreres ved det følgende: 0,5 ml flytende spermatozoer (i lettflytende tilstand) ble ført inn i et prøverør ved 37°C. 0,5 ml av faktoren (stammende fra Cowpers kjertler) ble oppløst i saltvann og satt til de flytende spermatozoer. Spermatozoene ble funnet å koagulere raskt under dannelse av et fast koagulat. Man så at dette koagulatet vendte tilbake til væskeform etter ca. 10 minutter. Tilsetning av faktoren som stammet fra Bartholinis kjertler ga en lignende, om enn svakere koagulering.

Eksperiment 6.

Faktoren trekker sammen glatt muskulatur i livmorsrørfor-bindelsen hos kvinner (UTJ). Når faktoren plasseres på glatt muskulatur fra UTJ, oppnås en sammensatt reaksjon. Dette skyldes at den kvinnelige livmorsrørforbindelse inneholder tre forskjellige muskelskikt som gir spesifikk reaksjon på de lipide monifiseringsmidler innenfor prostaglandinfamilien. Muskelvev ble isolert fra UTJ tatt fra sunne, fruktbare kvinner som hadde gjennomgått sterilisering eller en hystere atomi. Ringformede og langstrakte muskelfibre ble innført i en bioanalyseenhet med en Krebs bikarbonatbuffer. Som normalt tilsettes en blanding av oksygen og karbondioksyd, og forsøkene ble utført ved en temperatur på 37°C. Faktoren ble funnet å gi sammentrekning av den langstrakte muskulatur og avslapning i den ringformige muskulatur .

Eksperiment 7.

Faktoren trekker sammen vaginalmuskulatur. Glatt muskulatur isolert fra vaginaveggene hos kuer ble anordnet i bioanalyse-enheten. Faktoren som stammet fra Cowpers kjertler ekstrahert fra okser ga en markert kontraksjon av muskelstrimler. Det er velkjent at penisarterier utvides under ereksjon, mer blod tilføres corpora cavernosa som fylles som et resultat av dette, og en ereksjon finner sted.

Under sæduttømmingsforløpet trekker muskulaturen rundt uretra seg sammen i flere autonome sammentrekninger, og utstøter sæden fra penis ved høyt trykk. Spermatozoene som foreligger i sæden som utstøtes, avsettes i vagina og beveger seg, enten ved aktiv bevegelse eller passiv vandring til livmorsrommet, hvorfra spermatozoene beveger seg videre og når egget, som så gjennom-trenges.

Eksperiment 8 - Ereksjonsprøve

Aper (guenoner) 3-4 år gamle som veide 4,5-5.0 kg ble brakt i søvn med ketalar 1,8 ml + eventuelt ytterligere 0,5 ml.

Penis hos de respektive aper ble holdt tilbake ved hjelp av en langstrakt sugeanordning.

De følgende substanser ble injisert gjennom tunica albuginea i corpus carvarnosum (glatt muskulatur) ved hjelp av en sprøyte 26 G spiss, og den injiserte løsning hadde en temperatur på 30°C. 1. 0,5 ml fysiologisk natriumklorid (NaCl), ga ingen reaksjon; 2. 0,5 ml (15 mg) papaverin som ga en ereksjon i løpet av få minutter; ereksjonen varte 1-2 timer; 3. 0,5 ml (2 mg) fenoksybenzamin som ga den samme reaksjon som papverin, eventuelt med lengre varighet; 4. En frysetørket substans fremstilt i eksempel 2 ble oppløst i 0,5 ml fysiologisk NaCl etter nitrogeninnblåsning. Tre aper ble undersøkt. Ereksjon ble observert og varte i 2-4 timer for 2 dyrs vedkommende og opptil 24 timer for 1 dyr.

Det har vært mulig å vise at faktoren fra kjertlene til mennesker og pattedyr (Cowpers og Bartholinis kjertler) tydelig fremmer både ereksjon og sæduttømming, og fertiliserer egget ved: utvide muskulaturen i corpora cavernosa i penis;

utvide muskulaturen til penisarterien;

trekke sammen uretramuskulaturen;

trekke sammen vaginamuskulaturen;

trekke sammen de langsgående bunter i livmorsrørforbindelsen

(uterus-oviduktforbindelse);

forsterke spermatozoenes aktive bevegelighet;

øke spermatozoenes evne til å gjennomtrenge albumen (protein);

og

koagulere sæd.

Sett sammen med det faktum at ekstraktet fra kjertlene tjener til å smøre urogenital slimmembran, får man herved en indikasjon på at faktoren har en virkelig betydning ved fremme av ereksjon, sæduttømming og spermatozoenes bevegelighet og evne til å gjennomtrenge protein. Faktoren kan således brukes som en fruktbarhetsfremmende substans.

Den måte faktoren utøver sin virkning i en in vivo situasjon kan illustreres ved å starte med oppfinnernes pionerarbeide med elektronmikroskopstudier på kjertlene, primært Cowpers kjertler (L. Hellgren, E. Mylius og J.Vincent: The ultra-structure of the human bulbo-urethral gland. J. Submicrose Cytol 14 (4), 683-689, 1982). Faktoren kan anses å ha enten en direkte eller en indirekte virkning,eller en kombinasjon av de to. Den direkte virkning kan anses å virke på spermatozoene ifølge ekseperiment 1-7. Den indirekte ("homonelle") virkning på faktoren på muskulaturen i penisarterien, vagina, uretra og ovidukt eller Fallopion-rør kan oppnås gjennom blodsirkulasjon. At dette er tilfelle, under-bygges av oppfinnernes elektronmikroskopiske oppdagelse av sekresjonens granuler i Cowpers og Bartholinis kjertler som er tilstede i kjertelblodkarene, idet det granulære innhold sannsyn-ligvis tømmes direkte i sirkulasjonen.

Faktoren kan brukes som et fruktbarhets- og ereksjonsfremmende middel. Disse midler kan utgjøre slike lipidfraksjoner fra Cowpers og Bartholinis kjertler som de som trekker sammen gerbiltykktarm, f.eks. det første urene totale lipidekstrakt, og spesielt de aktive fraksjoner eluert i tørrkolonnekromatografi på høytrykksvæskekromatografi i eksempel I. Midlene kan også foreligge i blandinger sammen med vanlige fortynningsmidler. Blandingene kan foreligge i form av injiserbare væsker, spray, tabletter, suspensjoner, løsninger, sirups, suppositorier og kapsler. Prøveløsningene fordampes fortrinnsvis til tørrhet og oppløses i fysiologisk koksalt og injiseres.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av ereksjons- og fruktbarhetsfremmende middel.karakterisert ved at a) vev valgt fra gruppen omfattende pattedyrs Cowper's kjertler og Bartholini's kjertler dissekeres; b) kjertelvevet finknuses; c) et væskeekstrakt fra kjertelvevet fjernes ved lipid-løsningsmiddelekstraksjon utført ved en sur pH, hvori lipid-løsningsmiddelet er valgt fra gruppen bestående av etylacetat eller metanol eller kombinasjonen derav; d) vann fra ekstraktet oppnådd fra trinn b) fjernes; e) løsningsmiddelet fra ekstraksjonstrinnet c) fordampes i et vannbad ved opptil ca. 40°C i et nitrogenmiljø, og f) ekstraktet fra trinn d) eller e) fraksjoneres ved revers-fase-HPLC, hvilket gir den biologisk aktive fraksjon som fremkaller ereksjon hos dyr og mennesker.