NO165917B - Analogifremgangsmaate for fremstilling av terapeutisk aktivt diamino-2,2-difluorhex-5-yn. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktivt diamino-2,2 - difluor-hex-5-yn.

Decarboxylering av ornithin til putrescin, en reaksjon som katalyseres av enzymet ornithin-decarboxylase (ODC), er første trinn i biosyntesen av polyaminene spermidin og spermin. Spermidin dannes ved omdannelsen av en aktivert aminopropyl-del fra S-adenosyl-S-methyl-homocysteamin til putrescin, mens spermin dannes ved omdannelsen av en andre aminopropylgruppe til spermidin. S-adenosyl-S-methyl-homocysteamin dannes ved decarboxyleringen av S-adenosylmethionin (SAM), en reaksjon som katalyseres av enzymet S-adenosylmethionin-decarboxylase

(SAM-DC).

Polyaminene som finnes i dyrevev og mikroorganismer, er kjent for å spille en viktig rolle i cellevekst og celledeling. Starten av cellevekst og celledeling er forbundet med både en markert økning i ODC-aktivitet og en økning i nivåene av putrescin og polyaminene. Selv om den nøyaktige mekanisme for rollen av polyaminene ved cellevekst og cellevekst ikke er kjent, synes det som om polyaminene kan lette makromolekylære prosesser slik som DNA, RNA eller proteinsyntese. Polyamin-nivåene er kjent for å være høye i embryonisk vev, i testik-lene, ventral prostata og thymus; i tumorvev; i psoriatiske hudlesjoner; og i andre celler som gjennomgår hurtig vekst eller celledeling.

Da putrescin er forløperen for både spermidin og spermin, vil en blokade av omdannelsen av ornithin til putrescin, slik som ved inhibering av ODC, forhindre ny biosyntese av disse polyaminer, og således gi gunstig fysiologisk effekt.

I US patentskrift 4 139 563 er det beskrevet at bl.a. forbindelser av følgende formel A er inhibitorer av ornithin-decarboxylase :

hvori R betegner hydrogen eller C^-C^-alkyl.

Enn videre er det i US patentskrift 4 421 768 beskrevet at forbindelsene av etterfølgende formel B også er ornithin-decarboxylaseinhibitorer:

hvori p betegner 1 eller 2.

Foreliggende oppfinnelse angår en analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktivt diamino-2,2-difluorhex-5-yn av formel I:

Farmasøytisk akseptable salter av forbindelsen av generell formel I omfattes også innen oppfinnelsens ramme.

Forbindelsen av formel I inhiberer ornithin-decarboxyl-aseenzymet (ODC) in vitro og in vivo, og fremkaller en reduksjon i putrescin- og spermidinkonsentrasjonene i celler hvori aktive biosynteser av polyaminer finner sted. Forbindelsen av formel I er derfor anvendbar i pattedyr for regulering av uønsket cellevekst eller celledeling. Forbindelsen av formel ler et anvendbart farmakologisk middel for behandling av de sykdommer eller tilstander som er kjent innen faget for å være karakterisert ved høy ODC-aktivitet. I særdeleshet er forbindelsen anvendbar systemisk for regulering av veksten av tumorvev i pattedyr, for behandling av godartet prostata-hypertropi, og for regulering av veksten av patogene, para-sittiske protozoa i infiserte husdyr og mennesker.

Forbindelsen av formel I kan også anvendes for å studere nærværet og den fysiologiske funksjon av ODC-inhibering i biologiske systemer og dets forbindelse med patologiske prosesser.

ODC-aktiviteten av forbindelsen kan bestemmes in vitro ved den metode som er beskrevet av B. Metcalf et al., J. Am. Chem. Soc, 100, 2551 (1978). ODC-aktiviteten av forbindelsen av formel I kan bestemmes in vivo ved metoden ifølge C. Danzin, Biochemical Pharmacology, 28, 627 (1979).

Eksempler på farmasøytisk akseptable salter av forbindelsen fremstilt ifølge oppfinnelsen innbefatter ikke-toksiske syreaddisjonssalter dannet med uorganiske syrer slik som saltsyre, hydrobromsyre, svovelsyre og fosforsyre, eller med organiske syrer slik som organiske carboxylsyrer, f.eks. sali-cylsyre, maleinsyre, malonsyre, vinsyre, sitronsyre og ascor-binsyre, og organiske sulfonsyrer slik som f.eks. methansul-fonsyre.

Det er antatt at forbindelsen av generell formel I er "substrat-indusert irreversibel inhibitor" av ornithin-decarboxylase. Slike inhibitorer er også kjent innen faget som "enzym-aktiverte, irreversible inhibitorer", "selvmords-enzyminhibitorer", "K .-inhibitorer" eller "mekanisme-baserte

eat

inhibitorer". For at en forbindelse skal være en substrat-indusert, irreversibel enzyminhibitor må forbindelsen være et substrat for målenzymet, og forbindelsen må inneholde en latent, reaktiv gruppe som er ømfintlig for å bli demaskert som et resultat av den normale katalytiske virkning av enzymet. Demaskering av den latente, reaktive gruppe ved virkningen av enzymet danner en reaktiv funksjon som alkylerer en nucleofil rest tilstedeværende på det aktive sted av enzymet. Således dannes det en covalent binding mellom inhibitoren og enzymet på det aktive sted, resulterende i irreversibel inaktivering av enzymet. Slike inhibitorer er uhyre spesifikke da inhibitoren må være et substrat for målenzymet, og da bioomdannelse av inhibitoren med målenzymet kreves før enzymet inaktiveres. Selv om det er antatt at forbindelsene av generell formel I generelt utviser sin virkning ved hjelp av en substrat-indusert mekanisme, kan inhiberingen finne sted ved andre mek-anismer slik som ved konkurrerende inhibering.

Som anvendt her, menes med uttrykket "tumorvev" både godartede og ondartede tumorer eller neoplasmer, og innbefatter leukemia, lymfoma, melanoma og sarcoma. Uttrykket "regulering av veksten av tumorvev" som anvendt her, betyr nedsettelse, avbrudd eller stansing av veksten av en hurtig celledelende tumor i et varmblodig dyr. Det skal forstås at administreringen av en forbindelse av formel I ikke gir en "legning" av tumoren i den betydning at tumorvevet ødelegges eller fullstendig elimineres fra det dyr som behandles.

For regulering av veksten av tumorvev kan forbindelsen av formel I administreres til en pasient i forbindelse med andre terapeutiske metoder eller i kombinasjon med cytotoksiske legemidler som er kjent innen faget for å være anvendbare for cancerkjemoterapi. Eksempelvis kan forbindelsen av formel i administreres i forbindelse med kirurgisk fjerning av tumoren eller med bestrålingsbehandling, hormonell behandling, immuno-terapi eller lokal varmeterapi. Enn videre kan forbindelsen av formel I fordelaktig administreres til en pasient i forbindelse med et kjemisk cytotoksisk middel som er kjent innen faget for å være anvendbar for tumorkjemoterapi. Når en slik kombinasjonsterapi anvendes for behandling av en tumor, kan det kjemoterapeutiske cancermiddel administreres ved en dose som er kjent innen faget for å være effektivt for behandling av tumoren. Imidlertid kan forbindelsen av formel I gi en additiv eller synergistisk effekt med et kjemoterapeutisk middel mot en bestemt tumor. Når således en slik kombina-sjons-antitumorterapi anvendes, kan dosen av det administrerte kjemoterapeutiske middel være mindre enn den som administreres når midlet anvendes alene. I kombinasjon med forbindelsen av formel I kan det kjemoterapeutiske middel derfor administreres ved et lavere doseringsnivå eller ved mindre hyppige intervaller sammenlignet med det kjemoterapeutiske middel når dette anvendes alene.

I kombinasjon med forbindelsen av formel I kan et hvilket som helst kjemoterapeutisk cancermiddel anvendes. Legemidler som vanligvis anvendes for cancerkjemoterapi, er beskrevet i The Medical Letter, vol. 22, nr. 24 (utg. 571), 28. nov. 1980, publisert av Medical Letter, Inc., New Rochalle, N.Y., 10801. Eksempler på cytotoksiske kjemoterapeutiske midler er cyclofosfamid, methotrexat, prednison, 6-mercapto-purin, procarbozin, daunorubicin, vincristin, vindesin, vinblastin, klorambucil, cytosin-arabinosid, 6-thioguanin, thio-TEPA, 5-fluoruracil, 5-fluor-2-deoxyuridin, 5-azacytidin, nitrogen-sennep, 1,3-bis-(2-klorethyl)-1-nitrosourea (BCNU), 1-(2-klorethyl)-3-cyclohexyl-l-nitrosourea (CCNU), busulfan, adriamycin, bleomycin, cycloleucin eller methylglyoxal-bis-(guanylhydrazon)(MGBG). Andre kjemoterapeutiske cancermidler vil være innlysende for fagmannen.

Effekten av forbindelsen av formel I for kontroll av veksthastigheten av hurtig celledelende tumorvev kan bestemmes i standard dyretumormodeller etter oral eller parenteral administrering. Eksempelvis kan antitumoreffekten demonstreres i følgende modeller: (a) L1210 leukemia i mus, (b) EMT 6 tumor i Balb/C mus, (c) 7,12-dimethylbenzanthracen-fremkalt (DMBA-fremkalt) brysttumor i rotter, eller (d) Morris 7288 C eller 5123 hepatoma i Buffalo-rotter. I tillegg kan antitumoreffekten av forbindelsen i kombinasjon med kjemoterapeutiske midler demonstreres i dyremodeller.

Når forbindelsen av formel I administreres i kombinasjon med et kjemoterapeutisk middel ved behandling av en ond-artet neoplastisk sykdom, kan den terapeutiske effekt av det kjemoterapeutiske middel potensieres ved at dimensjonen fremkalt av det kjemoterapeutiske middel kan økes og ny vekst av tumorvevet kan nedsettes eller forhindres. Anvendelse av slik kombinasjonsterapi muliggjør derfor mindre doser eller færre individuelle doser av det kjemoterapeutiske middel. Således nedsettes de skadelige og/eller svekkende bivirkninger av det kjemoterapeutiske middel til et minimum, samtidig som anti-tumoref fekten økes. Uttrykket "kombinasjonsterapi" tar i be-traktning administrering av forbindelsen av formel I umiddelbart før starten av kjemoterapi, samtidig med kjemoterapi eller under perioden umiddelbart etter opphør eller avbrudd av kjemoterapien.

Når kjemoterapi resulterer i remisjon av tumoren og

alle tumorceller ikke er ødelagt, kan ny vekst av tumoren forhindres eller nedsettes i det uendelige ved kontinuerlig behandling med forbindelsen av formel I. Således kan forbindelsenav formel I administreres for å stoppe eller ned-sette veksten av tumoren under perioder når kjemoterapi under

anvendelse av et cytotoksisk middel temporært kan være av-brutt .

Et foretrukket cytotoksisk middel for kombinasjonsterapi med forbindelsen av formel I er methylglyoxal-bis-(guanylhydrazon), heretter angitt som MGBG, som også er en inhibitor av S-adenosylmethionin-decarboxylase. Aktiviteten av MGBG som et kjemoterapeutisk middel ved behandling av neo-plastiske sykdommer er vel dokumentert. Eksempelvis har W. A. Knight et al., Cancer Treat. Rep., 4_3 , 1933, (1979), rapportert at en dose av MGBG administrert intravenøst en eller to ganger i uken til pasienter i fremskredet tilstand med carcinoma i blæren, esofagus, lunge, pancreas, kolon, nyre, bryst og prostata, havrecellecarcinoma, adenocarcinoma, lymfoma, hepatoma, melanoma, leukemia eller Edwings sarcoma, fremkalte målbar regresjon av tumoren i mange av de behandlede pasienter og fullstendig forsvinning av sykdommen hos to av de 65 behandlede pasienter.

Mengden av MGBG som skal administreres, kan være den samme som den mengde som er kjent innen faget for å være effektiv for tumorterapi. Effektive og ikke-toksiske doser bestemmes av legen i hvert tilfelle under hensyntagen til den individuelle pasients tilstand. Eksempelvis kan en dose på 250-500 mg pr. m 2 kroppsoverflate infuseres en eller to ganger i uken i 100 ml vandig 5% dextroseløsning i løpet av en 30 minutters periode. Kombinasjonsterapi med forbindelsen av formel I forbedrer responsen av tumorvevet overfor den cytotoksiske effekt av MGBG og muliggjør bruk av en mindre individuell dose av MGBG og et kortere behandlingsforløp enn hva som ville være nødvendig med anvendelse av MGBG alene.

Egnede doser av forbindelsen av formel I for anvendelse i kombinasjonsterapi med MGBG eller andre kjemoterapeutiske cancermidler kan være en hvilken som helst mengde som er effektiv til å forhindre polyaminbiosyntese tilstrekkelig til å regulere tumorveksthastigheten -eller for å oppnå en for-sterket respons på det cytotoksiske middel som administreres i forbindelse dermed.

Uttrykket "regulering av veksten av patogene, parasitt-iske protozoa" som anvendt her, betyr nedsettelse, avbrudd eller stansing av replikasjonen av protozoaen i en infisert vert. Forbindelsen av formel I er anvendbar mot T.b. brucei (som forårsaker trypanosomiasis i kveg), T.b. rhodesiense (som forårsaker human sovesyke), coccidia, f.eks. Eimeria tenella (som forårsaker intestinal coccidiosis i fugler (f.eks. kyllinger, kalkuner og ender)) og den exoerythrocytiske form av plasmodia, f.eks. plasmodium falciparum (som fremkaller human malaria).

Den antiprotozoale aktivitet av forbindelsen av

formel I kan demonstreres in vivo eller in vitro ved standard mikrobiologiske testprosedyrer. Eksempelvis kan aktiviteten av forbindelsen overfor T.b. brucei og T.b. rhodesiense bestemmes i infiserte mus ved administrering av testforbind-elsen ad lib daglig (3 til 15 dager etter infeksjon) som en løsning i drikkevannet. Aktivitet indikeres ved en økning i overlevelsestid (sammenlignet med ubehandlede kontrolldyr) eller fravær av parasitter i blodet. Aktiviteten av forbindelsen overfor coccidia kan bestemmes i infiserte kyllinger, f.eks. de infisert med E. tenella ved administrering av test-forbindelsen daglig ad lib (fra en dag før injeksjon til 5 dager etter infeksjon) som en løsning i drikkevannet. De cecale lesjoner vurderes etter en standard lesjonsbedømmelses-prosedyre, (se Reid. Am. J. Vet. Res. , _30, 447 (1969) og Avian Coccidiosis, P. Long., red., Britisk Poultry Science, Ltd., Edinburgh). Aktiviteten av forbindelsen overfor malaria

(p. faleiparum) kan bestemmes ved en standard in vitro plate-kulturtest (se K. Rieckmann et al., Lancet, 1, 22 (1978)). Antimalariaaktivitet kan også bestemmes i spesielle stammer av mus infisert med den exoerythrocyttiske form av p. berghei. Ved denne test administreres forbindelsen ad lib i drikkevann idet man starter to dager før infeksjon og fortsetter 28 dager etter infeksjon. Aktivitet måles ved en signifikant nedsettelse i dødsfall sammenlignet med kontrollene, eller ved en signifikant økning i overlevelsestid.

Forbindelsen ifølge oppfinnelsen kan administreres på forskjellig måte for å oppnå den ønskede effekt. Forbindelsen kan administreres alene eller i form av farmasøytiske prepar-ater enten oralt eller parenteralt, f.eks. subkutant, intra-venøst eller intraperitonealt. Mengden av administrert ny forbindelse vil variere og kan være en hvilken som helst

effektiv mengde. Avhengig av pasienten, den tilstand som skal behandles og administreringsmåte, kan den effektive dose av administrert forbindelse variere fra 5 mg/kg til 500 mg/kg kroppsvekt pr. dag. Enhetsdoser av forbindelsen kan f.eks. inneholde fra 10 mg til 500 mg av forbindelsen og kan administreres f.eks. fra 1 til 4 ganger daglig.

Uttrykket "enhetsdoseringsform" anvendes her for å angi

en enkel eller multippel doseringsform inneholdende en mengde av den aktive bestanddel i blanding med eller på annen måte i assosiasjon med fortynningsmidlet eller bæreren, hvilken mengde er slik at en eller flere på forhånd bestemte enheter normalt kreves for en enkel terapeutisk administrering.

Når det gjelder multiple doseringsformer slik som væsker eller graderte tabletter, vil en på forhånd bestemt enhet være en fraksjon slik som en 5 ml (teskje) mengde av en væske eller halvparten eller en fjerdedel av en gradert tablett, av den multiple doseringsform.

Fremgangsmåter for fremstilling av forbindelsen av

formel I beskrives i det etterfølgende. Hvis en aminogruppe av en reaktant i noen av de beskrevne reaksjonstrinn vil være involvert i en uønsket reaksjon under de relevante reaksjons-betingelser, vil aminogruppen beskyttes på kjent måte ved innføring av en egnet beskyttende gruppe. Den beskyttende gruppe velges under hensyntagen til arten av den relevante reaksjon og lettheten når det gjelder fjerning av denne til den frie aminogruppe. Den beskyttende gruppe kan velges fra

f.eks. acyl, f.eks. lavere alkanoyl, eksempelvis acetyl,

propionyl, trifluoracetyl og lignende; aroyl, f.eks. benzoyl, toluoyl og lignende; lavere alkoxycarbonyl, f.eks. methoxy-carbonyl, ethoxycarbonyl, tert.-butoxycarbonyl og lignende; carbobenzoxy, benzensulfonyl og tosyl. Begge aminohydrogenatomer kan substitueres med en enkel beskyttende gruppe slik som

f.eks. fthalyl. De beskyttende grupper innføres på i og for seg kjent måte, f.eks. ved omsetning av aminet med et lavere alkanoyl- eller aroylklorid, anhydrid, sulfonylklorid, tert.-butoxycarbonyloxyimino-2-feny1-acetonitril (B0C-0N), eller di-tert.-butyldicarbonat ((B0C)20).

Fjerning av den beskyttende gruppe etter at den krevede omsetning er blitt fullført, kan utføres på i og for seg kjent måte for den relevante, beskyttende gruppe. Vanligvis vil denne fjerning være en hydrolytisk splitting under anvendelse av en sterk organisk eller uorganisk syre slik som f.eks. tri-fluoreddiksyre, saltsyre og lignende syrer; eller med hydrogcn-kloridgass under vannfrie betingelser. Anvendelse av betingelser som vil redusere den umettede binding eller av reak-tantene, slik som hydrobromsyre, som vil reagere med den umettede binding, må unngås. De anvendte løsningsmidler velges avhengig av betingelsene for fjerning av den beskyttende gruppe. Eksempelvis kan ethere slik som f.eks. diethylether, anvendes for splitting under anvendelse av hydrogenkloridgass.

I det tilfelle hvor en acetylenisk gruppe må beskyttes, er den foretrukne, beskyttende gruppe trialkylsilyl, spesielt trimethylsilyl, som lett kan innføres ved omsetning av den frie acetyleniske gruppe med et trialkylsilylklorid. Trialkyl-silylgruppen kan lett fjernes ved basehydrolyse for å frigi den acetyleniske gruppe.

Analogif remgangsmåten ifølge oppfinnelsen er kjennetegnet; ved at den tilsvarende alkohol av formel II behandles for å omdanne hydroxylgruppen til en primær aminogruppe: via et amino-beskyttet derivat av den tilsvarende fthalimido-forbindelse av generell formel III:

Fthalimidoforbindelsen av formel III kan erholdes på

i og for seg kjent måte ved behandling av et amino-beskyttet derivat av forbindelsen av formel II med fthalimid i nærvær av et trialkyl- eller triaryl-fosfin og diethylazodicarboxylat i et vannfritt, aprotisk løsningsmiddel. Vanligvis anvendes 1 til 3 ekvivalenter hver av fthalimid, fosfin og diethylazo-

dicarboxylat pr. ekvivalent av derivat av formel II ved en temperatur på 10 til 100°C i et tidsrom på fra 18 til 24 timer. Hensiktsmessig er fosfinet trifenylfosfin, og det aprotiske løsningsmiddel er tetrahydrofuran.

Fthalimidogruppen kan omdannes på i og for seg kjent måte til den krevede primære aminogruppe. Eksempelvis kan fthalimidogruppen splittes hydrolytisk ved oppvarming med en sterk uorganisk syre, fortrinnsvis en blanding av saltsyre og eddiksyre. Syrer som er reaktive overfor acetyleniske bind-inger, f.eks. hydrobromsyre, kan selvsagt ikke anvendes. Det foretrekkes å frigi aminogruppen ved oppvarming, fortrinnsvis under tilbakeløpsbetingelser, av fthalimidoderivatet med et hydrazin eller methylamin i et polart, organisk løsningsmiddel, spesielt en alkohol. Hensiktsmessig anvendes methylhydrazin i methanol.

Den foretrukne amino-beskyttende gruppe for forbindelsen av formel III er fthalimido, hvorved begge aminogrupper av den ønskede forbindelse av formel I kan frigis samtidig.

Forbindelsene av formel II kan erholdes ved omsetning på i og for seg kjent måte av et ethynylmagnesiumhalogenid, fortrinnsvis bromidet, med et amino-beskyttet derivat av det tilsvarende aldehyd av etterfølgende generelle formel IV:

Hensiktsmessig utføres reaksjonen i tetrahydrofuran, og ethynylmagnesiumhalogenidet dannes in situ ved tilsetning av ethylmagnesiumhalogenid til tetrahydrofuran mettet med acetylen. Igjen er den foretrukne amino-beskyttende gruppe fthalimido.

Forbindelsene av formel IV kan erholdes på i og for seg kjent måte ved oxydasjon av et amino-beskyttet derivat av det tilsvarende olefin av etterfølgende generelle formel V:

Egnede, oxyderende midler innbefatter kaliumperman-ganat, osmiumtetroxyd og for tiden foretrukket, ozon. Ved anvendelse av ozon foretrekkes det å føre ozonet gjennom en løsning av olefinet i et ikke-protisk løsningsmiddel, f.eks. diklormethan, og deretter tilsette dimethylsulfid for å redusere det ozonide reaksjonsmellomprodukt.

Forbindelsene av formel V kan erholdes fra den tilsvarende alkohol av etterfølgende generelle formel VI ved omdann-else på i og for seg kjent måte av hydroxylgruppen til den primære aminogruppe;

Hensiktsmessig forløper omdannelsen via den tilsvarende tosyloxy-, mesyloxy- eller fortrinnsvis trifluormethylsulfonyl-oxy-forbindelse ved behandling av alkoholen av formel VI med tosylklorid, mesylklorid eller trifluormethylsulfonylanhydrid i nærvær av en base slik som pyridin i et ikke-protisk løsnings-middel, spesielt diklormethan. Mellomproduktet behandles deretter med et alkalimetallfthalimid i et polart, organisk løs-ningsmiddel hensiktsmessig dimethylformamid, under dannelse av det tilsvarende fthalimidoderivat. Vanligvis anvendes fthalimidoderivatet som det amino-beskyttede derivat som kreves som reaktant for fremstilling av en forbindelse av formel V. Om nødvendig, kan imidlertid aminogruppen frigis f.eks. ved behandling med en uorganisk syre eller hydrazin.

Alkoholen av formel VI kan erholdes ved reduksjon av den tilsvarende ester av etterfølgende generelle formel VII

med et reduksjonsmiddel slik som borhydrid, som selektivt reduserer estergruppen

hvori R1 betegner C^-C^alkyl.

Forbindelsen fremstilt ved de foregående fremgangsmåter, kan isoleres enten per se eller som syreaddisjonssalter derav.

Syreaddisjonssaltene er fortrinnsvis de farmasøytisk akseptable, ikke-toksiske addisjonssalter med egnede syrer slik som de som tidligere er angitt i foreliggende beskrivelse. Bortsett fra farmasøytisk akseptable syreaddisjonssalter er andre salter også innbefattet innen rammen for syreaddisjonssalter, slik som f.eks. de med picrinsyre eller oxalsyre, idet disse kan tjene som mellomprodukter ved rensing av forbindelsene eller ved fremstilling av andre, f.eks. farmasøytisk akseptable syreaddisjonssalter, eller som er anvendbare for identifisering eller karakterisering av basene.

Et resulterende syreaddisjonssalt kan omdannes til en fri forbindelse etter kjente metoder, f.eks. med behandling med et alkali- eller jordalkalimetallhydroxyd eller -alkoxyd, med et alkalimetall- eller jordalkalimetallcarbonat eller hydrogen-carbonat, med trialkylamin, eller med en anionbytterharpiks.

Et resulterende syreaddisjonssalt kan også omdannes til et annet syreaddisjonssalt etter kjente metoder, og eksempelvis kan et salt med en uorganisk syre behandles med et natrium-, barium- eller sølvsalt av en syre i et egnet fortynningsmiddel hvori det resulterende, uorganiske salt er uløselig og således fjernes fra reaksjonsmediet. Et syreaddisjonssalt kan også omdannes til et annet syreaddisjonssalt ved behandling med et anionbytterpreparat.

Oppfinnelsen illustreres ytterligere ved det etterfølgende eksempel.

Eksempel

1, 4- diamino- 2, 2- difluor- hex- 5- yn

(Formel I)

(A) 2, 2- difluorpent- 4- en- l- ol

(formel VI)

En løsning av 146,8 g (0,9 mol) ethyl-2,2-difluorpent-4-enoat, formel VII; R1=C.;H5) i 350 ml ethanol ble dråpevis tilsatt i løpet av 1 time til en løsning av 34 g (0,9 mol) natriumborhydrid i 550 ml absolutt ethanol ved romtemperatur. Under tilsetningen ble det observert at reaksjonsblandingen ble varm. Etter 25 minutter ble blandingen avkjølt med salt/is til 16°C, og tilsetningen ble fortsatt ved denne temperatur. Omrøringen ble fortsatt i ytterligere 30 minutter ved isbadtemperatur og deretter i 2 timer ved romtemperatur.

Reaksjonsblandingen ble fordampet,"residuet ble oppløst i 500 ml diklormethan, og 350 ml 4N svovelsyre ble tilsatt, hvilket bevirket kraftig utvikling av hydrogen. Løsningen- ble? fortynnet med 500 ml vann og ble deretter ekstrahert med- 4r x. 250 ml diklormethan. De kombinerte, organiske ekstrakter, ble. vasket med svovelsyre (to ganger, 200 ml, 2N), saltvann, og ble tørket over magnesiumsulfat og konsentrert ved 25°C under vann-pumpesug.

Destillasjon av konsentratet ga 2,2-difluorpent-4-en-l-ol, kp. 48-50°C/ll mm Hg som en farveløs, mobil olje (110,8 g, kvantitativt).

<1>H NMR CDC13 delta 6,1-5,7 (1 H, m); 5,3 (2 H, br.d);

3,70 (2 H, t, J = 12 Hz); 3,2 (1 H, br.s); 2,70 (2 H, dt,

J = 6, 15 Hz) .

<19>FNMR CDC10/CCF, -54 (tt, J = 12,15 Hz).

j Db

(B) 2, 2- difluorpent- 4- enyl- trifluormethylsulfonat

Til en løsning av 78 g (0,64 mol) av alkoholen fremstilt

i trinn A i 500 ml diklormethan og 55,3 g (0,7 mol) pyridin ved 0°C, ble tilsatt en løsning av 204 g (0,7 mol) trifluormethylsulfonylanhydrid i diklormethan i løpet av 0,75 time mens temperaturen ble opprettholdt ved 5°C med salt/isavkjøling. Etter endt tilsetning fikk reaksjonsblandingen oppvarmes til romtemperatur, ble omrørt 0,5 time og avkjølt til 0°C, hvorpå

350 ml vann ble tilsatt. De resulterende lag ble fraskilt, det vandige lag ble ekstrahert med 2 x 500 ml diklormethan, den kombinerte, organiske fase ble tilbakevasket med 2 x 200 ml vann, ble tørket over natriumsulfat og konsentrert ved rota-sjons fordampning .

Konsentratet ble destillert ved vannpumpetrykk:

kp. 50-52°C 134 g (83%) ,

<1>H NMR CDC13 delta 5,8 (1 H, m); 5,3 (2 H, m); 4,50

(2 H, t, J = 11 Hz); 2,77 (2 H, dt, J = 7, 16 Hz)

<19>NMR CDC13/C6F6 -88 (s), -57 (tt, J = 11, 16 Hz).

(C) 2, 2- difluorpent- 4- enyl- fthalimid

(formel V; R=H; fthalyl-beskyttende gruppe)

123 g (0,67 mol) kaliumfthalimid ble tilsatt til en om-rørt løsning av 130 g (0,51 mol) 2,2-difluorpent-4-enyl-trifluormethylsulfonat i trinn B ovenfor i 1,2 liter dimethylformamid. Blandingen ble oppvarmet til 120°C i 21 timer under hvilket tidsrom mesteparten av det faste materiale ble oppløst.

Etter avkjøling til romtemperatur ble 2 liter vann tilsatt mens temperaturen ble opprettholdt ved 20°C. Det faste materiale ble oppløst ved tilsetning av diethylether, etherlaget ble fraskilt, det vandige lag ble ekstrahert med 3 x 1,7 liter diethylether. De kombinerte, organiske lag ble vasket med 3 x 150 ml 2N natriumhydroxyd, 3 x 500 ml vann, ble tørket (MgS04) og fordampet under dannelse av 114,8 g (90%) 2,2-difluorpent-4-enyl-fthalimid som et hvitt, fast materiale;

smp. 74-77°C.

<1>H NMR CDC13 delta 7,87 (4 H, m); 5,9 (1 H, m); 5,3

(2 H, m); 4,10 (2 H, t, J = 14 Hz); 2,75 (2 H, dt, J = 7, 16 Hz).

<19>F NMR CDCl-/C,Ft - 60,5 (tt, J = 16, 14 Hz).

JOD

En prøve krystallisert fra diethylether/pentan, hadde

et smeltepunkt på 78-80°C.

Funnet: C 62,53; H 4,51; N 5,63%

<C>13<H>11N02F2 krever: C 62,15; H 4,41; N 5,58%

(D) 2, 2- difluor- l- fthalimidobutan- 4- al

(formel IV; R=H; fthalyl-beskyttende gru<p>pe)

En løsning av 18 g (72 mmol) 2,2-difluorpent-4-enyl-fthalimid fremstilt i trinn C i 500 ml diklormethan ble avkjølt på et tørris/acetonbad, og 0,5 mmol/min. ozon ble boblet inn i løsningen inntil en blåfarging ble observert. OzcnEtrømmen ble stoppet, og 60 ml dimethylsulfid ble tilsatt alt på en gang. Kjølebadet ble fjernet, og blandingen ble omrørt ved romtemperatur over natten. Diklormethan og overskudd av dimethylsulfid ble fjernet ved rotasjonsfordampning. Residuet ble tatt opp i 100 ml diklormethan, ble vasket med 3 x 40 ml nettet, vandig natriumbicarbonat og to ganger med 50 ml vann hver gang, og deretter med saltvann, ble tørket over natriumsulfat, hvorpå løsningsmidlet ble fjernet ved rotasjonsfordampning under dannelse av 18,1 g (100%) 2,2-difluor-l-fthalimidobutan-4-al som et hvitt, fast materiale (smp. 76-78°C).

<1>H NMR CDC13 delta 9,87 (1 H, m); 7,87 (4 H, m); 4,22

(2 H, t, J = 14 Hz); 3,07 (2 H, dt, J = 2, 17 Hz).

<19>F NMR CDC13/C6F6 -64 (ddd, J = 17, 14, 2 Hz).

Hvis reaksjonsblandingen bare får stå 1 til 2 timer

etter tilsetning av dimethylsulfid, er ozonoidet 3-(2,2-difluor-3-fthalimidopropyl)-1,2,4-trioxalan en hovedurenhet-i aldehydet: <1>H NMR CDC13 delta 7,53 (4 H, m); 5,60 (1 H, t, J = 5 Hz);

5,22 (1 H, s) ; 5,13 (1 H, s) ; 4,17 (2 H, t, J = 14 Hz);

2,45 (2 H, dt, J = 5, 16 Hz).

<19>F NMR CDC13/C6F6 -62 (m).

(E) 2, 2- difluor- l- fthalimido- hex- 5- yn- 4- ol

(formel II; R=H; fthalyl-beskyttende gruppe)

1 liter tørr is-kald tetrahydrofuran ble mettet med acetylen i løpet av 1 time. Ethylmagnesiumbromid (2 M løsning i diethylether, 40 ml, 80 mmol) ble deretter tilsatt til denne løsning i løpet av 15 minutter, og etter endt tilsetning ble acetylen-strømmen opprettholdt i 30 minutter. En løsning av 72 mmol 2,2-difluor-l-fthalimidobutan-4-al fremstilt i trinn D i 150 ml tetrahydrofuran, ble deretter dråpevis tilsatt i løpet av 15 minutter, og blandingen ble omrørt under nitrogen i 1 time mens den fikk oppvarmes til romtemperatur.

Blandingen ble helt over i 1 liter IN saltsyre og ble ekstrahert med 3 x 750 ml diethylether. De kombinerte, organiske ekstrakter ble vasket med saltvann, tørket over natriumsulfat og konsentrert.

Produktet ble behandlet med aktivt carbon i methanol. Krystallisering av dette materiale fra ethylacetat/hexan og kromatografi av modervæskene (500 g Si02 70-230 mesh: ethylacetat/hexan 1:1) ga totalt 6,58 g 2,2-difluor-l-fthalimido-hex-5-yn-4-ol med en renhet tilstrekkelig for anvendelse i trinn F. Totalt utbytte: 33%, Rf (ethylacetat/hexan 1:1) 0,69. En prøve omkrystallisert fra methanol hadde et smeltepunkt på 172-4°C.

■"■H NMR (CD30D/(CD3) 2S0) delta 7,87 (4 H, m) ;

4,67 (1 H, td, J = 6, 2 Hz); 4,5-3,7 (2 H, m); 3,03

(1 H, d, J = 2 Hz); 2,40 (2 H, ddd, J = 18, 15 6 Hz).

<19>F NMR CDCl3/C6Fg -64 (m).

m.s. (NH3/DCI) m/e 297 (MNH^<+>, 70%); 280 (MH<+>, 100%);

262 (20%); 242 (50%); 160 (75%).

Funnet: C 59,55; H 4,06; N 5,13%.

C14H11N03F2 krever: c 60,22; H 3,97; N 5,02%.

(F) 2, 2- difluor- 1, 4- bis-( fthalimido)- hex- 5- yn

(formel III; ]=H; fthalyl-beskyttende gruppe)

7,5 ml (47,4 mmol) diethylazodicarboxylat ble tilsatt

til en iskald løsning av 8,88 g (31,8 mmol) 2,2-difluor-1-fthalimido-hex-5-yn-4-ol fremstilt i trinn E, 16,7 g (63,7 mmol) trifenylfosfin og 5,12 g (34,8 mmol) fthalimid i 500 ml tetrahydrofuran under nitrogen og i løpet av IO minutter. Blandingen ble omrørt ved 0°C i 2 timer og deretter ved romtemperatur i 65 timer.

Tetrahydrofuranet ble fjernet ved rotasjonsfordampning, og residuet ble renset ved flashkromatografi (800 g, Si02, 230-400 mesh; ethylacetat/hexan 1:1). To sett i. v fraksjoner ble oppsamlet. De inneholdende 2,2-difluor-4-bis-(fthalimido) -hex-5-yn og trifenylfosf in., ble vasket med diethylether under dannelse av det ønskede bis-fthalimid med tilstrekkelig renhet, mens fraksjoner inneholdende 2,2-difluor-1,4-bis-(fthalimido)-hex-5-yn og N,N'-dicarbethoxyhydrazin, ble vaskat med methanol. Sluttelig ble kolonnen vasket med ethylacetat. Igjen ga methanolvasking bis-fthalimid. Totalt 4,85 g (36%)

av det ønskede produkt ble isolert; Rf (ethylacetat/hexan, 1:1) 0,34.

En prøve vasket ytterligere en gang med methanol, hadde et smeltepunkt på 201-203°C.

<1>H NMR (CDC13) delta 7,77 (8 H, m); 5,60 (1 H, ddd,

J = 9, 4, 2 Hz); 4,08 (2 H, t, J = 14 Hz); 3,5-2,5 (2 H, m); 2,43 (1 H, d, J = 2 Hz).

<19>F NMR CDCl3/C6Fg -59 (m).

m.s. (EI) m/e 408 (M<+>, 5%); 388 (m-HF, 15%); 380 (5%)

368 (10%); 345 (20%); 241 (95%); 184 (100%); 160 (80%).

Funnet: C 63,86; H 3,51; N 6,83%

C22H14N2F2°4 krever: c 64'71'" H 3,46; N 6,86%.

(G) 2, 2- difluorhex- 5- yn- l, 4- diamin- bis- t- butylcarbamat

(formel I; 4=H, BOC-beskyttende gruppe)

2,46 ml (46 mmol) methylhydrazin ble tilsatt til 4,85 g (11,9 mmol) 2,2-difluor-1,4-bis-(fthalimido)-hex-5-yn fremstilt i trinn F i 50 ml methanol og 50 ml tetrahydrofuran, og løsningen ble oppvarmet til 80°C (forsiktig tilbakeløp) under nitrogen i 22 timer. Blandingen ble deretter avkjølt til romtemperatur og konsentrert ved rotasjonsfordampning, og sluttelig med ethanolazeotrop.

Residuet ble suspendert i en blanding av 200 ml methanol, 10 ml vann og 20 ml konsentrert saltsyre og ble omrørt i 30 minutter. Det faste materiale ble fjernet ved filtrering og vasket med vann. De kombinerte filtrater ble fordampet til tørrhet.

Residuet ble oppløst i 500 ml vann og 25 ml tetrahydrofuran. 5 g natriumcarbonat og 10 g (45,9 mmol) di-tert.-butyldicarbonat ble tilsatt, og blandingen ble omrørt ved romtemperatur over natten.

Blandingen ble ekstrahert med 3 x 50 ml diethylether.

De kombinerte ekstrakter ble vasket med saltvann, tørket over natriumsulfat og fordampet. Residuet ble flashkromatografert (ca. 200 g Si02, 230-400 mesh, pentan/diethylether 2:1) under dannelse av 2,2 g (53%) 2,2-difluor-hex-5-yn-l,4-diamin-bis-t-butylcarbamat , R^ 0,31.

En prøve krystallisert fra pentan, hadde et smeltepunkt på 108-115°C.

<1>H NMR (CDCL3) delta 4,8 (3 H, m); 3,57 (2 H, dt, J = 6, 14 Hz); 2,3 (3 H, m); 1,4 7 (18 H, s) .

<19>F NMR CDC13/C6F6 -59.

(H) 2, 2- difluorhex- 5- yn- l, 4- diamin- dihydroklorid

(formel I; R=H; dihydroklorid-syreaddisjonssalt)

En mettet løsning av saltsyre i diethylether (20 ml) ble tilsatt til en løsning av 2,2 g (6,3 mmol) 2,2-difluorhex-5-yn-1,4-diamino-bis-t-butylcarbamat fremstilt i trinn G i 10 ml diethylether. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 4 dager. Bunnfallet ble oppsamlet, vasket med diethylether og omkrystallisert fra methanol/diisopropylether under dannelse av 2,2-difluorhex-5-yn-l,4-diamin-dihydroklorid som et hvitt, ikke-hygroskopisk fast materiale, 1,09 g, 78%, som smelter under spaltning over 200°C.

LE NMR (D20: HDO = 4,50 delta) delta 3,50 (2 H, dd,

J = 15, 18 Hz); 3,00 (1 H, d, J = 2 Hz), 2,7 (2 H, m).

Signalet for H-4 ble skjult av løsningsmidlet.

Funnet: C 32,41/32,55; H 5,31/5,36; N 12,60/12,78%. C,H,0N0F0C10 krever: C 32,60; H 5,47; N 12,67%. 6 12 2 2 2.

Den ODC-inhiberende aktivitet av forbindelsen av

formel I kan vises in vivo ved følgende prosedyre:

Hannrotter av Sprague-Dawley-stammen (200-220 g kroppsvekt) ble gitt mat og drikke ad lib under en konstant 12 timers lys- 12 timers mørkesyklus. Legemidlene ble injisert intraperitonealt (oppløst i 0,9% saltvann) eller ble gitt ved sonde (opp-løst i vann). Rotter gitt saltvann eiler vann, tjente som kontroll. 5 til 6 timer etter legemiddeladministrering bie dyrene avlivet ved halshugging, og den ventrale prostata og thymus ble skåret raskt ut og umiddelbart bearbeidet. Vevene ble homogenisert med tre volumer 30 mM natriumfosfatbuffer (pH 7,1) inneholdende 0,1 mM EDTA, 0,25 M sucrose, 0,1 mM pyridoxal-fosfat og 5 mM dithiothreitol. Ornithin-decarboxylase- aktivitet ble bestemt på en 1000 g supernatant av prostata-homogenat og på et helt thymushomogenat, hovedsakelig som beskrevet av Ono et al. (Biochem. Biophys. Acta, 284, 285 (1972)).

Aktiviteten av forbindelsen av formel I som inhibitor

av ornithin-decarboxylase (ODC) kan demonstreres, in vitro ved-følgende prosedyre:

Ornithin-decarboxylase (ODC) ble fremstilt fra leveren

av rotter som var blitt injisert med thioacetamid (150 mg/kg kroppsvekt) 18 timer før avlivning og ble renset ti ganger ved syrebehandling ved pH 4,6 som beskrevet av Ono et al. (Biochem. Biophys. Acta 284, 285 (1972)). Hovedløsningen av ODC er sammensatt av protein (16 mg/ml), natriumfosfatbuffer (30 mM,

pH 7,1), dithiothreitol (5 mM) og pyridoxal-fosfat (0,1 mM).

Den spesifikke aktivitet av denne hovedløsning er 0,12 nmol C02/min. pr. mg protein. For et typisk forsøk blandes 320 ul

av denne hovedløsning ved tid 0 med 80 ul av en løsning av inhibitoren i vann og inkubert ved 37°C. Ved forskjellige tider ble 50 ul aliquoter overført i et 1 ml prøvemedium inneholdende natriumfosfat (30 mM, pH 7,1), dithiothreitol (5 mM), pyridoxal-fosfat (0,1 mM), L-ornithin (0,081 mol) og DL-[l-<14>C]-ornithin (0,043 mol, 58 Ci/mol) i et lukket kar hvori et filterpapir fuktet med 50 pl hyaminhydroxyd (IM) var anordnet. Reaksjonen fikk forløpe i 60 minutter ved 37°C og ble deretter avsluttet ved tilsetning av 0,5 ml 40% trikloreddiksyre. Etter ytterligere 30 minutter ble C02 absorbert på filterpapiret tellet i en standard scintillasjonsvæske. K^. (tilsynelatende dissosiasjonskonstant) og T50 (halveringstid ved uendelig konsentrasjon av inhibitor) ble beregnet etter metoden ifølge Kitz og Wilson (J. Biol. Chem., 237, 3245 (1962)).

Claims (1)

1. Analogifreargangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktivt diamino-2,2-difluor-hex-5-yn av formel I:

   karakterisert ved at den tilsvarende alkohol av formel II behandles for å omdanne hydroxylgruppen til en primær aminogruppe:

   via et amino-beskyttet derivat av den tilsvarende fthalimido-forbindelse av generell formel III: