NO164691B - Fremgangsmaate for fremstilling av et geldannet naeringsmiddel og anvendelse av dette for fremstilling av naeringsmidler og matvareprodukter. - Google Patents

Abstract

For å fremstille termisk geldannede emulsjoner uten A ty til fortykningsmidler eller å tilsettes kalsium, blir et vandig medium inneholdende geldannede myseproteiner homogenisert med et lipidmedium under intense betingelser, hvoretter emulsjonen varmebehandles.Fremgangsmåten kan benyttes for f. eks. å fremstille eggkremer, omeletter, pannekaker, quich, pølser, geleer, desserter og smørbare kremer med utmerkede organoleptiske egenskaper.

Description

Z og Z<1>

betegner gruppene ' ir.- i'..-

-COOalkyl • i og -COOII v- i:

eller -CH2OH og" -CtfO ""' l' .'<:>/

eller -CH2OH og -O^OCOCHg CC/

eller -CH20acyl og - Cti^ OH"

eller -COR, og. -CHOH-R,

eller -(C=R2)-R1 ...og -CORj- •; ,c.:r: :' <... ri: ?= •' > / Cl L- i = ; C' ;' C i hvor R^ er lavere alkyil-, eller bedjr^e^-T?^ -danner sammen en ethylen-

eller propy^lengruppe j og-rR^/ e^^ ert 'oxsrmgrnappe , hydrazongruppe eller semicarbazongruppe, og f remgangSmåten/^er^Jkarakterisert ved at en forbindelse av formelen: y .. A-z - ■ , ""'.:' C'":'

hvor C. er et optisk inaktivt carbonatom, og X, Y, Z og A er som ovenfor angitt, f erment eres: med" bakt er ie"-", gjær-, eller soppkul.t ur er eller med derav isolerte.- enzymer-. ;•• ■.; ;■: •>..

For videre belysning av gruppene X, Y;■ og Z i"'ut gaiigsmat erdalet

skal anføres: ...

Som valgf ri gruppe Z" kan eksempelvis hevnes:"" en mettet eller

umettet åpenkjedet eller cyclisk hydrocarbonrest som:også kan være avbrutt av heteroatomer. Denne rest kan dessuten være substituert,

f.eks. med haiogenatornet eller frie eller"funksjonelt avledede keto-,

hydroxy-, carboxyl- eller aminogrupper. Ifølge foreliggende opp-

finnelse er særlig også slike hydroca r bon.rest ..er egnet - som er substi-

tuert med cycliske hydrocarbonrester , eller,, rester som er ..i stand tii å undergå ringslutningsreaks joner under dannelse ■■ av .kondenserte ringsystemer, eksempelvis kan her nevnes:

hvor W er et hydrogenatom eller fortrinnsvis en alkyl- eller acyl-gruppe. Disse grupper kan ytterligere være substituert eller avbrutt av heteroatomer...f;

Z er en valgfri, enzymatisk foranderlig gruppe enten er bundet direkte til. C. 'oller også. bundet t il, C., over en met hy len gruppe .

For den enzymat isk, foranderlige -gruppe ;i gruppen Z kan eksempelvis nevnes de i nedenstående tabell, spalte 1, oppførte grupper. Som det fremgår derav, kan den enzymatisk foranderlige..gruppe' også

være Z selv. I løpet av det enzymatiske reaksjonstrinn forandres Z ifølge oppfinnelsen til Z<*>. For å lette forståelsen av foreliggende oppfinnelse er i nedenstående tabell de enzymatisk foranderlige grupper ifølge spalte 1 stilt overfor de derav dannede grupper av gruppen Z* (spalte 2). Spalte 3 i tabellen belyser ytterligere den tilsvarende mikrobiologisk mulige :reaksjonstype.■

; Deri' enzymatisk foranderlige gruppe i gruppen Z kan stå i ende-stilling eller midt st il ling. I det tilfelle den står i midt-stilling, kan den gjenblivende endéstilte rest være et hydrogenatom eller en hvilken som helst organisk rest. Som gjenblivende organisk rest kan eksempelvis nevnes: en fortrinnsvis lavere mettet, umettet ellér; forgrenet alkylgruppe: som"-også kan være substituert med halogen, -hydroxyl, araino eller carboxyl "i fri eller' funksjonelt endret forni. Begge-gruppene Z kan imidlertid også éammen utgjøre en cyclisk - gruppe, og som foretrukken cyclisk gruppe kan nevnes: hvor C. er det optisk inaktive carbonatom, Q er -CP^-Ct^- eller. - CH^-) °g den enzymatisk foranderlige gruppe V er en ketogruppe i fri form eller i form av et oxim, hydrazon eller semicarbazon (av den selektivt foranderlige V fåes V<*>).

Som bekjent inneholder mange forbindelser som er verdifulle

som virkestoffer eller som mellomprodukter i legemiddelkjemien, ett eller flere asymmetriske carbonatomer. Eksempelvis kan nevnes-: cocain, 1-tropassyren av 1-hyoscyamin og scopolamin, a-aminosyrer, steroidhormoner, steroidalkaloider, hjerteglycosider, substituerte malonsyreesterderivater , 1,3,5(10) ,8(9) , l^-øst rapentaen-3 ,17(3-diol - 3-methylether. Fagmannen vet at spesielt den tekniske syntese av.-optiske antipoder av disse virkestoffer, respektive syntesen av , . egnede optisk aktive mellomprodukter for fremstilling av disse forbindelser ved anvendelse av rent kjemiske arbeidsmetoder vanskelig-gjøres i vesentlig grad ved de vanskeligheter og de uunngåelige ut-byttetap på minst 50% av det teoretiske ved racematadskillelse.

I de tilfelle ved hvilke der under syntesen ikke bare dannes ett men fleré optisk aktive sentrer, blir de nevnte vanskeligheter enda mere komplisert. På grunn av dette er den tekniske fremstilling av optisk aktive farmasøytika st erkt .begrenset .

Renfremstilling av en av de optisk aktive antipoder har imidlertid nettopp derved stor interesse, da nesten alltid bare én enantiomer, respektive diastereomer form har den ønskede farmakologiske virkning, og racematet viser derfor som regel høyst den halve virksomhet. Den motsatte form kan dessuten også ha uønskede bivirkninger.

Ved foreliggende fremgangsmåte overvinnes nu de nevnte vanskeligheter ved at man under syntesegangen ved opptreden av et mellom-produkt med to likeverdige substituenter sjalter inn et enzymatisk reaksjonstrinn hvorved bare én av de to like grupper Z omvandles enzymatisk og selektivt til Z' (respektive V til V), hvorved samtidig et inaktivt carbonatom C. overføres til et optisk aktivt carbonatom C 3ved en optisk aktiv antipode. I løpet av det enzymatiske reaksjonstrinn kan carbonatomet i gruppen Z, ved hvilken den enzymatiske reaksjon finner sted, selv også bli et asymmetrisk carbonatom av en optisk aktiv antipode. Det selektive angrep på bare én av de like reaksjonsdyktige grupper i gruppen Z ved det anvendte fermentsystem var i høyeste grad overraskende. Derved blir det mulig å overføre et fra reaksjonssentret fjernet optisk inaktivt carbonatom til et optisk aktivt carbonatom. Overraskende nok oppstår derved alt efter reaksjonsbetingelsene de spesielt ønskede optisk aktive antipoder, hvilket betyr et vesentlig fremskritt ved den tekniske fremstilling av disse kompliserte oppbyggede forbindelser.

Ved utførelse av det enzymatiske reaksjonstrinn er spesielt de utgangsmaterialer egnet hvis gruppe Z inneholder en ketogruppe, til hvis selektive, enzymatiske reduksjon fermentsystemer er anvendbare, fortrinnsvis mugg, f.eks. Aspergillus ochraceus, Aspergillus niger, PeniciUium notatum eller gjær, som f.eks. Saccharomyces uvarum, Saccharomyces cerivisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces postorianus eller bakterier, som f.eks. Bacillus esterificans , Bacillus laterosporus, Brevibacterium vitarumen, Propionobacterium årabinosum, Protaminobacter alboflavus, Mesentericus spee, Mycoplana dimorpha, Bacillus thuringiensis.

Likeledes egnet er selvsagt de fra disse mikroorganismer isolerte enzymer.

Valget av den egnede mikroorganisme og de egnede fermenterings - betingelser for det enzymatiske reaksjonstrinn ifølge oppfinnelsen, er for det første avhengig av om det endelig ønskede fremgangsmåte-produkt skal foreligge i d- eller l-form og for det annet av typen av den ved fremgangsmåten endrede gruppe Z i utgangsproduktet, respektive dens variant V. Mikroorganismer og fermenteringsbetingelser finnes ved hjelp av et forforsøk som er rutinemessig for en fagmann som er fortrolig med enzymatiske reaksjoner.

En foretrukken anvendelse finner foreliggende stereospesifikke fremgangsmåte på steroid-totalsynteseområdet for fremstilling av virksomme steroidforbindelser og spesielt for fremstilling av egnede mellomprodukter som så kan forarbeides videre ved kjente arbeidsmetoder til de forskjelligste steroidhormoner. På steroidområdet. Oppstår' ra c erna fet' for det meste ved sterisk uspesifikt forløpende ringslutnihgsreaksjoner ved dannelse av et asymmetrisk C-atom 13 som eksempelvis kan illustreres ved følgende prosesskjema:

Reaksjonens uspesifisitet er i dette eksempelvise angitte

skjema å tilbakeføre til likeverdigheten av begge ketogrupper.

Utgangsmateriålet I er på den ene side i formen a) i stand til sur dehydratisering av l4-ketogruppen med begge H-atomer på C-atom 8»

og gir da den' ønskede 1,3,5(10),8(9),14-østrapentaen-3-ol-17-on-3-methylether, og på den annen side kan forbindelsen I også reagere i formen b), som kan dannes ved dreining av cyclopentanringen 180° om den fritt bevegelige akse C-12-C-13, idet dessuten ringslutningen ;;i formelt kommer i stand ved avspaltning av 17-kstogruppen med de to <* >C-8-H-atomer.

For fremstilling av ønskede forbindelser med rasjonelle utbytter var man derfor for det meste tvunget til å anvende den såkalte partialsyntese, dvs. man går ut fra slike naturlig forekommende mellomprodukter hvori den til slutt ønskede konfigurasjon allerede foreligger.

Ved anvendelse av foreliggende fremgangsmåte ved rasjonell totalsyntese av optisk aktive steroider er det hensiktsmessig å gå ut fra slike produkter i hvilke D- eller D-homoringen av den til slutt ønskede steroidforbindelse allerede er fordannet i utgangs-mat erialet.

En spesiell utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er så-ledes en fremgangsmåte ved fremstilling av optisk aktive antipoder av den generelle formel: hvor c , X og Y er som ovenfor angitt, V er en ketogruppe i fri form eller i form av et oxim, hydrazon eller semicarbazon, V er ^CH-OH eller - men ikke samtidig med V-en ketogruppe, og Q er -CHg-CH-eller - CH^-, idet fremgangsmåten er karakterisert ved at en forbindelse med den generelle formel:

hvor x, Y, Q, og V er som ovenfor angitt, fermenteres med bakterie-, gjær- eller soppkulturer eller derav isolerte enzymer.

Særlig verdifulle mellomprodukter i løpet av totalsyntesen ved fremstilling av steroidforbindelser, er spesielt 3-etheren av 13(3-X-8(l4)-seco-l,3,5(lO) ,9( H)-øst ratet raen-3 , l7p-diol-14-on og 13(3-X-1,3,5(10) ,8(9) ,l^-5*strapentaen-3,17p-diol, da disse er særlig egnet for videre opparbeidelse til de som steroid grunnmaterialer kjente viktige østron- og østradiol-derivater. Dermed er foreliggende stereospesifikke fremgangsmåte spesielt også en elegant fremgangsmåte ved fremstilling av optisk aktive antipoder med ett eller flere asymmetrisentrer av den generelle formel:

hvor C 3, X og Q er som ovenfor angitt , og Y er hvor W er hydrogen eller alkyl, idet fremgangsmåten er karakterisert ved at en forbindelse med den generelle formel:

hvor , X, Y og Z er som ovenfor angitt, fermenteres med bakterie-, gjær- eller soppkulturer eller med derav isolerte enzymer.

Alt efter valg av fermenteringssystemet og fermenteringsbe-tingelsene får man såvel substituenten -X som eksempelvis den i 17-stilling værende hydroxylgruppe i a- eller |3--konf iguras jon. Med henblikk på totalsyntesen av hormonvirksomme stéroidforbindelser er det av særlig betydning når disse substituenter foreligger i p-kon-figurasjonen. Til fremstilling av disse forbindelser er særlig gjær av klassen Saccharomyces, fortrinnsvis Saccharomyces uvarum

(CBS 1508) eller derav isolerbare enzymer egnet.

Den kjemiske omvandling av en 8(14)-secoforbindelse kan f.eks. forklares ved følgende reaksjonsskjerna:

Som allerede nevnt til å begynne med, er foreliggende fremgangsmåte imidlertid ikke begrenset bare på totalsyntetisk fremstilling av virksomme steroidforbindelser, respektive deres verdifulle mellomprodukter. Som nedenstående formelskjema eksempelvis viser, kan man ved foreliggende fremgangsmåte fremstille:

1) g- aminosyre- syntese:

De efterfølgende eksempler vil belyse optpfinnelsen ytterligere.

Eksempel 1

Fremstilling av 3-methoxy-8(14)-seco-1,3,5(10),9(11)-øst ratet raen-l4a-ol-l7-on (13p-meth<y>l-l4a-OH-SM, lik 13a-methyl-17(3-OH-SM,) ved fermentering med mugg

a) Reduksjon av 3-methoxy-8(14)-seco-1,3,5(IO),9(11)-øst rat etraen-l4»17- dion ( SM) med Aspergillus ochraceus ( CBS - Dahme-)

(Fermentering med muggstamraen i rystekolben)

En 2 1 Erlenmeyerkolbe med 500 ml næringsoppløsning bestående av

3% glucose O, 1% KH2PO^

1% maisstøpvæske 0,05% MgSO^ "

0,2% NaN03 0,05% KC1

0,2% K2HPO^ 0,002% FeSO^

steriliseres ved opphetriing i 1/2 time ved 120°C og podes efter av-kjøling med en suspensjon av Aspergillus ochraceus (CBS), som fåes ved avspyling åv skrå-agarkultur med fysiologisk koksaltoppløsning.

Denne forkultur rystes i 2 dager ved 30°C med et svingetall på 145 omdr. pr. min., overpodes så 50 ml's porsjoner av kulturen i 10 2-liters fermenteringskolber som hver inneholder 450 ml av den samme næringsoppløsning, ryster dem i 6 timer ved 30°C, tilsetter hver kolbe under sterile betingelser 5 ml av en 2%-ig ethanolisk SM-oppløsning og fermenterer videre i 24 timer.

Fermenteringsforløpet følges ved hjelp av tynnskiktskromatografi. I denne hensikt påføres silicagelplater ifølge Stahl methyl-isobutylketon-ekstraktene av fermenteringsprøvene, platen utvikles over 15 cm eluer ingsflat e i systemet kloroform-aceton 9 + 1> på-sprøyt es et reagens av 1 ml konsentrert svovelsyre og 20 ml 95%-ig ethanol, tørres i IO minutter ved l40°C og betraktes i langbølget UV-lys.

SM R„ 0,92 Farve: rødgul 13(3-methyl-l4a-OH-SM, og 17a-0H-SM.. Ri. 0,72 Farve: rødgul 13P-methyl-l4(3-OH-SM7 og 17P-0H-SM7 R„ 0,63 Farve: grønngul

De forenede fermenteringssatser ekstraheres med 2 x 2500 ml

methyl-isobutylketon, og ekstraktet inndampes ved 45°C badtemperatur i vakuum til ca. 5 ml. Man renser konsentratet ved preparativ tynnskiktskromatografi under anvendelse av silicagel GF2^ som absorbens og benzen-eddikester 9+1 som elueringsmiddel.

Den i kortbølget UV-lys synlige hovedsone (med Rp.-verdi på. ca. 0,4) fraskilles, elueres med lOO ml methylenklorid ved værelsetemperatur, eluatet inndampes-ved 25°C badtemperatur, og residuet omkrystalliseres fra 10 deler diisopropylether.

Man får 13P-methyl-l4a-OH-SM,; smp. 101^102° - 103,5°C aD 20 =+47,8 o (dioxan, c=l); 6264 <=><20>-900

b) Reduksjon av SM med Aspergillus niger ( ATCC 9142)

13|3-methyl-l4a-OH-SM1 kan fåes under lignende eksperimentelle

betingelser som beskrevet i eksempel la og ved fermentering med Aspergillus niger (ATCC 9142).

c) Reduksjon av SM med Rhizopus nigricans ( ATCC 6227b)

13p-methyl-l4a-OH-SM1 kan ved de samme eksperimentelle betingelser som beskrevet i eksempel la, fåes ved fermentering med Rhizopus nigricans (ATCC 6227b).. ;

d) Reduksjon av SM med Penicillium notatum ( NRRL 2284)

Under de samme eksperimentelle betingelser som i eksempel la

kan man ved fermentering av SM med Penicillium notatum (NRRL 2284) fremstille 13(3-methyl-l4a-OH-SM± .

Eksempel 2

Fremstilling av 133- methyl- l4a- OH- SMx ved fermentering med gjær

a) Reduksjon av SM med Saccharomyces cerevisiae ( NRRL Y- 2250)

(Fermentering med gjær i rystekolbe.)

En 2 1 Erlenmeyerkolbe med 500 ml næringsoppløsning av 5% glucose og 2% kornstøpvæske steriliseres og podes så med en suspensjon av Saccharomyces cerevisiae (NRRL Y-225.0) erholdt ved vasking av en skrå-agarkultur med fysiologisk koksaltoppløsning. Man ryster forkulturen 1 dag ved 30°C og et svingetall på 145 omdr. pr. min., overfører 50 ml<*>s porsjoner av kulturen i.fire 2 1 fermenterings-• kolber som hver inneholder 450 ml av den samme næringsoppløsning, ryster disse 6 timer ved 30°C, tilsetter hver kolbe 5 ml av en 2%-ig ethanolisk SM-oppløsning•og fermenterer videre i 20 timer. Fermenteringssuspensjonen opparbeides så som i eksempel la.

Man får 130-methyl-l4a-0H-SM1; smp.'101^102° - 104°C

= +46,2° (dioxan; c=l) , * 26l+ = 21'000

b) Reduksjon av SM med Saccharomyces cerevisiae ( NCYC 1021)

Under de i eksempel 2a beskrevne betingelser.kan man fra SM ved

fermentering med Saccharomyces cerevisiae (NCYC 1021) fremstille 130-methyl-l4a-OH-SM1.

c) Reduksjon av SM med Saccharomyces carlsbeigensis ( CBS ! 5o5)

Under de i eksempel 2a beskrevne betingelser kan mån av SM ved

fermentering med Saccharomyces carlsbergensis (CBS 1505) fremst ille 13p-methyl-l4a-OH-SM1.

d) Reduksjon av SM med Saccharomyces pastorianus [-(Inst . tf . GHr-urigsgewerbe) Berlin; Kop. 33]

Under de samme betingelser som i eksempel 2a beskrevet, men med en fermenteringstid på 40 timer kan man av SM ved fermentering med Saccharomyces pastorianus fremstille 13(3-methyl-l4a-0H-SM^.

Eksempel 3

Fremstilling av r3P- methyl- l4a- OH- SM- L ved fermentering med bakterier

a) Reduksjon av SM' med«Bacillus esterificans ( BBA - Berlin-)

(Fermentering med bakterier i rystekolbe)

En 2 1 Erlenmeyerkolbe med 500 ml næringsoppløsning av 0,5% glucose, 0,5% gjærekstrakt, 6,2% maisstøpvæske og 0,1% pepton (Merck) steriliseres og podes så med en suspensjon av Bacillus esterificans erholdt ved vaskning av en skrå-agarkultur med fysiologisk koksalt-oppløsning. Man ryster forkulturen 1 dag ved 30°C og et svingetall på 145 omdr. pr. min., overfører 50 ml's porsjoner av kulturen i fire 2 1 fermenteringskolber, som hver inneholder 450 ml av den samme næringsoppløsning, ryster disse i 4 timer ved 30°C, tilsetter hver kolbe 5 ml av en 2%-ig ethanolisk SM-oppløsning og fermenterer videre i 20 timer.

Ferment er ingssuspens jonen opparbeides som beskrevet i eksempel la.

Man får 13P-methyl-l4a-0H-SM1; smp. 101°A020 - 104°C.

b) Reduksjon av SM med Bacillus laterosporus ( ATCC 4517)

Under de eksperimentelle betingelser beskrevet i eksempel 3a,

men med en fermenteringstid på 44 timer, kan man ved fermentering med Bacillus laterosporus (ATCC 4517) fremstille 13|3-methyl-l4a-0H-SM1.

c) Reduksjon av SM med Brevibacterium vitarumen ( ATCC 10234)

Under de i eksempel 3a beskrevne betingelser kan SM ved fermentering med Brevibacterium vitarumen (ÅTCC 102.34) reduseres til 13(3-methyl-lifa-OH-SMj^.

d) Reduksjon av SM med Propionibacterium arabinosum ( ATCC 4965)

Fra SM kan man under de i eksempel 3a beskrevne betingelser ved

fermentering med Propionibacterium arabinosum (ATCC 4965) fremstille 13P-methyl-l4a-0H-SM1.

e) Reduksjon av' SM med Protaminobacter alboflavus ( ATCC 8458)

Under de i eksempel 3b angitte betingelser kan man av SM ved

fermentering med Prdtaminobactér alboflavus (ATCC 8458) fremstille 13(3-methyl-l4a-OH-SM1 • f) Reduksjon av SM med Mesentericus spee. (Robert-Koch-Inst., Berlin) .

Fra SM kan man under de i eksempel 3a angitte betingelser ved fermentering med Mesentericus spee.. (Robert-Koch-Inst. , Berlin) få 13p-methyl-l4a-OH-SM1.

g) Reduksjon av SM med Mycoplana dimorpha ( ATCC 4279)

Under de i eksempel 3b angitte betingelser kan man fra SM ved

fermentering med Mycoplana dimorpha (ATCC 4-279) fremstille 13p-methyl-l4a-0H-SM1 •

h) Reduksjon av SM med Bacillus thurjngiensis ( BBA - Darmstadt-)

(Fermentering med bakterier i f erménteringsapparat)

Et f erménteringsapparat av rustfritt stål. med 50 liters kapasitet inneholdende 36 1 næringsmedium av 6,5% glucose, 6,5% gjærekstrakt, 6,2% maisstøpvæske og 0,1% pepton (Merck), steriliseres ved opphetning i 1/2 time ved 126°C og podes med 1 liter av en dag gammel rystekultur av Bacillus thuringiensis (BBA -Darmstadt-).

(Inokulumet fåes under de samme betingelser som beskrevet for dyrkningskolben i eksempel 3a.) Efter en dags formering ved 29°C under omrøring (220 omdr...pr. min.) og luftning (1,65 mr/h) overføres 1,8 1 av kulturen under sterile betingelser i et like stort f erménteringsapparat med 28 1 av den samme næringsoppløsning. Efter 6 timers dyrkning under røring og luftning som ovenfor,, tilsettes siliconolje SH + 5% smultolje som antiskumningsmiddel og en oppløsning av 15,0 g SM i 800 ml ethanol, og det fermenteres videre i 16 timer. Derpå ekstraherer man fermenteringssuspensjonen med .2 x 15 ml methyl-isobutylketon, inndamper ekstraktet ved 45°C badtemperatur i vakuum til en sirup og oppløser denne i 150 ml isopropylether. Efter 20 timers henstand ved 0°C avsuges de utskilte krystaller, vaskes med litt iskold.isopropylether og tørres i vakuum ved 6o°C.

Utbytte: 13,1 9 13(3-methyl-l4a-0H-SM1 '= 87% av det teoretiske.

Smp. 98°/99° = 100°C.

Forbindelsen kan ved omkrystallisering av fire deler alkohol renses videre.

i) Reduksjon av SM med Protaminobacter alboflavus ( ATCC 8458)

Ved de i eksempel 3h. angitte betingelser kan SM bare reduseres , vidtgående med Protaminobacter"alboflavus (ATCC 8458) når mari

20 timer efter subst rat-tilsetningen avstenger lufttilførselen helt

og derpå fermenterer, videre i 20 timer. For å isolere det dannede 13p-methyl-l4a-0H-SM1 i. er .det nødvendig å løse konsentratet av rå-ekstraktet i methylenklorid og filtrere det over én med 10% vann desaktivert silicagelsøyle og derpå som beskrevet, krystallisere eluatet fra diisopropylether..

Eksempel 4

Fremstilling av 3-methoxy-8(14)-seco-1,3,5(10),9(11)-østratetraen- 173 - ol - l4 - on ( 133 - methyl - lyp - OH - SM .^ ) ved fermentering med gjær

a) Reduksjon av SM med Saccharomyces ellipsoides (Stamm Tokayer S 22, Berlin)

Under de i eksempel 2a beskrevne betingelser kan SM reduseres med Saccharomyces ellipsoides (Stamm Tokayer S 22, Berlin). Det ved

preparativ tynnskiktskromatografi erholdte råprodukt omkrystalliseres to.ganger fra ca. 1G deler diisopropylether og gir 133-méthyl-17p-OH-SM1.

Smp. 110°/112° 114°C aD = -39,2° (dioxan, c=l)

C264 = 20-800

b) Reduksjon av SM med Saccharomyces pastorianus (Inst. f. Garungs-gewerbe, Berlin Kop. 127)

Under de i eksempel 2a beskrevne betingelser kan man av SM ved fermentering med Saccha romyces . pastor ianus fremstille 13(3-methyl-17(3-OH-SM-l-c) Reduksjon av SM med Saccharomyces carlsbergensis ( CBS 2354)

Under de i eksempel 2a beskrevne forsøksbetingelser kan man av

SM ved fermentering med Saccharomyces carlsbergensis (CBS 2354) fremstille 138-methyl-173-OH-SMj^.

d) Reduksjon av SM med Saccharomyces uvarum ( CBS 1508)

(Fermentering med gjær i fermenteringsapparat)

Et ferménteringsapparat av rustfritt stål med 5o 1 kapasitet inneholdende 30 1 næringsoppløsning av 5% stivelsessukker og 2% mais-støpvæske steriliseres ved 1/2 times oppvarmning ved 120°C og podes med 1 liter av en 1 da^ gammel rystekultur av Saccharomyces uvarum (CBS 1508)•

(Inokulumet fremstilles under de samme betingelser som beskrevet for dyrkningskolbén i eksempel 2a.) Efter 1 dags formering ved 29°C under omrøring (220 'omdr. pr. min.) og luftning (1,65 m /h) overførés 1,8 1 av kulturen under sterile betingelser i et like stort ferménteringsapparat med 28 1 av deri samme næringsoppløsning. Efter 6 timers dyrkning under' røring og luftning som ovenfor tilsettes siliconolje SH + 5% smultoljé som antiskumningsmiddél og en oppløs-ning av 45,0 g SM i 800 ml ethanol, og det fermenteres videre i 19 timer. Derpå ekstraherer mån f erment eringssiispensjorien 2 x 15 1 methyl-isobutylketon, inndamper ekstraktet ved 45°C badtemperatur i vakuum til en sirup, tilsetter denne 400 ml diisopropylether og lar den erholdte oppløsning stå i 16 timer ved 0°C.

De érholdte krystaller,'avsuges ,. vaskes med 25 ml iskdld diisopropylether og tørres i vakuum ved 6o°C; Utbytte: 31,8 g 133 methyl-17P-OH-SM1 = 71% av det teoretiske.

Smp. 106°/108° - 109°C aD° = -34,5° (dioxan, c=l)

£264 = 20'100

Forbindelsen kan renses ytterligere ved omkrystallisasjon fra

4 deler ethanol.

Eksempel 5

Fremstilling av 130-methyl-173-OH-SM, ved reduksjon av SM med Curvularia lunata ( NRRL 2434)

(Fermentering med mugg i ferménteringsapparat)

Et ferménteringsapparat av rustfritt stål med 50 1 kapasitet inneholdende 30 1 næringsoppløsning av

3% glucose 0,1% KH2P0^

1% maisstøpvæske 0,05% MgSO^

0,2% NaN03 0,O5% KC1

0,2% K^HPO^ 0,002% FeSO^

steriliseres ved en 1/2 times oppvarmhing ved "!20°C og podes med 1 liter av en 2 dager gammel rystekultur av Cu:cvularia ;l.unata

(NRRL 2434)•

(Inokulumet fremstilles under de samme betingelser. som beskrevet for dyrkningskolbén i eksempel la), Efter 2 dagers formering ,yed -29°C under omrøring (220 omdr. pr. min.) og luftning (1,65 m3/h).over-føres 3 liter av kulturen under sterile betingelser til et like stort férmenteringsapparat inneholdende 27 liter av den samme næringsopp-.

løsning.

Efter 16 timers dyrkning under - omrøring og luftning som ovenfor, tilsettes "Pluronic L 81" som antiskumningsmiddél og en oppløs-ning av 6,0 g SM i 450 ml ethanol, og det fermenteres videre; i 20 timer. Derpå ekstraherer man fermenteringssuspensjonen 2 x 15 1. methyl-isobutylketon, inndamper ekstrakten ved 45°C badtemperatur i vakuum til en sirup, skiller denne ved søylekromatografi over 200 g med 10% vann desaktivert silicagel som absorbens og carbontetraklorid-methylenkloridblanding som elueringsmiddel.

Den 13(3-methyl-17P-OH-SM-^-holdige fraksjon inndampes og omkryst a lliseres efter inndampning fra isopropylether.

Eksempel 6

Fremstilling av 3-methoxy-8(14)-seco-1,3,5(10),9(11)-øst rat et ra en-17a-ol-l4-on (13(3-methyl-17(3-OH-SM^ ved reduksjon av SM med Arthrobacter simplex ( ATCC 6946)

Under de i eksempel 3i beskrevne betingelser fermenteres SM med Arthrobacter simplex.

Man får et krystallisat med smeltepunkt 91°/92° - 95°C,

aD = -l6° (dioxan; c=l).

Dette renses ved flere gangers fraksjonert krystallisasjon fra isopropylether og fra ethanol.

Man får 13P-methyl-17p-OH-SM]L .

Smp. 100°/101° - 102°C a<20> = -44,3° (dioxan, c=l)

&264 = 20•600

Eksempel 7

3- methoxy- l , 3, 5( 10) , 8, l4- østrapentaen- 17| 3- ol <C>19H22<0>2 ( 282'37)

30,04 g (0,100 mol) 13P-methyl-17p-0H-SM1 kokes 2,5 timer i

42 ml methanol og 84 ml methylenklorid med 0,81 ml konsentrert saltsyre under tilbakeløp. Oppløsningen helles så i 85 ml vann, den organiske fase fraskilles, og den vandige fase ekstraheres nok to ganger med methylenklorid. De forenede organiske faser vaskes nøy-trale med bicarbonatoppløsning og vann.og tørres. Efter avtrekning av oppløsningsmidlet i vakuum og omkrystallisasjon fra ethanol, får man 21,00 g (74,4%) 3-methoxy-l, 3 , 5.(IO) , 8 , l4-øs-t rapent aen -17(3-ol , <smp.><1>07 - 109°C, a<20> = -141° (c=T, CHC13)

Forbindelsen er identisk med 3-methoxy-1,3,5(10),8,14-østra - pentaen-173-ol som er utvunnet ved racematspaltning av racemisk materiale, med hensyn til smeltepunkt, dreining og alle spektra: såvel som gass- og tynnskiktskromatografi.

Eksempel 8

3-methoxy-l ,3, 5 (IO) ,8-øst rat et ra en-173-ol S9H24°2 (28Z*'38).

.58,00. g (0,205 mol) 3-methoxy-1,3,5( 10) , 8 , l4-øst rapentå en —173 - ol hydreres med 8,2 g forhydrert 5%-ig palladium/calciumcarbohat i 200 ml benzen og 200 ml tetrahydrofuran. 482C) ml hydrogen (95% av det teoretiske) opptaes i løpet.av 50 minutter. Katalysatoren filtreres fra oppløsningen. Efter avdampning av oppløsningsmidlet i vakuum og omkrystallisasjon fra ethanol får man: 39,80 g (68,2%) 3-methoxy-l,3,5(10),8-østratetraen-173-ol. ,

Smp. 123° - 126°C, a? 0 -7,1° (c=l, CHC13) ..

Eksempel 9

3- methoxy- l, 3, 5( 10)- østratrien- 173- ol (" Østradiolmethylether")

11,35 g (0,040 mol) 3-methoxy-l,3,5(10),8-østratetraen-173-ol oppløses i 120 ml absolutt tetrahydrofuran og tilsettes ved -50°C til en oppløsning av lOO mg lithium i 120 ml flytende ammoniakk og 9,9 ml anilin. Ved den samme temperatur tilsettes porsjonsvis 34o mg lithium og der omrøres i ytterligere 10 minutter. Derpå tilsettes 0,72 ml" vann i 12 ml tetrahydrofuran, hvorved oppløsningen blir klar. Efter tilsetning av ytterligere 0,59 9 lithium omrøres i ytterligere 20 minutter, :og oppløsningen avfarves så med ammoniumklorid. Efter avdampning av ammoniakken tilsettes vann, det organiske oppløsningsmiddel avtrekkes vidtgående i vakuum, og den gjenværende blanding ekstraheres med methylenklorid. De forenede methylenkloridoppløsriinger vaskes anilinfrie med ln saltsyre og vaskes nøytrale med bicarbonat-oppløsning og vann. Efter tørring av oppløsningen, avtrekning av oppløsningsmidlet i vakuum og omkrystallisasjon fra ethanol får man 8,5 g (74,0%) 3-methoxy-l,3,5(10)-østratrien-173-ol ("Østradiolmethylether") . • •

Smp. 114° - 116°C, a<20>:= +72°..:. ' Forbindelsen er identisk med østradiolméthyléthér utvunnet fra natur-, lig materiale med hensyn , til smeltepunkt , dreining og alle spektra såvel som gass- og tynnskiktskromatogram.'

Eksempel IO

3-methoxy-1,3 ,5 (10) ,8 ,l4-øst rapentaen-17 8- ol - acetat <c>2i<H>2U°3 ( 32Zf

5,00 g (0,0167 mol) 13p-methyl-l7p-OH-SM1 behandles i 15 timer

i pyridin ved værelsetemperåtur med 30 ml acetahhydrid. Reaksjons-, blandingen helles så i saltsyre, ekstraheres med methylenkloridopp-løsning, og de forenede methylenkloridfaser vaskes nøytrale med ln saltsyre, bicarbonatoppløsning og vann. Den efter tørring og avtrekning av oppløsningsmidlet i vakuum tilbakeværende olje taes opp i 800 ml benzen og kokes i 15 minutter i en vannutskiller med 2^8 g P-. toluensulfonsyre. Efter avkjøling vaskes nøytralt med bicarbonat-oppløsning og vann. Tørring og avtrekning av oppløsningsmidlet gir: 4,89 g (90,5%) 3-methoxy-l,3,5(10),8,l4-østrapehtaen-178-ol-acetat. Smp. 79° - 82°C, a<20> -180°

I gasskromatogram er denne forbindelse 98%-ig og kan anvendes til hydrering til 3-methoxy-1,3,5(10) ,&-østrat etraen-l7P-ol-acetat.

Til sammenligning med acetatet av 3-methoxy-l,3,5(10),8,14-øst rapentaen-17P~ol fra racematspaltningen av racemisk materiale, omkryst a lliser es fra ethanol. Man får: 3,60g {56,6%) 3-methoxy-l, 3 , 5(10) ,8 , l4-østrapentaen-176-ol-acetat.

Smp. 86° - 87°C, a<20> ='-188°

Disse data såvel som spektra og kromatogrammer er identiske med dem for det ved racematspaltning erholdte acetat.

Eksempel 11

3-methoxy-l,3,5(10),8-østratetraen-17p-ol-acetat C21H26<0>3 (<32>6,41)

Urent 2,40 g (0,0074 mol) 3-methoxy-1,3,5(10),8,14-østrapentaen-178-ol-acetat hydrerés med 664 mg forhydrert 5%-ig palladium/calcium-carbonat i 8 ml benzen og 8 ml tetrahydrofuran. I løpet av 2 timer opptaes 180 ml hydrogen (97% av det teoretiske). Efter frafiltrering av katalysatoren, avtrekning av oppløsningsmidlet i vakuum og om-krystallisas jon fra ethanol får man:

1,61 g (66,6%) 3-methoxy-l,3,5(10),8-østratetraen-17P-ol-acetat.

Smp. 110° - 113°C, a<2>° = -49° (c=l, CHC13)

Eksempel 12

3- Methoxy- 1, 3, 5( 10) , 8- øst ratetraen- 17p- ol c19^ 2k°2' (2&4,38)

2,70 g (0,0083 mol) 3-methoxy-1 ,3,5(lo) , 8-østratetraen-17B-ol - acetat røres ved værelsetemperatur i 3 timer i 50 ml ln methanolisk

kalilut. Derved løser forbindelsen seg fullstendig. Ved avkjøling av oppløsningen faller produktet ut.. Fellingen gjøres fullstendig med-100 ml isvann. Man får:

2,14 g (95,1%) 3-methoxy-l,3,5(10),8-østråtetraen-178"61.

Smp. 125° - 127°C, a2° = -7,9° (c=l, CHC13)

Forbindelsen er altså identisk med det ved hydrering av 3~ methoxy-1 ,3 ,5(10) ,8,14-østrapentaen-178-ol erholdte.

Eks empe1 13

3-methoxy-l,3,5(10),8,l4-østrapentaen-176-ol <c>i9<H>22°2 (<2>82>37)

150 mg (0,00046 mol) 3-methoxy-1,3,5(10),8,14-østrapentaen-173-ol-acetat omrøres i 3 ml methanolisk ln kalilut i 3 timer under nitrogen. Forbindelsen oppløses derved litt efter litt. Under is-avkjøling syres med 0,6 ml konsentrert saltsyre og felles med 2,4 ml vann. Man får efter fornyet omkrystallisasjon fra ethanol/vann: 107,5 mg (82,5%) 3-methoxy-l,3,5(10) ,8,l4-østrapentaen-173-ol.

Smp. 101° - 102°C, a20 -135° (c=l, CHC13)

Eksempel 14

3- methoxy- 13a- 1, 3, 5( 10), 8, 14- østrapentaen- 170- ol- acetat C21H24°3 (~2^)

2,00 g (0,067 mol) 138-methyl-l4a-OH-SM1 (lik 13a-methyl-170-OH-SM^) behandles i 16 timer ved værelsetemperatur i 20 ml pyridin med 12 ml acetanhydrid. Reaksjonsmassen helles derpå i vann, ekstraheres med methylenklorid, og de forenede methylenkloridfaser vaskes nøy-trale med saltsyre, bicarbonat og vann. Efter tørring og avdrivning av oppløsningsmidlet i vakuum blir den oljeaktige, ikke krystalliser-bare rest oppløst i 50 ml benzen og kokt med 120 mg p-toluensulfonsyre i IO minutter i en vannutskiller. Efter fortynning med ether vaskes nøytralt med vann og bicarbonat, oppløsningen tørres og opp-løsningsmidlet drives av i vakuum. Omkrystallisasjon fra ethanol gir: <1>,83 g (84,7%) 3-methoxy-l3a-1, 3 ,5(10),8,14-øs trapentaen-170-ol-acetat.

Sm<p.> 127° - 129°, a<20> = +183° (c=l, CHCl3)

Eksempel 15

3- methoxy- 13a- l, 3, 5( IQ), 8, 14- østrapentaen- 178-ol ciaH22°2(282»37)

800 mg (0,00246 mol) 3-methoxy-13a-1,3,5(10),8,l4-østrapentaen-178-ol-acetat omrøres i 16 ml ln methanolisk kalilut i 3 timer under

nitrogen. Derved oppløses forbindelsen. Under isavkjøling,:felles med vann og vaskes grundig. Man får: 681, mg (97,6%) 3-methoxy-13a-l ,3 ,.5.(10) ,8 ,l4-østrapentaen-17P-ol. Spaltes over 32°C, a.20 = +199°

Forbindelsen er ifølge alle spektrer og kromatogrammer enhetlig, men spaltes meget lett.

Eksempel 16

3- methoxy- l , 3 , 5 ( 10) , 8 , 14- øst rapent aen- 17a- ol- acetat C2iH2l+ °3 (324,40)

300 mg (0,001 mol) 133-methyl-17a-OH-SM1 behandles i 16 timer ved værelsetemperatur med 3 ml pyridin og 2 ml åcetahhydrid. Reaksjonsmassen helles derpå i vann, ekstraheres med methylenklorid, og de forenede methylenkloridoppløsninger vaskes nøytrale med saltsyre, bicarbonat og vann.. Efter tørring og avdrivning av oppløsningsmidlet blir der igjen en olje, som taes opp i 8 ml benzen og kokes i IO minutter med 18 mg p-toluensulfonsyre. Efter fortynning med ether vaskes nøytralt med vann og bicarbonat, oppløsningen tørres, og opp-løsningsmidlet drives.av. Omkrystallisasjon fra ethanol gir: 244 mg.(70,5%) 3-methoxy-l,3,5(10),8,14-østrapentaen-17g-ol-acetat.

Smp. 126° -127,5°C, a<20> = -197° (c=r, CHC13)

Eksempel 17

3- methoxy - 1, 3, 5 ( 10), 8 , l4~ 0st rapent aen- 17a- ol : C^9H2202 . (282 ,37)

200 mg (0,0O06l8 mol) 3-methoxy-1,3,5(IO) ,8,l4-østrapentaen - 17a-ol-acetat omrøres i 4 ml ln methanolisk kalilut i 3 timer under nitrogen. Forbindelsen oppløses derved fullstendig. Under isav-kjøling felles med vann, bunnfallet frasuges og vaskes grundig.

Man får:

128 mg (73,5%) 3-methOxy-l ,3 ,5(10) ,8 ,l4-østrapentaen-17,a-ol..

Spaltes over 30°C, a<20> = -197° (c=l, CHC13)

Forbindelsen oppbevares kjølig da den spaltes hurtig.

Eksempel 18

3- methoxy ^ 8 , 14- se. co-, 94, l4a- oxido- l, 3 , 5 ( IO) - øst rat rien- 17- on C19H24°3 (300,38)

400 mg (0,00133 mol) 13a-methyl-176-OH-SM1 kokes i 20 ml methanol og 4o ml methylenklorid m'éd 0,4 ml konsentrert saltsyre 1/2 time under tilbakeløp. Efter tilsetning av vann fraskilles det organiske skikt, og vannfasen-ekstraheres med methylenklorid.' De

forenede organiske faser vaskes nøytrale med bicarbonat og vanri, tørres, og oppløsningsmidlet drives av i Vakuum. Man far: 400 mg (100%) 3-methoxy-8,l4-9l,l4a-oxido-l,3,5(IOj-øst rat rien-17-on som er enhetlig tynnskiktskromatografisk. Flere gangers omkrystal-lisas jon fra ethanol gir 45 mg,av forbindelsen.

Sm<p.> 89° - 90°C, a<20> = +41,7° (c=l, CHClg)

Strukturen ble bevist ved IR, UV, NMR og massespekt rum.

Eksempel 19

Fremstilling av 136-methyl-l4a-OH-SM1 ved fermentering med Saccharomyces uvarum ( CBS 1508) ved den hvilende cellemetode

En 30 1 forfermenteringskultur av Saccharomyces uvarum (CBS 1508), fremstilt som i eksempel 4d beskrevet, fra-sentrifugeres. Man vasker den erholdte gjær med destillert vann, sentrifugerer, igjen og suspenderer den i 30 1 destillert vann. 500 ml's porsjoner av suspensjonen fylles i åtte 2 1 Erlenmeyerkolber som lukkes med en vattpropp og rystes med et svingetall på 145 omdr. pr. min. ved 30°C. Efter 4 timer tilsettes pr. kolbe 250 mg SM oppløst i 2,5 ml "Methylcellosolve", og der fermenteres videre i 20 timer. Derpå forenes fermenteringssatsene, ekstraheres med 2x1 liter methyl-isobutylketon, ekstrakten inndampes i vakuum ved 45°C badtemperatur til tørr-het, og residuet krystalliseres én gang fra en benzen-hexanblanding og én gang fra ethanol. Man får 13(3-methyl-l4a-OH-SM1:

Smp. 101°/102° - 103°C, (a) = +45,4° dioxan (c=l)

Eksempel 20

Fremstilling av 13(3-methyl-l4a-0H-SM ved fermentering med Saccharo myces uvarum ( CBS 1508 ) - tørrpulver

Fra en 30 1 forfermenteringskultur av CBS 1508 utvinner man, som i eksempel 19 beskrevet, gjæren ved sentrifugering. Denne suspenderes i 3 1 aceton, suspensjonen røres i 15 minutter, gjæren suspenderes igjen i 3 1 aceton, omrøres, gjæren suges av og tørres i 3 timer i vakuum ved værelsetemperatur.

Det erholdte tørrpulver suspenderes i 30 1 destillert vann, og denne suspensjon anvendes til fermenteringen.

Fermenteringen av SM og opparbeidelsen av satsen følger, som beskrevet i eksempel 19. Man får:

138-methyl-l4a-OH-SM1.

Smp. 100°/102° - 103°C, <a)D = +43° dioxan (c=l)

Eksempel 21

Fremstilling av 133-methyl-l4a-0H-SM1 ved hjelp av en oppløsning av 203- hydroxy - st eroid- dehydrogenase

Til .en bl.anding av 4,4 ml 0,022 molar fosfatpuffer (pH 5,5),

0,7 ml 0,4%-ig DPNH-oppløsning og 0,03 ml av en 1:5 fortynnet suspensjon av 203-hydroxy-steroid-dehydrogenase (fra C. F. Boehringer und SOhne G.m.b.H., Mannheim) tilsettes 1 mg SM i 0,05 ml ethanol, og

der rystes i 15 minutter ved værelsetemperatur. Ved tynnskiktskromatografisk analyse (som i eksempel la) ble som eneste.reaksjonsprodukt påvist 138-methyl-l4a-OH-SM1.

Eksempel 22

.Fremstilling av 138-ethyl-3-methoxy-8(l4)-seco-18-nor-1,3,5(10),9(11)-østratetraen-17p-ol-l4-on (133-ethyl-178-OH-SM1)

Under betingelsene som beskrevet i eksempel 4d fermenteres

15,0 g 138-ethyl-3-methoxy-8(l4)-seco-18-nor-l,3,5(10),9(H)-øst ra - tetraen-l4,17-dion (138-ethyl-SM) med Saccharomyces uvarum (CBS 1508) i 20 timer. Derpå ekstraheres fermenteringssuspensjonen to ganger med 15 1 methyl-isobutylketon, ekstrakten inndampes ved 45°C badtemperatur til eh sirup, og det erholdte produkt omkryst alliseres fra isopropylether. Man får: 133-ethyl-3-methoxy-8 (14) -seco-18-nor-1,3,5(10) , 9( 11) -øst ratet.raen-17B-ol-l4-on

Smp. 85° - 86,5°C, (a)D = +15,2° dioxan (c=l)

Ifølge NMR-spektret er hydroxylgruppen i p-stilling i forhold til 138_e.thylgruppen.

Eksempel 23

Fremstilling av 3-methoxy-8(14)-seco-D-homo-1,3,5(10),9(11)-østra-tetraen-17a8-ol-l4-on (17a p -0H<- (D-homo-SM1))

1,6 g 3-methdxy-8(l4)-seco-D-homo-l,3,5(10), 9 ( H)-østratetraen - l4,17a-dion (D-homo-SM) fermenteres, som beskrevet i eksempel 20., med aceton-tørrpulver fra Saccharomyces uvarum (CBS l5o8), det erholdte råprodukt renses, som beskrevet i eksempel la, ved preparativ. tynn-skiktskromatograf i og omkrystalliseres fra isopropylether. Man får: 3-methoxy-8(14)-seco-D-homo-1,3,5(10), 9(H)-øst rat et raen-17a p-ol-4-on.

Smp. 115<9> 1-16,5°C (a)D = +28,5° dioxan (c=l)

Eksempel 24 Fremstilling av 2-methyl-3-methoxy-8(14)-seco-1,3,5(10),9(11)-østra-tetraen- l4a- ol- 17- on __ :—_ 500. ml *s. porsjoner av.en.suspensjon av Saccharomyces uvarum (CBS 1508) tørrpulver (eksempel 20) fylles i l6 2 1 Er lenmey er kolber, som.lukkes med en vattdott og rystes med et svingetall på 145 omdr. pr. min. ved 30°C.

Efter 1 time tilsettes pr. kolbe 100 mg 2-methyl-3-methoxy-8(l4)-seco-l,3,5(10),9(11)-østratetraen-l4,17-dion (dette hittil ikke beskrevne utgangsmateriale fremstilles på i og for seg kjent vis som følger: 6-methoxy-7-methyltetralin oxyderes med kromsyre til 6-methoxy-7-methyltetralon-l (smp. 102 - 104°C), fra hvilket man efter Grignard-reaksjonen med vinylmagnesiumbromid og påfølgende kondensa-sjon av det dannede "Viscols" med 2-methylcyclopentandion-l,3 får 2-methyl-3-methoxy-8(14)-seco-1,3,5(10),9(11)-øst ratetraen-14,17-dion (smp. 101° - 103°C), og ryster videre i 48 timer. Fermenteringssatsene forenes derpå, ekstraheres med 2x21 methylisobutylketon., ekstrakten inndampes i vakuum ved 45°C badtemperatur, residuet renses ved preparativ tynnskiktskromatografi (eksempel la), og produktet omkrystalliseres fra isopropylether. Man får: 2-methyl-3-methoxy-8(l4)-seco-1,3,5(10),9(11)-østratetraen-l4a-ol-17-on.

Smp. 135° - 137°C, (a)<20> = +47,8° dioxan (c=l)

Ifølge NMR-spektret er hydroxylgruppen i a-stilling med hensyn til 133-methylgruppen.

Eksempel 25

Fremstilling av 4-methyl-3-methoxy-8(14)-seco-1,3,5(10),9(11)-østra-t et r aen- 17 3- ol- 14- on

30 1 av en suspensjon av Saccharomyces uvarum (CBS 1508) tørrpulver (eksempel 20) omrøres i et ferménteringsapparat av rustfritt stål ved 30°C ved 200 omdr. pr. min. og luftes med 300 1 luft pr. time. Man tilsetter 3,0 g 4-methyl-3-methoxy-8(14)-seco-1,3,5(10) ,9(H)-østratetraen-l4,17-dion (dette hittil ikke beskrevne utgangsmateriale fremstilles på i og for seg kjent vis som følger: 5-methyl-6-methoxy-tetralon-l underkastes Grignard-reaksjohen med vinylmagnesiumklorid, og dét derved dannede tilsvarende "Vinol" kon-denseres med 2 -methyl -cyclopentandion til 3-methoxy-4-methyl-8(14)-seco-l,3,5(lO) ,9(H)-østratetraen-l4,17-dion (smp. 154° - 155°C)) oppløst, i 800 ml ethanol., omrøres i 48 timer under luftning og videre i 60 timer uten luftning. Derpå ekstraheres, som vanlig, med methyl-isobutylketon, ekstrakten inndampes, residuet skilles ved preparativ tynnskiktskromatografi, og det erholdte .råprodukt omkrystalliseres fra isopropylether. Man får: 4-methyl-3-methoxy-8(l4)-seco-1,3,5(10),9(11)-øst ratet raen-170-ol-l4-on.

Smp. 167° - 168°C, (a) = -43,6° dioxan (c=l)

Ifølge'NMR-spektret står hydroxylgruppen i Ø-stilling i forhold til 130-methylgruppen.

Eksempel 26

Fremstilling av d-0-(3,4-methylendioxyfenyl)-glutarsyre-monoethylester

a. 0 -(3,4-methylendioxyfenyl)-gluta rsyrediethylester

<C>16H2Q°6 ( MV: 308' 34>

10,0 g 0-(3,4-methylendioxyfenyl)-glutarsyre (W. T. Smith jun. and R. W. Shelton, J. Am. chem. Soc. 7_6, 2731 (1954)) oppvarmes i 50 ml thionylklorid i 2 timer under tilbak eløp. Derpå avdestilleres thionylkloridet i vakuum, det erholdte syreklorid tilsettes lOO ml absolutt ethanol, blandingen omrøres inntil oppløsningen blir klar, oppløsningen får stå i l6 timer ved værelsetemperatur og inndampes på dampbad i vakuum. Den erholdte olje taes opp i ether, etherfasen vaskes med mettet vandig bicarbonatoppløsning og derpå med vann, tørres over natriumsulfat og fraksjoneres i vakuum. Man får: 9,7 g 3-(3,4-methylen-dioxyfenyl)-glutarsyrediethylester = 79% av det teoretiske.

KplZf = 222° - 224°C

b. rac-Ø-(3,4-methylendioxyfenyl)-glutarsyre-monoethylester

Cl4Hl6°6 ( MV: 28Q , 27 )

5,0 g 0-(3,4-methylendioxyfenyl)-glutarsyre-diethylester opp-løses i 75 ml ethanol, oppløsningen tilsettes 50 ml 10%-ig vandig kalilut og oppbevares i 30 minutter ved værelsetemperatur. Derpå tilsettes oppløsningen 100 ml vann, syres med 2n saltsyre, ekstraheres med ether, etherfasen vaskes med litt vann, tørres over natriumsulfat og inndampes i vakuum ved 50°C badtemperatur til en sirup. Residuet skilles over en silicagelsøyle ved hjelp av kloroform-methanol-gradienter og gir:

1,56 g rac-Ø-(3,4-methyleridioxyfenyl)-glutarsyre-monoethylester = 34% av det teoretiske som sirup. Tynnskiktskromatografi: Anvendes silicagelplater ifølge Stahl, er følgende å iaktta: Man utvikler over 15 cm løpeflate i systemet kloroform:methanol (4'+ 1), utvikler med et reagens av 1 ml konsentrert svovelsyre og 20 ml 95%-ig ethanol og tørrer i 30 minutte:: ved l40°C.

0-(3,4-methylendioxyfenyl)-glutarsyre-diethylester R_ 0,90 0-(3,4-methylendioxyfenyl)-glutarsyre-dimethylester R_ 0,90 0-(3,4-methylendioxyfenyl)-glutarsyre-monoethylester R o 25

resp. monomethylester F ' 0-(3,4-methylendioxyfenyl)-glutarsyre Rp 0,00

c. d- 0-( 3, 4- methylendioxyfenyl)- glutarsyre- monoethylester

En 30 1 tørrfermenteringskultur av Curvularia lunata (NRRL 2434)

(fremstilt ved de i eksempel 5 nevnte betingelser) filtreres over gas, mycelet vaskes to ganger med destillert vann og suspenderes i 15 1 destillert vann.

Man fyller i hver.av åtte 2 1 Erlenmeyerkolber 500 ml av mugg-suspensjonen, lukker kolbene med en vattdott og ryster dem med et svingetall på 145 omdr. pr. min. ved 30°C. Efter 1 time tilsettes hver kolbe 125 mg 0-(3,4-methylendioxyfenyl)-glutarsyre-diethylester

i 5 ml ethanol og efter ytterligere 3 timer nok 125 mg materiale i 1 ml ethanol.

Efter 24 timers rystning ved 30°C er fermenteringen avsluttet. Man forener kultursuspensjonene og ekstraherer dem med 2x21 methyl-isobutylketon. Ekstrakten blir inndampet i vakuum ved 45°C badtemperatur, og den erholdte sirup opparbeides som beskrevet i eksempel 26b. Man får:

d-0-(3,4-methylendioxyfenyl)-glutarsyre-monoethylester

(<a>)D<=> +9,6° dioxan (c=2)

Identifiseringen av forbindelsen støtter seg på den IR-spektro-skopiske sammenligning med racematet.

Eksempel 27

Fremstilling av d-0-(3,4-methylendioxyfenyl)-glutarsyre-monomethylester

a. 0-(3,4-methylendioxyfenyl)-glutarsyre-dimethyles ter

C14H16°6 ( MV: 28°>27)

10,0 g 0-(3,4-methylendioxyfenyl)-glutarsyre (eksempel 26) oppløses i 100 ml tørr tetrahydrofuran, avkjøles til 0°C, og oppløs-

ningen oppbevares med 200 ml iskold diazomethanoppløsning, fremstilt fra 60 ml 40%-ig vandig kalilut, 20,O g nitrosomethylurea og 200 ml ether, i 30 minutter ved 0°C og i 30 minutter ved værelsetemperatur. Derpå tilsettes 10 ml iseddik, og der' f raksjoneres efter spaltning

av diazomethanet . Man får: 8,9 g 0 - ( 3 , 4-methylendioxyf enyl) - glutarsyre-dimethylester = 80% av det teoretiske.

Kpl5: 215 - 219°C Smp. 40 - 42°C

b. rac-0-(3,4-methylendioxyfenyl)-glutarsyre-monoethylester

C13Hl4°6 (MV: 266>25)

Syntesen av forbindelsen skjer analogt med den for rac-0-(3,4~ methylendioxyfenyl)-glutarsyre-monoethylesteren (eksempel 26b).

Man får: 1,85 g rac-Ø-(3,4-methylendioxyfenyl)-glutarsyre-monoethylester = 39% av det teoretiske som sirup.

Tynnskiktskromatografi: se eksempel 26b.

c. d- 0- f 3 , 4- methylendioxyf enyl)- glutarsyre- monomethylester

2,0 g av dimethylesteren fermenteres under de samme betingelser som i eksempel 26c med Curvularia lunata og opparbeides.

Man får: d-0-(3,4-methylendioxyf enyl)-glutarsyre-monomethylest er

(a)D = +7,2° dioxan (c=2)

Identifiseringen av forbindelsen støtter seg på IR-spektroskopisk sammenligning med racematet.

Eksempel 28

Fremstilling av 1-0-(3,4-methylendioxyfenyl)-glutarsyre-monoethylester

Under de i eksempel la angitte betingelser fermenteres 1,6 g 0-(3,4-methylendioxyfenyl)-glutarsyre-diethylester i 16 rystekolber hver med 500 ml næringsoppløsning med Penicillium albidum (CMI 40.290) i 48 timer. Opparbeidelsen skjer på lignende måte som i eksempel 26c. Man får: l-0-(3 ,4-methylendioxyfenyl)-glutarsyre-monoethylester

(<a>)D<=> -8,9° dioxan (c=2)

Identifiseringen av forbindelsen skjer IR-spektroskopisk ved sammenligning med racematet.

Eksempel 29

Fremstilling av d- 3-( 3, 4- methylendioxyfenyl)- pentan- 5- ol- l- al

a.1 3-(3,4-methylendioxyfenyl)-pentan-l ,5-diol C12Hi6°4 (MV: 224,25)

Man drypper en oppløsning av 20 g 0-(3,4-methylendioxyfenyl)-glutarsyre-diethylester (eksempel 26a) i 200 ml tørr ether under om-røring til en suspensjon,av 4,0 g LiAlH^ i 200 ml tørr ether. Derpå omrøres i ytterligere 16 timer, overskudd av lithiumaluminiumhydrid spaltes med eddikester og vann, filtreres, etherfasen vaskes med fortynnet saltsyre, vandig bicarbonatoppiøsning og vann, tørres med natriumsulfat og inndampes i vakuum til,en sirup.

Råproduktet renses over en silicagelsøyle ved hjelp av methylenklorid-eddiksyreester-gradienter, og det erholdte produkt om-krysta lliseres fra isopropylether.

Man får: 7,8 9 3~( 3 ,4-methylendioxyf enyl) -p>ent an-1 ,5-diol = 54% av det teoretiske.

Smp. 69°/70° - 71°C.

b. d- 3-( 3, 4- methylendioxyfenyl)- pentan- 5- o1- 1- al

1,6 g 3-(3,4-methylendioxyfenyl)-pentan-1,5-diol oppløst i

80 ml "Methylcellosolve" fermenteres med Achromobacter parvulus (ATCC 4335) under de i eksempel 3a beskrevne betingelser i 16 rystekolber hver med 500 ml's fylling.

Efter 48 timers fermenteringstid forenes fermenteringssuspen-sjonene, rystes med 2x21 methyl-isobutylketon, ekstrakten inndampes i vakuum ved 45°C badtemperatur, og residuet skilles over en

silicagelsøyle ved hjelp av methylenklorid-eddiksyreester-gradient er.

Produktet krystalliseres fra ethanol, og man får: d-3-(3,4-methylendioxyfenyl)-pentan-5-ol-1-al.

Smp. 139°/140° - l4l°C, (a)<20> = +9,8 ° ethanol (c=2)

Ifølge NMR- og IR-spektrene foreligger forbindelsen i sin pyranoseform.

Tynnskiktskromatografi:

Den utføres som beskrevet i eksempel la, med løpemiddel kloroform:aceton (9 + 1).

3-(3,4-methylendioxyfenyl)-pentan-1,5-diol R r 0,10 3-(3,4-methylendioxyfenyl)-pentan-5-ol-1-al Rf_ r 0,6o Eksempel 3Q

Fremstilling av 1- 3-( 3 , 4- methylendioxyfenyl)- pentan- 5- ol- 1- al

1,6 g 3-(3,4-methylendioxyfenyl)-pentan-1,5-diol fermenteres under lignende betingelser som beskrevet i eksempel 29b med Aceto-bacter aerogenes (BBA - Berlin) og opparbeides.

Man får: 1-3-(3,4-methylendioxyfenyl)-pentan-5-o1-1-al

Smp. 136°/139° - l4o°C, (a)D = -12,0° ethanol (c=2)

Eksempel 31

Fremstilling av d-2-(3,4-methylendioxybenzyl)-propan-1,3-diol-l-acetat <cn>Hi4°4 (MV: 210,21)

a. 2-( 3, 4- methylendioxybenzyl)- propan- 1, 3- diol

20 g piperonyl-malonsyre-diethylester (Karrer, Heiv. 6, 915

(1923)) reduseres under de i eksempel 29a anvendte betingelser med

lithiumaluminiumhydrid.

Man får: 9,2 g 2-(3,4-methylendioxybenzyl)-propan-1,3-diol = 64% av det teoretiske.

Sm<p.> 83°/84° - 86°C.

b. d-2-( 3, 4- methylendioxybenzyl)- propan- 1, 3- diol- l- acetat

1,6 g 2-(3,4-methylendioxybenzyl)-propan-1,3-diol fermenteres under de samme betingelser som beskrevet i eksempel 29b med Myxo-coccus rubescens (BBA - Berlin), men med en fermenteringstid på 120 timer, og opparbeides.

Man får: d-2-(3,4-methylendioxybenzyl)-propan-1,3-diol-1-acetat som sirup.

(<a>)D<=><+>8,5° ethanol (c=2)

Tynnskiktskromatografi ble utført på lignende måte som i eksempel 29b.

2-(3,4-methylendioxybenzyl)-propan-1,3-diol R_ 0,10 2-(3,4-methylendioxybenzyl)-propan-1,3-diol-l-acetat R_ 0,60

Eksempel 32

133-ethyl-3-methoxy-18-nor-l,3,5(10),8,±4-østrapentaen-17p-ol <C>20<H>24°2 ( 286. 40)

5,34 g (0,017 mol) 133-ethyl-173-OH-SM1 i 7 ml methanol og 14 ml methylenklorid oppvarmes i nærvær av 0,274 ml konsentrert saltsyre i 3,5 timer under tilbakeløp. Oppløsningen helles s"å i 14 ml vann og opparbeides analogt med eksempel 7. Efter omkrystallisasjon fra

ethanol får man 4 g (82%) 138-ethyl-3-methoxy-18-nor-l,3,5(lo),8,14-øst rapentaen-17p-ol.

Smp. 88° - 90°C, o^° = -140° (c=l, CHC13).

Eksempel 33

13p-ethyl-3-methoxy-18-nor-l,3,5(10),8,14-østrapentaen-173-ol-acetat C22H26°3 ( 338, 43)

5,34 9 (0,017 mol) 133-ethyl-17P-OH-S.M1 får stå i 48 -timer med 4,30 ml acetanhydrid og 5,1 ml pyridin i 38 ml absolutt benzen ved værelsetemperatur. Derpå helles i vann og vaskes nøytralt med saltsyre og bicarbonat. Den erholdte benzeniske oppløsning tørres, filtreres og oppvarmes så i nærvær av 110 mg p-toluensulfonsyre i 30 minutter under vannfraskillelse. Oppløsningen vaskes så nøytral, tørres, filtreres og inndampes til tørrhet. Efter omkrystallisasjon fra ethanol får man 4,6o g (80%) 138-ethyl-3-methoxy-18-nor-1,3 ,5(10) ,8 ,l4-østrapentaen-173-ol-acetat .

Smp. 75° - 76°C, a<20> = -202° (c=l, CHClg)...

Eksempel 34

3-methoxy -D-homo-1, 3,5( 10) ,8 ,14-østrapentaen-178-°l-acetat C22H26°3 ( 338>43) 75 mg (0,239 mmol) 17p-0H-(D-homo-SM-L) behandles med 0,6 ml acetanhydrid og 1,0 ml pyridin i l6 timer ved værelsetemperatur. Derpå helles i vann, ekstraheres med methylenklorid, og me.thylen-kloridoppløsningen vaskes nøytral med saltsyre og bicarbonat. Efter tørring, filtrering og inndampning av oppløsningen taes opp i 8 ml benzen, og der kokes med 20 mg p-toluensulfonsyre i 12 minutter under tilbakeløp. Efter nøytralvaskning, tørring, filtrering og inndampning av oppløsningen omkrystalliseres fra ethanol. Man får 53 mg (66%) 3-methoxy-D-homo-1,3, 5 (IQ),8,l4-østrapentaen-17p-ol-acetat.

Smp. 120° - 121°C e3o6 = 30.700.

Eksempel 35

Fremstilling av 1-methyl-3-methoxy-8(14)-seco-1,3,5(10),9(11)-øst ra - tetraen- l4a- ol- 17- on v ■

1,6 g 1-methyl-3-methoxy-8(l4)-seco-1,3,5(10),9(11)-øst ratetraen-l4,17-dion fermenteres i 16 fermenteringskolber med Saccharo-myces uvarum (CBS 1508) under de samme betingelser som beskrevet i eksempel 2a, og opparbeides.

Man far: 1-methyl-3-methoxy-8(14)-seco-1,3,5(10),9(11)-østråtetraen-l4a-ol-17-on.

<Smp.> 93°/94° - 95° (a)<20> = +23° (dioxan c=l)

(E)264 =20.100

Eksempel 3°

Fremstilling av 13-0-(n-propyl)-3-methoxy-8(14)-seco-18-nor-1 , 3 , 5( 10) , 9( 11) - øst rat et ra en- 170- ol- 14- on.. ■ ..■

Under betingelsene beskrevet ,i eksempel.22 fermenteres 3,0 g 130-(n-propyl)-3-methoxy-8(14)-seco-18-nor-l,3,5(10),9(11)-øst ratetraen-14,17-dion med Saccharomyces uvarum (CBS 1508) og opparbeides. Det erholdte oljeaktige råprodukt renses over en silicagelsøyle ved hjelp av carbontetraklorid-methylenklorid-gradienter.

Man får: 13-0-(n-propyl)-3-methoxy-8(14)-seco-18-nor-1 , 3 , 5 (10) ,9 (H )-øst rat etraen-17P-ol-l4_on som sirup.

(a)<20> = +12,0° (dioxan c=l)

Eksempel 37

Fremstilling av 1-methyl-l-(6-carboxy-3-ketohexyl)-cyclopentan-2-ol-5- on og 4-( 2'- carboxyethyl)- 8- methyl- 4, 9- dehydro- hydrindan- 1- ol- 5- on

4,0 g 1-methy1-1-(6-carboxy-3-ketohexyl)-cyclopentan-2,5-dion-ethylester fermenteres i 32 fermenteringskolber med Saccharomyces uvarum (CBS 1508) under de i eksempel 2a beskrevne betingelser og a opparbeides til et konsentrat.

Da det i råproduktet erholdte l-metnyl-l-(6-carboxy-3-keto-hexyl)-cyclopentan-1-ol-3-on bare er vanskelig isolerbart ved søyle-kromatografi , tilsettes det til tørrhet inndampede konsentrat for ringslutning av forbindelsen 25 ml 5n saltsyre og oppvarmes i 1 time under tilbakeløp. Man lar oppløsningen avkjøle, ekstraherer med kloroform, vasker kloroformfasen med litt vann, tørrer den med natriumsulfat og inndamper i vakuum til tørrhet. Residuet skilles over en med syrevasket silicagel fylt søyle ved hjelp av kloroform-methanol-gradienter, de fraksjoner som inneholder 4-(2'-carboxyethyl)-8-methyl-4,9-dehydro-hydrindan-l-ol-5-on forenes, inndampes i vakuum ved 35°C badtemperatur til tørrhet, tilsettes litt vann og får stå

til krystallisasjon ved 0°C.

Man får: 4-(2'-carboxyethyl)-8-methyl-4,9-dehydro-hydrindan-l-ol-5-on-monohydrat.

Smp. 106°/108°- 109°C, (a) = +28° (aceton)

Eksempel 38

Fremstilling av 1- piperonyl- malonsyre- monoethylester

a., rac-piperonylmalonsyre-monoethylester ci3Hx_}°6 (MV: 2oo«25)

Ved å gå ut fra piperonylmalonsyre-diethylester skjer syntesen av forbindelsen analogt med den for rac-0-(3,4-methylendioxyfenyl)-

glutarsyre-monoethylester.

Man får: rac-piperonylmalonsyre-monoethylester som sirup.

b. 1- piperonylmalonsyre- monoethylester

1,6 g piperonylmalonsyre-diethylester fermenteres med Penicillium albicum (CMJ 40 290) under de samme betingelser som angitt i eksempel 28, og opparbeides.

Man får: 1-piperonylmalonsyre-monoethylester som sirup.

(a) = -1,9° (dioxan c=2)

Eksempel 39

Fremstilling av 1-2-(3,4-methylendioxybenzy1)-propan-1, 3-diol-1-acetat

a. 2-(3,4-methylendioxybenzyl)-propan-1,3-diacetat

C15H18°6 ( MV: 295' 31)

2,0 g piperonylpropandiol oppløses i 6 ml tørr pyridin, tilsettes 3 ml acetanhydrid og oppbevares i 4 timer ved værelsetemperatur. Blandingen helles i 40 ml iskold 8%-ig vandig svovelsyre,

omrøres i 1 time, blandingen ekstraheres med 3 x 50 ml eddiksyre-ester, eddiksyreesterfasen vaskes med vann,, bicarbonat og vann, tørres over natriumsulfat og inndampes i vakuum til tørrhet.

Man får: 2,8 g 2-(3,4-methylendioxybenzyl)-propandioldiacetat = 100% av det teoretiske som sirup.

b. 1-2(3,4-methylendioxybenzyl)-propan-1,3-diol-1-acetat

C13<H>16°5 ( MV: 253, 28)

800 mg av diacetatet, oppløst i 40 mL dimethylformamid, fermenteres i 8 fermenteringskolber under de i eksempel 3a angitte betingelser med Achromobacter parvulus (ATCC 4335) og opparbeides til et råprodukt. Dette renses som beskrevet i eksempel 31.

Man får: 1-2 (3 ,4-methylendioxybenzyl)-prop.an-1, 3-diol-1-acetat som sirup.

(<a>)D<=> -3,6° (dioxan)

Eksempel 4o

Fremstilling av 1-(3-methoxy-8(14)-1,3,5(IO),9(H)-øst ratetraen-l4,17-dion- monos em icarbazon)

a. 3-methoxy-8(14)-s eco-1,3,5(10),9(11)-øst rat et ra en-14,17-dion-disemicarbazon C21<H>28°3N6 (MV: 412,49)

5,0 g SM oppløses i 130 ml ethanol, oppløsningen tilsettes 7,5 g semicarbazid-hydroklorid og 11,2 g natriumacetat og rystes i 1 time

ved værelsetemperåtur. Derpå tilsettes ca. 150 ml vann, det utskilte produkt f ra suges" efter 3/4 times henstand ved 0°C og omkrystalliseres fra ethanol. Man får: 4,4 g 3-methoxy-8(14)-seco-1, 3,5(IO),9(11)-Øst ratetraen-14,17-dion-disemicarbazon.

Smp. 211°/212° - 213°C.

(-)-(3-methoxy-8(14)-seco-1,3,5(10) ,9(H)-øst ratetraen-14,17-dion-monosemicarbazon) ^qH^^O^N^ .(MV: 355,44)

6,0 g av disemicarbazonet, oppløst i. 300 ml.dimethylformamid, fermenteres med Streptococcus cremoris 303P (BFA fUr Milchwirtschaft, Kiel) under de i eksempel 3h angitte betingelser og opparbeides til et råprodukt. Dette opprenses over en silicagelsøyle ved hjelp av methylenklorid-kloroform-gradienter, og man får: (-)-(3-methoxy-8(14)-seco-1,3,5(10) ,9(11)-øst rat etraen-14,17-dion-monosemicarbazon)..

Smp. 204° - 205,5°C, (a)364 = "25,5°

Eksempel 4l

Fremstilling av ( - ) -3-methoxy-8(l4) -seco-1 , 3, 5 (IO) ,9(11) -øst ra - t et raen- l4, 17- dion- monosemica rbazon

Under de i eksempel 40 beskrevne'betingelser fermenteres 6,0 g 3-methoxy-8(14)-seco-1,3,5(10) ,9(11)-øst ratetraen-14,17-dion-disemi - carbazon med St reptococcus lactis 3021 ( BF A flir Milchwirt schaf t , Kiel) og opparbeides.

Man får: (-)-3rmethoxy-8(14)-seco-1,3,5(10) ,9(11)-østrat etraen-14,17-dion-monosemica rba zon .

Smp. 203° - 205°C, (a)36z+ = -23°

Eksempel 42

Fremstilling av 6-thia-8(14)-seco-1,3,5(10) ,9(H ) -øst rat etraen-l4a-ol- 17- on

3,2 g 6-thia-8(14)-seco-1,3,5(10),9(11)-øst rat etraen-14,17-dion oppløst i 320 ml ethanol fermenteres i 32 fermenteringskolber hver på 500 ml med Saccharomyces uvarum (CBS 1508) under de i eksempel 2a angitte.betingelser i 16 timer, og opparbeides.

Det erholdte råprodukt renses over en silicagelsøyle ved hjelp av hexan-aceton-gradienter.

Man får: 6-thia-8(14)-seco-1,3,5(IO) ,9(11)-øst ratetraen-l4a-ol-17-on som sirup.

(a)D = +27° (dioxan c=l)

Claims (6)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av optisk aktive forbindelser med den generelle formel: hvor C 3er et asymmetrisk carbonatom, X er hydrogen, methyl, ethyl eller propyl, Y er en mettet eller umettet hydrocarbongruppe med åpen eller cyclisk kjede, som kan være avbrutt av heteroatomer, A er en carbon-carbonbinding mellom C og Z eller Z' eller en methyl-engruppe, og Z og Z' betegner gruppene -COOalkyl og -COOH eller -CH2OH og -CHO eller -CH2OH og -O^OCOCH-j eller -CH2Oacyl og -CH2OH eller -COR.,^ og -CHOH-R-j^ eller -(C=R2)-R-L og -COR1 - hvor R^ er lavere alkyl, eller begge R^ danner sammen en ethylen-eller propylengruppe, og R2 er en oximgruppe, hydrazongruppe eller semicarbazongruppe, karakterisert ved at en forbindelse av formelen: hvor C. er et optisk inaktivt carbonatom, og X, Y, Z og A er som ovenfor angitt, fermenteres med bakterie-, gjær- eller soppkulturer eller med derav isolerte enzymer.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, ved fremstilling av optisk aktive forbindelser med den generelle formel: hvor C ,,X og Y er som ovenfor angitt, V er.en ketogruppe i fri.. form eller i form av et oxim, hydrazon eller semicarbazon, V' er ^CH-OH eller - men ikke samtidig med V en ketogruppe, og Q er -CH2-CH2- eller -CH2-, karakterisert ved at én forbindelse med deri generelle formel: hvor X, Y, Q, og V er som ovenfor angitt,,fermenteres med. bakterie-, gjær- eller soppkulturer,eller derav isolerte.enzymer. , 3.

Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2j ved fremstilling av optisk aktive forbindelser med den generelle formel:. hvor c 3, X og Q er som ovenfor angitt, og Y er , :..„ .. hvor w er hydrogen eller alkyl , karakt er ise r" t ved at en forbindelse med den generelle formel: hvor C, X, Y og Z er som ovenfor angitt, fermenteres med bakterie-, gjær- eller soppkulturer eller med derav isolerte enzymer.

Fremgangsmåte ifølge krav 1-3, karakterisert ved at man utfører den enzymatiske omvandling av én ketogruppe ved hjelp av sopper, som Aspergillus ochraceus, Aspergillus niger, Curvularia lunata, Rhizppus nigricans eller Penicillium notatum eller derav fremstillbare enzymer, eller ved hjelp av gjær, som Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces ellipsoides eller derav fremstillbare enzymer, eller ved hjelp av bakterier, som Bacillus esterificans, Bacillus laterosporus, Brevibacterium vitarum, Propionibacterium arabinosum, Protaminobacter alboflavus, Mesentericus spee, Mycoplana dimorpha, Bacillus thuringiensis eller derav fremstillbare enzymer.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1-4, karakterisert ved at man til den selektive enzymatiske reduksjon av én ketogruppe anvender Saccharomyces uvarum (CBS 1508).

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1-4, karakterisert ved at man ved den selektive enzymatiske reduksjon av én ketogruppe anvender Bacillus thuringiensis (BBA - Darmstadt).

7- Fremgangsmåte ifølge krav 1-4, karakterisert ved at man ved den selektive enzymatiske reduksjon av én ketogruppe anvender Arthrobacter simplex (ATCC 6946) .