NO160791B - Fremgangsmaate for proteolyse av plasmaproteiner for fremstilling av proteinholdige hydrolysater med aksepterbar smak og uten bitter aroma. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for proteolyse av plasmaproteiner for fremstilling av proteinholdige hydrolysater med aksepterbar smak og uten bitter aroma, og det særegne ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er at proteolysen av plasmaproteinene gjennomføres ved hjelp av termolysin i nærvær av kalsiumioner i et vandig reaksjonsmedium med pH 5-7 ved en temperatur på høyst 80°C.

Disse og andre trekk ved oppfinnelsen fremgår av patent-kravene.

Man har i den senere tid søkt å utnytte et antall produkter

som hittil i stor grad hår vært kastet, og blant disse produkter har blod, som er et biprodukt ved slakting av dyr, en betydelig potensiell verdi pga. dets høye proteininnhold. Videre er det et faktum at hittil er bare en liten del av blodet blitt tatt vare på og anvendt for forskjellige formål.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører tilveiebringelse av en

ny fremgangsmåte for utnyttelse av blod og vedrører mer spesielt tilveiebringelse av en ny prosess for utnyttelse av plasmaproteinene ved hjelp av hydrolyse.

Når man forsøker å hydrolysere proteiner støter man imidler-

tid ofte på den vanskelighet at det blir en ubehagelig smak på disse hydrolysater, og dette er en stor ulempe da disse proteinhydrolysater finner deres hovedsakelig anvendelse i næringsmidler for mennesker og dyr.

Dette er spesielt tilfellet når hydrolysen gjennomføres på enzymatisk måte hvor da bitter smak ofte opptrer.

Den foreliggende oppfinnelse avhjelper denne ulempe ved at

den tillater fremstilling av hydrolysater uten dårlig smak.

Mens enzymatisk hydrolyse er gunstig på grunn av dens spesi-fisitet og det forhold at den utøves under milde betingelser, vil kontinuerlige operasjoner medføre dårlig utnyttelse av enzymet. Enzymet går faktisk tapt ved slutten av prosedyren.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for enzymatisk hydrolyse som tillater kontinuerlig fremstilling av plasmaprotein-hydrolysater.

Den erkjennelse som ligger til grunn for den foreliggende oppfinnelse er at termolysin, som er et enzym som er kjent for sin varmestabilitet i nærvær av kalsiumioner, er spesielt egnet for proteolyse av plasmaproteiner og fører under de nevnte betingelser til hydrolysater uten bitter smak/aroma.

Termolysin er en metallendopeptidase isolert fra et dyrk-ningsfiltrat av Bacillus termoproteolyticus rokko. Dets molekylvekt er 37.500 (bestemt ved likevekts-sedimentering). Enzymet inneholder fire atomer ganske sterkt bundet Ca <+>

pr. molekyl og anvendes i nærvær av kalsiumioner. En kal-siumkonsentrasjon ekvivalent med 100 ganger termolysinkonsen-trasjonen er generelt tilstrekkelig. Høyere konsentrasjoner kan anvendes, men tilveiebringer generelt ikke noen spesielle fordeler.

pH i reaksjonsblandingen kan opprettnoldes ved den ønskede verdi ved å anvende en syre, base eller buffer. pH innstilles foretrukket til en verdi mellom 5,5 og 6,5. Bufferen kan spesielt være en barbital/natriumacetat-buffer M/7 med pH 6. Buffere som kompleksdanner kalsium må selvfølgelig unngås.

Selv om det teoretisk er mulig å arbeide ved temperaturer opptil 80°C, blir termolysin ustabilt i løpet av lengre tidsperioder over 60°C selv om de andre betingelser ved fremgangsmåten . tilfredsstilles. Arbeidstemperaturen er fordelaktig 50 til 60°C.

Proteinkonsentrasjonen i reaksjonsblandingen er fordelaktig fra 10 til 120 g/l og foretrukket fra 30 til 50 g/l. Konsentrasjonen av rent enzym kan spesielt være fra 0,2 til 5 vekt% i forhold til vekten av protein.

Det er videre erkjent at utbyttet av proteolysen tydelig kan økes hvis det på forhånd gjennomføres en denaturering av plasmaproteinene.

Denne denaturering kan spesielt gjennomføres ved termisk be-handling (oppvarming) av proteinene ved en temperatur på 70 til 100°C idet pH opprettholdes ved en verdi på 5 til 7. Denatureringstiden forkortes når temperaturen økes. Ved 70°C kan denatureringstiden være omtrent 30 minutter.

Fremgangsmåten kan utøves kontinuerlig hvor da plasmaproteiner tilsettes kontinuerlig til en reaksjonsblanding inneholdende termolysin i nærvær av kalsiumioner ved pH 5 til 7 og en temperatur under 80°C, idet denne blanding opprettholdes i et system som innlemmer en ultrafiltreringsover-flate, og de hydrolyserte proteiner utvinnes fra ultrafil-treringsf iltratet.

På denne måte er termolysin innesperret i systemet.

Det er overraskende funnet at enzymet på den ene side har høy stabilitet og på den annen side er det funnet at ved å anvende det foretrukne temperaturområde (50 til 60°C) for-hindres nesten all bakterievekst, idet denne vekst er et hyppig opptredende og spesielt brysomt fenomen ved enzymatisk proteolyse.

Systemet kan være en enkel ultrafiltreringscelle som kontinuerlig tilføres plasmaproteiner under trykk.

Ved en foretrukket utførelsesform av fremgangsmåten tilsettes plasmaproteiner kontinuerlig til reaksjonsblandingen inneholdende enzymet i en reaktor, blandingen føres kontinuerlig gjennom en ultrafiltreringsinnretning som tilbakeholder enzymet og plasmaproteinene mens de hydrolyserte proteiner utvinnes fra ultrafiltreringsfiltratet og den tilbakeholdte del resirkuleres til reaktoren.

Ved denne utforelsesform anvendes fordelaktig en hulfiberinnretning som en ultrafiltreringsinnretning.

En slik innretning omfatter en samling av mikroporøse hule fibre som innvendig er dekket med en "hud" for ultrafiltrering.

En slik innretning er fordelaktig da forholdet overflate/ volum er meget stort, membranene er selvbærende og konsentra-sjons-polariseringsfenomener begrenses på grunn av den laminære strøm som foregår langs membranoverflaten.

I praksis kan det anvendes en innretning som tilbakeholder molekyler med molekylvekt over 10.000.

Det er videre funnet at hvis hydrolysatet underkastes en

annen ultrafiltrering på en membran som har en lavere tilbake-holdelsestersel, er det naturlig å separere et tilbakeholdt material som inneholder glykopeptider; idet det for den' nevnte annen ultrafiltrering anvendes en membran som tilbakeholder molekyler med molekylvekt over 1000.

De etterfølgende førsøk illustrerer oppfinnelsen.

I - diskontinuerlige forsøk

A) Fremstilling av substratet

Bovint plasma anvendes som substrat for hydrolysen. Plasmaet oppnås ved sentrifugering av total mengde blod samlet sammen med et antikoagulasjonsmiddel (4 g/l trinatriumcitrat 2H20)

i slaktehuset.

Metoden gjennomføres kontinuerlig idet alt blod med antikoa-gulas jonsmidlet ved temperaturen for slaktingen føres gjennom en beskyttende sil og deretter under innvirkning av tyngde-kraften inn i en separator av typen "Westfalia BTA 35".

Under innvirkning av sentrifugalkraften oppnås 2 faser:

en gul lett fase : plasma

en rød tung fase : blodkoagulat

Utbyttet ved prosedyren er 65% (volum/volumj_ med hensyn til plasma og 35% (volum/volum) med hensyn til blodkoagulat.

Det således oppnådde plasma lagres umiddelbart ved +4°C

for å begrense bakterieforurensning.

De biokjemiske egenskaper av det bovine plasma er som følger:

totalt proteininnhold : 65 g.l-'*'

inklusive 45% albumin og

55% globulin

- totalt lipidinnhold : 10.7 g.kg<-1>

- karboiiydratinnhold : 1 g.l ~<*>

- pH = 7,46

- Na+ = 139 mEkv/1

- K<+> = 4,3 mEkv/1

- Cl" = 100 mEkv/1

- Natrium-eitrat 2 r^O konsentrasjon = 4 g.l ^

b)_ Fremst i lling_av_enzymet

Sigma-termolysin, i form av et frysetørket produkt inneholdende 25% buffersalter som natrium og kalsiumacetat, anvendes .

Det frysetørkede produkt oppløses i en barbital/natriumacetat-buffer M/7, pH 6, CaCl2 2x10 ~<3>M.

c) Proteolysemetode (standard forsøk)

I 40 ml barbital/natriumacetat-buffer M/7, pH 6, oppløses plas-mamassen som.er nødvendig for å oppnå den ønskede proteinkon-sentrasjon i et sluttvolum på 50 ml. Proteinkonsentrasjonen bestemmes ved hjelp av Kjeldahl-metoden. pH-innstilling gjennomføres ved tilsetning av IN HC1 eller IN NaOH. Prote-inoppløsningen fremstilt på denne måte omrøres og ekvili-c breres til den temperatur som velges for gjennomføring av hydrolysen. Ved reaksjonstid 0 tilsettes termolysinet oppløst i 10 ml barbital/natriumacetat-buffer M/7, pH 6, samt mengden CaCl^ nødvendig for å oppnå den ønskede slutt-konsentrasjon.

pH i reaksjonsmediet overvåkes og innstilles kontinuerlig ved hjelp av en pH-stat av typen "Metrohm".

Avhengig av rekasjonstiden trekkes prøver ut av mediet

for å overvåke hydrolysen.

d) Forsøk

Forskjellige forsøk med proteolyse gjennomføres på den ene

side med nativt bovint plasma og på den annen side med bovint plasma denaturert ved oppvarming til 70°C i 30 minutter.

Betingelsene er som følger:

Termolysinkonsentrasjon : 5 x 10~^ M

Proteolysehastigheten ble målt for forskjellige substrat-konsentrasjoner..

Proteolysehastigheten uttrykkes som ^umol-ekvivalenter leucin

dannet pr. minutt i samsvar med metoden til Ricks et al.

(1977, FEBS 11 møte i København, bind 44, Symposium A3

Pergamon Press side 119-128) .

i

Resultatene er vist i fig. 1 hvor kurve A tilsvarer det

native substrat og kurve B det vyarme denaturerte substrat.

Disse kurver viser et maksimum avhengig av substratkonsentra-sjon (80 g/l i tilfellet av nativt plasma og 60 g/l i tilfellet av denaturert plasma). Videre viser en sammen-

ligning av disse kurver at varmedenatureringen i meget sterk grad øker proteolysetakten.

II - Kontinuerlige forsøk

a) Innretning anvendt for forsøkene

Forsøkene ble gjennomført i en laboratorie-enzymreaktor vist

skjematisk i fig. 2.

Denne reaktor inkluderer en beholder 1 inneholdende plasmaproteinene i vandig medium, under omrøring.

En peristaltisk pumpe 2 fører proteinene inn i selve reaktoren

3 som har en kapasitet på 2 liter. Omrøring i denne reaktor opprettholdes ved hjelp av en røreinnretning 4.

Denne reaktor består av et fat neddykket i et termostatstyrt bad 5 opprettholdt ved passende temperatur ved hjelp av en oppvarmingsmotstand 6.

En pumpe 7 fører også en CaCl^-oppløsning fra beholderen 8

inn i reaktoren 3.

pH i reaks jonsblandingen som er tilstede i reaktoren 3 inn*' stilles kontinuerlig ved hjelp av en pH-stat 9 ("Metrohm E 526").

En pumpe 10 sørger for sirkulering av reaksjonsblandingen gjennom en hulfiber-ultrafiltreringsinnretning 11 ved hjelp av en kjøleinnretning- 12. Et manometer 13 tillater overvåk-ing av innløpstrykket i hulfiberultrafiltreringsinnretningen.

Ultrafiltratet uttømmes gjennom et rør 14 mens det tilbakeholdte material returneres til reaktoren 3 gjennom et rør 15 utstyrt med en enveisventil 16.

Hulfiber-ultrafiltreringsinnretningen består av en samling

av hule fibre av typen "Amicon type H-^P 10,8 "„ fremstilt av polysulfon som har en tilbakeholdelsesterskel på 10.000 og en total overflate på 830 cm 2 med en indre fiberdiameter på 0,2 mm og en lengde på 20 cm idet det totale antall» er 1000.

b) Forsøksbetingelser

Substratet er bovint plasma fortynnet med vann og 0,5% NaCl,

inneholdende 30 g.l -1 totalt protein (målt ved hjelp av Kjeldahl-metoden) innstilt til'pH 6 med IN HC1 og forhånds-denaturert ved tidligere gjennomført oppvarming av substratet ved pH 6 i 30 minutter ved 70°C. Termolysinet oppløst i 0,1 1 barbital/natriumacetat-buffer M/7, pH 6, tilsettes til 0,6 1 av substratet som holdes ved 60°C. I termo-statkaret for reaktoren 3 er den endelige enzymkonsentrasjon 10 ~<5>M.

Kalsiumkonsentrasjonen fikseres ved 2xl0~^M (kalsium til-

_2

settes kontinuerlig i form av en konsentrert 2x10 M CaCl0-oppløsning ved hjelp av pumpen 7),. idet strømningstakten

-1

er innstilt til 0,5 ml minutt

Etter 30 minutters inkubasjon ved 60°C resirkuleres reaksjonsblandingen i reaktoren, idet strømningshastigheten er innstilt til 10 l.t-^ og ultrafiltrerings-strømningstakten d er innstilt til 0,3 l.t-^. Temperaturen i reaktoren opprettholdes ved 60°C, men senkes til 50°C i ultrafiltreringsinnretningen .

c) Resultater

Figur 3 viser det momentane utbyttet oppnådd som en funksjon

VUF

av forholdet , hvorved VUF er ultrafiltratvolumet og VRer reaksj onsvolumet.

Det iakttas at dette utbyttet er høyt og stabilt over en lang periode.

Det er videre iakttatt at det ikke var noe akkumulering av hydrolysert protein i det tilbakeholdte material.

Det har vært mulig å oppnå en kontinuerlig drift med — yp —

på opptil 13, det vil si en hydrolysetid på omtrent 30 timer.

Filtrering av hydrolysatet på "Biogel P6" viser nærvær av peptider med en molekylvekt på under 2000.

III - Separering av en qlykopeptidfraks ion fra hydrolysatet 900 ml av hydrolysatet oppnådd ved kontinuerlig proteolyse (som beskrevet i II) underkastes ultrafiltrering på "Amicon KlPl" mem'3ran me& en tilbakeholdelsesterskel på 1000, under anvendelse av en hulfiber-ultrafiltreringsinnretning (med konfigurasjon identisk til den innretning som er anvendt under II).

En konsentrert glykopeptidfraksjon gjenvinnes fra det tilbakeholdte material.

Resultatene for sammensetningen av hydrolysatet med hensyn på tørr ekstrakt samt prosentdelen proteiner som omdannes er som følger: peptider: 85 til 90 vekt% glykopeptider: < 5 vekt%

frie sukkere: < 1 vekt%

resten: mineralsalter

Prosentdelen proteiner som omdannes til peptider eller glykopeptider med molekylvekt < 10000 Da er omtrent 81 vekt% ved de mest fordelaktige betingelser.

Disse glykopeptider bestemmes ved hjelp av metoden til Dubois et al (Anal.Chem 28, 3, side 350-356).

Hydrolysatet oppnådd i samsvar med den foreliggende oppfinnelse eller fraksjoner derav, kan finne anvendelse spesielt innenfor industrien for fremstilling av næringsmidler for dyr eller mennesker.

Claims (8)

1. Fremgangsmåte for proteolyse av plasmaproteiner for fremstilling av proteinholdige hydrolysater med aksepterbar smak og uten bitter aroma, karakterisert ved at proteolysen av plasmaproteinene gjennomføres ved hjelp av termolysin i nærvær av kalsiumioner i et vandig reaksjonsmedium med pH 5-7 ved en temperatur på høyst 80°C.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at plasmaproteinene før proteolysen underkastes en denaturering som gjennomføres ved oppvarming til en temperatur på 70 til 100°C.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav -1 og 2, karakterisert ved at temperaturen i reaksjonsblandingen innstilles under proteolysen til en verdi på 50 til 60°C.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 og 2, karakterisert ved 'at pH innstilles til mellom 5,5 og 6,5.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, for kontinuerlig proteolyse av plasmaproteiner, karakterisert ved at plasmaproteiner tilsettes kontinuerlig til et reaksjonsmedium inneholdende termolysin i nærvær av kalsiumioner ved pH 5-7 og ved en temperatur under 80°C, idet dette medium opprettholdes i et system som innbefatter en ultrafiltreringsinnretning og de hydrolyserte proteiner utvinnes i ultrafiltreringsfiltratet.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 5, karakterisert ved at temperaturen i reaksjonsmediet innstilles til en verdi på 50 til 60°C.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 5 eller 6, karakterisert ved at det før proteolysen gjennomføres en denaturering av plasmaproteinene ved oppvarming til en temperatur på 70 til 80°C.

8. Fremgangsmåte som angitt i krav 5-7, karakterisert ved at plasmaproteiner tilsettes kontinuerlig til reaksjonsmediet inneholdende enzymet i en reaktor, blandingen føres kontinuerlig gjennom en ultrafiltreringsinnretning som tilbakeholder enzymet og plasmaproteinene, de hydrolyserte proteiner utvinnes fra ultrafiltreringsfiltratet og det tilbakeholdte material resirkuleres til reaktoren,- idet det som ultraf iltreringsinnretning anvendes en hulfiberinnretning som tilbakeholder molekyler med molekylvekt over over<1> 10 000; og om ønsket underkastes hydrolysatet en ytterligere ultrafiltrering for å oppnå et tilbakeholdt material inneholdende glykopeptider.

9- Fremgangsmåte som angitt i krav 8, karakterisert ved at det for den annen ultrafiltrering anvendes en membran som tilbakeholder molekyler med molekylvekt over 1 000.