NO159562B - Reagens for anvendelse ved bestemmelse av glukose ifluida. - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrører et reagens for semi-kvantitativ bestemmelse av nærvær av høye nivåer av glukose i vandige fluida og en spesiell indikator (kromogen) anvendelig i slik bestemmelse.

Bestemmelse av glukose i kroppsfluida som urin eller blod

er av viktighet, ikke.bare i tilfelle av diabetiske pasienter som må kontrollere sukkerinntaket, men det er også viktig i de situasjoner hvori påvisning av sykdom da en offentlig helseundersøkelse nødvendiggjør undersøkelse av urin eller blod i et stort antall mennesker. Fordi tidlig diagnose og kontinuerlig kontroll er så viktig ved diabetes må en glukoseprøve for å være av størst verdi for legen i hans diagnose og kontroll av sykdommen, være relativt hurtig,

enkel nok for å kunne brukes på sykehus og følsom nok til å reagere på variasjoner i urin eller blodglukose.

Bruk av glukoseoksydase, et peroksydaktivt stoff og en kromogen som oksyderes når det utsettes for hydrogenperoksyd i nærvær av det peroksyderende aktive stoff for bestemmelse av glukose i urin er kjent. Systemet omfatter dannelsen av hydrogenperoksyd med virkning av glukoseoksydase på glukose

og den resulterende oksydasjon av kromogenet (Cr) til dets oksyderte tilstand (Cr<*>) som er lett synlig ved en farge-forandring: ; Prøven kan benyttes i bestemmelsen av en serie materialer som reagerer med oksygen og en oksydase resulterende i dannelsen av hydrogenperoksyd. Således er systemet anvendelig for påvisning av okkult blod i forskjellige kroppsvæsker fordi hemoglobin er et slikt material. Mange forskjellige kromogener er anført som anvendelig i den angitte bestemmelsesmetode. US patent nr. 3 012 976 omtaler bruk av o-tolidin, o-toluidin, p-toluidin, o-fenylendiamin, N,N'-dimetyl-p-fenylendiamin, N,N'-dietyl-p-fenylendiamin, benzidin, p-anisidin, o-katekol og pyrogalol i en blodprøve av den nevnte type. ;US patent nr. 3 335 069 vedrører en prøve for urinsyre og omtaler bruk av o-anisidin og p-ahisidin som kromogener. ;Av kromogenene som er angitt å være anvendelig har få virkelig blitt benyttet i praksis. Benzidin var et foretrukket kromogen, men på grunn av det funn at det er et potent karsinogen, tapte det interesse. Det funn at 3,3<1>,5,5'-tetraalkylbenzidin ikke var karsinogen og publikasjonen av dette førte til den åpenbare fordel ved å benytte en av disse forbindelser som kromogen i et system av overnevnte type. Slike er angitt i britisk patent nr. 1 464 359. Side 5 i denne publikasjon gjengir de iakttatte resultater med o-tolidin, tetrametylbenzidin og tetraetylbenzidin som kromogen ved 0, 50, 100, ;250, 500 og 1000 mg % glukose i det undersøkte fluidum. ;Hvert av disse materialer slår om fra gult til lys grønt når glukosekonsentrasjonen øker fra 0 til 50 mg %. Når glukose-konsentrasjonen øker mørkner fargen av det oksyderte kromogen således at de iakttatte farger var oliven, sort, sort og mørkegrønn, respektivt. Denne iakttagning belyser et problem med den semi-kvantitative bestemmelse av glukose i vandige fluida, fordi ved høyere konsentrasjoner fremtrer kjente kromogener sorte eller meget mørkegrønne og derved begrenser deres anvendelse som kromogener i semi-kvantitative prøve-innretninger. Semi-kvantitativ bestemmelse av glukose i urin når glukose-konsentrasjonen er høy, dvs. fra ca. 2000 ;til 5000 mg %, er spesielt viktig da uringlukose-konsentrasjoner hos diabetes pasienter kan være så høy som 5% eller høyere. Den kvantitative bestemmelse av uringlukose-konsentrasjoner på 5% er viktig av minst to grunner: ;a) Høye uringlukose-konsentrasjoner er vanligvis forbundet med diabeteskoma. I ulykkessituasjoner er det viktig å be-stemme hvorvidt en bevisstløshet er diabeteskoma. En prøve av denne beskrivelse som indikerer en høy uringlukosekonsen-trasjon vil derfor antyde diabeteskoma, ;b) Uringlukosenivåer blir forhøyet hvis det er blitt admini-strert en utilstrekkelig insulinmengde. En prøve som kan ;finne uringlukosekonsentrasjoner har derfor stor viktighet i den terapeutiske overvåkning av insulindoseringen. ;Bruk av m-anisidin som et kromogen i reaksjoner innbefattende peroksyder og peroksydase er ikke omtalt i litteraturen. To publikasjoner refererer bruk av m-anisidin i systemer inneholdende peroksyd og spormengder av Cu++. De er: Dolmanova, I.F., et al. "Mechanism of the Catalytic Action of Copper in the Oxidation of a Series of Organic Compounds by Hydrogen Peroxide". Vestn. ;Mosk,Univ., Khim 1970, 11 (5), 573. ;Krause, F., "Organic Inhibitors Which are Converted ;Into Active Redox Catalysts by Trace Amounts of Cu<++.>" Oesterr. Chem. Ztg. 68 (2), 54 (1967). ;Det ville være ønskelig og er en hensikt ifølge oppfinnelsen å tilveiebringe en forbedret bestemmelsesmetode av glukose ;i vandig fluida ved glukoseoksydase/peroksydert aktivt stoff-system, hvilken metode er anvendelig for den semi-kvantitative bestemmelse av glukose i konsentrasjoner på 2000 til 5000 mg %. ;Oppfinnelsen vedrører et reagens for bestemmelse av nærvær av glukose i en flytende prøve, hvor sammensetningen omfatter glukoseoksydase, et peroksydativt aktivt stoff og en eller flere kromogener som reagerer med hydrogenperoksyd, idet reagenset erkarakterisert vedat m-anisidin benyttes som kromogen alene eller sammen med et annet kromogen med høy ekstinksjonskoeffisient, spesielt en molar ekstinksjonskoeffisient over 10 000, fortrinnsvis mellom 15 000 og 65 000. Her vil det med uttrykket "fluida" forstås kroppsfluida som blod, serum, blodplasma, urin, spinalfluida og i tillegg vandig oppløsninger inneholdende urin. ;Glukoseindikatoren ifølge oppfinnelsen kan være i form av ;et behandlet papir, flaskereagens, knusbar kapsel inneholdende indikatoren i reagens form, en pille eller tablett som kan has i vann eller alkohol, eller fluida som undersøkes for glukose eller en fast alkoholgel inneholdende reagenset. Når indikatoren er i pille eller tablettform kan indikatoren inneholde et varmeutviklende stoff som litiumklorid som tilveiebringer varme når det has i vann og således akselererer reaksjons hastigheten. ;Den foretrukkede glukoseindikator fremstilles ved å behandle en egnet bærematriks med glukoseindikatorsammensetningen i form av flytende reagens. Uttrykket "bærematriks" refererer enten porøse eller ikke-proøse matrikser som er uoppløselig i og bibeholder sin struktur når de utsettes for vann eller fysiologiske fluida. Egnede porøse matrikser som kan benyttes, innbefatter papir, cellulose, trefsyntetisk harpiksull, vevede eller ikke-vevede tekstiler og lignende. Ikke-porøse matrikser innbefatter glassfibre og organoplast-iske materialer som polypropylen og lignende. Bærematriksen ;, kan fuktes, dyppes , dusjes eller trykkes med den flytende reagenssammensetning og bærematriksen deretter tørkes ved hjelp av egnede innretninger som omgivende eller pressluft-tørket for å gi den tørre reagens/matrikssammensetning. Matriksen kan fortrinnsvis festes på en uoppløselig bære- ;i del som en organoplastisk strimmel eller ;styren, med egnede innretninger som dobbel adhesjonstape for lettere bruk. ;i ;En typisk flytende reagenssammensetning vil inneholde fra 1000 til 1600 internasjonale enheter (I.U:) glukoseoksydase pr. ml, 600 til 1300 I.U. pepperrotperoksydase pr.ml., og fra 10 til 15 mg/ml av m-anisidin som kromogen. 1 en foretrukken utførelsesform anvendes en liten mengde, 0,5 til 1,0 mg/ml av en annen indikator som har en høy ekstinksjonskoeffisient. ;Dette er tilfelle fordi de angitte prøvesysterner som benytter m-anisidin som kromogen i semi-kvantitative avlesninger over et område fra 250 til 5000 mg/dl med fargeomslag ved ca. 250, ;500, 1000, 2000 og 5000 mg/dl. Tilsetningen av en liten mengde av en annen kromogen som har en høy ekstinksjonskoeffisient gir et system som er i stand til å påvise glukose i mindre konsentrasjoner, f.eks. 100 mg/dl, som gir muligheten å differensiere mellom konsentrasjoner på 2000 og 5000 mg/dl, hvilke nivåer normalt er vanskelig, hvis ikke umulig å adskille. ;Den molare ekstingsjonskoeffisient (molar absorbsjon) av annen kromogen er fortrinnsvis over 1.000, fortrinnsvis mellom 15.000 og 65.000. ;Egnede materialer for bruk som annen kromogen innbefatter o-tolidin, benzidin, syringaldazin, diaminofluorin og tetrametylbenzidin. Fortrinnsvis tilsettes tetrametylbenzidin for å tilveiebringe semi-kvantitativ følsomhet ved lave glukosekonsentrasjoner. Da glukosebestemmelsen virker best ved en pH fra 5,0 til 7,0, settes vanligvis en puffer til sammensetningen for å opprett-holde den ønskede pH. ;Stoffer som har peroksydativ aktivitet som er anvendelig ;ifølge foreliggende oppfinnelse kan velges fra forskjellige organiske og uorganiske kilder. Planteperoksydaser som pepperrotperoksydase eller potetperoksydase kan benyttes. Uorganiske forbindelser som har peroksydaseaktivitet innbefatter iodider som natrium og ammoniumiodid og molybdater som kalium og ammoniummolybdater. I tillegg kan det benytter urohemin og et antall andre porfyringstoffer med peroksydativ aktivitet. Andre stoffer som ikke er enzymer, men som har peroksydativ aktivitet innbefatter slike forbindelser som jern, sulfo- ;cyanat, jerntannat, ferro-ferrocyanid, kaliumkromsulfat og lignende. ;Oppfinnelsen skal forklares nærmere ved hjelp av noen eks-empler : ;Eksempel 1 ;Det ble utført et eksperiment for å vise forbedringen i kvantitativ bestemmelse oppnådd ved bruk av indikatoren m-anisidin i overnevnte prøveinnretning. Eksperimentet ble begrenset til å vise forbedringen med glukosekonsehtra-sjoner fra 2000 til 5000 mg/dl- Mens enhetene som anvendes i dette eksempel er mg/dl er det klart at de er ekvivalente til mg% benyttet tidligere. Strimler ble preparert av prøveoppløsninger ved å impregnere Whatman 31 ET papir med den'flytende reagenssammensetning og tørke det behandlede papir ved 50°C i 15 min. ;Det ble fremstilt flere prøveoppløsninger, idet det ble benyttet følgende generelle formel: ; <*>Mindre mengder av glukoseoksydase ble benyttet

ved visse indikatorer. Vann ble tilsatt i disse tilfeller for å bringe totalvolumet til 10 ml.

Emulfor "ON-870" er et ikke-ionisk detergent. Dets formål er å tilveiebringe bedre strimmelfuktbarhet, som, på sin side, tilveiebringer mer jevn fargeutvikling.

Antall av glukoseoksydaseenheter som ble tilsatt ble variert for å møte behovet for hver indikator.Værelsetemperatur-inkubasjonstidene for de fremkomne strimler ble derfor variert bare mellom 60 og 90 sek. Mengdene av glukoseoksydase ble variert for å muliggjøre hvert system til å utvikle omtrent samme mengde farge ved en hver gitt inkubasjonstid. Derfor de systemer som benytter indikatorer med lavere molarekstinksjonskoeffisienter, inneholdt tilsvarende høyere glukoseoksydasekonsentrasjoner. Dette er normalt det som gjøres for å oppnå mere kvantiteringen av en prøvestrimmel-sammensetning. Hvis glukoseoksydasekonsentrasjonen ble holdt lik for alle indikatorer ville strimler som benytter indikatorer med høyere'ekstinksjonskoeffisient utvikle farger så mørke på reaksjon av 2% glukose at 2% og 5% glukosekonsentrasjoner ikke kan adskilles.

Refleksjonsmålinger ble tatt ved den optimale bølgelengde

for hver indikator etter å ha dyppet strimlene i enten 2000 eller 5000 mg/dl glukose i urin. De nærværende reflek-sjonsverdier for de to glukosekonsentrasjoner ble overført til KS verdier. Refleksjonsmålinger kan overføres til K/S verdier ved følgende formel:

hvor K er prøvens absorbsjonskoeffisient, S er matriksens lysspredende koeffisient og R er fraksjonen av innfallende lys reflektert fra reagensbæreren. Dette er en forenklet

versjon av Kubelka-Munk ligningen. K/S verdier står i forhold til refleksjonsmålinger som absorbering til transmitt-eringsmålinger. Disse plotter (K/S i forhold til % glukose) tilveiebringer en mer brukbar sammenligning av indikatorer

med forskjellig e morlar ekstinksjonskoeffisienter. En opptegning av K/S verdier i forhold til glukosekonsentrasjoner på 2000 og 5000 mg/dl gir skrålinjer som tilveiebringer et mål av hver indikators kvantitative kapasitet. Følgende tabell angir beregnede og normaliserte verdier for de opp-nådde skrålinjer.

Helningene ble normalisert til å tilhøre en verdi på 100%

til helningen av m-anisidin. Skrålinjene oppnådd for de andre indikatorer ble deretter oppført som prosenter av skrålinjen opptatt for m-anisidin. Brattere skrålinjer gir bedre kvantitering.. Resultatene oppstilt i tabellen viser at forskjellen mellom fargeintensitetene utviklet som reaksjons på 2% og 5% glukose er vesentlig større for m-anisidin enn for andre indikatorer. Resultatene viser at skrålinjen oppnådd med m-anisidin var i det minste to ganger så stor som den oppnådd med flere strukturert beslektede og strukturelt forskjellige redoks-indikatorer.

Eksempel II

En optimalisert prototyp inneholdende en liten konsentrasjon av tetrametylbenzidin og m-anisidin ble fremstilt som i eksempel I, idet det ble "benyttet følgende ingredienser for å danne en prøveoppløsning for påføring på prøvestrimler: Ytelsen av disse strimler ble vurdert ved bruk av 56 kliniske urintyper. Fargene utviklet av prøvestrimlene som reaksjon på nærvær av glukose i disse prøver ble sammenlignet med et standard fargekart med blokker ekvivalent til 0,0, 100, 250, 500, 1000, 2000 og 500 mg/dl glukose. Prøvestrimlene kunne lett adskille alle disse nivåer. En korrelasjonsplotting sammenligner disse resultater med en heksokinase referens-fremgangsmåte tilveiebragte en lineær regresjon på y = 1,07X + 0,08 og en korreks jonskoef f isient på 0,,93.

i

Claims (5)

1. Reagens for bestemmelse av nærvær av glukose i en flytende prøve, hvor sammensetningen omfatter glukoseoksydase, et peroksydatlvt aktivt stoff og en eller flere kromogener som reagerer med hydrogenperoksyd, karakterisert vedat m-anisidin benyttes som kromogen alene eller sammen med et annet kromogen med høy ekstinksjonskoeffisient, spesielt en molar ekstinksjonskoeffisient over 10 000, fortrinnsvis mellom 15 000 og 65 000.

2. Reagens ifølge krav 1,karakterisert vedat den foreligger i form av en flytende reagensoppløsning inneholdende 1 000-1 600 internasjonale enheter glukoseoksydase pr. ml, 600-1 300 internasjonale enheter pepperrotperoksydase pr. ml og fra 10-35 mg pr. ml m-anisidin, og det andre kromogen er tilstede i en mengde på 0,5-1,0 mg/ml.

3. Reagens ifølge krav 1 og 2,karakterisertved at andre kromogen er benzidin, syringaldazin, diaminofluorin, o-tolidin eller tetrametylbenzidin.

4. Prøveinnretning for bestemmelse av nærvær av glukose i en flytende prøve,karakterisert vedat den omfatter en bærermatriks som er behandlet\ med et flytende reagens ifølge krav 1-3, med etterfølgende fordampning av oppløsningsmidlet for å etterlate en tørr reagenssammensetning.

5. Prøveinnretning ifølge krav 4,karakterisertved at den har form av en prøvestrimmel.