NO159394B - Fremgangsmaate for fremstilling av immunogene kapselformede polyosider fra kapselbakterier. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av immunogene kapselformede polyosider fra kapselbakterier, og det karakteristiske ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er at man gjennomfører en dyrkn ing av kapselbakterier i et syntetisk medium inneholdende mindre enn 0,5 vekt% proteinhydrolysat, mikroorganismene fjernes ved sentrifugering, supernatanten filtreres på en membran som tilbakeholder molekyler med en molekylvekt på 100.000 dalton eller mer hvorved man erholder et tilbakeholdt material rikt på kapselformede polyosider, og proteinene, nukleinsyrene og lipidene i dette material fjernes ved enzymatisk hydrolyse, ekstraksjon, dialyse og filtrering, og det kapselformede polyosid gjenvinnes ved utfelling.

Disse og andre trekk ved oppfinnelsen fremgår av patent-kravene.

De nevnte polyosider er indikert for anvendelse ved fremstilling av vaksine.

Det er kjent å bekjempe smittsomme sykdommer på to forskjellige- måter, nemlig enten ved direkte innvirkning mot den pato-gene mikrobe (antibiotika, antiseptika) eller ved en indirekte virkning via forsterkning av de systemiske forsvarsmekanismer (vaksinering, seroterapi-, immun-modulering) .

Bruken av midler som ville utøve en direkte innvirkning hind-res ofte av visse vanseklighéter som kan begrense deres virkning (spesielt giftigheten av molekylet og bakterieresistens).

I motsetning til dette har forsterkning av de systemiske forsvarsmekanismer via ervervelse av spesifikke antistoffer av-gjorte fordeler, spesielt med hensyn til varigheten av be-skyttelsen og spesifisiteten. Vaksinering med hele mikroorganismer er imidlertid ikke alltid uten ulemper som hyper-sensitiveringsfenomener, dårlig toleranse eller pyrogenisitet er blant de hyppigste. De tilskrives nærværet av multiple antigener fra bakterien.

Det er derfor helt naturlig at forskere spesifikt har rettet sine anstrengelser mot isolering av antigenet som er ansvarlig for de beskyttende antistoffer.

I tilfellet med kapselbakterier finnes de kapselformede polyosider å være immunogene i mennesker med få bireaksjoner.

En første anvendelse i mennesker av slike kapselformede polyosider er utviklingen av antimeningokokk-vaksine A og C og ganske nylig av en polyvalent vaksine inneholdende de rensede polyosider av 14 serologe typer av pneumococcus.

Flere andre kapselbakterier er involvert i en rekke patolog-iske prosesser, som f.eks.:

Haemophilus influenzae, type b

Klebsielle pneumoniae,

Escherichia coli, eller

Streptococci , gruppe B

og tilsvarende vaksiner kan fremstilles fra deres kapselformede polyosider.

I europeisk patentansøkning 0 002 404 er det beskrevet en fremgangsmåte for fremstilling av kapselformede polyosider fra Streptococcus pneumoniae.

Ved den nevnte prosess dyrkes mikroorganismen med kompleks dyrkningsmedium. Etter inaktivering med fenol og uten separering av mikroorganismene fra dyrkningsmediet tilsettes en alkohol som etanol, forurensningene som er utfelt separeres, og en annen tilsetning av alkohol gjennomføres for utfelling av polyosidet. Forurensningene (proteiner, nukleinsyre) fjernes så fra det re-suspenderte polyosid ved hjelp av en enzym-behandling eller ved behandling med et kationisk over-flateaktivt middel (citrimoniumbromid), idet disse behand-linger kan kompletteres ved hjelp av en diafiltrering.

Denne prosess er i realiteten ikke generelt anvendelig på grunn av at de spesifikke betingelser vedrørende hvert trinn varierer med det polyosid som skal separeres. Det er således nødvendig å gjennomføre pre-tester for å bestem-me betingelsene de forskjellige utfellinger. I tillegg kan denne prosess bevirke en nedbrytning av polyosid-kjed-ene på grunn av bruken av visse medier.

Formålet for den foreliggende oppfinnelse er å tilveie-bringe en mer generelt anvendelig, enklere og mindre ned-brytende fremgangsmåte for fremstilling av polyosider med meget høy molekylvekt.

Ved et vesentlig trekk ved oppfinnelsen gjennomføres bak-teriedyrkingen i syntetisk eller halvsyntetisk medium.

Ved "syntetisk medium" menes vandige oppløsninger av kjente kjemikalier med lav molekylvekt som er til stede i bestemte mengder.

Med "halvsyntetisk medium" menes et medium analogt med det først nevnte men som ytterligere inneholder en liten mengde (vanligvis mindre enn 0,5. vekt%) naturlig forekommende materialer som f.eks. protein-hydrolysater.

Ved oppfinnelsen gjennomføres ekstraksjon av polyosidene

i supernatanten av kulturen etter fjernelse av mikroorganismene og ikke fra det totale dyrkningsmedium.

Filtrering gjennom en membran med porøsitet som er i stand . til å holde tilbake molekyler med en molekylvekt på 100,000 dalton eller mer, gjør det mulig å oppnå hurtig et tilbake-holdende material omfattende overveiende polyosidene, sam-men med mindre mengder proteiner, nukleinsyrer og lipider.

Fjernelse av forurensningene gjennomføres fordelaktig på følgende måte: det tilbakeholdte material underkastes en enzymhydrolyse, typisk med en blanding av Pronase, RNase og DNase, en butanol-kloroformblanding (foretrukket en 1:1 blanding på volumbasis) tilsettes dertil,den vandige fase separeres, den vandige fase underkastes en dialyse hvoretter det resulterende material filtreres gjennom en membran som holder tilbake molekyler med en molekylvekt på 100,000 dalton eller mer.

Det rensede polyosid kan separeres på kjent måte, fra det bibeholdte material ved utfelling med en alkohol som f. eks. metanol.

De følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.

EKSEMPEL 1

Pneumokokk-polyosid, type 3.

En frysetørket stamme av Streptococcus pneumoniae, type 3, anvendes som utgangsmaterial.

a) Fremstilling av kimmaterialer.

Den frysetørkede stamme tilsettes til T-buljong.

Dyrking gjennomføres i 16 timer ved 37°C.

5 ml av den resulterende kultur blandes med 15 ml sterili-sert skummet melk. Materialet fylles inn i ampuller i en mengde på 0,5 ml/ampulle og frysetørkes og de frysetørkede materialer lagres ved +4°C.

b) Forkultur.

Kimmaterial (frysetørket material lagret i en ampulle) tilsettes til en kolbe inneholdende 200 ml av det halvsyntetiske medium beskrevet i det følgende, og dyrkning" gjennomføres ved 37°C i 6 timer.

Dyrkningsmedium:

c) Dyrking.

Selve dyrkingen gjennomføres i en gjæringsbeholder inneholdende 18 liter av dyrkningsmediet definert under b) . Poding gjennomføres i en mengde på 1% med forkulturen.

Dyrkningen gjennomføres ved 37°C ved pH 7,4 med omrøring

i en tidsperiode på vanligvis omtrent 16 timer , til slutten av den eksponentielle vekstfase.

d) Separering av supernatanten.

Ved slutten av den eksponentielle fase separeres supernatanten med en gang ved kontinuerlig sentrifugering med 5000 omdreininger pr. minutt. Supernatanten underkas-

tes en steriliserende filtrering gjennom "Millipore" membran 0,22 ,u og anvendes med en gang eller lagres ved -25°C.

e) ' Ekstraksjon.

Et volum av supernatant på omtrent 20 liter konsentreres

til et volum på 2 liter ved filtrering gjennom en "Millipore" IO<5> membran som er i stand til å tilbakeholde molekyler med en molekylvekt på 100,000 dalton eller mer.

Det resulterende tilbakeholdte material filtreres gjennom

en "Diaflo" 10 5 membran etter tilsetning av 5 liter apyro-genisk sterilt destillert vann for å komplettere separeringen i samsvar med molekylvekten.

Flere påfølgende diafiltreringer tillater en konsentrasjon til omtrent 350 ml som så frysetørkes i 1-liters kolber.

Alle de ovennevnte operasjoner gjennomføres ved en tempera-tur på opptil maksimalt 8°C.

f) Rensing.

Det frysetørkede mellomprodukt oppløses i 900 ml fosfatbuffer 0,001 M - pH 7. 20 mg RNase type 1, 20 mg pankreatin-DNase og 180 ^ul (20 enheter/ml) RNase Tl tilsettes dertil. Materialet inkuberes i 4 timer ved 37°C hvoretter 170 mg Pronase type 9,

800 mikroliter ren fenol og 2 dråper toluen tilsettes dertil.

Blandingen inkuberes over natten ved 37°C. Reaksjonen avsluttes og et like stort volum (900 ml) butanol-kloroform (1:1) tilsettes dertil. Det resulterende material omrøres i 1 time. De to faser dekanteres ved sentrifugering med 10,000 omdreining pr. minutt i 30 minutter.

Den vandige fase som inneholder polyosidet dialyseres mot

20 liter apyrogent sterilt destillert vann i en tidsperiode på omtrent 60 timer.

Dialysatet underkastes en diafiltrering gjennom en "Amicon" 10 5 membran. Volumet av det tilbakeholdte material er 1140 ml. 160 ml 40* natriumacetat (endelig konsentrasjon 5%) og 3,9 liter absolutt etanol (3 volumandeler) tilsettes så.

Bunnfallet samles ved sentrifugering ved 12000 omdreininger pr. minutt i 30 minutter. Bunnfallet oppløses i apyrogent destillert vann. Den resulterende oppløsning fylles i glass, hvert inneholdende 4 ml oppløsning. Materialet frysetørkes under vakuum til å gi 9 g av det ønskede produkt. Dette produkt er det rensede polysakkarid som inneholder:

Alle de ovennevnte trinn (bortsett fra inkubasjonene) gjen-nomføres mellom 0 og +4°C.

EKSEMPEL 2

Pneumokokk-polyosid type 23.

En frysetørket stamme av Streptococcus pneumoniae type 23 anvendes som utgangsmaterial.

Dyrkningen og separeringen av supernatanten gjennomføres under betingelsene definert i eksempel 1 (trinn a - d).

Ekstraksjon og rensing av polyosidet gjennomføres på følg-ende måte:

e) Ekstraksjon.

15 liters volum supernatant konsentreres til et volum på 1,5

liter under betingelsene definert i eksempel l-e.

Tre påfølgende diafiltreringer gjør det mulig å konsentrere og deretter frysetørke til å gi 1,8 g av et material med følgende sammensetning:

f) Rensing.

Det frysetørkede mellomprodukt opptas i 200 ml 0,01M fosfatbuffer (pH 7). 1 mg RNase, 1 mg DNase og 20 enheter RNase Tl/ml tilsettes. Det resulterende material inkuberes ved 37°C i 3 timer hvoretter Pronase type 8 (180 ^ug/ ml), fenol (1 ^ul/ml) og toluen (1 dråpe) tilsettes dertil. Hele blandingen inkuberes over natten ved 37°C.

Tre påfølgende ekstråksjoner gjennomføres med et likt

volum (200 ml) butanol-kloroform 1:1. Den resulterende blanding omrøres så mekanisk.

Den endelige vandige fase dialyseres i omtrent 60 timer

mot 4 liter apyrogent sterilt destillert vann.

Dialysatet filtreres gjennom "Amicon" 10 5 membran. Materialet konsentreres til 50 ml. Absolutt etanol (3 volumdeler) og natriumacetat (endelig konsentrasjon 5%) tilsettes dertil og blandingen settes bbrt over natten ved -20°C.

Det resulterende bunnfall samles ved sentrifugering. Bunnfallet oppløses i apyrogent sterilt destillert vann og fryse-tørkes så til å gi 1050 g av et produkt inneholdende:

Alle de ovennevnte trinn (med mindre annet er angitt) gjen-nomføres mellom 0 og +6°C.

EKSEMPEL 3

Pneumokokk-polyosid type 19.

En frysetørket stamme av Streptococcus pneumoniae type 19 anvendes som utgangsmaterial.

Dyrkningen og separeringen av supernatanten gjennomføres under betingelsene angitt i eksempel 1 (trinn a - d).

Ekstraksjon og rensing av polyosidet gjennomføres på følg-ende måte:

e) Ekstraksjon.

Under anvendelse av metoden i eksempel l-e inndampes et 75

liters volum supernatant til 2 liter ved hjelp av tre diafiltreringer til å gi 2,3 g med følgende sammensetning:

f) Rensing.

Det frysetørkede mellomprodukt oppløses i 150 ml 0,01M

forfatbuf fer (pH 7) . DNase (3 mg) , RNase (3 mg) og RNase Tl (30 yul) tilsettes dertil, og det resulterende material inkuberes så ved 37°C i 4 timer hvoretter Pronase (62 mg) fenol (150 yul) og toluen (1 dråpe) tilsettes. Blandingen får reagere over natten ved 37°C.

Proteinfjernelse gjennomføres med et likt volum (3 påfølg-

ende ekstraksjoner) med kloroform -butanol 1:1.

Den vandige fase dialyseres i 60 timer mot 4 liter apyrogent sterilt destillert vann. Dialysatet underkastes en diafiltrering gjennom "Amicon" XM 100 membran.

Det tilbakeholdte material utfelles med 3 volumdeler etanol inneholdende 5* natriumacetat.

Etter oppbevaring over natten i en fryser oppløses bunnfallet i apyrogent sterilt destillert vann og frysetørkes til å gi 7 30 mg produkt inneholdende:

Også her gjennomføres alle de ovennevnte trinn (bortsett fra inkubasjonene) mellom 0 og +4°C.

EKSEMPEL 4

Pneumokokk-polyosid type 1.

En frysetørket stamme av Streptococcus pneumoniae type 1 anvendes som utgangsmater ial. Dyrkningen og separeringen av supernatanten gjennomføres under betingelsene definert i eksempel 1.

Ekstraksjon og rensing av polyosidet gjennomføres på følg-ende måte:

e) Ekstraksjon.

100 liter av dyrkningssupernatanten underkastes en diafiltrering gjennom "Pellicon"-kassetter ("Millipore" IO5 membran) . Volumet av det endelige tilbakeholdte material er 3 liter som frysetørkes i kolber til å gi 6,1 g produkt

inneholdende:

f) Rensing.

Det resulterende produkt oppløses i 800 ml apyrogent sterilt destillert vann og til oppløsningen tilsettes:

16 mg RNase

16 mg DNase

- 160 / Ul RNase Tl.

Materialet inkuberes ved 37°C i 4 timer hvoretter fenol (300 ^ul) toluen (2 dråper) og Pronase type 8 (150 mg) tilsettes dertil og hele blandingen inkuberes over natten ved 37°C. Proteinene ekstraheres med et like stort volum kloroform-butanol (1:1). Den vandige fase dialyseres i 60 timer. Diafiltreringen gjennomføres gjennom "Amicon" XM 100 membran. Volumet av det endelige tilbakeholdte material er 150 ml. Oppløsningen felles med 3 volumdeler kald etanol inneholdende 5% natriumacetat.

Fraksjonen opptas i 250 ml apyrogent sterilt destillert vann og frysetørkes i kolber under vakuum til å gi 3,7

g renset pdlyosid inneholdende:

Diffusjonskoeffisienten i K -gelen av polyosidet er 0,05. Molekylvekten er derfor minst 2 x 10 7.

EKSEMPEL 5

Polyosid frå K. pneumoniae, type 2.

En stamme av Klebsiella pneumoniae type 2 anvendes som utgangsmaterial.

Dyrkningen og separeringen at supernatanten gjennomføres under betingelsene gjennomført i eksempel 1 (trinn a - d), men hvor det som dyrkningsrnedium anvendes følgende synte-tiske medium:

Ekstraksjon og rensing av polyosidet gjennomføres på følg-ende måte:

e) Ekstraksjon.

90 liter av dyrkningssupernatanten anvendes. Diafiltrering

gjennomføres gjennom "PeULcon"-kassetter (2 kassetter, 10<5 >membran). Etter konsentrasjon til 1,5 liter vaskes materialet 3 ganger med 10 liter vann. Det endelige tilbakeholdte material er 2,6 liter. Materialet frysetørkes i kolber til å gi 6,1 g produkt som inneholder:

f) Rensing.

Det resulterende produkt oppløses i 350 ml vann. Dertil tilsettes :

7 ml 0,5M fosfatbuffer, pH 7,0

7 mg RNase

7 mg DNase

- 70 ^ul RNase Tl

(før filtrering av enzymene gjennom 0,22 yu).

Blandingen inkuberes ved 37°C i 4 timer hvoretter Pro-tease type 8 (70 mg), fenol (350 <y>ul) og toluen (1 dråpe) tilsettes, og blandingen inkuberes over natten ved 37°C. Reaksjonen avsluttes og proteinfjernelse kompletteres ved 3 ekstraksjoner med butanol-kloroform (1:1). Den vandige fase dialyseres i 60 timer mot apyrogent sterilt destillert vann. Diafiltrering gjennomføres gjennom "Amicon" XM 100 membran. Volumet av det endelige tilbakeholdte material er 150 ml. Oppløsningen felles med 3 volumdeler kald absolutt etanol inneholdende 5* natriumacetat. Bunnfallet samles ved sentrifagering, oppløses i 250 ml vann og frysetørkes deretter i kolber under vakuum. Det rene polyosid oppnådd på denne måte inneholder:

K av det oppnådde polyosid er 0,1. Molekylvekten er så-

7

ledes mer enn 10 .

EKSEMPEL 6

Polyosid fra H. influenza, type b.

En frysetørket stamme av Haemophilus influenzae type b anvendes som utgangsmaterial.

Dyrkningen og separeringen av superr'-anten gjennomføres under betingelsene definert i eksempel 1 (trinn a - d) , men urider anvendelse av følgende halvsyntetiske dyrkningsmedium:

Ekstraksjon og rensing av polyosidet gjennomføres på følg-ende måte:

e) Ekstraksjon.

30 liter av dyrkningssupernatanten anvendes. Diafiltrer-

ing gjennomføres gjennom "Millipore" 100,000 membran (2 kassetter) . Den første konsentrasjon gir et volum på 1 liter. Materialet vaskes med 3 x 10 liter sterilt destillert vann. Det konsentreres til 1,3 liter og frysetørkes i kolber til å gi 3,9 g av et produkt som inneholder:

Det således oppnådde produkt oppløses i 200 ml vann.

Etter filtrering gjennom 0,22 ^u, tilsettes følgende material.

4,5 ml 0,5M fosfatbuffer, pH7

4 mg RNase

4 mg DNase

40 ^ul RNase Tl

Hele blandingen inkuberes ved 37°C i 4 timer hvoretter Pro-tease type 8 (65 mg), fenol (200 ^,ul) og toluen (2 dråper) tilsettes og det resulterende material inkuberes over natten ved 37°C. Reaksjonen avsluttes med tre ekstraksjoner med butanol-kloroform (1:1). Den vandige fase samles ved sentrifugeiring ved 12,000 omdreininger pr. minutt ved +4°C

i 30 minutter. Den dialyseres i 60 timer mot apyrogent sterilt destillert vann (hyppige endringer i dialysemediet), Konsentrering gjennomføres gjennom "Amicon" XM 100 membran (2 vaskinger x 100 ml). Volumet av diafiltratet er 100 ml. Diafiltratet felles ved volumdeler kald absolutt etanol inneholdende 5% natriumacetat. Bunnfallet, samlet ved sentrifugering, opptas i 100 ml apyrogent sterilt destillert vann. Oppløsningen frysetørkes i kolber under vakuum til å gi 1,3 g rent polyosid som inneholder:

Ribose: Ribitol: Fosfor: 0,9 : 1 : 0,98 (teoretisk for-

hold 1:1:1).

KD er nær 0,1 tilsvarende en molekylvekt på omtrent 10 <7>.

De rensede immunogene kapselformede polyosider oppnådd i sam-

svar med oppfinnelsen kan anvendes for fremstilling av vaksiner for tilførsel til mennesker og dyr for preven-

tiv (eller helbredende) formål. Vaksinene kan fremstilles ved innlemmelse av de rensede kapselformede polyosider oppnådd i.samsvar med oppfinnelsen i fysiologisk holdbare flytende bærere som f.eks. en fysiologisk saltløsning eller vann for injeksjon.

For dette formål kan et eller foretrukket flere rensede kap-self ormede -polyosider fremstilt i samsvar med oppfinnelsen og fra forskjellige serologiske typer innlemmes. I til-

legg kan polyvalente vaksiner fremc_illes ved innlemmelse av to eller flere rensede kapselformede polyosider oppnådd fraforskjellige typer mikroorganismer.

Resultatene av tester som viser den immunogene aktivitet

av polyosidene fremstilt i samsvar med oppfinnelsen er

gitt i det følgende.

a) Titrering av serum-antistoffer i mus

OC) Hannmus av typen Swiss med 20 g kroppsvekt ble anvendt

i grupper på hver 10 dyr.

En sammenligningsgruppe ble ikke gitt noen behandling.

En gruppe ble behandlet ved I.P. tilførsel i en mengde på flere doser av polyosidet i eksempel 1 pr. dyr.

Titrering av de hemagglutinerende antistoffer ble gjennom-ført i samsvar med teknikken beskrevet i litteraturen under anvendelse av røde blodlegemer fra sauer sensitivert med polyosidet ved hjelp av kromklorid.

Resultatene gjengitt i tabell I viser en økning i serum-nivå av hemagglutinerende antistoffer i forhold til sam-menligningsdyrene, sammen med en konvensjonell immunitær paralyse ved høyé doseringer.

/o) - Analoge tester ble gjennomført i mus med polyosidet fra eksempel 5 (polyosid fra Klebsiella pneumoniae, type 2).

De oppnådde resultater er gitt i tabell II.

b) Titering aV serum-antistoffer i rotter.

Samme undersøkelse ble gjennomført med hannrotter av typen

Sprague Dawley med 400-500 g kroppsvekt.

Gruppene på 10 dyr ble tilført en I.P. injeksjon av 2 og 20/Ug .polyosid fra Streptococcus pneumoniae, type 3 pr. dyr. Titering av de hemagglutinerende antistoffer ble gjennom-ført den 4., 6. og 14. dag etter tilførselen.

De oppnådde, resultater er gitt i tabell III.

I samsvar med litteraturen øket serum-antistoffnivået

gradvis til å nå et maksimalt nivå den 6. dag.

c) Spesifikk beskyttelse.

0C-grupper av 10 hannmus av typen Swiss ble immunisert med polyosidet fra Streptococcus pneumoniae type 1, oppnådd i samsvar med metoden fra eksempel 4, ved subkutan tilførsel (2 injeksjoner med 1 ukes mellomrom). Injisterte doser: 0(47 - 4,7 - 47 og 470 ^ug/kg.

På den 10. dag etter den annen immunisering ble dyrene infisert med virulent pneumococcus ( type 1) ved subkutan tilførsel (1250 mikroner/dyr).

Etter 10 døgns observasjon var dødeligheten som følger:

/3-grupper av 10 hannmus Swiss ble immunisert med KP^ polyosidet ved subkutan tilførsel (2 injeksjoner med 1 ukes mellomrom, injisterte doseringer: 53 - 533 - 5332 ^ug/kg).

På den 8. dag etter den siste behandling ble Klebsiella pneumoniae type 2 stamme injisert i <f>yrene i en mengde på 650 mikroorganismer/dyr. Etter 10 døgns observasjon var dødeligheten funnet å være følgene^-

Polyosidene fremstilt i samsvar med oppfinnelsen er typisk nyttige for fremstilling av følgende vaksiner: a) vaksiner for preventiv eller helbredende behandling av akutte og kroniske respirasjonssykdommer, omfattende

et eller flere av de rensede polyosider svarende til hver av de følgende mikroorganismer:

Streptococcus pneumoniae

Haemophilus influenzae, type b

Klebsiella pneumoniae

Escherichia coli

For eksempel:

b) Antipneumokokk-vaksine omfattende de rensede polyosider fra følgende typer av Streptococcus pneumoniae: 1, 3, 4, 6A, 7F, 8, 9N, 12F, lk, 18L, 19F, 23, 2, 11A, 15F.

For eksempel:

blanding omfattende 50;ug aktivt material i et volum nå 0 05 ml fysiologisk løsning. I «Li», o-f.tt.nd. «,»« a*tivt »t.rl.l i - - på 0,5 ml fysiologisk løsning.

Claims (4)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av immunogene kapselformede polyosider fra kapselbakterier, karakterisert ved at man gjennomfører en dyrkning av kapselbakterier i et syntetisk medium inneholdende mindre enn 0,5 vekt% proteinhydrolysat, mikroorganismene fjernes ved sentrifugering, supernatanten filtreres på en membran som tilbakeholder molekyler med en molekylvekt på 100.000 dalton eller mer hvorved man erholder et tilbakeholdt material rikt på kapselformede polyosider, og proteinene, nukleinsyrene•og lipidene i dette material fjernes ved enzymatisk hydrolyse, ekstraksjon, dialyse og filtrering, og det kapselformede polyosid gjenvinnes ved utfelling.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, for fremstilling av kapselformende polyosider fra Streptococcus pneumoniae type 3,

23, 19 og 1, karakterisert ved at man som dyrkningsmedium anvender et medium med den følgende sammensetning:

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, for fremstilling av kapselformede polyosider fra Klebsiella pneumoniae type 2, karakterisert ved at man som dyrkningsmedium anvender et medium med følgende sammensetning:

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, for fremstilling av kapselformede polyosider fra Haemophilus influenzae type b, karakterisert ved at som dyrkningsmedium anvender et medium med følgende sammensetning: