NO153548B - Fremgangsmaate for automatisk celle-volumbestemmelse. - Google Patents

Description

Fremgangsmåte til fremstilling av et nytt, terapeutisk aktivt polypeptid.

Foreliggende oppfinnelse angår en

fremgangsmåte for fremstilling av et nytt,

terapeutisk aktivt polypeptid med formel I

og dets syreaddisj onssalter, og det særegne ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er at et nonapeptid med formel V oksyderes i vandig oppløsning ved en pH av fra 4 til 9, hvoretter eventuelt de erholdte forbindelser på i og for seg kjent måte overføres i sine syreaddisj onssalter. Nonapeptidet av formel V kan for eksempel fremstilles ved at et heksapeptid-derivat med den alminnelige formel II i hvilken R' er en ved peptidsynteser for beskyttelse av sulfhydrylgruppen vanlig anvendt gruppe, og R" er en ved peptidsynteser for beskyttelse av aminogruppen vanlig anvendt gruppe, omsettes med et reaksjons-dyktig derivat av en fri syre med den alminnelige formel III, hvor R' og R" har den ovennevnte betyd-ning, til et nonapeptid-derivat med den alminnelige formel IV

hvoretter dette ved avspaltning av beskyt-telsesgruppene R' og R" omda,nnes til non-apetidet med formel V.

For beskyttelse av sulfhydrylgruppen anvendes fortrinnsvis fenyl-, benzyl-, p-brom-benzyl-, p-klor-benzyl-, p-nitro-benzyl- eller på xylylgruppen, og for beskyttelse av aminogruppen anvendes fortrinnsvis karbobenzoksy-, karbo-p-klor-benzyloksy-, p-toluen-sulfonyl- eller trifenylmetylgrup-pen.

Nonapeptidderivatet med den alminnelige formel IV kan man imidlertid ikke bare fremstille på den ovenfor beskrevne måte, men også ved kondensasjon av to andre polypeptider, henholdsvis et polypeptid og en aminosyre i form av deres beskyttede derivater.

Utgangsstoffene for fremstilling av nonapeptid-derivatet med formel V fåes, i den utstrekning de tidligere ikke er kjent, ved hjelp av innen peptidkjemien vanlig anvendte metoder, hvorved aminosyrene enkeltvis eller etter foregående dannelse av mindre peptidenheter knyttes til hver-andre.

Oksydasjonen av nonapeptidet med formel V til det ønskede sluttprodukt med formel I gjennomføres fortrinnsvis ved til-føring av luft, oksygen, hydrogenperoksyd eller kaliumferricyanid.

Det oppnådde polypeptid med formel I kan overføres til sine syreaddisj onssalter på i og for seg kjent måte ved omsetning med uorganiske eller organiske syrer. Som syrer kan anvendes eksempelvis klorhy-drogen-, bromhydrogen-, svovel-, fumar-, eple-, malein-, eddik- og vinsyre.

Forbindelsen med formel I har en like sterk vasokonstriktiv virkning som de naturlige vasopressiner, fra hvilke den nye forbindelse skiller seg ornitin og i stedet for tyrosin inneholder ved at den i stedet for lysin (vasopressin fenylalanin, kfr. følgende skjematiske opp-fra svin, formel VI a) hhv. arginin (vaso- stilling,

pressin fra kveg, formel VI b) inneholder

Ved forbindelsen med formel I mangler imidlertid, i motsetning til de naturlige vasopressiner, den antidiuretiske virk-ningskomponenten i stor utstrekning, slik at forbindelsen med formel I kan anvendes i terapien som en substans med en ønsket vasokonstriktiv effekt. Den spesifikke vasokonstriktive virkning oppnås ved direkte påvirkning av karmuskulaturen, slik at forbindelsen med formel I — i motsetning til adrenalin og noradrenalin — ikke frem-kaller noen vegetatlv-nervøse bivirkninger. Den selektive vasokonstriktive effekt av forbindelsen med formel I var overrasken-de, da strukturen av ornitinresten er lik den tilsvarende for lysin og arginin, og man kunne derfor vente at også egenskapene for den nye forbindelse med formel I tilsvarte egenskapene for begge de naturlige hormoner.

Hovedanvendelsesområdet for den nye

forbindelse I er i profylaksen og terapien for parenchymatøse blødninger, hvorved i

infiltrasjonen av vevet med forbindelsen I resulterer i en uttalt ischemiserende virkning (lokal blodmangel). Forbindelsen med formel I finner særlig anvendelse ved ki-rurgiske inngrep i øre-, nese-, hals-medisi-nen, gynekologien og fødselshjelpen, urolo-gien og tannmedisinen. Den tilsettes for dette enten lokal-bedøvelsesrnidlet eller fortynnes ved operasjoner under alminnelig narkose med fysiologisk koksaltoppløsning og anvendes til infiltrasjon. Forbindelsen med formel I kan også anvendes oralt for terapeutisk behandling av bestemte tilfel-ler av hypotoni, eller behandling av kol-laps- og sjokktilstander.

Den nye polypeptid med formel I, som i det etterfølgende er benevnt Fe2-Orn8-vasopressin, er forskjellig fra den i det østerrikske patentskrift nr. 223 754 beskrevne forbindelse, som i det etterfølgende er benevnt Fe2-Lys8-vasopressin, ved at den i stilling 8 fremviser en omitinrest og ikke en lysinrest, skjematisk anskueliggjort ved

Det fremgår tydelig av den etterfølg-ende tabell at ornitin-gruppen i stilling 8 bevirker betydelige endringer i de farma-kologiske egenskaper like overfor det tidligere kjente f enylalanin2-Lys8-vasopressin. De vasopressinliknende egenskaper ble ut-prøvet med blodtrykk i rotter, tilsvarende forskriftene i Brit. Farmakopoeia, og på hemning av diuresen i med alkohol nar-kotiserte rotter som var tilført vann. Som sammenlikningsf orbindelse tj ente den tredje internasjonale HHL-standard.

Aktiviteter i IEjmg.

Det fremgår tydelig av den ovenstående tabell at virkningen på blodtrykket av Fe2-Orn8-vasopressin er omtrent 10 ganger sterkere enn virkningen av Fe2-Lys8-vasopressin. Imidlertid er også forholdet mel-lom den pressoriske aktivitet og den antidiuretiske aktivitet ved Fe2-Orn8-vasopressin vesentlig gunstigere enn ved Fe2-Lys8-vasopressin.

Det i henhold til oppfinnelsen frem-stilte, tidligere ukjente polypeptid med formel I, kan anvendes som fri base eller som et salt av en organisk eller uorganisk syre, enten som legemiddel i seg selv, eller.i tilsvarende legemiddelformer for oral, paren-teral, enteral, eller intranasal tilførsel. For fremstilling av egnede legemiddelformer anvendes forbindelsen sammen med uorganiske eller organiske farmakologisk in-differente hjelpestoffer. Som hjelpestoffer anvendes, f. eks. for tabletter og drageer, melkesukker, stivelse, talkum, stearinsyre etc; for tyktflytende siruper, rørsukker-, invertsukker-, glykoseoppløsninger etc; for injeksjonspreparater: vann, alkohol, glyce-rol, planteoljer etc; for suppositorier: naturlige eller herdede oljer og vokser etc. Preparatene kan ytterligere inneholde egnede konserverings-, stabiliserings-, fukte-midler, oppløsningsformidlere, søtnings- og fargestoffer, aromabestanddeler etc. I de etterfølgende eksempler er temperaturan-givelsene i °C.

Eksempel 1.

a) N- a- karbobenzoksy- N- b- p- toluen-sulfonyl- L- ornityl- glycin- etylester.

Man løser 104 g N-a-karbobenzoksy-N-f>-p-toluensulfonyl-L-ornitin og 27 g glycin-etylester i 450 ccm acetonitril, avkjøler ved 0°C, tilsetter 51 g dicykloheksyl-karbodi-imid og rister 4 timer ved romtemperatur. Det utfelte dicykloheksyl-urinstoff frafiltreres og vaskes med acetonitril1. Det sam-lede filtrat inndampes i vakuum. Resten krystalliseres etter tilsetning av petroleter. Etter omkrystallisasjon fra n-propanol, fås 93 g N-a-karbobenzoksy-5-p-toluensulfonyl-L-ornityl-glycin-etylester. Smeltepunkt

135°C. (a) tj--—! 0 (96 pst. etanol).

b) N- karbobenzoksy- L- prolyl- N- b- p-toluensulfonyl- L- ornityl- glycin- amid. 90 g N-cx-karbobenzoksy-N-S-p-toluen-sulfonyl-L-ornityl-glycin-etylester løses i 800 ccm vannfri eddiksyre som er mettet med hydrogenbromid. Man lar det hele stå 1 time ved 20°C, avdamper i vakuum ved under 40°C og vasker resten grundig med dietyleter. Resten løses i 500 ccm acetonitril, tilsettes 25 ccm trietylamin og 43 g N-karbobenzoksy-L-prolin, avkjøler ved 0°C, tilsetter ytterligere 35,5 g dicykloheksylkar-bodiimid og rister over natten ved 20°C. Etter frafiltrering av dicykloheksylurin-stoffet inndampes filtratet i vakuum ved 30°C, restes løses i eddikester og denne oppløsningen vaskes med svovelsyre og vandig ammoniakk. Etter tørring over natri-umsulfat avdampes eddikesteren i vakuum og resten løses i 1 liter absolutt etanol. Løsningen avkjøles ved 0°C, mettes med ammoniakk og får henstå over natten ved 20°C. Etter inndamping i vakuum ved 30°C omkrystalliseres resten fra acetonitril. Man får 58 g N-karbobenzoksy-L-prolyl-N-ft-p-toluensulfonyl-L-ornityl-glycinamid.

Smeltepunkt 122°C. (Under spalting).

(0)22= —-46° (95 pst. iseddik).

c) N- karbobenzoksy- L- glutaminyl- L-asparaginyl- S- benzyl- L- cysteinyl-L- prolyl- N- b- p- toluensulfonyl- L-ornityl- glycin- amid. 100 g N-karbobenzoksy-L-prolyl-N-5-p-toluensulfonyl-L-ornityl-glycinamid lø-ses i 500 ccm vannfri eddiksyre som er mettet med hydrogenbromid, lar henstå 1 time ved 20°C og avdamper i vakuum ved under 40°C. Resten vaskes grundig med dietyleter, og settes deretter til en løsning av 100 g N-karbobenzoksy-L-glutaminyl-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-azid, og 26 ccm trietylamin i 1000 ccm dimetylformamid. Det hele hensettes over natten ved 20°C, det tilsettes 3000 ccm eddikester, bunnfallet frafiltreres og det vaskes med eddikester. Det fås da 105 g N-karbobenzoksy-L-glutaminyl-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-N-5-p-toluensulfonyl-L-ornityl-glycin-amid. Smeltepunkt 193° C. (a) ^ = —39° (dimetylformamid). d) N- karbobenzoksy- S- benzyl- L- cysteinyl- L- fenylalanyl- L- fenylalanyl- L-glutaminyl- L- asparaginyl- S- benzyl-L- cysteinyl- L- prolyl- N- h- p- toluen-sulfonyl- L- ornityl- glycinamid.

50 g N-karbobenzoksy-L-glutaminyl-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-N-5-p-toluensulfonyl-L-ornityl-glycinamid løses i 250 ccm vannfri eddiksyre som er mettet med hydrogenbromid og hensettes 1 time ved 20°C. Etter avdamp-ning av oppløsningsmidlet i vakuum ved under 40 °C vaskes resten grundig med dietyleter og tilsettes en oppløsning av 31,5 g

N-karbobenzoksy-S-benzyl-L-cysteinyl-L-fenylalanyl-L-fenylalanin-azid og 7,5 ccm trimetylamin i 250 ccm dimetylformamid. Det hele hensettes i 2 dager ved 20°C, tilsettes derpå 1000 ccm eddikester og bunnfallet vaskes med eddikester. Etter tørring i vakuum ved 30°C, vaskes produktet med varm metanol. Det fås 45 g N-karbobenzoksy-S-benzyl-L-cysteinyl-L-fenylalanyl-L-fenylalanyl-L-glutaminyl-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-N-8-p-toluensulfonyl-L-ornityl-glycinamid. Smeltepunkt 224°C.

(a) = ■—40° (dimetylformamid).

e) L- cysteinyl- L- fenylalanyl- L- fenylalanyl- L- glutaminyl- L- asparaginyl-L- cysteinyl- L- prolyl- L- ornityl-glycinamid. En oppløsning av 5 g N-karbobenzoksy-S-benzyl-L-cysteinyl-L-fenylalanyl-L-fenylalanyl-L-glutaminyl-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-N-5-p-toluensulfonyl-L-ornityl-glycinamid i 1200 ccm tørret flytende ammoniakk tilsettes under omrøring ved koketemperaturen for opp-løsningen så meget natrium- eller kalium-metall at det opptrer en varig blåfarging. Etter tilsetting av 3 g ammoniumklorid inndampes løsningen til tørrhet. Resten inneholder L-cysteinyl-L-fenylalanyl-L-f enyl-alanyl-L-glutaminyl-L-asparaginyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-ornityl-glycinamid. f) Polypeptidforbindelsen med formel I.

Den ifølge eksempel le) oppnådde rest

løses i 5 liter 0,01-n-eddiksyre og oksyderes ved en pH av 6,5—8,0 ved gjennomledning av luft eller oksygen i løpet av 1 time ved 20°C. Oppløsningen innstilles med fortyn-net saltsyre på pH på 4,0—5,0 og inndampes til tørrhet etter tilsetting av 50 g natrium-klorid, eller 0,64 g metansulfonsyre, eller av 0,76 g trifluoreddiksyre, hvorved det fåes et tørt pulver som er godt holdbart. Det kan oppbevares og ved anvendelsen gir det en klar oppløsning. Man kan imidlertid også anvende oppløsningen direkte, eventuelt etter fortynning med vann eller en saltoppløsning.

Til fjernelse av de uorganiske salter kan det ovenfor nevnte etter tilsetting av trifluoredddiksyre oppnådde pulver, under-kastes en motstrømsfordeling i systemet sek.-butanol/vann/trifluoreddiksyre med forhold 120/160/1. Etter 200 overførings-trinn befinner stoffet seg i rørene 57 til 77 med et maksimum i røret 67 (K = 0,50). Etter avdamping fåes det virksomme polypeptid med godt utbytte i form av dets hydroskopiske trifluoracetat, som forhol-der seg enhetlig både kromatografisk og elektroforetisk. Migrasjonen ved papirelektroforesen ved pH 5,8 og 40 V/cm er 50 mm i løpet av 60 min (det som referanse anvendte histidin vandrer 65 mm). Migrasjonen ved papirelektroforesen med pH 1,9 og 40 V/cm er 69 mm i løpet av 60 min. (Det som referanse anvendte tryptofan vandrer 66 mm). Rf ved papirkromatografi i systemet isoamylalkohol/pyridin/vann i forholdet 35/35/30 er 0,28. Totalhydrolysen (16 timer, 110°C, HC1 6 N) gir de følgende ami-nosyrer i ekvimolekylære mengder: Cystin, glutaminsyre, asparaginsyre, prolin, ornitin og glycin, såvel som dobbelt ekvimolekylar mengde: fenylalanin. Produktet har de følgende biologiske virknin-ger: 150 IE/mg på blodtrykket i rotter, 15 IE/mg på hemning av diurese i rotter, og mindre enn 1 IE/mg på rotteuterus.

Eksempel 2.

Man går frem som i eksempel 1. Det oksyderes imidlertid til slutt ved 0—40 °C ved tilsetting av 7,5 ccm av en l-n oppløsning av hydrogenperoksyd i vann ved en pH av 7,5—8,0 (i stedet for oksydasjonen ved gjennomledning av luft eller oksygen).

Eksempel 3.

Man går frem som i eksempel 1. Det oksyderes imidlertid til slutt ved 0—35 °C ved tilsetting av 6,7 ccm l-n oppløsning av kaliumferricyanid i vann ved en pH av 5,5—7,5.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et nytt, terapeutisk aktivt nonapeptid med formel I

   oksyderes i vandig løsning ved en pH av fra 4 til 9, hvoretter den erholdte forbindelse eventuelt overføres i sine syreaddisj onssalter.