NO152092B - Analogifremgangsmaate til fremstilling av sykliske oktapeptider med terapeutisk virkning - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrører analogifremgangsmåte til fremstilling av sykliske oktapeptider med terapeutisk virkning.

Oppfinnelsen vedrører spesielt fremstilling av syklopeptider som inneholder de vesentlige trekk av Somatostatin, som delsekvensene av aminosyrene M-ll eller en ekvivalentsekvens er imidlertid svovelfri. De Somatostatin-analoge syklopeptider fremstilt ifølge oppfinnelsen er sykliske oktapeptider med formel

hvori trp betyr L-Trp eller D-Trp, hvori benzenringen kan være substituert med et halogenatom og Gaba(Ar) betyr den nedenfor nærmere definerte rest av en med en syklisk hydro-karbyl-substituert y-aminosmørsyre, samt addisjonssalter og komplekser herav.

Det i benzenringen av trp 8-restene eventuelt tilstedeværende halogenatom er spesielt et klor- eller fluor-atom som fortrinnsvis befinner seg i 5-stilling, som trp er det spesielt foretrukket 5-F-D-trp (5-fluor-D-tryptofyl) og fremfor alt D-trp.

Den som Gaba(Ar) betegnende rest er definert med formelen

hvori hver gang et av symbolene Ra, Rg og Ry betyr en nedenfor nærmere definert rest Ar og de øvrige to betyr hydrogen. Den til resten Gaba(Ar) svarende syre har for-kortelsen H-Gaba(Ar)-0H.

Den sykliske hydrokarbylrest Ar er en monodi-

eller polysyklisk arylrest som minst inneholder en aromatisk ring og med maksimalt 12 ringkarbonatomer eller en syklo-alkylrest med 3- til 8-, og fremfor alt 5- og/eller 6-leddede ringer som eksempelvis syklopropyl, syklobutyl, syklooktyl og helt spesielt syklopentyl og sykloheksyl,

videre også 1-bisyklø [2,2,2 ]oktyl, 2-bisyklo [2,2,2 loktyl eller 2-bisyklo [2,2, 1]heptyl. En arylrest er i første rekke naftyl, som 1- eller 2-naftyl, en tilsvarende delvis hydro-genert naftyl, som spesielt 1-, 2-, 5- eller 6-(l,2,3,4-tetra-hydronaftyl) eller fenyl. De kan ha en eller flere alkylrester med maksimalt 4 karbonatomer, f.eks. metyl,

etyl, propyl, isopropyl eller en butyl, idet det samlede antall karbonatomer maksimalt utgjør 18 karbonatomer.

Som slike er eksempelvis å nevne 4,4-dimetylsykloheksyl,

en tolyl som 2-, 3- eller 4-tolyl eller en bifenylyl, f.eks. 4-bifenylyl.

I deres aromatiske del kan arylrestene være substituert med halogen, f.eks. klor, brom, jod og spesielt fluor, lavere alkoksy, spesielt et slikt som avleder seg fra en av de nevnte lavere alkylrester med maksimalt 4 karbonatomer, herunder fremfor alt metoksy, videre også nitro samt fenoksyrester. Spesielt foretrukket er ved de nevnte substituenter substituerte fenylrester, som 4-fluor-fenyl, 4-klorfenyl, 4-nitrofenyl og spesielt 3-fenoksyfenyl, samt også naftylrester, f.eks. 4-klor-l-naftyl.

Resten Ar befinner seg i a~ t Y~ eller fortrinnsvis g-stilling av kjeden av y-aminosmørsyre, følgelig avleder seg spesielt foretrukkede rester av formel Gaba(Ar) av de følgende smørsyrer: 4-amino-3-sykloheksyl-4-amino-3-fenyl-, 4-amino-3-(4-fluorfenyl)-, 4-amino-3-(4-nitrofenyl)-, 4-amino-3-(4-klor-l-naftyl)-4-amino-3-(2-naftyl) og fremfor alt 4-amino-3-(1-naftyl)- og 4-amino-3-(3-fenoksyfenyl)-smørsyre.

Som resultat av substitusjonen med resten Ar oppstår på det tilsvarende karbonatom av syrekjeden et asymmetri-sentrum som har til fv-lqe nærvær av hver qanq to diastereomerer av syklopeptid fremstilt ifølge oppfinnelsen som hvis ønsket adskilles fra iiveiuiiure eller ogsa kan anvendes sammen som diaoiareomerblanding for samme anvendelsesformål. Vanligvis er hver gang den som isomer B betegner de diastereomere foretrukket, dvs. den som avleder seg fra hydrofilere diastereomere ved motstrømsfordeling av tilsvarende beskyttede mellomprodukter av formel II (se nedenfor).

Spesielt foretrukkede sykliske oktapeptider med formel I fremstilt ifølge oppfinnelsen er følgende: fjD-trp8; B-sykloheksyl-

Gaba^-^J-syklo-s omatos tat in ( 5-12 )-oktapept id med formel

fD-trp; fB-f enyl-Gaba1 J-syklo-somatostatin(5-12)-. oktapeptid med formel [5-F-D-trp<8>; 0-(1-naftyl)-Gaba<12>]-syklo-somatostatin (5-12)-oktapeptid med formel og fremfor alt [D-trp<8>; |3-(l -nafty1)-Gaba ]-syklo-somatostatin(5-12)-oktapeptid med formel og ^D-trp<8>; p-(3-fenoksyfenyl)-Gaba<12>J-syklo-somatostatin (5-12)-oktapeptid med formel

Hver av disse nevnte forbindelser kan som en diastereomerblanding avledes fra en racemisk [d, 1-Gaba (Ar)] -rest, eller også foreligge som en individuell diastereomer, f.eks en i de følgende eksempler omtalt og ved fysikalske data-karakterisert, avledet fra bare en av de optiske isomere former av £Gaba(Ar)J - rest. Spesielt foretrukket er hver gang den isomere B av de ovenfor fremhevede forbindelser.

Alle ovenfor generelt eller som foretrukkede karakteriserte somatostatin-analoger med formel I kan også foreligge i form av syreaddisjonssalter eller komplekser. Som syreaddisjonssalter kommer det spesielt i betraktning fysio-logisk tålbare salter med vanlig terapeutisk anvendbare syrer av de uorganiske syrer er det å nevne halogenhydrogensyrer, som klorhydrogensyre, men også svovelsyre og fosfor- respek-tiv pyrofosforsyre, av de organiske syrer er det i første rekke å nevne sulfonsyrene som benzen- eller p-toluen-sulfonsyre eller lavere alkansulfonsyrer som metansulfonsyre, videre også karboksylsyrer som eddiksyre, melkesyre, palmitinsyre og

stearinsyre, eplesyre, vinsyre, ascorbinsyre og sitronsyre.

Under komplekser er det å forstå de i deres struktur ennå ikke helt avklarte forbindelser som ved tilsetning av visse uorganiske eller organiske stoffer oppstår til peptider og gir disse en forlenget virkning. Slike stoffer er eksempelvis omtalt for ACTH og andre adrenocorticotrop virksomme peptider. A o nevne er f.eks uorganiske forbindelser som avleder seg fra metaller som kalsium, magnesium, aluminium, kobolt og spesielt sink, fremfor alt tungtoppløslige salter som fosfater, pyrofosfater og polyfosfater, samt hydroksyder av disse metaller, videre alkalimetallpolyfosfater, f.eks "Calgon N","Calgon 322" eller "Calgon 188". Organiske stoffer som frembringer en forlengning av virkningen er eksempelvis ikke-antigene gelatintyper, f.eks polyoksygelatin eller polyvinylpyrrolidon og karboksymetylcellulose, videre sulfonsyre-eller fosforsyre-ester av alginsyre, dekstran, polyfenoler og polyalkoholer, fremfor alt polyfloretinfosfat og fytinsyre, samt polymerisater og kopolymerisater av basiske eller fremfor alt sure aminosyrer, f.eks protamin eller polyglutamin-syre.

Når intet annet angis refererer betegnelsen av ami-nosyrerestene seg til rester av a-aminosyre av L-rekken, som forekommer i naturen.

Når intet annet er angitt betegner begrepet "lavere" hvor det alltid forekommer i forbindelse med en organisk rest eller en forbindelse med en slik rest eller en slik forbindelse med maksimalt 7» imidlertid fortrinnsvis med maksimalt k karbonatomer.

De nye syklopeptider fremstilt ifølge oppfinnelsen har en fy-siologisk virkning som i grunnkarakter tilsvarer virkningen av Somatostatin. De kan derfor med fordel anvendes i tilsvarende terapeutiske indikasjoner som dette f.eks til behandling av f unks j onsf ors tyrre.ls e hvor sekresjonen av veksthormoner eller glukagon er overnormal høy, som ved akromegali eller diabetes. I det de dessuten også hemmer blodtap i fordøyel-seskanalen kan de også anvendes i dette indikasjonsområdet med resultat.

Somatostatin, et syklisk tetradekapeptid med formel

^Science 179 « 77 (1973)J hemmer som bekjent hypofysestyrt sekresjon av veksthormon (Somatotropin). Dessuten hemmer den den sekretoriske aktivitet av det endokrine Pancreas, som sekresjon av insulin og glukagon. Disse verdifulle egenskaper kan ved somatostatin selv ikke komme til full praktisk anvendelse da denne forbindelse har en for kort virkningstid. For det meste er det ofte en fordel når det virksomme stoff utgjør ved sin hemmende virkning hovedsaklig på en av de to kjertler hvorimot den andre kjertel skal påvirkes minst mulig (i de fleste tilfelle er hemming av den hypofysære sekresjon, dvs. veksthormon-utkrysning mindre ønsket). Derfor tilstre-bes ved modifisering av grunnsekvensene spesielt ved utelat-else av enkelte opprinnelige aminosyre- og/eller utveksling mot andre ofte også "unaturlige" aminosyrer å oppnå en viss sosiasjon av hemmevirkningen samt den lengst mulige virkningstid. Således ble det f.eks funnet at spesielt fordelaktige fysiologiske egenskaper av denne type med syklopeptider av typen hvori Gaba betyr resten av y-aminosmørsyre °S P tallene 0, 1 eller 2, og ved de nær beslektede forbindelser opptrer, sml. Europeisk søknad nr. 78 100 994.9» publisert under nr. 001295. - Som et typisk trekk av disse forbindelser forekommer nærvær av en rett karbonkjede som skal simulere den opprinnelige gruppering -CH^-S-S-CIL,- i cystinresten av Somatostatin.

Overaskende ble det nå fastslått at ved en helt uvan-lig modifisering av et enkelt hver gang usubstituert kjedeav-snitt, dvs. ved substitusjon av Y<_>aminosy:ren en syklisk hydrokarbylrest ibeholdes ikke bare den ønskede aktivitet, men økes ytterligere. Således har forbindelsen fremstilt ifølge oppfinnelsen med formel I i forhold til Somatostatin såvel en øket hemming av insulin- og Glukagon-sekresjon som også en vesentlig forlengning av virkningstiden. Eksempelvis ble det ved bestemmelse av insulin- og Glukagon-frigjøring på isolerte p.erfunderte rottepankreas [g.M. Grodsky og R.E. Fanska i "Methods in Enzymology" _3_2, Part D, side 364; (J.G. Hardman og B.W.0'Malley, Editors; Academic Press, New York, 1975)J funnet at fD-trp<8>; f3-(1-naftyl)Gaba 12J -syklo-somatostatin (5-12)-oktapeptid (formel ID) som diastereomerblanding har den ca. 10 ganger den isolerte isomere |3 sogar en omtrent 20 ganger hemmevirkning sammenlignet med £D-trp ; Gaba J-syklo-somatostatin (5-12)-oktapeptid (formel M, p = l).

Forbindelsen fremstilt ifølge oppfinnelsen kan fremstilles etter i og for seg kjente metoder idet man sykliserer et lineært peptid med.formel

hvori II' betyr en i nedenfor definert formel II svarende rest hvori den amidiske binding mellom to vilkårlig naboplasserte aminosyrerester av peptidringen er avbrutt, og C betyr en fri hydroksylgruppe, en med en aktiveringsgruppe modifisert hydroksylgruppe eller hydrazinogruppen -NH-NH2, og en dannet forbindelse med formel

hvori Gaba(Ar) og trp har ovennevnte betydning, A betyr en

£-aminobeskyttelsesgruppe eller hydrogen og B betyr en hydroksylbeskyttelsesgruppe eller hydrogen,idet bare et av symbolene A og B kan bety hydrogen avspalter beskyttelsesgruppen eller-gruppene.

Som f-amino-beskyttelsesgrupper kan anvendes alle i peptid-kjemien vanlige amino-beskyttelsesgrupper, slik de sam-menfattende omtales i de tilsvarende oppslagsverker, f.eks. i Houben-Weyl: Methoden der organischen Chemie; 4. opplag, bind 15/1» E. Wiinsch (utgiver): Synthese von Peptiden.

(Georg Thieme Verlag, Stuttgart; 1974).

Foretrukket er acidolytisk avspaltbare grupper som i første rekke tert-butoksykarbonylgruppen og analoge grupper, f.eks tert-amyloksykarbonyl-, isopropyloksykarbony1-, diisopropyl-metoksykarbonyl-, allyloksykarbonyl-- syklopenty loksykarbonyl-, sykloheksyloksykarbonyl-, d-isobornyloksykarbonyl- og adam-antyloksykarbonylgruppen, samt også grupper av aralkyl-typen, som benzhydryl og trifenylmety1 (trityl), eller bestemte aral-koksykarbonylgrupper av 2-(p-bifenylyl)-2-propyloksykarbony1-typer, som er omtalt i sveitsisk patent 509 266.

Videre kan man imidlertid også anvende reduktivt eller basiske avspaltbare aminobeskyttelsesgrupper, f.eks spesielt benzyloksykarbonylgruppen og benzyloksykarbonylgrup-pene som i den aromatiske del er substituert med ha log ena tomer, nitrogrupper, lavere alkoksygrupper og/eller lavere alkylrester, som p-klor- og p-brombenzyloksykarbonyl-, p-nitrobenzyloksykarbonyl-, p-metoksybenzyloksykarbonyl-, p-tolyloksy-karbonyl-grupper, eller også isonikotinyloksykarbonylgruppen, videre også acylgruppen, som p-toluensulfonyl, benzensulfonyl, o-nitrobenzensulfenyl, respektive også formyl, trifluoracetyl eller ftaloyl.

En spesielt fordelaktig S-amino-beskyttelsesgruppe er en etoksykarbonylgruppe som i |3-stilling har en med tre hydrokarbonrester substituert silylgruppe som trifenylsilyl-, dimetylbutyl-silyl- eller fremfor alt trimetylsilylgruppen. En slik (3-trihydrokarbylsilyl-etoksykarbonylgruppe, som en |3-(trilavere-alkylsilyl)-etoksykarbonyl- f.eks spesielt |3-(tri-metylsilyl)-etoksykarbonylgrupper, danner med £-aminogruppen som skal beskyttes et tilsvarende {3-trihydrokarbylsilyl-etok-sykarbonylaminogruppe (f.eks p-trimetylsilyletoksykarbonyl-aminogruppen) som er bestandig, og for betingelsene for sur hydrolyse og hydrogenolyse, men under helt spesifikke, meget milde betingelser lar seg avspalte ved innvirkning av fluor-idioner. I denne henseende forholder den seg analogt de videre nedenfor som karboksylbeskyttelsesgrupper omtalte (3-silyletylestergrupper. (Denne likhet må taes spesielt hen-syn til ved syntesen hvor enkelte unntak utelukker anvendel-sen av en av disse beskyttelsesgrupper den samtidige anvendelse av en annen beskyttelsesgruppe). Ytterligere detaljer er angitt nedenfor ved beskyttelse av karboksylgruppen med silyletylester.

Som hydroksylbeskyttelsesgrupper kan det anvendes alle for disse formål i peptid-kjemien vanlige grupper, sml. ovennevnte verk (Houben-Wey1). Foretrukket er acidolytisk avspaltbare grupper som 2-tetrahydropyranyl og helt spesielt tert-butyl. Videre kan man imidlertid også anvende reduktivt eller basiske avspaltbare hydroksydbeskyttelsesgrupper, f.eks benzylgrupper, som i den aromatiske del kan være substituert med halogen, nitro og/eller lavere alkoksy, respektive lavere alkanoylrester, som acetyl eller aroylrester som benzoyl.

Fortrinnsvis velges beskyttelsesgruppene A og B således at de er avspaltbare under lignende betingelser, spesielt foretrukket er derved de fremhevede acidolytisk avspaltbare grupper. Avspaltningen av begge beskyttelsesgrupper foregår da fordelaktig en eneste operasjon kan imidlertid også anv.endes grupper av forskjellig type og hver enkelt avspaltes.

En ved hjelp av symbolet C vist funksjonellgrupper kompletterer karbonylgruppen av den C-terminale aminosyrerest og danner sammen med den en fri karboksylgruppe, en aktivert estergruppe, respektive karbazolylgruppen.

Aktiveringsgruppen hvorved hydroksylgruppen er modifisert er spesielt en slik som danner den aktiverte ester av N-hydroksysuksinimid, 1-hydroksybenzotriazol, N,N<1->disyklo-heksylisourinstoff, 2, k,5-triklorfenol, 2-nitrofenol, 4-nitrofenol, pentaklorfenol eller pentafluorfenol, men også en annen fra peptid-kjemien kjent aktiveringsgruppe av denne tyPe» sml. Houben-Weyl, bind 15/H.

Blant de lineære peptider med formel III er de foretrukket hvori resten Gaba(Ar) står som en endeplassert aminosyre i resten £ll Q . Disse foretrukkede utgangsstoffer er karakterisert ved formlene

og spesielt

hvori A, B, C, trp og Gaba(Ar) har ovennevnte betydning.

Et spesielt foretrukket er forbindelser med formlene Illa og Illb, hvori A betyr en aminobeskyttelsesgruppe, fremfor alt en acidolytisk avspaltbar amino-beskyttelsesgruppe, B betyr en hydroksylbeskyttelsesgruppe, fremfor alt en acidolytisk avspaltbar hydroksylbeskyttelsesgruppe og C betyr en fri hydroksylgruppe.

Sykliseringén ifølge oppfinnelsen av de lineære peptider med formel III foregår på i og for seg kjent måte ved hjelp av vanlig fordannelse av amidb.inding vanlige koplings-metoder, idet imidlertid de peptidiske utgangsstoffer anvendes i en meget lav konsentrasjon for å forskyve koplingsfor-løp til gunst av den intramolekylære syklisering på bekost-ning av intramolekylært polykondensasjon.

De lineære peptider anvendes fordelaktig i en ca.

-k -2

1.10 -molar til ca. 1.10 -molar, fortrinnsvis imidlertid i en ca. 1.10 _ o-molarkonsentrasjon som tilsvarer en vekt/volum-konsentrasjon på ca. 0,01 til 1,0$, fortrinnsvis 0,1$. Mens tilsvarende fortynning kan innstilles i reaksjonsblandingen fra begynnelsen eller også stadig dannes langsom inndrypning av utgangsstoffer og eventuelt de øvrige reagenser i reak-s j onsblandingen.

Fortrinnsvis foregår sykliseringen idet man ved en ovenfor angitt begynnelseskonsentraajon a) behandler et utgangsstoff med formel III, hvori C betyr en fri hydroksylgruppe, og hvori såvel £-aminogruppen av lysinresten som hydroksylgruppen av threoninresten er beskyttet, med et karbodiimid, eventuelt i nærvær av en aktivester-dannende komponent eller b) omsetter et utgangsstoff med formel III, hvori C er en til aktivert ester modifisert hydroksylgruppe og endeplassert aminogruppe foreligger i protonisert form, idet minst £-aminogruppen av lysinrestene er beskyttet med en organisk base eller c) behandler et utgangsstoff med formel III, hvori C betyr gruppen -NHNH£, og minst £-aminogruppen av lysinresten er beskyttet, i første rekke under sure betingelser med salpetersyre eller en lavere alkylester herav, og deretter sykliserer ved en av de ovennevnte lave konsentrasjoner med overskytende organisk base.

Sykliseringen gjennomføres i egnede oppløsnings-midler; eksempelvis er det å nevne dioksan, tetrahydrofuran, acetonitril, pyridin, dimetylformamid, dimetylacetamid, dimetylsulfoksyd, N-metylpyrrolidon, heksametylfosfortriamid, samt også etylacetat, kloroform og metylenklorid, og blandinger herav.

Ved fremgangsmåtevariant a) tilveiebringes sykliseringen ved hjelp av et karbodiimid, fortrinnsvis N,N'-disyk-loheksylkarbodiimid som man med fordel anvender i overskudd, er å anta at derved går utgangsstoffet med formel III med fri karboksylgruppe primært over i en aktivert ester av disyklo-heksylisourinstoff (respektive et analogt isourinstoff) og denne in vitro dannede aktive ester videre-reagerer med en gang. På en intermediær danning av en aktiv ester er utvil-somt tilsetningen av en aktiv ester-dannende komponent og til-bakeføres som hjelpereagens; til dette formål kan det tjene i peptid-kjemien vanlige aktiv-ester dannende komponenter som spesielt 2, k,5-triklorfenol, 2- eller 4-nitrofenol, pentaklor-og pentafluorfenol, eller fremfor alt N-hydroksyforbindelse hvor-av spesielt fordelaktig er å nevne N-hydroksysuksinimid, N-hydroksypiperidin og fremfor alt 1-hydroksybenzotriazol. Arbeidstemperaturen ved denne variant utgjør vanligvis 0-70°C, fortrinnsvis 35-55°C.

Ved variant b), som arbeider med ferdige aktive-estere, spesielt de allerede fremhevede, foregår sykliseringen spontant så snart den endeplasserte aminogruppe avprotoniseres med basen. De anvendte baser er fortrinnsvis kvaternære, og fremfor alt tertiære amine, f.eks trietylamin eller N-etylmor-forin. Fortrinnsvis arbeider man ved 10-30°C, spesielt ved værelsestemperatur.

Ved variant c) kan den første fase, dvs. dannelsen av syreazider foregå ved behandling med salpeter-syrling eller en ester herav, med fordel ved en vesentlig høyere konsentrasjon av utgangsstoffet enn den etterfølgende syklisering. Hensiktsmessig arbeider man med for eksempel en ekvi-valent av et lavere-alkylnitrit som etyl-, isoamyl- og spesielt tertbutylnitrit i saltsurt miljø ved temperatur fra ca. -30° til ca. -5°C, fortrinnsvis ca. -20°C; et lite overskudd av nitrit er tillatelig. Deretter blir oppløsningen av det dannede azid til en nødvendig fortynning ved en temperatur på ca. 0°C i ca. 35°C ved hjelp av en overskytende organisk base, f.eks en av de ovenfornevnte og derved bringes som en fremgangsmåte, variant b til spontan syklisering.

Går man ifølge oppfinnelsen ut fra et razemisk v-amino-smørsyre H-Gaba(Ar)-0H eller et derivat herav så får man ved kombinasjon med en ellers sterisk enhetlig delsekvens 5-11 et diastereomerpar. Dette kan oppdeles ved vanlige.fysikalske skillemetoder i individuelle diastereomerer, f.eks ved fraksjonert felling eller krystallisering, forskjellige kromatografiske teknikker som adsorpsjon- respektive fordel-, ingskromatografi, gelfiltrering og ioneutvekslet skilling, eller spesielt ved fordeling mellom to egnede oppløsningsmid-delsystemer, spesielt ved hjelp av motstrømsfordeling, (Craig-fremgangsmåten). Spesielt fordelaktig forløper atskillelsen etter sistnevnte metode ved allerede sykliserte forbindelser, dvs. ved sluttstoffene med formel I og fremfor alt ved deres sykliske forløpere med formel II. (Den derved isolerte mindre hydrofile diastereomere betegnes som isomer A, den hygmere hydrofile som isomer B.) De til denne atskillelse egnede oppløsningsmiddelsystemer er peptidkjemien generelt vanlige, og består for det meste av en tofaset kombinasjon av klorerte hydrokarboner, lavere alkoholer og vann som spesielt velges således at begge faser foreligger i tilnærmet like volum-mengder. Disse systemer står i snever forbindelse med de for tynnsjiktskromatografi og er avleddbare fra disse (sml. også gjennomføringseksemplet).

Avspaltningen av beskyttelsesgruppen i II foregår på i og for seg kjent måte; den sure hydrolyse (acidolyse) gjen-nomføres f.eks. ved hjelp av trifluoreddiksyre, saltsyre eller fluorhydrogen, ved syrefølsomme beskyttelsesgrupper og også ved hjelp av en lavere-alifatisk karboksylsyre som maursyre og/eller eddiksyre, i nærvær av vann og eventuelt av en polyhalogenert lavere-alkanol eller lavere-alkanon, som 1,1,1,3,3,3-heksafluorpropan-2-ol eller heksafluoraceton.

De reduktivt avspaltbare grupper, spesielt slike som inneholder benzylrester, fjernes fortrinnsvis hydrogenolytisk, f.eks ved hydrogenering under palladiumkatalyse. Isonikotinyloksykarbonylgruppen avspaltes fortrinnsvis ved sink-reduksj on.

Sluttstoffene fremstilt ifølge' oppfinnelsen fåes alt etter typen av isolering som baser eller som syre-addisjonssalter, disse kan deretter omdannes i hverandre på i og for seg kjent måte.

Også dannelsen av de ovennevnte komplekser foregår etter kjente eller til disse ekvivalente metoder.

Komplekser med uorganiske stoffer som tungtoppløs-lige metall-, f.eks. aluminium- eller sinkforbindelser fremstilles fortrinnsvis på analog måte, slik det er kjent for ACTH, f.eks. ved omsetning med et oppløselig salt av det an-gjeldende metall, f.eks. sink-klorid eller sink-sulfat og ut-felling med et alkalimetallfosfat og/eller -hydroksyd. Komplekser med organiske forbindelser som polyoksygelatiner, karboksymetylcellulose, polyvinylpyrrolidon, polyfloretinfosfat, polyglytaminsyre etc. fåes ved blanding av disse stoffer med peptider i vandig oppløsning. På samme måte kan det også fremstilles uoppløselige forbindelser med alkalimetallpolyfosfater.

Forbindelsene med ovenfor karakteriserte formel II er nye.

Også de lineære peptider med formel III er nye og deres fremstilling foretas etter i og for seg kjente metoder,,idet man kondenserer med hverandre de til oppbyg-ning av disse mellomprodukter nødvendige aminosyrer, respektive mindre peptidenheter under dannelse av CONH-bindinger i en vilkårlig tidsmessig rekkefølge, idet ikke i reaksjonen deltagende funksjonelle grupper intermediært kan beskyttes.

De ovenfor som foretrukket fremhevede lineære peptider med formler Illa og Illb er fortrinnsvis tilgjengelig som mellomprodukter hvis fremstilling inngående ble omtalt i forbindelse med syntesen av andre somatostatinranaloge i ovennevnte europeiske søknad,' publiseringsnummer 0 001 295, de der karakteriserte mellomprodukter har allerede den foretrukkede (D-trp) Q-Somatostatin(5-11)-sekvens i en egnet beskyttet form og kan direkte kondenseres med egnede derivater av en substituert -y-aminosmørsyre med formel H-Gaba(Ar)-0H. Sistnevnte utgangsstoffer på sin side er kjent eller tilgjengelig etter generelt kjente fremgangsmåter.

Ved fremstillingen av de lineære peptider med formel III, som også generelt deres mellomprodukter, kommer det som beskyttelsesgrupper for de endeplasserte ct-amino- og karboksylgrupper, spesielt i betraktning er de ved syntesen av lang-kjedede peptider vanlige beskyttelsesgrupper som for eksempel lett og selektivt kan avspaltes ved solvolyse eller reduksjon.

Som oc-amino-beskyttelsesgrupper er eksempelvis å

nevne: eventuelt for eksempel med halogen, nitro, lavere-alkyl eller lavere-alkoksy, substituerte di- eller triaryl-lavere-alkylgrupper, som difenyImetyl- eller trifenylmetyl-grupper, f.eks. benzhydryl, trityl, di-(p-metoksy)-benzhydryl, eller fremfor alt fra karbonsyre avledende hydrogenolytiske avspaltbare grupper som eventuelt i aromatisk rest med halo-genatomer, nitrogrupper, lavere-alkyl- eller lavere-alkoksygrupper substituerte benzyloksykarbonylgrupper, f.eks. benzyloksykarbonyl (dvs. karbobenzoksy), p-brom- eller p-klor-benzyloksykarbonyl, p-nitrobenzyloksykarbonyl, p-metoksybenzyloksykarbonyl; videre også 2-(p-bifenylyl)-2-propyloksykar-bonyl og tilsvarende i det sveitsiske patent 509 266 omtalte aryloksykarbonylgrupper. Derved er det å påse at (X-amino-beskyttelsesgrupper må være selektivt avspaltbare under opp-nåelse av den eventuelt tilstedeværende £-aminobeskyttelsesgruppe av lysinresten. Det er forøvrig også av fordel når ved deres avspaltning også en eventuelt tilstedeværende kar-boksyl- og hydroksylbeskyttelsesgruppe forblir uberørt.

Karboksylgrupper beskyttes eksempelvis ved hydrazid-dannelse eller ved forestering. Egnet til forestering er f.eks lavere- eventuelt substituerte alkanoler som metanol, etanol, cyanmetylalkohol, 2,2,2-trikloretanol, benzoylmetyl-alkohol og spesielt tert-butylalkohol, men også et eventuelt substituert benzylalkohol. En spesiell fordelaktig kategori av de substituerte alkanoler er etylalkoholer, som i (3-stilling har en trisubstituert silylgruppe, som trifenylsilyl-, dimetyl-butyl-silyl- eller fremfor alt trimetylsilylgruppe. Slik det f.eks omtales i belgisk patent nr. 851.576 egner disse alkoholer seg spesielt godt til beskyttelse av karbonyl-grupper for de tilsvarende p-s ilyletyles tere, f.eks |3-(trime-tylsilyl)-etylester, riktignok har stabiliteten av vanlig alkylestere imidlertid lar seg avspalte selektivt under milde betingelser ved innvirkning av fluorid-ioner under bibehold av andre beskyttelsesgrupper.

For dannelse av aktiverte estere som f.eks i forbindelsene med formel III, egner det seg f.eks eventuelt med elektrone-tiltrekkende substituenter, substituerte fenoler og tiofenoler som fenol, tiofenol, tiokresol, p-nitrotiof enol, 2,4,5- og 2,4,6-triklorfenol, pentaklorfenol, pentafluorfenol, o- og p-nitrofenol, 2,4-dinitrofenol, p-cyanofenol, videre f.eks N-hydroksysuksinimid, N-hydroksyftalimid og N-hydroksy-piperidin.

Treoninrestens hydroksylgruppe kan beskyttes ved forestering eller foretering som allerede nevnt ovenfor, den kan imidlertid også bibeholdes fri.

Disse beskyttelsesgrupper kan avspaltes på kjent måte. Således kan man avspalte benzyloksykarbonylgruppen med hydrogenolyse, N-tritylgruppen med mineralsyrer som halogen-hydrogensyre, f.eks fluorhydrogen eller fortrinnsvis klorhy-drogen eller en organisk syre som maursyre, eddiksyre, klor-eddiksyre eller trifluorsyre i vanndig eller absolutt tri-fluoretanol som oppløsningsmiddel (sml. cLoæ. 2 346 147) eller med vanndig eddiksyre, tert-butyloksykarbonylgruppen med trifluoreddiksyre eller saltsyre, 2-(p-bifenylyl)-isopropyloksy-karbonylgruppen med vanndig eddiksyre eller f.eks med en blanding av eddiksyre, maursyre (82,8$ig) og vann (7:1:2) eller etter fremgangsmåten i henhold til d.o.s. 2 346 147 •

P-silylestergruppene avspaltes fortrinnsvis med fluoridione-avgivende reagenser, f.eks fluorider av kvaternære organiske baser som trietyl-ammoniumfluorid. De kan imidlertid også på samme måte som de vanlige alkylestere avspaltes fra alkalisk hydrolyse, f.eks ved hjelp av alkali-metallhydroksyder,- karbonater eller -bikarbonater, eller ved hjelp av hydrazinolyse, f.eks ved hjelp av hydrazinhydrat omdannes i de tilsvarende karbazoylgrupper. Til avspaltning av tert-butylestere anvender man fortrinnsvis acidolyse for benzylestere da hydrogenolyse.

En kondensasjon av aminosyre- og/eller peptidenhetene som er å gjennomføre for fremstilling av de lineære peptider med formel III foregår på i og for seg kjent måte, idet man fortrinnsvis tilknytter en aminosyre eller et peptid med beskyttet a-aminogruppe og eventuelt aktivert terminal-karboksylgruppe ( = aktiv komponent) til en aminosyre eller et peptid med fri a-amino-gruppe og fri eller beskyttet, f.eks for-esteret terminal karboksylgruppe (= passiv komponent), i det dannede produkt frigjør den terminale aminogruppe og omsetter dette peptid, inneholdende en fri a-aminogruppe og en eventuelt beskyttet terminal karboksylgruppe, men ytterligere aktiv komponent, dvs. en aminosyre eller et peptid med aktivert terminal karboksylgruppe og fri a-aminogruppe, osv. Karboksylgruppen kan eksempelvis aktiveres ved overføring i et syre-azid, -anhydrid, -imidazolid, -isoksazolid eller en aktivert ester som en av de ovennevnte eller ved reaksjon med et karbodiimid, som N,N<1->disykloheksylkarbodiimid, eventuelt under en tilsetning av N-hydroksysuksinimid eller et usubstituert eller f.eks med halogen, metyl eller metoksy substituert 1-hydroksybenzotriazol eller 4-hydroksy-benzo-l,2,3-triazin-3-oksyd (sml. bl. a. tysk patent 1 917 690, 1 937 656 og 2 202 613) eller med N,N'-karbonyldiimidazol. Som de mest vanlige koplingskomponenter er det å nevne karbodiimidmetoden, videre også azidmetoden, metoden aktiverte estere og anhydrid» metoden, samt Merrifield-metoden og metoden av N-karboksy-anhydrid eller N-tiokarboksyanhydrid.

Det er spesielt foretrukket fremstilling av de lineære peptider med formel III anvender man som koplingsmetoden karbodiimid-metoden med N,N'-disykloheksylkarbodiimid i nærvær av 1-hydroksybenzotriazol. Den terminale karboksylgruppe beskyttes derved i form av |3-(trimetyl-silyl)-etylestere, a-aminogruppen av de aktive komponenter beskyttes ved benzyloksykarbonylgruppen som avspalter til ethvert koplingstrinn ved hydrogenolyse. Til beskyttelse av g-aminogruppen av lysinresten anvendes acyleringen med tert-butoksykarbonylgruppen og for hydroksylgruppen av treoninresten foreteringen med tert-butylgruppen. Disse to beskyttelsesgrupper kan hvis ønsket til slutt avspaltet i et trinn ved sur hydrolyse, f.eks ved hjelp av trifluoreddiksyre, saltsyre eller fluor-

hydrogen.

Alt etter arbeidsmåte får man forbindelsen i form av baser eller deres salter. Fra saltene kan det på i og for seg kjent måte utvinnes basene. Av sistnevnte igjen lar det seg ved omsetning med syre, f.eks. med slike som danner de ovennevnte salter, fremstilles terapeutisk anvendbare syre-addis j ons salter .

På grunn av det snevre* forhold mellom de nye forbindelser i fri form og i form av deres salter er de foregående og følgende med fri forbindelse ved deres salter også eventuelt å forstå de tilsvarende salter respektivt fri forbindelse.

I oppfinnelsen gjelder der også de utførelsesformer av fremgangsmåten, hvor et utgangsstoff anvendes i form av et salt.

Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen anvendes fortrinnsvis slike utgangsstoffer som fører til de innledningsvis og spesielt verdifulle omtalte forbindelser.

De ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen dannede produkter er anvendelige som farmasøytiske preparater som inneholder forbindelsen med formel I eller farmasøytisk anvendbare salter herav. De farmasøytiske preparater kan spesielt finne anvendelse i de ovenfor angitte indikasjoner når de administreres intraperitonealt som intravenøst, intramuskulært eller subkutan, eller også intranasalt.

Den nødvendige dose avhenger av den spesielle sykdom som

skal behandle dens tyngde og terapiens varighet. Antall og mengde av enkeltdoser såvel administreringsskjerna kan

best bestemmes ved hjelp av en individuell undersøkelse

av pasienten. Metoder til bestemmelse av disse faktorer

er vanlig for fagfolk. Vanligvis ligger imidlertid ved en injeksjon av en terapeutisk virksom mengde av en slik forbindelse i dosisområdet fra ca. 0,001 til ca. 0,2 mg/kg legemsvekt. Foretrukket gir områder fra ca. 0,0015 til ca. 0,15 mg/kg legemsvekt og administreringen foregår

ved intravenøs infusjon eller subkutan-injeksjon.

Følgelig inneholder farmasøytiske preparater til paren-

teral administrering i enkeltdosis-form i avhengighet

av applikasjonstypen pr. dose ca. 0,08 til ca. 15 mg av en av forbindelsene ifølge oppfinnelsen. Ved siden av det virksomme stoff inneholder de vanligvis dessuten en puffer, f.eks. en fosfatpuffer, som skal holde pH mellom ca. 3,5 og 7»videre natriumklorid, mannit eller sorbit til innstilling av isoto-nien. De kan foreligge frysetørket eller oppløst form idet oppløsningen med fordel kan inneholde et antibakterielt vir-kende konserveringsmiddel, f.eks 0,2 - 0,3$ 4-hydroksybenzo-syre-metylester eller -etylester. Skal slike preparater det virksomme stoff foreligge i form av et kompleks med forlenget virkningstid, så kan dette dannes direkte ved tilsettning av de kompleksdannende komponenter til en injeksjonsoppløsning som f.eks tilberedes i henhold til de ovennevnte forholds-regler. Som tilsettning egner det seg f.eks 0,1 - 1,0 vektprosent av et sink(ll)-salt (f.eks sulfat), i forbindelse med 0,5 - 5j0 vektprosent protamin (f.eks som sulfat), referert til injeksjonsoppløsningens samlede volum. Denne tilbered-ning foreligger som oppløsning av pH 3»5 til 6,5 eller som suspensjon fra ca. pH 7»5 til 8,0.

Et preparat for intranasal- administrering kan foreligge som en vanndig oppløsning eller gelé, en oljeaktig opp-løsning eller suspensjon, eller også en fettholdig salve. Et preparat i form av en vanndig oppløsning får man f.eks ved at man oppløser det virksomme stoff med formel I, eller et terapeutisk anvendbart syreaddisjonssalt herav i en vanndig puf-feroppløsning av pH inntil 7|2 og tilsetter et isotoni-frem-bringende stoff og til den vanndige oppløsning tilsettes hensiktsmessig et polymert klebemiddel, f.eks polyvinylpyrrolidan og/eller et konserveringsmiddel. Enkeltdosen utgjør ca.. 0,08 til ca. 15 mg, fortrinnsvis 0,25 til 10 mg, som er inneholdt til ca. 0,05 ml av en oppløsning, respektive 0,05 g av en gelé.

En oljeaktig applikasjonsform for en intranasal administrering får man f.eks ved suspendering av et peptid med formel I eller et terapeutisk anvendbart syreaddisjonssalt herav i en olje, eventuelt under tilsetning av svellemidler som aluminiumstearat og/eller grenseflate-aktive midler

(tensider), hvis HLB-verdi ("hydrofilik-lipofilik-balance") ligger under 10, som fettsyre-monoester av flerverdige alkoholer, f.eks. glycerol-monostearat, sorbitan-monolaurat, sor-bitanmonostearat eller sorbitanmonoleat. En fettholdig salve får man f.eks. ved suspendering av det virksomme stoff dannet ifølge oppfinnelsen i et strykbart fettgrunnlag, eventuelt under tilsetning av et tensid av HLB-verdi under 10. En emul-sjonssalve får man ved utdrivning av en vandig oppløsning av det peptidisk virksomme stoff i et mykt strykbart fettunderlag med tilsetning av et tensid, hvis HLB-verdi ligger under 10. Alle disse intranasale applikasjonsformer kan også inneholde konserveringsmidler. Med enkeltdosene utgjør ca. 0,08 til ca. 15 mg, fortrinnsvis 0,25 til 10 mg, inneholdt i ca. 0,05 til ca. 0,1 g av grunnmassen.

For den intranasale administrering egner det seg videre også inhalasjons- respektivt insufflasjonspreparater,

som insufflasjonskapsler, som muliggjør å insuffliere det virksomme stoff i form av et pudder med åndedrettet eller aerosoler og spray som kan fordele det farmakologisk virksomme stoff i form av et pudder eller i form av dråper av en oppløsning eller suspensjon. Preparater med pudder-fordel-ende egenskaper inneholder foruten det virksomme stoff vanligvis hjelpemidler, insufflasjonskapsler inneholdende f.eks. faste bærestoffer som laktose, aerosol- respektivt spray-tilberedninger inneholdende f.eks. en flytende drivgass med et kokepunkt under værelsestemperatur, samt hvis ønsket, ytterligere bærestoffer som flytende eller faste ikke-ioniske eller anioniske tensider og/eller faste fortynningsmidler. Preparater hvori det farmakologisk virksomme stoff foreligger i oppløsning, inneholder foruten dette et egnet drivmiddel, videre hvis' nødvendig, et ekstra oppløsningsmiddel og/eller en stabilisator. I stedet for drivgass kan det også anvendes trykkluft som frembringes ved hjelp av en egnet kompremerings-og avspenningsinnretning etter behov.

De ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen dannede

nye forbindelser med formel I og terapeutisk anvendbare syre-addis jonssalter herav, finner anvendelse som farmakologisk aktive forbindelser, spesielt i de for somatostatin vanlige indikasjo-

ner, fortrinnsvis i form av farmasøytiske preparater. De dag-lige doser som administreres et varmblodsdyr av ca. 70 kg ut-gjør fra ca. 0,1 til ca. 120 mg.

I de følgende eksempler forklares oppfinnelsen nærmere. Temperaturen angis i Celsiusgrader; som forkortninger f.eks for betegnelse aminosyre, peptider, beskyttelsesgrupper etc., anvendes de vanlige, f.eks de i "synthese von Peptiden" (utgiver: E. Wunsch). , bind XV, det fra "Methoden der org. Chemieti (Houben-Weyl) (1974; G. Thieme, Stuttgart), oppstilte forkort-elser. Spesielt anvendes følgende forkortelse:

Boe tert-butoksykarbonyl

But tert-butyl (som eterdannende gruppe)

DCC N,N'-disykloheksylurinstoff

DCCI N,N'-disykloheksylkarbodiimid

Gaba 4-aminosmørsyre-resten, -NH-(CH£)^-CO-

OBzl Benzyloksy (som esterdannende gruppe)

Z Benzyloksykarbonyl (karbobenzoksy)

CD Sirkulardikroismus

ORD Optisk rotasjonsdispersjon

DC Tynnsjiktkromatografi.

I DC anvender man, når intet annet er angitt kiesel-gel som adsorberes som følgende systemer som elueringsmiddel:

System 52: n-butanol-eddiksyre-vann (75:7,5:21)

101: n-butanol-pyridin-eddiksyre-vann (38:24:8:30) 111B: n-butanol-pyridin-25$ig vanndig ammoniakk-vann

(40:24:6:30)

112A: n-butanol-pyridin-maursyre-vann (42:24:4:20). 157A: Kloroform-metanol-vann-eddiksyre (90:10:1:0,5) 157C: Kloroform-metanol-vann-eddiksyre (75:27:5:0,5) 157F: Kloroform-metanol-vann-eddiksyre (70:40:9:0,5).

Eksempel IA

t- Asn- Phe- Phe-( P- trp)- Lys- Thr- Phe-( ft- fenyl) Gaba- J - isomer A

l60 mg beskyttet oktapeptid med formel

-Is omer A

oppløses ved 5° C under N£ i 1,5 ml av en blanding av 89 volumprosent trifluoreddiksyre, 10 volumprosent vann og 1 volumprosent tioglykolsyre. Oppløsningen oppvarmes med en gang til 25°C og oppfylles etter 50 minutter ved denne temperatur med 5 ml peroksyd-fri. eter. Det resulterende rå trifluoracetat av sluttprodukter frafUtreres, tørkes i vakuum, oppløses i

5 ml IN normal eddiksyre og filtreres gjennom 15 ml anioneutveksler, f.eks "AG"1-X8 (et produkt fra Bio-Rad Laboratories, Richmond, California, USA), i acetatform, eluatet lyofiliserea

Den dannede tittelforbindelse er tynnsjiktkromatografisk i tre systemer.

DC (cellulose, merk): System 101 : Rf 0,66

111B : Rf 0,48

112A : Rf 0,60

DC (i vann): X (nm)/mol. Ellipt. : 235/-58OO (min); 223/+6600 (piax)

På analog måte fåes også de følgende sluttstoffer med formel

fra tilsvarende beskyttede oktapeptider: (Ar)Gaba - B-(2-naftyl)Gaba - Isomer A DC: System 157C : Rf 0,27;

(Ar)Gaba = |3-(2-naftyl)Gaba - Isomer B DC: System 157C : Rf 0,27;

(Ar)Gaba = 8-(4-fluorfenyl)Gaba - Isomer B DC: System I57C : Rf 0,29.

Eksempel IB

l— Asn- Phe- Phe- ( D- trp ) - Lys- Thr- Phe- ( B- f enyl ) Gaba- l - Isomer B

189 mS beskyttet oktapeptid med formel

oppløses ved 5°C under N~ i 1,9 ml av en blanding av 89 volumprosent trifluor-eddiksyre, 10 volumprosent vann og 1 volumprosent tioglykolsyre, oppløsningen oppvarmes med en gang til 25°C og oppfylles etter 50 minutter ved denne temperatur med 5 ml peroksydfri eter. Det resulterende rå trifluoracetat av sluttprodukter frafUtreres, tørkes i vakuum, oppløses i 5 ul 1 N eddiksyre og filtreres gjennom 15 ml anioneutveksler, f.eks "AG" 1-X8, et produkt fra Bio-Rad Laboratories, Richmond,

California, USA), i acetatform. Eluatet inndampes i vakuum

og residuet underkastes motstrømsfordeling i systemet n-butanol-eddiksyre-vann ( 2k00:600:3000) over 270 trinn. De i elementene 229 til 250 innholdte faser (K= 6,7) samles, inndampes i vakuum og lyofiliseres fra tert-butanol-vann (l:l).

Den dannede tittelforbindelse er tynnsjiktkromatografisk enhetlig i tre systemer.

DC (Cellulose, merk): System 101 : Rf 0,64

111B : Rf 0,48

112A : Rf 0,58

CD: (in vann): X(nm )/moI.Ellipt.: 235/-37OO (min); 220/+35000

(max).

De peptidiske utgangsstoffer ifølge eksemplene IA og IB er oppnåelig på følgende måte:

Trinn 1. 1

dtl- H-( B- fenyl) Gaba- OBzl- p- toluolsulfonat

En blanding av 1,10 g d,l-4-amino-3-feny1-smørsyre og 1,17 g p-toluensulfonsyre-monohydrat i 3»2 ml benzylalkohol og 50 ml benzen destilleres langsomt ved normaltrykk inntil iløpet av 3 timer tilsammen er oppfanget 40 ml av en fraksjon, kokepunkt 70° - 90°C. Den klare reaksjonsoppløsningen konsentreres i vannstrålevakuum og deretter i høyvakuum ved ca.

60°C i 3 ml. Den utfeldte krystallgrøt utrøres med 15 ml eter, krystallene frafiltreres og vaskes med 10 ml eter. For videre rensning utrøres dette materiale med 10 ml eter ved værelsestemperatur iløpet av 1 time, frafiltreres, vaskes med eter og tørkes i vakuum. Smeltepunkt l45-8°C.

DC: [Kloroform-metanol-vann (l4:6:l)] Rf 0,40

[kloroform-metanol (85:15)] Rf 0,17

På analog måte fåes også:

a) av d, 1-4-amino-3-(2-naftyl)-smørsyre fåes d,1-H- [fi-(2-naftyl)] Gaba-OBzl-p-toluensulfonat,

,DC: System 157C: Rf 0,48; og

b) av d, 1-4-am in o- 3 - (4-f luorf eny 1) - smørsyre fåes d, 1-H- [(3-(4-fluorfenyl)] Gaba-OBzl-p-toluensulfonat.

DC: System 157: Rf 0,45.

Trinn 1. 2

Z-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe- [d,1-(B-fenyl) GabaJ - OBzl

En blanding av 500 mg Z-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys (Boc)-Thr(But)-Phe-OH (se ovennevnte europeiske søknad, eksempel 1, trinn 1.7) og 189 mg d,1-4-amino-3-fenylsmørsyre-benzylester-p-toluensulfonat (trinn l.l) i 2 ml dimetylformamid blandes med 0,048 ml N-metylmorfolin, 58 mg N-hydroksybenzotriazol og 104 mg DCCI og hensettes 20 timer ved værelsestemperatur. Til opparbeidelse frasentrifugeres fra utfeldt DCC, det overstående blandes med 15 ml vann og frafiltreres. Utvundne faste stoffer utrøres for ytterligere rensning med 3 nil etanol i 10 minutter, suspensjonen avkjøles ved 0°C, det rene produkt frafiltreres og tørkes i vakuum.

DC: [Kloroform-metanol (85:15)] Rf 0,70.

På analog måte fåes også av tilsvarende forbindelse ifølge trinn 1.1: a) Z-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-^d,1- [p-(2-naftyl)] GabaJ-OBzl,

DC: System 15~A : Rf 0,65; og

b) Z-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-|d,1-[B-(4-f luorf enyl)] Gaba}-OBzl,

DC: System 157A : Rf 0,64.

Trinn 1. 3

H-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe- [d,1-(B-fenyl) GabaJ- 0H

En oppløsning av 453 mg Z-Asn-Phe-(D-trp)-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-[d,l-(B-fenyl)Gaba] -OBzl (trinn 1.2) i 20 ml dimetylformamid hydrogeneres etter tilsettning av 50 mg palladium-kull (10$) i 3 timer ved værelsestemperatur, og normaltrykk. Til opparbeidelse konsentreres oppløsningen etter frafiltrering av katalysatoren i høyvakuum til 2 ml og produktet utfelles med 25 ml peroksydfri eter, frafiltreres og tørkes i vakuum. Råproduktet underkastes uten ytterligere rensning neste trinn 1.4 (syklisering).

På analog måte fåes tilsvarende forbindelser ifølge trinn 1.2: a) H-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-(d,1-[B- (2-naftyl)] Gaba}-0H;

DC : System 157C : Rf 0,67; og

b) H-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-{d,l-[B-(4-fluor-fenyl)] Gaba}-0H,

DC: System 157A : Rf 0,06.

Trinn 1. 4

En oppløsning av 386 mg rå H-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys (Boe)-Thr(But)-Phe- [d,1-(B-fenyl)Gaba] -0H (Trinn 1.3), 400 mg N-hydroksybenzotriazol og 610 mg DCCI i 300 ml dimetylformamid holdes i 20 timer ved 50°C. For opparbeidelse avdampes oppløsningsmiddelet i høyvakuum ved ca. 30°C og residuet utdrives med 15 ml etylacetat. Det utfeldte disykloheksylurin-stoff fjernes før frafiltrering. Filtratet fortynnes med etylacetat i 50 ml, vaskes med hver gang 40 ml IN vanndig oksalsyre og deretter med vann til nøytralitet, tørkes over natriumsulfat og inndampes i vakuum. Råproduktet underkastes for rensning av atskillelse av de diastereomere A og B mot-strømsfordeling i systemet metanol-vann-kloroform-karbontetraklorid (2700: 675:900:1575 volumdeler) over khO trinn. De elementene 104 til 155 befinnende faser (K = 0, kl) inneholder en av de to isomerer (isomer A), de elementene 164-207 (K = 0,70) befinnende faser inneholder da den andre (isomer B). Fasene av de tilsvarende elementer forenes og inndampes i vakuum. Residuet oppløses i 20 ml tert-butanol og lyofiliseres hvormed det hver gang fremkommer tynnsjiktkromatografisk enhetlig diastereomer av ovennevnte fellesformel.

DC: [Kloroform-metanol (85:15)3 Isomer A: R^, 0,65} isomer B: Rf 0,55.

Qcioroform-metanol-vann (l4:6:l)] Isomer A: R^ 0,95f Isomer B: Rf 0,90.

På analog måte fåes av tilsvarende forbindelser til trinn 1.3: Isomer A : K = 0,27; DC : System 157A : Rf 0,39 Isomer B : K = 0,51; DC : System 157A : Rf 0,32,

Isomer B : K = 0,78; DC : System 157A : Rf 0,31.

Eksempel 2A

250 mg beskyttet oktapeptid med formel

oppløses ved 5°C under N0 i 2,5 ml av en blanding av 89 volumprosent trifluor-eddiksyre, 10 volumprosent vann og 1 volumprosent tioglykolsyre, oppløsningen oppvarmes med en gang til 25°C og etter 50 minutter ved denne temperatur utfelles med 8 ml peroksydfri eter. Det fremkommende rå trifluoracetat av

sluttproduktet frafiltreres, tørkes i vakuum, oppløses i 5 ml IN eddiksyre og filtreres gjennom 15 ml anioneutveksler, f.eks "AG"1-X8 (et produkt fra Bio-Rad Laboratories, Richmond, California, USA), i acetatform, eluatet lyofiliseres.

Den dannede tittelforbindelse er i tre systemer tynnsjiktkromatografisk enhetlig.

DC (Cellulose, merk): System 101 : Rf 0,60

111B : Rf 0,45

112A : Rf 0,58

CD(in l$-vanndig eddiksyre): \(nm)/mol.Ellipt.: 226/-8000 (min)

Eksempel 2B

257 mg beskyttet oktapeptid med formel -Isomer B oppløses ved 5°C under N£ i 2,5 ml av en blanding av 89 volumprosent trifluor-eddiksyre, 10 volumprosent vann og 1 volumprosent tioglykolsyre, oppløsningen oppvarmes med en gang til 25°C og utfelles etter 50 minutter ved denne temperatur med 10 ml peroksydfri eter. Det resulterende rå trifluoracetat av sluttproduktet frafiltreres, tørkes i vakuum, oppløses i 5 ml 1 N eddiksyre og filtreres gjennom 15 ml anioneutveksler, f.eks "AG" 1-X8 (et produkt fra Bio-Rad Laboratories, Richmond, California, USA), i acetatform, eluatet lyofiliseres.

Den dannede tittelforbindelse er en tynnsjiktkromatografisk enhetlig tre systemer.

DC (Cellulose, merk): System 101 : Rf 0,57

111B : Rf 0,44

112A : Rf 0,53

CD (i 1^-vanndig eddiksyre): X(nm)/mol.Ellipt.: 237/+65OO (maks); 2 31/-70OO (min) ; 223/+12000 (maks . )

Det peptidiske utgangsstoff i eksemplene 2A og 2B

fåes på følgende måte:

Trinn 2. 1

d, 1- H-[ 3-( l- naftylfl Gaba- OBzl- p- toluensulfonat

En blanding av 1,05 S d,l-4-amino-3-(1-naftyl)-smør-syre og 0,871 g p-toluensulfonsyre-monohydrat i 2,4 ml benzylalkohol og 50 ml benzen destilleres langsomt ved normaltrykk inntil iløpet av 3 timer tilsammen er oppfanget kO ml fraksjon, kokepunkt 70°-90°C. Den klare reaksjonsoppløsning konsentreres i vannstrålevakuum og deretter i høyvakuum ved ca. 60°C i 3 ml. Den utfeldte krystallgrøt utrøres med 15 ml eter, krystallene frafiltreres og vaskes med 10 ml eter.

For ytterligere rensning utrøres dette materialet med 10 ml eter ved værelsestemperatur, iløpet av en time frafiltreres, vaskes med eter og tørkes i vakuum, smeltepunkt 152-154°C.

DC: [Kloroform-metanol-vann (l4:6:l)]Rf 0,60

[Kloroform-metanol (85:15)] Rf 0,28

Trinn 2. 2

Z- Asn- Phe- Phe-( D- trp)- Lys( Boe)- Thr( But)- Phe-[ d, 1- B-( 1- naftylj Gaba- OBzl

En blanding av 700 mg Z-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boe )-Thr(But)-Phe-OH (sml. trinn 1.2) og 295 mg d,l-4-amino-3-(1-naftyl)-smørsyre-benzylester-p-toluensulfonat (trinn 2.l) i 2 ml dimetylformamid blandes med 0,067 ml N-metylmorfolin, 81 mg N-hydroksybenzotriazol og 147 mg DCCI og hensettes 20 timer ved værelsestemperatur. For opparbeidelse frasentrifugeres fra utfeldt DCC, det overstående blandes med 200 ml vann og frafiltreres. Det dannede faststoff blir for ytterligere rensning utrørt med 3 ml metanol iløpet av 10 minutter, suspensjonen avkjølt ved 0°C, det rene produkt frafiltrert og tørket i vakumm.

DC: [Klorof orm-metanol (85:15)J Rf 0,72

[Kloroform-metanol-vann (l4:6:l3Rf 0,93

Trinn 2. 3

H. Asn- Phe- Phe-( D- trp) - Lys ( Boe ) - Thr ( But) - Phe- [ d. 1- 6- ( 1- naf tyl))

Gaba- OH

En oppløsning av 794 rag Z-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys (Boe )-Thr (But)-Phe-[d,l-B-( 1-naf tyl)] Gaba-OBzl (trinn 2.2) i 40 ml dimetylformamid hydrogeneres etter tilsettning av 80 mg palladium-kull (10$) i 4 timer ved værelsestemperatur og normaltrykk. For opparbeidelse konsentreres oppløsningen etter frafiltrering av katalysatoren i høyvakuum til 2 ml, og produktet utfelles med 40 ml peroksydfri eter, frafiltreres og tørkes i vakuum. Råproduktet underkastes uten ytterligere rensing neste trinn 2.4 (syklisering).

Trinn 2. 4

En oppløsning av 678 mg rå H-Asn-Phe-(D-trp)-Lys (Boc)-Thr(But)-Phe[d,1-B-(1-naf tylj] Gaba-OH (trinn 2.3), 676 mg N-hydroksybenzotriazol og 1030 mg DCCI i 500 ml dimetylformamid holdes i 20 timer ved 50°C. For opparbeidelse avdampes opp-løsningsmiddelet i høyvakuum ved ca. 30°C og residuet utdrives med 20 ml etylacetat. Det utfeldte disyklourinstoff fjernes ved filtrering, filtratet fortynnes med etylacetat til 200 ml, vaskes tre ganger med hver gang 50 ml IN vanndig oksalsyre og deretter med vann til nøytralitet, tørkes over natriumsulfat og inndampes i vakuum. Råproduktet underkastes for rensning, motstrømsfordeling i systemet metanol-vann-kloroform-karbontetraklorid (2700: 675:900:1575 volumdeler) over 56O trinn. De elementene 89 til 143 befinnende faser (K = 0,22) inneholder en av de to stereo-isomerer (isomer A), de i elementene 152-224 befinnende fase (K = 0,47) den andre (isomer B). Fasen av de tilsvarende elementer forenes og inndampes i vakuum. Residuet oppløses i 20 ml tert-butanol og lyofiliseres, hvormed det hver gang fremkommer et tynnsjiktkromatografisk enhetlig diastereomer av ovennevnte fellesformel.

DC: [Kloroform-metanol (85:15)] Isomer A: Rf 0,60; Isomer B:Rf 0,50.

Eksempel 3A

182 mg beskyttet oktapeptid med formel oppløses ved 5°C under Ng i 1,8 ml av en blanding av 89 volumdeler trifluor-eddiksyre, 10 volumprosent vann og 1 volumprosent tioglykolsyre, oppløsningen oppvarmes med en gang til 25°C, og etter 50 minutter ved denne temperatur utfelles med 60 ml heksan-eter (2:l). Det fremkommende rå trifluoracetat av sluttproduktet frafiltreres, tørkes i vakuum, oppløses i 5 ml 1 N eddiksyre og filtreres gjennom 15 ml anioneutveksler, f.eks "AG" 1-X8 (et produkt fra Bio-Rad Laboratories, Richmond, California, USA), i acetatform, eluatet lyofiliseres.

Den dannede tittelforbindelse er tynnsjiktkromatografisk enhetlig i tre systemer.

DC: System 101 : Rf 0,88

111B : Rf 0,50

112A : Rf 0,78

Eksempel 3B

I67 mg beskyttet oktapeptid med formel oppløses ved 5°C under Ng i 1,7 ml av' en blanding av 89 volumprosent trifluoreddiksyre, 10 volumprosent vann og 1 volumprosent tioglykolsyre, oppløsningen oppvarmes med en gang til 25°C og etter 50 minutter ved denne temperatur utfelles med 6 ml heksan-eter (2:l). Det resulterende rå trifluoracetat av sluttproduktet frafiltreres, tørkes i vakuum, oppløses i 5 ml 1 N eddiksyre og filtreres gjennom 15 ml anioneutveksler, f.eks "AG"1-X8 (et produkt fra Bio-Rad Laboratories, Richmond, California, USA), i acetatform, eluatet lyofiliseres.

Den dannede tittelforbindelse er tynnsjiktskromato-grafisk enhetlig, i tre systemer.

DC: System 101 : Rf 0,83

111B : Rf 0,75

112A : Rf 0,70

Det peptidiske utgangsstoff for eksemplene 3A og 3B er oppnåelig på følgende måte:

Trinn 3. 1

d. 1- H-( 3- sykloheksyl) Gaba- OBzl- p- toluensulfonat

En blanding av 0,50 g d, l-4-amino-3-sykloheksyl-smør-syre-hydroklorid og 0,428 g p-toluensulfonsyre-monohydrat i 1,2 ml benzylalkohol og 40 ml benzen destilleres langsomt ved normaltrykk inntil de iløpet av tre timer tilsammen er oppfanget 30 ml av en fraksjon, kokepunkt 70°C-90°C. Den klare reaksjonsoppløsning konsentreres i vannstrålevakuum og deretter i høyvakuum ved ca. 60°C til 3 ml. Den utfeldte kry-stallgrøt utrøres med 15 ml eter, krystallene frafiltreres og vaskes med 10 ml eter. For ytterligere rensning utrøres dette materiale med 10 ml eter ved værelsetemperatur iløpet av en time, frafiltreres, vaskes med eter og tørkes i vakuum.

DC: [Kloroform-metanol-vann (l4:6:l)J Rf 0,48

[Kloroform-metanol (85:15)] Rf 0,15

Trinn 3. 2

Z- Asn- Phe- Phe-( D- trp)- Lys( Boe)- Thr( But)- Phe-( d, 1- B- svklohek-syl) Gaba- 0Bzl

En blanding av 1,06 g Z-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys (Boc)-Thr(But)-Phe-OH (sml. trinn 1.2)„og 448 mg d,l-4-amino-3-sykloheksyl-smørsyre-benzylester-p-toluensulfonat (trinn 3«l)

i 5 ml dimetylformamid blandes med 0,111 ml N-metylmorfolin, 123 mg N-hydroksybenzotriazol og 223 mg DCCI og ihensettes 20

timer ved værelsestemperatur. Til opparbeidelse frasentrifugeres utfeldt DCC, det overstående blandes med 20 ml vann og frafiltreres. Det dannede faste stoff utrøres for ytterligere rensning med 3 ml metanol i 10 minutter, suspensjon av-kjøles til 0°C, det rene produkt frafiltreres og tørkes i vakuum.

DC: (kloroform-metanol (85:15)] Rf 0,80

(kloroform-metanol-vann (l4:6:l)] Rf 0,95.

Trinn 3»3

H- Asn- Phe- Phe-( D- trp)- Lys( Boe)- Thr( But)- Phe-( d, 1- 3- sykloheksyl ) Gaba- OH

En oppløsning av 980 mg Z-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys (Boc)-Thr(But)-Phe-(d,l-8-sykloheksyl)Gaba-0Bzl (trinn 3.2)

i 50 ml dimetylformamid hydrogeneres etter tilsettning av

100 mg palladium-kull (10$) i 4 timer ved værelsestemperatur og normaltrykk. For opparbeidelse konsentreres oppløsningen etter frafiltrering av katalysatoren i høyvakuum til 2 ml og produktet utfelles med 40 ml peroksydfri eter, frafiltreres og tørkes i vakuum. Råproduktet underkastes uten ytterligere rensning neste trinn 3»4 (syklisering).

Trinn 3. 4

En oppløsning av 836 mg H-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys (Boe)-Thr(But)-Phe-(d,l-P-sykloheksyl)Gaba-OH (trinn 3.3), 860 mg N-hydroksy-benzotriazol og 1,31 g DCCI i 640 ml dime-tylf ormamid holdes i 20 timer ved 50°C. For opparbeidelse

avdampes oppløsningsmiddelet i høyvakuum ved ca. 30°C og residuet utdrives med 20 ml etylacetat. Det utfeldte disyklo-heksylurinstoff fjernes ved frafiltrering. Filtratet fortynnes med etylacetat i 200 ml, vaskes tre ganger med hver gang 50 ml 1 N vanndig oksalsyre og deretter med vann til nøytra-litet, tørkes over na tr iumsulf a-t og inndampes i vakuum. Råproduktet underkastes for rensning motstrømsfordeling i systemet metanol-vann-kloroform-karbontetraklorid (2700 : 675

900 : 1575 volumdeler) over 400 trinn. De i elementene 81 til 108 befinnende faser (K = 0,30) inneholder en av de to diastereomerer (isomer A), de i elementene 120-147 befinnende faser (K = 0,49) den andre (isomer B). Fasen av de tilsvarende elementer forenes og inndampes i vakuum. Residuet opp-løses i 20 ml tert-butanol og lyofiliseres, hvormed det hver gang fremkommer et tynnsjiktkromatografisk enhetlig diastereomer av ovennevnte fellesform.

DC: [Kloroform-metanol (85:15)3 Isomer A : Rf 0,51,

Isomer B : Rf 0,42.

Eksempel 4A

280 mg beskyttet oktapeptid med formel

oppløses ved 5°C under Ng i 2,8 ml av en blanding av 89 volumprosent trifluor-eddiksyre, 10 volumprosent vann og 1 volumprosent tioglykolsyre, oppløsningen oppvarmes med en gang til 25°C og etter 50 minutter ved denne temperatur utfelles med 50 ml peroksydfri eter. Det resulterende rå trifluoracetat av sluttproduktet frafiltreres, tørkes i vakuum, opp-løses i 5 ml 1 N eddiksyre og filtreres gjennom 15 ml anioneutveksler, f.eks "AG" 1-X8 (et produkt fra Bio-Rad Laboratories, Richmond, California, USA), i acetatform, eluatet lyo-filis eres.

Den dannede tittelforbindelse er tynnsjiktkromatografisk enhetlig i tre systemer.

DC: System 52 : Rf 0,49

111B : Rf 0,40

157F : Rf 0,53

CD: i 1%-ig vanndig eddiksyre: A/mol.Ellipt.

[nm/Grad.cm<2>.dmoI"<X>J: 210/-37430(min); 222/-534(maks.);

230/-15506(min).

Eksempel kB

268 mg beskyttet oktapeptid med formel oppløses ved 5°C under Ng i 2,7 ml en blanding av 89 volumprosent trifluor-eddiksyre, 10 volumprosent vann og 1 volumprosent tioglykolsyre. Oppløsningen oppvarmes med en gang til 25°C og etter 50 minutter ved denne temperatur utfelles med 30 ml peroksydfri eter. Det resulterende rå trifluoracetat av sluttproduktet frafiltreres, tørkes i vakuum, oppløses i 5 ml 1 N eddiksyre og filtreres gjennom 15 ml anioneutveksler f.eks "AG" 1-X8 (et produkt fra Bio-Rad Laboratories, Richmond, California, USA), i acetatform, eluatet lyofiliseres.

Den dannede tittelforbindelse er tynnsjiktkromatografisk enhetlig i tre systemer.

DC: System 52 : Rf 0,49

111B : Rf 0,38

157F : Rf 0,52

CD: i l$-ig vanndig eddiksyre: X/ m°l•Ellipt.

[nm/Grad. cm2, dmo 1~-1] : 220/+30354(maks.); 232,5/-13811

(min}

Det peptidiske utgangsstoff for eksemplene 4A og 4B er oppnåelig på følgende måte: Trinn 4. 1

d. 1- H-[ g-( 3- fenoksyfenyl)] Gaba- OBzl- p- toluensulfonat

En blanding av 0,500 g d,1-4-amino-3-(3-fenoksyfenyl)-smørsyrehydroklorid og 0,308 g p-toluensulfonsyre-monohydrat i 0,85 nil benzylalkohol og 70 ml benzen destilleres langsomt ved normaltrykk inntil det iløpet av tre timer tilsammen oppfanges 30 ml av en fraksjon, kokepunkt 70°-90°C. Den klare reaksjonsoppløsningen konsentreres i vanns tråleva-kuum og deretter i høyvakuum ved ca. 60°C til 3 ml. Den utfeldte krystallgrøt utrøres med 15 ml eter, krystallene frafiltreres og vaskes med 10 ml eter. For ytterligere rensning utrøres dette materiale med 10 ml eter ved værelsestemperatur iløpet av en time, frafiltreres og vaskes med eter og tørkes i vakuum.

DC: [Klorof orm-metanol-vann ( 14 :6 :1 ]i] R^ 0,6l

[Kloroform-metanol (85:15)J Rf 0,30.

Trinn 4. 2

Z- Asn- Phe- Phe-( D- trp)- Lys( Boe)- Thr( But)- Phe- Cd. 1- B-( 3- fenok-syf enyl)] Gaba- OBzl

En blanding av 819 mg Z-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys (Boc)-Thr(But)-Phe-OH (sml. trinn 1.2) og 34l mg d,l-4-amino-3-(3-f enoksyf enyl) - smørsyre-benzyles ter-p -toluensulf onat (trinn 4.1) i 6 ml dimetylformamid blandes med 0,071 ml N-metylmorfolin, 95 mg N-hydroksybenzotriazol og 171 mg DCCI og hensettes 20 timer ved værelsestemperatur. For opparbeidelse frasentrifu--geres fra utfeldt DCC, det overstående blandes med 20 ml vann og frafiltreres. Det utvundne faste stoff utrøres for ytterligere rensning med 3 ml metanol iløpet av 10 minutter. Suspensjonen avkjøles til 0°C. Det rene produkt frafiltreres og tørkes i vakuum.

DC: [Kloroform-metanol (85:15)] Rf 0,76

[Kloroform-metanol-vann (l4:6:l)J Rf 0,94.

Trinn 4. 3

H- Asn- Phe- Phe-( D- trp)- Lys( Boe)- Thr( But)- Phe- [ d. 1- B-( 3. fenoksyfenyl)] Gaba- OH

En oppløsning av 943 mg Z-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys (Boe)

-Thr(But)-Phe-[d,l-B-(3-fenoksyfenyl)] Gaba-OBzl (trinn 4.2) i 30 ml dimetylformamid hydrogeneres etter tilsetning av 100 mg palladium-kull (10$) iløpet av 4 timer ved værelsestemperatur og normaltrykk. For opparbeidelse konsentreres oppløsningen etter frafiltrering av katalysatoren i høyvakuum til 2 ml og produktet utfelles med 40 ml peroksydfri eter, frafiltreres og tørkes i vakuum. Råproduktet underkastes uten ytterligere rensning neste trinn 4.4 (syklisering).

Trinn 4. 4

l- Asn- Phe- Phe- ( D- trp) - Lys ( Boc)- Thr ( But)- Phe- Tl3 -( 3- f enoksyf enyl J GabaJ

En oppløsning av 811 mg rå H-Asn-Phe-Phe-(P-trp)-Lys (Boe )-Thr (but)-Phe- [d, 1-B-(3-f enoksyf enyl)J Gaba-OH (trinn 4.3) 784 mg N-hydroksybenzotriazol og 1,20 g BCCI i 580 ml dimetyl-formamid holdes i 20 timer ved 50°C. For opparbeidelse avdampes oppløsningsmiddelet i høyvakuum ved ca. 30°C og residuet utdrives med 20 ml etylacetat. Pet utfeldte disyklohek-sylurinstoff fjernes ved frafiltrering, filtratet fortynnes med etylacetat i 200 ml, vaskes tre ganger med hver gang 50 ml 1 N vanndig oksalsyre og deretter med vann til nøytralitet, tørkes over natriumsulfat og inndampes i vakuum. Råproduktet underkastes for rensning motstrømsfordeling i systemet metanol-vann-kloroform-karbontetraklorid (2700:675:900:1575 volumdeler) over 600 trinn. Pe i elementene 80 til 113 befinnende faser (K = 0,17) inneholder en av de to diastereomerer (isomer A), de i elementene 125-167 befinnende faser (K = 0,3l) den andre (isomer B). Fasen av de tilsvarende elementer forenes og inndampes i vakuum. Residuet oppløses i 20 ml tert-butanol og lyofiliseres, hvorved hver gang fremkommer en tynnsjiktkromatografisk enhetlig diastereomere og ovennevnte fellesformel.

PC: [Kloroform-metanol (85:15)] Isomer A: Rf 0,60;

Isomer B: Rf 0,51,

[Kloroform-metanol-vann (l4:6:l)] Isomer A: R^ 0,89»

Isomer B: Rf 0,83.

Eksempel 5

(5_F-D-trp = 5-Fluor-D-tryptofyl)

147 mg beskyttet oktapeptid med formel

oppløses ved 5°C under Ng i 2,5 ml av en blanding av 89 volumprosent trifluor-eddiksyre, 10 volumprosent vann og 1 volumprosent tioglykolsyre, oppløsningen oppvarmes med en gang til 25°C og etter 50 minutter ved denne temperatur utfelles med 15 ml peroksydfri eter. Det resulterende rå trifluoracetat av sluttproduktet frafiltreres, tørkes i vakuum, opp-løses i 5 ml 1 N eddiksyre og filtreres gjennom 15 ml anioneutveksler, f.eks "AG" 1-X8 (et produkt fra Bio-Rad Laboratories, Richmond, California, USA), i acetatform. Eluatet inndampes i vakuum og residuet underkastes motstrømsfordeling i systemet n-butanol-eddiksyre-vann (4:1:5) over 230 trinn.

De i elementene 230 til 274 inneholdte faser (K = 13,7), samles, inndampes i vakuum og lyofiliseres fra tert-butanol-vann (l:l).

Den dannede tittelforbindelse er tynnsjiktkromatografisk enhetlig i tre systemer.

DC: System 52 : Rf 0,50

111B: Rf 0,45

157F: Rf 0,55.

Det peptidiske utgangsstoff er oppnåelig på følgende måte: Trinn 5. 1

Z- Asn- Phe- Phe-( 5- F- D- trp)- Lys( Boe)- Thr( But)- Phe-Cd, l-3-(l-naftylfl Gaba- OBzl

En blanding av 4ll mg Z-Asn-Phe-Phe-(5-F-D-trp)-

Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-OH (sml. trinn 11.5, eksempel 11 av den innledningsvis angitte europeiske søknad) og 172 mg d,l-4-amino-3-(1-naftyl)-smørsyre-benzylester-p-toluensulfonat -(trinn 2.l) i 3 ml dimetyl-formamid blandes med 0,039 ml N-metylmorfolin, 47 mg N-hydroksybenzotriazol og 85 mg DCCI og hensettes 20 timer ved værelsestemperatur. For opparbeidelse frasentrifugeres fra utfeldt DCC, det overstående blandes med 10 ml vann og frafiltreres. Det fremstilte faste stoff ut-røres for ytterligere rensning med 2 ml metanol iløpet av 10 minutter, suspensjonen avkjøles ved 0°C, det rene produkt frafiltreres og tørkes i vakuum.

DC: [Kloroform-metanol (85:15)] Rf 0,67

Otloroform-metanol-vann (l4:6:l)J Rf 0,87.

Trinn 5. 2

H- Asn- Phe- Phe-( 5- F- D- trp)- Lys( Boe)- Thr( But)- Phe- Cd, 1- 8- fi-na f tyl) J Gaba- OH

En oppløsning av 421 mg Z-Asn-Phe-Phe-(5-F-D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe-[d,l-6-(l-naftyl)] Gaba-OBzl (trinn 5 :l) i 15 ml dimetyl-formamid hydrogeneres etter tilsettning av 50 mg palladium-kull (10$) iløpet av 4 minutter ved værelsestemperatur og normaltrykk. For opparbeidelse konsentreres oppløsningen etter frafiltrering av katalysatoren i høyvakuum til 2 ml og produktet utfelles med 40 ml peroksydfri eter, frafiltreres og tørkes i vakuum. Råproduktet underkastes uten ytterligere rensning neste trinn 5*3 (syklisering).

Trinn 5. 3

En oppløsning av 357 mg rå H-Asn-Phe-Phe-(5-F-D-trp)-Lys(Boc)-Thr(But)-Phe- [d ,1-B-(1-naftyl)] Gaba-OH (trinn 5.2), 355 mg N-hydroksy-benzotriazol og 543 mg DCCI i 260 ml dime-tylf ormamid holdes i 20 timer ved 50°C. For opparbeidelse avdampes oppløsningsmiddelet i høyvakuum ved ca. 30°C og residuet utdrives med 20 ml etylacetat. Det utfeldte disyklohek-sylurinstoff fjernes ved frafiltrering, filtratet fortynnes med etylacetat til 200 ml, vaskes tre ganger med hver gang 50 ml 1 N vanndig oksalsyre og deretter med vann til nøytra-litet, tørkes over natriumsulfat og inndampes i vakuum. Råproduktet underkastes for rensning motstrømsfordeling i systemet metanol-vann-kloroform-karbontetraklorid (2700:675:900: 1575 volumdeler) over 480 trinn. De i elementene 75 til 114 befinnende faser (K = 0,24) inneholder en av de to diastereomerer (isomer A), de i elementene l6l-l86 befinnende faser (K = 0,50) inneholder den andre (isomer B).

Fasen av de tilsvarende elementer forenes og inndampes i vakuum. Residuet oppløses i 20 ml tert-butanol og lyofiliseres, hvormed det hver gang fremkommer en tynnsjiktkromatografisk enhetlig diastereomere av ovennevnte fellesformel.

DC: [Kloroform-metanol (85:15)] Isomer A: Rf 0,54;

Isomer B: Rf 0,45»

(kloroform-metanol-vann (l4:6:l)] Isomer A: R^ 0,90;

Isomer B: Rf 0,85.

Eksempel 6

178 mg beskyttet oktapeptid med formel

forarbeides på nøyaktig samme måte som omtalt i eksempel 1 B. Produktets rensning foregår ved motstrømsfordeling i systemet tert-butanol-toluen-metanol-puffer (800:800:340:ll4o)

(Puffer inneholdende 2,2 g ammoniumacetat og 1,6 ml is-eddik i 1 liter vann) over 770 trinn. Fasene som inneholder den rene isomer B (K = l,l) inndampes i vakuum og residuet lyofiliseres fra tert-butanol-vann.

DC: System 52 : Rf 0,46

157C : Rf 0,24.

Analogt får man også

K = 0,33 (i ovennevnte oppløsningsmiddelssystem),

DC : System 157C : Rf 0,28.

De peptidiske utgangsstoffer fåes på følgende måte:

Trinn 6. 1

H- Asn- Phe- Phe-( D- trp)- Lys( Boe)- Thr( But)- Phe- OH

En oppløsning av 3,1 g Z-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boe) -Thr(But)-Phe-OH (fremstilt ifølge trinn 1.7, eksempel 1, i den innledningsvis nevnte europeiske patentsøknad) i 100 ml dimetylformamid hydrogeneres etter tilsettning av 300 mg palladium-kull (10$) i 2 timer. Etter frafiltrering av katalysatoren inndampes oppløsningen i høyvakuum til 20 ml og anvendes uten ytterligere rensning for neste trinn 6.2.

Trinn 6. 2

Na- 2- trimetylsilyletoksykarbonyl- Asn- Phe- Phe-( P- trp)- Lys( Boc)-Thr( But)- Phe- 0H

Den i trinn 6.1 dannede dimetylformamidoppløsning av det beskyttede heptapeptid blandes med 9k0 mg 2-trimetylsilyl-etyl-suksinimidyl-karbonat (Me SiCHpCH„0C00N( /C0C| H2 ) ,og 0,27ml

J, ^ ^COCHo N-metylmorfolin og reageres i 45 minutter ved værelsestemperatur. Etter tilsettning av ytterligere 0,13 ml N-metylmorfolin reagerer .ennå i 2 l/2 time. Produktét utfelles ved inndrypning i 100 ml 0,2 N saltsyre ved 0°C og utdrives for rensning hver gang tre ganger med etylacetat og med acetonitril.

DC: System 157A : Rf 0,29.

Trinn 6. 3

Na- 2- trimetylsilyletoksykarbonyl- Asn- Phe- Phe-( D- trp)- Lys( Boe )-Thr ( But)- Phe- [ d . 1- g - ( 4- klor- 1- naf tyl ) 3 Gaba- OH

Til en oppløsning av 1,35 g Na-2-trimetylsilyl-etok-sykarbonyl-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe-OH

(trinn 6.2) og 180 mg N-hydroksysuksinimid i 2 ml dimetylformamid settes ved 0°C en oppløsning av 216 mg DCCI i 0,8 ml di-metylf ormamid og omsettes i 4 1/2 time (del l). I mellomtiden oppløses 304 mg d,l-4-amino-3-(4-klor-l-naftyl)-smørsyre i 0,6 ml 2 N benzyltrimety1-ammoniumhydroksyd i metanol under tilsettning av 10 ml dimetylformamid og litt vann og inndampes i høyvakuum i 1 til 3»5 ml. Den uklare oppløsning haes ved 0°C det ovennevnte del 1, ettervaskes igjen to ganger med 0,2 ml dimetylformamid og omsettes natten over ved værelsestemperatur. Produktet utfelles ved inndrypping i 100 ml iskald 0,2 N saltsyre, frafiltreres og vaskes med vann. Etter tørkning utdrives en ved hver gang tre ganger med etylacetat og acetonitril.

DC : System 157A : Rf 0,39 og 0,4l (diastereomere).

På analog måte fåes når det gåes ut fra d,l-4-amino-3-(4-nitro-fenyl)-smørsyre

Na- 2- trimetylsilyletoksvkarbonyl- Asn- Phe- Phe-( D- trp)- Lys( Boc)-Thr( But )- Phe- &. 1- 6-( 4- nitrofenyl ) J Gaba- OH

DC : System 157A : R 0,37.

Trinn 6. 4

H- Asn- Phe- Phe-( D- trp)- Lys( Boe)- Thr( But)- Phe- Ci. 1- 8-( 4- klor-naftyl) 3 Gaba- OH- hydroklorid

En oppløsning av 1,55 S 2-trimetylsilyletoksykarbonyl-Asn-Phe-Phe-(D-trp)-Lys(Boe)-Thr(But)-Phe- [d,1-8-(4-klor-naftyl)] Gaba-OH (trinn 6.3) i 4,2 ml dimetylformamid blandes ved 0°C iløpet av 2 minutter med 8,6 ml av en 0,59 M oppløs-ning av tetraetylammoniumfluorid i dimetylsulfoksyd og omsettes i tre timer ved 30°C. Produktet utfelles ved inndrypping av reaksjonsblandingen i 200 ml iskald 0,1 N saltsyre. Fellingen frasentrifugeres, vaskes med iskaldt vann, oppløses i tert-butanol og lyofiliseres. Residuet oppløses i 3 ml di-metylf ormamid og felles igjen med vann. Det ved sentrifuge-ring isolerte produkt vaskes ennå flere ganger med vann og

tørkes i høyvakuum.

DC : System 157A : J<j; 0,09 og 0,12 (diastereomere) .

På analog mate fåes av tilsvarende utgangsstoff

( srni . trinn 6 . '))

H- Asn- 1' he- l' he-( D- trp)- Ly s ( l) oc ) - Thr ( llut)- Phe- Cd , 1- 6- ( 4- nitro-f eny. I )] Gaba- OH. Hydroklorid

DC : System 157C : R 0,53 og 0,55 (Diastereomere).

Trinn 6. 5

En oppløsning av 1,25 g HC1 .H-/Vsn-P<h>e-Ph<e>-(D-trp ) - Lys ( Boe ) -Thr ( Dut ) -Phe Cd, l-p - (4-CJIlor-l-naf tyl )] Gaba-OH (trinn 6.4), 1,33 g N-hydroksybenzotriazol-monohydrat, 0,1 ml N-metyl-morf olin og 1,8 g DCCI i 800 ml dimetylformamid holdes i 18 timer ved 50°C. Kor opparbeidelse tilsettes 1,1 g oksalsyre, oppløsningen inndampes sterkt i høyvakuum og det utfeldte di-sykloheksylurinstoff fjernes ved frafiltrering. Filtratet utfelles ved inndrypping i fortynnet natriumhydrogenkarbonat-oppløsning. Kåpx^oduktet underkastes for rensning motstrøms-fordeLing i systemet metanol-vann-kloroform-karbontetraklorid (2700:675:900:1575 volumdeler) over 560 trinn. Det i elementene 154-228 befinnende produkt (K = 0, 43) isoleres på vanlig te - is0111 ei' U:

DC : System 157A : l*r 0,33.

I'.'i ana Log m/ite lår man av tilsvarende lineære ut-(jarigss to fl' (sml. trinn 6.4) ved syklisering av etterfølgende mots t roms forde 1 ing i samme opp.l øsningsiniddelsys tem

DC : System I 57A : K 0,27.

1 de folgende ekseinp.ler 7-1-3 vises fremstil Ling av farmasøytiske applikasjonsformer. Betegnelsen "virksomt stoff" refererer seg til de ifølge oppfinnelsen oppnåelige sluttprodukter med formel I, spesielt de fra eksemplene 1-6 og i første rekke fb-trp 8 , 3-(1-naftyl)Gaba <12> iJ-syklo-somatostatin(5-12)-oktapeptid-isomer B fra eksempel 2B og ^D-trp Q, (3- ( 3-fenoksyfenyl)Gaba 12]-syklo-somatostatin( 5-12 ) -oktapeptid fra eksempel 4B.

Claims (6)

1. Analogifremgangsmåte til fremstilling av sykliske oktapeptider med terapeutisk virkning og med formel hvori trp betyr L-Trp eller D-Trp, hvori benzenringen kan være substituert med et halogenatom, og Gaba(Ar) betyr resten av Y~aminosmørsyre substituert med sykloalkyl med 3-8 C-ringatomer eller aryl som eventuelt er substituert med halogen, laverealkyl, laverealkoksy, nitro eller fenoksy, og som har maksimalt 12 C-ringatomer, samt syreaddisjonssalter og komplekser herav, karakterisert ved at et lineært peptid med formel hvori II<*> betyr en til den nedenfor definerte formel II svarende rest, hvori amidbindingen mellom to vilkårlige naboplasserte aminosyrerester av peptidringene er avbrutt, og C betyr en fri hydroksylgruppe, en ved en aktiveringsgruppe modifisert hydroksylgruppe eller en hydrazingruppe -NH-NH2 1 sykliseres, og igjen danner forbindelse med formel hvori Gaba(Ar) og trp har ovennevnte betydning, A betyr en e—aminobeskyttelsesgruppe eller hydrogen og B betyr en hydroksylbeskyttelsesgruppe eller hydrogen, idet bare et av symbolene A og B kan bety hydrogen, avspaltes beskyttelsesgruppen eller -gruppene, og hvis ønsket, frigjøres fra et dannet syreaddisjonssalt tilsvarende base og/eller en dannet base omdannes i et syre-addis jonssalt herav.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det fremstilles en forbindelse med formel I, hvori trp betyr D-trp og Gaba(Ar) betyr resten av 4-amino-3-fenylsmørsyre eller 4-amino-3-(2-naftyl)-smørsyre, i form av en diastereomerblanding eller en individuell diastereomer eller et farmasøytisk anvendbart syreaddisjonssalt eller et kompleks herav.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det fremstilles en forbindelse med formel I, hvori trp betyr D-trp og Gaba(Ar) betyr resten av 4-amino-3-(4-fluorfenyl)-smørsyre, 4-amino-3-(4-nitrofenyl)-smørsyre eller 4-amino-3-(4-klor-l-naftyl)-smørsyre i form av en diastereomerblanding eller en individuell diastereomer eller et farmasøytisk anvendbart syreaddisjonssalt eller et kompleks herav.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det fremstilles [ D-Trp <8> , 3-sykloheksyl-gaba 121 -syklo-somatostatin(5-12)-oktapeptid,. i form av en diastereomerblanding eller en individuell diastereomer eller et farmasøytisk anvendbart syre-addis jonssalt eller et kompleks herav.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det fremstilles [D-Trp p , B-(3-fenoksyfenyl)-Gaba "IO1-syklo-somatostatin(5-12)-oktapeptid, i form av en diastereomerblanding eller en individuell diastereomer eller et farmasøytisk anvendbart syreaddisjonssalt eller et kompleks herav.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det fremstilles [D-Trp , 6-(1-naftyl)-Gaba ]-syklo-somatostatin(5-12)-i oktapeptid i form av en diastereomerblanding eller en indi viduell diastereomer eller et farmasøytisk anvendbart syre-addis jonssalt eller et kompleks herav.