NO152049B - Analogifremgangsmaate for fremstilling av den farmasoeytisk anvendelige forbindelse 4,5,6,7-tetrahydroisoksazolo (5,4-c)pyridin-3-ol - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av den hittil ukjente, farmasøytisk anvendelige forbindelse 4,5,6,7-tetrahydroisoksazolo[5,4-c]pyridin-3-ol med formel I

eller salter derav med syrer.

GABA (gamma-aminosmørsyre) er kjent å være en neuro-transmitter i sentralnervesystemet i pattedyr. GABA finnes hovedsakelig i hjernen, hvor den er en dominerende hemmende transmitter (D. R. Curtis og G.A.R. Johnston, Ergebn. Physiol., 1974 , 69, 97-188) .

Det har vært beskrevet (Arzneimittelforschung, 1968, 18, 311-315) at muscimol med formelen

(et stoff som finnes i fluesopp (Amanita muscaria)) har forskjellige interessante farmakologiske egenskaper, og særlig hemmer motoriske funksjoner. Det er senere angitt at muscimol er en meget kraftig GABA-agonist med hensyn til bicucullin-følsomme postsynaptiske receptorer (Johnston et al., Biochem. Pharmacol., 1968, _17, 2488

og Curtis et al., Brain Res., 1971, 3_2 , 69-96) , men det viser også aktivitet som inhibitor for den høye affinitetsopptagelse av GABA

i rottenjerneskiver (Johnston, Psychopharmacologia, 1971, 22, 230-233). Nedsatt funksjon i GABA-systemet antas å være knyttet til etiologien av parkinsonisme, epilepsi, Huntingtons chorea (Thomas N. Chase og Judith R. Walters, GABA in Nervous System Function, redigert av E. Roberts, T.N. Chase og D.B. Tower,

Raven Press, New York, 1976, 497-513) og schizofreni, og

administrering av midler som innvirker på GABA-systemet er

derfor under overveielse og forskning for terapeutisk behandling

av slike sykdommer som er forbundet med funksjonsfeil i GABA-systemet. Det overveies videre å administrere midler som har innflytelse på GABA-systemet mot sykdommer hvor det inngår funksjonsfeil i hypofysesystemet, f.eks. sykdommer hvor det er nedsatt prolaktinsekresjon, og det antas videre at slike midler kan anvendes mot arteriosklerotiske sykdommer i hjernen hvor det ønskes vasodilatasjon. Uheldigvis har muscimol imidlertid giftige virkninger, f.eks. narkotisk virkning (hallusinatorisk effekt),

og forskjellen mellom den virksomme dose og den giftige dose av muscimol er meget liten (Arzneimittelforschung, 1968, 18, 311-315), hvilket kan begrense eller forhindre terapeutisk anvendelse av muscimol. Det er videre meget ønskelig å tilveiebringe et stoff med mer spesifikk GABA-aktivitet enn muscimol, som, som angitt ovenfor, viser betydelig GABA-opptagelseshemmende virkning foruten GABA-agonistvirkning. •I et forsøk på å etablere en struktur/ aktivitets-sammenheng er forskjellige muscimolanaloger eller muscimollignende stoffer- blitt syntetisert (P. Krogsgaard-Larsen et al., Journal of Neurochemistry, 1975, 25, 797-802 og 803-809). Imidlertid har ingen av de undersøkte forbindelser vist GABA-agonistvirkning med samme styrke som muscimol.

Foreliggende oppfinnelse angår fremstilling av en hittil ukjent forbindelse med GABA-beslektet virkning og salter derav med syrer eller baser, som kan anvendes for fremstilling av farmasøytiske preparater som inneholder den hittil ukjente forbindelse eller salter derav som aktiv bestanddel. Den hittil ukjente forbindelse og salter derav kan anvendes for behandling av neurologiske- "

og psykiatriske sykdommer, f.eks. epilepsi, parkinsonisme, schizofreni og Huntingtons chorea, eller sykdommer hvor det inngår funksjonsfeil i hypofysehormonsystemet, eller<:>arteriosklerotiske sykdommer i hjernen hvor det ønskes en vasodilatasjon.

Det har vist seg at den hittil ukjente forbindelse med

formel I

(4,5,6,7-tetrahydroisoksazolo[5,4-c]pyridin-3-ol)

tåles godt og er en meget kraftig GABA-agonist med meget spesifikk virkning, idet den er inaktiv som GABA-opptagelse-inhibitor. Detaljerte opplysninger angående denne forbindelses virkning er angitt nedenfor i avsnittet "Forsøksresultater".

Den kraftige, spesifikke GABA-agonist-virkning av forbindelsen med formel I er særlig bemerkelsesverdig på bakgrunn av at kjente, meget nær beslektede forbindelser, nemlig

ikke har en slik. kraftig og spesifikk GABA-agonist-virkning.

Selv om foreliggende oppfinnelse ikke skal bindes til noen teori, antas det at den bemerkelsesverdige'selektive virkning av forbindelsen I skyldes nitrogenatomets spesielle stilling i den 6-leddete ring.i forhold til den "sure hydroksygruppen i den 5-leddete ring.

Til forskjell fra alle andre bicykliske muscimolderivater

som har vært underkastet undersøkelse, har den hittil ukjente forbindelse 4,5,6,7-tetrahydroisoksåzolo[5,4-c]pyridin-3-ol

(betegnet som THIP) vært den eneste forbindelse som oppviser spesifikk GABA-agonistvirkning. Det er overraskende at THIP er den eneste av de nært beslektede forbindelser som har den kraftige virkning. THIP's affinitet til GABA-reseptorer in vitro er typisk 100 ganger og i de fleste tilfeller mer enn 1000 ganger større enn noen av de nært beslektede forbindelsers affinitet. I en artikkel i Adv. Exp. M ed. Biol. 123 (1979), 303-321 er det beskrevet forsøk som illustrerer dette forhold. Særlig figur 3 i denne artikkel viser den store forskjell mellom THIP og de beslektede bicykliske muscimolderivater. Muscimol har riktignok større affinitet til GABA-reseptorer, men muscimol har på grunn av sin giftighet ingen farmakologisk interesse. Den isomere forbindelse som er nevnt i Acta Chem. Scand. B 31 (1977), 584-588, og som i denne artikkel er betegnet som A, har ingen merkbar, affinitet til GABA-reseptorene. Den forbindelse som er beskrevet i Acta, Chem. Scand. B28 (1974)

nr. 5, side 533-538, er en med THIP analog forbindelse, nemlig 4,5,6,7-tetrahydroisoksazolo[4,5-c]pyridin-3-ol-zwitterion, som er den forbindelse i fig. 3 på side 310 i den ovennevnte artikkel,

som har IC^Q-verdien (umoD 72.

Denne IC^-verdi på 72 skal sammenlignes med verdien for THIP, som er 0,13. IC^Q-verdien angir den konsentrasjon ved

hvilken prøveforbindelsen hemmer binding av radioaktivt GABA

med 50%, slik at en høy IC^Q-verdi viser en lav reseptoraffinitet.

THIP er den eneste forbindelse blandt de bicykliske muscimolderivater som har vist seg å1 reagere signifikant med GABA-reseptorer, og har med andre ord GABA-antagonistvirkning. Det er i høy grad overraskende at THIP har denne virkning når de så nært beslektede forbindelser ikke har det!

Forbindelsen med formel I kan eksistere i en tautomer

form, som kan illustreres med den generelle formel I'

og i foreliggende beskrivelse og krav skal formel I forstås å dekke også denne tautomere form samt blandinger av de to tautomere former.

Eksempler på salter av forbindelsen med formel I er syreaddisjonssalter, f.eks. farmasøytisk godtagbare salter med uorganiske syrer, f.eks. saltsyre, bromhydrogensyre, salpetersyre, svovelsyre og fosforsyre, eller med organiske syrer, f.eks. organiske karboksylsyrer så som eddiksyre, propionsyre, glykolsyre, malonsyre, ravsyre, maleinsyre, fumarsyre, eplesyre, vinsyre, sitronsyre, glukuronsyre, benzoesyre og embonsyre, eller organiske sulfonsyrer, f.eks. metansulfonsyre, etansulfonsyre, benzensulfonsyre og toluensulfonsyre, hvilke salter kan fremstilles på i og for seg kjent måte, f.eks. ved å sette den aktuelle syre til basen, fortrinnsvis i et oppløsningsmiddel. Forbindelser med formel I

kan danne farmasøytisk godtagbare salter med baser, f.eks. metallsalter, f.eks. natrium-, kalium-, kalsium- eller aluminium-salter, og ammonium- og substituerte ammoniumsalter, f.eks. salter av aminer så som trietylamin, trietanolamin, etylpiperidin, prokain og dibenzylamin.

Forsøksresultater

Af finitetsbindingsforsøk

For å studere innvirkningen av forbindelse I på de sentrale GABA-receptorer in vitro ble forbindelse I undersøkt

i affinitetsbindingsforsøk. Affinitetsbindingen (natrium-

uavhengig binding) av GABA til membraner som var isolert fra rottehjerner, ble undersøkt som beskrevet av S. J. Enna og S. H. Snyder (Brain Res., 1975, 100, 81-97). Det ble bestemt IC5Q-verdier, de inhibitor-konsentrasjoner som forårsaket 50% hemning av GABA-binding.

x)

Ved tidligere forsøk ble funnet 2,6 ± 0,6 uM. Den angitte verdi (0,13 ± 0,005 pM) er basert på undersøkelse av fem forskjellige konsentrasjoner av I , som hver ble bestemt in triplo, og de angitte IC^-verdier er beregnet ved log-probit-analyse. Forskjellen mellom de to IC^q-verdier som er bestemt for I skyldes utviklingen'av en forbedret teknikk til fremstilling av rottenjerne-membraner.

Mi kroelektrofor etiske forsøk

For å studere innvirkningen av forbindelse I på de sentrale GABA-receptorer in vivo, ble forbindelse I undersøkt ved mikroelektroforetiske forsøk. Det ble utført forsøk med lumbale dorsale horn-interneuroner og Rensbaw-celler fra katter som var bedøvet med pentobarbiton-natrium. Den omtrentlige styrke av forbindelsens depressive virkning<1>ble uttrykt i forhold til styrken av GABA på grunnlag av de elektroforetiske strømmer som var nødvendige for å fremkalle like stor og sub-maksimal hemning av aktiveringen av de sentrale neuroner. Den hemmende virkning av I på sentrale neuroner ble opphevet med den spesifikke GABA-antagonist bicucullin-metoklorid (BMC).

Foroindelsen I innvirket ikke på GABA-opptagelses-

i - 4

systemet ved konsentrasjoner på 5 x 10 M og innvirket ikke på

de GABA-metaboliserende enzymer GABA: 2-okso-glutarat-amino-transferase og L-glutamat-l-karboksylase ved konsentrasjoner på IO*"3 M. ;Ifølge de ovennevnte forsøk er forbindelsen I en spesifikk og meget kraftig GABA-agonist. ;Forbinde 1 sen I er blitt sammenlignet med muscimol, ;den kraftigste hittil kjente GABA-agonist, i en serie farmakologiske forsøk: ;Toksisitet ;Foroindelsen I 'nar vist seq å være et qodt tolerabelt stoff: ;Det fremgår av disse tall at forbindelsen I er betydelig mindre giftig enn muscimol. ;Injeksjoner i substantia nigra på rotter ;a) Bilaterale injeksjoner: 0,1, 0,5 og 1,0 ug I . ,HBr ble injisert. Rottene oppviste en utpreget stereotyp oppførsel. ;I viste seg å være svakere enn muscimol. ;b) Unilaterale injeksjoner: 0,1 og 0,5 \ ig I ,HBr ble injisert. Rottene viste en kraftig og forlenget kontralateral dreining. ;I viste seg å være svakere enn muscimol. ;F armakologiske resultater med mus ;a) Forsterkning av metylfenidat-fremkalt gnaging (Scheel-Kruger et al.: Muscimol differentially facilitates stereotypy but ;antagonizes motility induced by dopaminergic drugs. A complex GABA-DOP AMINE interaction. Life Sciences, 1978, vol. 22, 75-84) . ;ED50-verdi (mg/kg) (den dose som forårsaker forsterkning hos 50% av dyrene) ;;b) Antagonisme av morfin-fremkalt motilitet (Christensen et al.: Muscimol antagonizes morphine hypermotility without potentiation ;of analgesia. European J. Pharmacol., 1978, 48, 459-462). ;MED (mg/kg) (minimal virksom dose) • ;c) Antagonisme av isoniazid-fremkalte kramper (modifikasjon (mus to ganger lavere konsentrasjon av isoniazid) av Mao et al.: Evidence for an involvement of GABA in the mediation of cerebellar c-GMP decrease and the anticonvulsant action of diazepam. Waunyn-Smiedeberg's Arch. Pharmacol. 1975, 289, 360-378). MED (minimal virksom dose) (mg/kg) ;Betingelser og teknikk ved isoniazid-antagonisme-forsøk: ;Hannmus, 20-2 5 g ;Isoniazid 300 mg/kg subkutant ;Makrolon-bur, type II ;Forsøks forbindelsen ble injisert intraperitonealt i doser på 0, 1/2, 1/8 og 1/32 av den bestemte "intravenøse LD5 -dose" . ;I tilfelle av uoppløselige stoffer ble det anvendt doser på 0, 1/4, 1/16 og 1/64 av den bestemte " intraperitoneale LD^-dose" . Til hvert dosenivå ble anvendt 5 mus. Umiddelbart efter administrering av forsøksforbindelsen ble 300 mg/kg isoniazid injisert subkutant. Denne dose isoniazid fremkaller uregelmessige, toniske, støtvise kramper i løpet av 60 minutter. ;Beregningene ble utført som ,"on-line procedure" på EDB-terminal. Resultatene er angitt som den prosentvise økning i tiden før krampene inntrer, og dessuten er angitt den minste dose (MED) som viser tydelig virkning (minste virksomme dose, beregnet ved hjelp av van der Waerden-test). ;Konklusjon: ;Ifølge disse forsøk har forbindelsen I vist seg å være en kraftig GABA-agonist. Forbindelsen I er svakere enn muscimol, ;men betydelig mindre giftig. ;Forbindelsene med formel I kan fremstilles ved at en forbindelse med den generelle formel V ;hvor Z betyr alkoksykarbonyl med den generelle formel VII: ;hvor R betegner C^_galkyl, underkastés en reaksjon for å fjerne gruppen Z ; forbindelsen med formel I, hvis den erholdes i form av et salt, omdannes om ønsket til den zwitterioniske form derav med formel Ia ved behandling med en base, eller til et annet salt, med ;i ;farmasøytisk godtagbare uorganiske og organiske syrer. ;Forbindelsen med formel I og salter derav kan fremstilles for administrering på en hvilken som helst passende måte, analogt med andre farmasøytiske midler. ;Oppfinnelsen belyses nærmere i de nedenstående eksempler. ;Alle forbindelser som er fremstilt ifølge utførelseseksemplene har vært underkastet elementæranalyse for C, H, N og, hvis det ;forekommer, halogen, og de er alle innenfor _+ 0,3% av de beregnede verdier. ;Eksempel 1 ;a) 3- hydroksy- 4, 5, 6, 7- tetrahydroisoksazolo[ 5, 4- c] pyridinium-bromid ( I ( salt)) ;En oppløsning av 309 mg (1,6 mmol) 3-hydroksy-4,5,6,7-tetrahydroisoksazolo[5,4-c]pyridin-6-karboksylsyre-metylester (som kan fremstilles ved behandling av l-metoksykarbonyl-3-oksopiperidin-4-karbohydroksamsyre-etylenacetal med syre, f.eks. konsentrert saltsyre) i 3 ml av en oppløsning av hydrogenbromid i iseddik (43%) kokes under tilbakeløpskjøling i 15 minutter. Efter inndampning til tørrhet i vakuum behandles residuet med ;3 ml av samme reagens i ytterligere 15 minutter. Ved inndampning ;av reaksjonsblandingen til tørrhet i vakuum og omkrystallisering (metanol-eter) av residuet får man 193 mg (56% av det teoretiske) I (salt) i form av svakt rødlige krystaller, smeltepunkt 162-163 (spaltning). ;IR-spektrum (KBr): 3700-3300 (m), 3070 (s), 3000-2300 (flere bånd, m-s), 1670 (m), 1580 (m), 1525 (s) og 1505 (w) cm<-1>. ;UV-spektrum (metanol): <210 nm. ;"*"H NMR-spektrum [ D^ O (natrium-3-(trimetylsilyl)propansulfonat anvendes som indre standard)]: 6 = 4,77 (ca. 5H, s), 4,43 (2H,t, J 1Hz), 3,7-3,4 (2H, q, J 6 og 7 Hz), 3,0-2,7 (2H, t).

b) 4, 5, 6, 7- tetrahydroisoksazolo [5,4-c] pyridin 22l£1• zwit terion (Ia)

Til en oppløsning av 77 mg (0,35 mmol) 3-hydroksy-4,5,6,7-tetrahydroisoksazolo [ 5,4-c]pyridiniumbromid i 0,6 ml vann settes en oppløsning av 39 mg (0,39 mmol) trietylamin i 0,6 ml etanol. Blandingen får stå ved 25°C i 2 timer. Det isoleres 42 mg (86%

av det teoretiske) av forbindelse Ia i form av farveløse krystaller, smeltepunkt 242-244°C (spaltning).

IR-spektrum (KBr): 3700-2900 (s), 2900-1900 (flere bånd, m-s),

1670 (s), 1625 (m) cm"<1>.

UV-spektrum [metanol (log e)]: 212 (3,64) nm.

pKft-verdier '(H20, 25°C) : 4,44 <+> 0,03, 8,48 ± 0,04.

Eksempel 2

4, 5, 6, 7- tetrahydroisoksazolo[ 5, 4- c] pyridin- 3- ol, zwitterion ( Ia)

En oppløsning av 37 g 3-hydroksy-4,5,6,7-tetrahydroisoksazolo [5 , 4-c] pyridin-6-karboksylsyre-metylest er (Va) i hydrogenbromid i iseddik (33% HBr, 250 ml) får stå i 16 timer ved romtemperatur. Ved inndampning til tørrhet i vakuum får man HBr-saltet av Ia i form av et gulaktig krystallinsk stoff som oppløses i en blanding av 100 ml vann;og 200 ml etanol. Det tilsettes trietylamin inntil pH er 6,5, hvilket får Ia i zwitterionform til å krystallisere. Efter henstand i 3 timer ved 5°C og filtrering, vaskes bunnfallet på filteret med en blanding av 25 ml vann og 50 ml etanol, hvorved man får 26 g (95% av det teoretiske) av zwitterionet i form av et hvitt, krystallinsk stoff, smeltepunkt 242-244°C (spaltning).

Claims (2)

1. Analogifremgangsmåte for fremstilling av den hittil ukjente, farmasøytisk anvendelige forbindelse 4, 5 , 6 , 7-tetrahydro-isoksazol[5,4-c]pyridin-3-ol med formel I eller salter derav med syrer, karakterisertvedat a) en forbindelse med den generelle formel V i hvor Z betegner alkoksykarbonyl med den generelle formel VII hvor R 5 betegner C^_g-alkyl, underkastes en reaksjon for fjernelse av gruppen Z, og at forbindelsen med formel I, hvis den er erholdt i form av et salt, omdannes om ønsket til zwitterionformen derav med formel Ia ved behandling med en base eller til et annet salt med farma-søytisk godtagbare uorganiske eller organiske syrer.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1 for fremstilling av 4,5,6,7-tetrahydroisoksazol[5,4-c]pyridin-3-ol eller et salt derav, karakterisert ved at metyl-3-hydroksy-4,5,6,7-tetrahydroisoksazol[5,4-c]pyridin-6-karboksylat hydrolyseres.