NO148281B

NO148281B - Fremgangsmaate ved fremstilling av allergenholdige forbindelser

Info

Publication number: NO148281B
Application number: NO77772848A
Authority: NO
Inventors: Weng Yek Lee; Alec Sehon
Original assignee: Pharmacia Ab
Priority date: 1976-08-17
Filing date: 1977-08-15
Publication date: 1983-06-06
Also published as: DK158359B; CH641681A5; CA1091153A; NL7709025A; FR2362156A1; JPS5324033A; SE7709233L; DE2736223C2; US4261973A; DK158359C; GB1578348A; AU2794277A; AU520366B2; DE2736223A1; JPH0116812B2; AT359637B; NO148281C; SE448147B; NO772848L; ATA592477A

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte av den art som er angitt i krav l's ingress.

Ca. 15%.av befolkningen i utviklede land lider av allergier mot tilsynelatende uskadelige forbindelser i omgivelsen såsom inhalanter (f.eks. pollen, støv og fjær som er ansvarlige for eksternt betinget astma og høysnue), forskjellige næringsmidler, ull, legemidler etc.. Allergiske pasienter i motsetning til normale individer produserer reagine antilegemer mot de antigene (allergene) bestanddelene i disse forbindelser.

Vanligvis vedrører uttrykket antigen en forbindelse med evnen til å fremkalle et immunsvar og i allmennet er dette også den forbindelse som anvendes for å påvise tilsvarende antilegemer gjennom noen av de mange in vitro- og in vivo-immunologiske fremgangsmåter som er tilgjengelige for de-monstrasjon av antigen-antistoff-vekselvirkning. På lignende måte anvendes uttrykket allergen for å betegne et antigen med evne til å fremkalle og forenes med reagine antilegemer; denne definisjon utelukker imidlertid ikke muligheten at allergener også kan fremkalle antilegemer av an-

dre klasser enn IgE. Såsom det her anvendes defineres uttrykket antigenisitet som evnen hos et antigen feller allergen til å forenes in vitro med tilsvarende antilegemer;

uttrykket a 11 e r g e n i c i t e t eller hudaktivitet som evnen hos et allergen til å forenes in vivo med homologe reagine antilegemer og derigjennom utløse systemanafylaksi eller lokale hudreaksjoner enten ved direkte hudprøve eller ved passive kutane anafylaktiske (PCA)-reaksjoner; og uttrykket immuno-genisitet i begrenset betydning som evnen hos et antigen eller allergen til å fremkalle tilsvarende spesifikke anti-legemssvar in vivo. Uttrykket tolerogenisitet betegner evnen hos en allergenholdig forbindelse til å, på en spesifikk måte,' vesentlig hemme immunsvaret in vivo på tilsvarende ikke modifiserte naturlige allergen; i denne sammenheng kommer uttrykket tolerogen til å anvendes vekslende med uttrykket immunosuppressiv.

Reagine antilegemer har den spesielle egenskap blant alle klasser av immunoglobuliner å bli fiksert til mast celler og basofiler hos de individer, i hvilke et allergent serum injiseres. Tverrbindingen av de IgE-antilegememolekyler som er fiksert til disse celler med et visst allergen, ut-løser degranulering av disse celler, hvilket følges av fri-givelse av farmakologiskt vasoaktive stoff fra granulene, eksempelvis histamin, bradykinin, den langsomt reagerende anafylaksi-forbindelsen (SRS-A), eosinofil kemotaktisk anafylaksi-faktor (ECF-A) og en blodplateaktiverende faktor. Disse forbindelser fører til de allergiske symptomer, dvs. system- eller lokalinflammatoriske reaksjoner, ved å virke på blodkar og glatt muskelvev; i verste fall kan disse reaksjoner føre til anafylaksi.

Den for nærværende anvendte terapi omfatter en lang rekke injeksjoner av det skadelige allergen i løpet av mange år hvilket måtte administreres i eksakte doser p.g.a. den in-neboende allergenisitet hos naturproduktene og den derav følgende fare for at de skal utløse systemanafylaktiske reaksjoner.

Man har på forskjellige måter forsøkt å modifisere allergenene i den hensikt å nedsette allergenisiteten, eksempelvis slik som beskrevet i norsk patent nr. 135.015, ved å danne inter- og intra-molekylære bindinger i det allergene materiale ved hjelp av eksempelvis en polyaldehyd. Disse modifiseringer har imidlertid alltid funnet sted med bibeholdelse av immunogenisiteten, dvs. dannelse av antilegemer .

Derfor er det vesentlig for en sikker og effektiv terapi å fremstille derivater av de naturlige allergenene som skal være kapable til å virke som tolerogener ved å markant undertrykke, om ikke helt oppheve, IgE-antilegemereaksjonen på en immunologisk spesifikk måte. Videre skal disse tolerogene derivater ha to ytterligere egenskaper, nemlig (i) de skal være ikke-allergene, dvs. de skal ikke kunne forenes in vivo med de IgE-antilegemer som er knyttet til mast celler og basofiler og følgelig skal de ikke kunne ut-løse anafylaktiske reaksjoner og (ii) de skal være ikke-immunogene, dvs. de skal ikke være egnet til å fremkalle en immunreaksjon mot seg selv ved gjentatte injeksjoner.

Man har nå funnet at disse mål kan oppnås ved overføring av immunogene allergener (såsom ovalbumin (OA) og ikke di-alyserbare bestanddeler av et vannholdig ekstrakt av "ragweed"-pollen (RAG) og hundealbumin) til tolerogene derivater som også er hovedsakelig ikke-immunogene (ved administrering uten adjuvantia) og ikke-allergene ved å kovalent koble ikke-immunogene vannoppløselige polymerer til disse allergener.

Foreliggende oppfinnelse vedrører således en fremgangsmåte til å fremstille slike allergenholdige forbindelser, og fremgangsmåten er særpreget ved det som er angitt i krav l's karakteriserende del.

Som ikke-immunogene vannoppløselige polymerer, som skal anvendes for fremstillingen av de ovenfor angitte allergenholdige forbindelsene, har polyetylenglykoler spesielt slike med en molekylvekt av 2000 - 35000 vist seg å være meget anvendelige. Polyetylenglykoler i denne sammenheng innbefatter også fysiologisk godtagbare derivater derav, såsom mono-lavere-alkyletere, fortrinnsvis monometylete-rene, hvorved hydroksylgruppene ved enden av molekylene passende anvendes i forbindelse med koblingen.

Også andre ikke-immunogene, vannoppløselige polymerer kan anvendes, såsom polyvinylalkoholer, polyvinylpyrrolidoner, polyalkryiamider og homopolymerer av aminosyrér.

For kovalent kobling av slike polymerer til allergenmolekylene kari man anvende alle koblingsmetoder som normalt anvendes for kobling mellom biologisk aktive materialer og inerte polymerer. Slike metoder er f.eks. kobling med hjelp av blandet anhydrid, cyanurklorid, isotiocyanat, reaksjon mellom -SH-derivat og -CH2I-derivat.

Koblingsreaksjonen utføres mellom aktive grupper i allergenmolekylene og i polymermolekylene. Om så kreves må slike grupper innføres i molekylene før koblingsreaksjonen. Slike aktive grupper er eksempelvis -NI^, -NCS, -SH, '•OH, -CH2I og -COOH, og de kan innføres ifølge velkjente metoder, om de ikke allerede er tilstedeværende i molekylene. Koblingen av polymerene til allergenet skal, som ovenfor nevnt, utføres i en slik utstrekning at de erholdte forbindelsene er tolerogene (immunosuppresiive) likesom hovedsakelig ikke-allergene og ikke-immunogene. Den grad av konjugering av polymermolekyler til allergenmolekylene som gir dette resultat kan variere fra allergen til aller^ gen. Imidlertid er det åpenbart for fagmannen hvordan den nødvendige konjugeringen skal erholdes i hvert tilfelle ved fremstilling av serier av konjugat med forskjellige konjugeringsgrader og fastslåelse av det spesielle område, innenfor hvilket de ovenfor angitte krav er oppfylt.

For lave konjugeringsgrader resulterer i allergene og immunogene konjugat og for høye konjugeringsgrader resulterer i konjugat som ikke er tolerogene.

Det er hensiktsmessig å fremstille tolerogene derivater

av hovedsakelig alle allergener som er ansvarlige for de vanlige former av allergi hos mennesker og andre patte-dyr .

Slike allergener stammer fra f.eks. dyr (spesielt husdyr såsom hunder, katter, kyr, hester, etc), pollen fra forskjellige gressorter og trær, insektgifter, næringsmidler, husstøv, midd og muggsopp.

De allergenholdige forbindelser fremstilt ifølge oppfinnelsen anvendes fortrinnsvis i form av oppløsninger i salt--oppløsning eller i en fysiologisk godtagbar buffer. Slike oppløsninger kan administreres parenteralt og fortrinns-

vis administreres de intravenøst eller intramuskulært. Ad-ministreringene kan gjentas med passende inte'rvall.

De allergenholdige forbindelser kan oppbevares i fryse-tørket form.

Oppfinnelsen belyses i de følgende eksempler og tabeller

og med henvisning til de vedlagte tegninger i hvilke

fig. 1 og fig. 2 er diagrammer som illustrerer testresul-tater .

Materialer og metoder

Dyr. 8-12 uker gamle, innavlede (C,-7BL/6 x DBA/2JF-^ - mus (betegnet som BgD2F^) og ikke innavlede pigmenterte rotter ble innkjøpt fra North American Laboratories Supply Company, Gunton, Manitoba, Canada.

Fremstilling av hapten- protein- konjugat. Ovalbumin (OA)

og bovin-Y-giobuliner (BBG) fra Nutritional Biochemicals CO.,Cleveland, Ohio, USA respektive Calbiochem, San Diego, California, USA anvendes for syntese av DNP^-OA- og DNP^g-BGG-konjugat gjennom reaksjonen med natrium-2,4-dinitorbenzen-

sulfonat (DNBS) i 0,2M Na2C03-oppløsning. Det 2,4-dinitrofe-nylerte ekstraktet av Ascaris suum (DNP-Asc) som inneholder

— 8

6,5 x 10 M DNP pr. mg Ase ble fremstilt ved omsetning av 4 6 mg Ase med 24 mg DNBS i nærvær av 4 6 mg Na2C02 i et totalt volum på 5,5 ml destillert vann ved 37 C i 2 timer. Ureagert hapten ble eliminert ved gelfiltrering gjennom en kolonne

(r)

av Sephadex"-- G-25 (dekstran tverrbundet med epiklorhydrin fra Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sverige).

Immunisering og måling^ av immunsvar

For optimale anti-DNP- og anti-OA-IgE-svar ble mus injisert i.p. med den lave standarddosen på 1 ug DNP^-OA suspendert med 1 mg nylig fremstilt aluminiumhydroksyd i 0,5 ml fosfatbuffret salt-oppløsning (PBS). Denne dose administrert ad i.p. vei kommer heretter til å kalles sensibiliseringsdose.

Det optimale spesifikke IgE-svaret for pollenallergener fra ragweed"(RAG) ble fremkalt hos mus gjennom i.p. injisering i nærvær av 1 mg A1(0H)^ av 10 ug av enten RAG eller av AgE, som utgjør en av de rensede komponentene i RAGJ AgE ble innkjøpt fra Worthington Biochemical Corporation, Freehold, New Jersey, U.S.A.. Mus ble sensibilisert også med 10 ug DNP-Asc forblan-det med 1 mg A1(0H)^ i 0,5 ml PBS for indusering av anti-DNP-og anti-Asc-IgE- antilegemer. Grupper på 5 mus ble behandlet på identisk måte og serumet fra musene innenfor hver gruppe ble slått sammen for bestemmelse av den gjennomsnittlige reagine titeren gjennom passiv kutan anafylaksi(PCA)-analyse. Sluttpunktene ved titreringen ble valgt som den resiproke verdi for den høyeste fortynningen av hvert serum som resulterte i en reaksjon med 5 mm i diameter. PCA-titrene for ett og samme reagine serum best<«>emt på forskjellige rotter var re-produserbare innenfor en faktor 2; alle PCA-titerene angis som middeltall av to bestemmelser. Samtidig nærvær av antilegemer av andre immunoglobulinklasser' enn reaginer i sera av immuni-serte mus ble konstatert ved passiv hemagglutinasjons-(HA)-analyse.

Følsomheten ved denne analyse ble ansett fullt tilstrekkelig

for denne undersøkelse ettersom den ga en HA-titer av størrelses-orden 1000 med et kanin-standard-anti-DNP-serum anvendt som kontroll for hver HA-test.

For indusering av optimale anti-DNP- og anti-OA-svar i Chester Beatty-rotter ble disse dyr injisert i.p. med 1 ug DNP^-OA i

10 0,5 ml PBS suspendert med 1 mg nylig fremstilt Al(OH)^ og 10 organismer fra en Bordetella pertussis-vaksine (Connaught Laboratories, Toronto, Canada). Titeren for IgE-antilegemer frembrakt i mus og rotter måles ved passiv kutan anafylaksi(PCA)-analyse i ikke innavlede pigmenterte rotter.

Adoptiv celleoverføring

Denne fremgangsmåte bestod i overføring av miltceller fra sensibiliserte og toleriserte mus til røntgenbestrålte (550 R) syngenetiske mottakere og injisering av mottakerne med stan-dardsensibiliseringsdosen antigen i nærvær av A1(0H)3 innen 4 timer etter celleoverføringen.

Eksempel 1- 2

To satser polyetylenglykol (PEG, fra Baker Chemical Co., phillipsburg, New Jersey, U.S.A.) med middelmolekylvekter på

6000 og 20000, nedenfor kalt PEGg resp, PEG2Q, ble koblet til OA og RAG med anvendelse.av cyanurklorid som koblingsmiddel med hjelp av en metode lignende den som beskrives av R. Sharon et al., J. Immunol. 114:1585 (1975).

OA-PEGg- og OA-PEG20-konjugatene ble fremstilt på følgende måte: en av disse PEG (0,4 g) oppløst i 6 ml 0,5N NaOH ble blandet med 0. 1 g OA i 5 mi PBS og en oppløsning av cyanurklorid (0,2 g i 3 ml N,N<1->dimetylformamid) ble tilsatt dråpevis under konstant omrøring til denne blanding. Reaksjonen fikk forløpe under om-røring ved romtemperatur i 2 timer og ytterligere 1 døgn ved 4°C. Reaksjonsblandingen ble deretter dialysert mot PBS for eliminering av alt ureagert cyanurklorid og konsentrert ved redusert trykk til et volum av 5 - 7 ml. Konjugatene ble deretter isolert fra fri PEG og OA ved filtrering gjennom en Sepharose® 4B-kolonne fra Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sverige med anvendelse av boratbufret saltoppløsning (BBS) som elueringsmiddel. OA-PEG-konjugateneforelå hovedsakelig i de fraksjoner som tilsvarte kolonnens frie kanalvolum; disse fraksjoner ble slått sammen og konsentrert.

Måten å fremstille RAG-PEGg og RAG-PEG20 på lignet det som ble beskrevet for OA-PEG-konjugat, dvs. reaksjonsblandingen bestod av 0,1 g av enten PEGg eller PEG20 i 2 ml 0,5N NaOH, 40 mg RAG i 5 ml PBS og 80 mg cyanurklorid i 1 ml N,N'-dimetylfor-mamid. RAG-PEG-konjugateneble isolert også ved filtrering gjennom en Sepharosé® 4B-kolonne såsom beskrevet ovenfor.

Biologiske eksperimenter

1. ' DNP- OA- system

( A) Hemming av reagint antilegemesvar med OA- PEG- konjugat

For å teste-effekten av OA-PEGg-konjugat på dannelsen av

reagine antilegemer ble 1 mg OA-PEGfa, injisert i.v. i mus 4

timer innen de ble immunisert med standardsensibiliseringsdosen på 1 ug DNP3~0A i A1(0H)3 på dag 0. Musene fikk i.p. en andre injeksjon av det immuniserende antigenet på dag 28 uten

ytterligere administrering av konjugatet. En kontrollgruppe mus fikk PBS istedenfor konjugatet. De reagine antilegemesvar som var spesifikke for haptenet og bæreren illustreres av dia-grammet i fig. 1, i hvilket PCA-titerene på den vertikale aksen er avsatt mot tiden, uttrykt . i uker, på den horisontale aksen. Begge de øvre kurvene tilsikter kontrollgruppen, mens begge de

nedre kurvene representerer testgruppen. Kurver trukket med hele linjer angir anti-DNP, mens de strek-prikkede kurver representerer anti-OA.

Som det fremgår av fig. 1 tilveiebringer kontrollgruppen maksi-

male primære IgE-svar på såvel haptenet som bæreren 14 dager etter sensibilisering og markant økte sekundære anti-DNP-og anti-OA-IgE-svar ble frembrakt 7 dager etter den andre injek-

sjonen av sensibliseringsdosen DNP-OA, som ble administrert 4

uker etter primær immunisering. På den andre siden resulterte behandling av mus med en eneste injeksjon av OA-PEGg på dag 0

i fullstendig undertrykkelse av de primære IgE-svarene på

både DNP og OA, og den sekundære immuniseringen av disse mus frembrakte kun lave IgE-svar tilsvarende ca. 10% av de som ble registrert for kontrolldyrene. Følgelig står det klart at behandling av mus med OA-PEGg førte til en forlenget undertrykkelse av OA-spesifikke T-hjelpeceller involvert i svaret på DNÅ-OA.

For å undersøke om den observerte hemmende effekten på OA-PEGg

var immunologisk spesifikk, ble mus injisert med 1 mg PEGg i.v.

4 timer innen de fikk den sensibiliserende dosen DNP-OA. Ved en annen gruppe mus ble PEGg erstattet med PEG2Q. Som vanlig fikk kontrollmusene kun sensibiliseringsdosen DNP-OA. Av de i tabell I opptatte resultatene er det åpenbart at hverken fritt PEGg eller PEG^ q påvirket dyrenes evne til å tilveiebringe rea-

gine antilegemesvar og man kan derfor dra slutningen at den hemming som fremkalles av OA-PEGg virkelig var spesifikk for det til PEGg koblede antigenet.

(B) Spesifisitet for immunosuppresjon med OA- PEGg

For å ta fram ytterligere bevis for spesifisiteten hos hemmin-

gen av IgE-antilegemer fikk mus på dag 0 en i.v. injeksjon av

0,8 mg OA-PEGg 4 timer før i.p. administrering av 1 ug DNP-OA eller 10 ug DNP-Asc i A1(0H)3. På dag 28 fikk disse dyr en andre i.p. injeksjon av sammen antigener i Al(0H)3. To kontroll-grupper mus som ikke fikk OA-PEGg ble innlemmet i dette eksperiment, dvs. en gruppe fikk to sensibiliseringsdoser DNP-OA på dag 0 og 2 8 og den andre gruppen to doser på 10 ug DNP-Asc i A1(0H)3 samme dager.

De i tabell II sammenfattede resultater gir ytterligere støt

for spesifisiteten for hemmingen av IgE-svarene på både DNP og OA ved i.v. administrering av OA-PEGg. Følgelig er det utvety-dig at mus behandlet med OA-PEGg (Test-A) ikke tilveiebrakte noe primært IgE-svar være seg på DNP eller OA, når de ble sensibilisert mot DNP-OA og sekundærsvaret på DNP-OA var markant lavere enn kontrolldyrenes. På den andre siden påvirket behandling av mus med OA-PEGg-konjugat ikke deres evne til å tilveiebringe et IgE-antilegemesvar på det ubeslektede antigenet DNP-Asc, dvs. det forelå ingen signifikant skillnad i IgE-anti-DNP-og -anti-Asc-antilegemetiterene for sera fra dyr i kontrollgruppen B og testgruppen B av mus.

(C) Evne hos OA- PEG- konjugat til å oppheve et pågående reagint antilegemesvar

Dette eksperiment ble utformet for å studere muligheten til å gjennom administrering av OA-PEG-konjugat oppheve et reagint antilegemesvar som ble faststilt minst 5 uker før forsøkene for å undertrykke det. Skjemaet for injeksjoner og PCA-titere for serumet angis i tabell III. Disse verdier viser at mens et langvarig og økt IgE-svar på DNP og OA kunne opprettholdes under 82 dager i kontrollgruppen av mus som har fått en andre og tredje sensibiliseringsdose av DNP dag 40 og 68, resulterte i administrering av tre i.v. injeksjoner pr. dag av 0,8 mg OA-PEGg dag 37, 38 og 39 i sensibiliserte mus i en meget markant minskning av disse dyrs evne til å tilveiebringe anti-DNP-

og anti-OA-IgE-svar etter sekundære og tertiære injeksjoner.

For å styrke at 0A-PEG20 skulle være i stand til å oppheve

et pågående reagint antilegemesvar på DNP-OA fikk mus; som dag 0 er sensibilisert mot DNP-OA, dag 2 2 en injeksjon på 1 mg

OA-PEG2Q og dag 28 en i.p. forsterkningsinjeksjon på sensibiliseringsdosen DNP-OA, Kontrollgruppen mus fikk bare de to sensibili-seringsinjeksjonene DNP-OA dag 0 og 28. Som det fremgår av tabell IV resulterte behandling av sensibliserte mus med OA-PEG20

i en meget utpreget hemming av de reagine antilegemesvarene på

både DNP og OA.

Det bør understrekes at anti-OA-IgE-titerene for musene innen 2 dager etter administrering av enten OA-PEGg eller OA-PEG2Q (dvs. dag 24) ikke ble påvirket i relasjon til nivået reagine antilegemer i kontrolldyrenes sera. Dette tyder på at modifisering av OA ved konjugering med PEG resulterte i maskering eller ra-dikal forandring av determinantene hos umodifisert OA, ettersom man ellers skulle forvente seg at de reagine antilegemer som forble i serumet hos dyr som er sensibilisert 24 dager tidligere ville ha blitt i. nøytralisert ved injeksjonen av den realtivt store dosen av OA-PEG-konjugat. Denne tolkning viste seg faktisk å være korrekt i de eksperiment som skal redegjøres for nedenfor.

(D) Opprettholdelse av ufølsomhet ved adoptiv overføring Alle donatorene av miltceller hadde blitt immunisert med en

sensibiliseringsdose DNP-OA 45 dager innen de ble avlivet. 9

dager innai deres milter ble tatt bort ble disse dyr oppdelt i 3 grupper, og hver gruppe fikk en i.v. dose av 0,2 mg OA-PEGg

1 0,5 ml PBS, eller 0,8 mg OA-PEGg i 0,5 ml PBS, eller kun 0,5 ml PBS. Deretter ble samtlige dyr avlivet og suspensjoner på 5 x 10 miltceller fra hver og en av de tre gruppene ble overført til syngenetiske, røntgenbestrålte (550 R) mottaker-

mus. Innen mindre enn 4 timer etter celleoverføringen fikk alle mottakere en i.p. sensibiliseringsdose DNP-OA og deres anti-DNP- og anti-OA-IgE-antilegemeititere ble fulgt under en 2 ukers-periode.

Som det fremgår av tabell V ble de reagine antilegemenivåene senket bare ubetydelig i løpet av 5 dager etter injeksjon av OA-PEGg i de intakte sensibiliserte mus som var bestemt for å ofres for celleoverføring. Etter adoptiv overføring svarte imidlertid miltcellene hos de prøvemus, som hadde blitt behandlet med

OA-PEGg, meget dårlig på en ytterligere sensibiliseringsdose DNP-OA som ble administrert til røntgenbestrålte mottakere, sammenlignet med miltcellene hos musene i kontrollgruppen. Følge-lig kan man trekke den slutning at behandling av sensibiliserte mus med OA-PEGc O resulterte i opphevelse av evnen hos disse dyrs miltceller til å tilveiebringe et reagint svar på fornyet eks-ponering av en ytterligere sensibiliseringsdose av antigenet etter adoptiv overføring.

(E) Hemming av hemagglutinerende antilegemer med OA- PEG- konjugat Foruten de hemmende effektene av OA-PEG-konjugat på dannelsen

av reagine antilegemer ble effekten av disse konjugat på dannelsen av hemagglutinerende antilegemer studert. For dette formål fikk musene en i.v. injeksjon av 0,2 mg eller 1,0 mg av enten OA-PEGg eller OA-PEG2Q 4 timer før administreringen av sensibiliseringsdosen DNP-OA, og samtlige mus fikk en andre injeksjon av sensibiliseringsdosen 28 dager senere. Som vises av de i tabell VI oppstilte resultatene hadde ingen av de to OA-PEG-tilberedningene noen signifikant effekt på hemaggluti-neringstitrene ved en dose av 0,2 mg. Administrering av OA-PEG-tilberedningene ved den høyere dosen 0,8 mg førte imidlertid til en liten, men signifikant redusering av hemagglutinerende antilegemer, og denne effekt var mer påtakelig på anti-DNP- enn på anti-OA-hemagglutinerende antilegemer. Av disse resultater kan man slutte seg til at OA-PEG-konjugat har en mer utpreget hemmende effekt på de celler som er involvert i dannelsen av IgE-antilegemer enn i fremstillingen av IgM-og/eller IgG-antilegemer.

II. Ragweed- allergensystem

(F) Opphevelse av reagint antilegemesvar på RAG

Det har vist seg at optimal produksjon av reagine antilegemer

mot RAG ble fremkalt i BgD^F-^-mus ved administrering av 10 ug RAG suspendert med 1 mg A1(0H)3 i 0,5 ml PBS. I de: nedenfor beskrevne eksperimentene bestod standardsensibiliseringsdosen

■ for indusering av reagine antilegemer mot ragweed-allergen av 10 ug RAG blandet med 1 mg Al(OH)3 i 0,5 ml PBS. Ved et for-søk på å oppheve et pågående reagint svar på RAG fikk sensibili-

serte mus 0,8 mg av enten RAG-PEGg eller RAG-PEG2Q på dag 15. Forsøksresultatene redegjøres for i fig. 2, hvor anti-RAG-PCA-titeren på den vertikale aksen er angitt mot tiden i uker på,,den horisontale aksen. Den heltrukne kurven representerer kontrollgruppen, den stiplede kurven RAG-PEG2Q-gruppen og den strek-prikkede kurven RAG-PEGg-gruppen. Som det fremgår av fig. 2 førte behandling med en av disse to RAG-PEG-konjugater til en redusering av anti-RAG-IgE-antilegemer, og IgE-antilegemenivåene fort-satte å synke tross administrering av den andre sensibiliseringsdosen RAG dag 21. Kontrolldyr tilveiebrakte derimot et typisk sekundærsvar.

Spesifisiteten for den hemmende effekten av RAG-PEG-konjugat på det anti-RAG-reagine svaret ble demonstrert ved det forsøk som redegjøres for i tabell VII. Mens således administrering av en andre sensibiliseringsdose RAG dag 34 etter den primære immuniseringen i mus, som har fått OA-PEG, eller RAG eller PBS ad i.v. vei dag 33, resulterte i et økt IgE-svar (dvs. anti-RAG-PCA-titeren var av størrelsesorden 500), så resulterte administrering av den andre sensibiliseringsdosen dag 34 i dyr som dagen forut har fått RAG-PEGg i en dramatisk senkning av den anti-RAG-reagine titeren (dvs. anti-RAG-PCA-titeren redusert til 60). Dessuten antyder det faktum at administrering av 500 ug av den ukonjugerte RAG-tilberedningen uten A1(0H)3 dag 33 ikke påvir-

ke t sekundærsvaret som ble påvist dag 41 (hvilket var resul-

tatet av den fornyede injiseringen av dyrene med den andre sensibiliseringsdosen RAG dag 34), at den ovenfor oberverte senk-

ning i anti-RAG-IgE- antilegemenivå. ikke var avhengig av nøytra-lisering av IgE-antilegemer med det injiserte konjugat, uten på en modulering av det immunologiske systemet hos dyrene som førte til en spesifikk hemming av anti-RAG-IgE-svaret. Det bør også noteres at i.v. administrering av 800 ug RAG dag 28

(dvs. samme dag som de immune dyrene også fikk en andre sensibiliseringsdose av antigenet) resulterte i reduksjon av den sekundære anti-RAG-PCA-titeren dag 35 til ca. 20, hvilket kan ha vært avhengig av nøytralisering av' sirkulerende IgE-antilegemer, men ikke bare disse dyr viste noe tegn på immunosuppre-

sjon ettersom ytterligere immunisering med en tredje sensibiliseringsdose RAG dag 56 resulterte i et normalt anamnio tisk IgE-svar.

(G) Mangel på evne hos OA- PEG- og RAG- PEG- konjugat til å fremkalle PCA- reaksjoner

Allergenisiteten for OA-PEG-konjugat ble testet på rotter med hjelp av PCA-analyse. For dette formål ble 0,1 ml av et stan-dardmusreaginserum med kjent PCA-titer (dvs. 1400), som er fremstilt ved i.p. immunisering med en sensibiliseringsdose DNP-OA, seriefortynnet to ganger og 50 ul-volumer av disse fortynnede oppløsninger ble injisert i.d. i den barberte huden hos ikke innavlede pigmenterte rotter. 24 timer etter sensibilisering

av huden ble 1,0 ml-oppløsninger inneholdende forskjellige mengder umodifisert OA eller OA-PEGg eller 0A-PEG2Q og 0,5% Evans' blå fargestoff injisert i-v. i forskjellige rotter. Rottene ble avlivet 30 min. senere og PCA-reaksjonene ble bestemt.

Som det fremgår av tabell VIII fremkalte 1 mg umodifisert OA

en kraftig PCA-reaksjon og tilsetning av ukonjugert PEG med en molekylvekt på enten 6000 eller 20000 til OA påvirket ikke PCA-reaksjonen avhengig av OA. Derimot kunne hverken OA-PEGb, eller 0A-PEG20,selv når de ble injisert i meget større mengder enn OA (dvs. 10 resp. 6 mg), fremkalle en signifikant reaksjon. Dessuten viser forsøk 8 og 9 at dyr; som ikke viste noen PCA-reaksjon når de ble provosert med enten OA-PEG, eller 0A-PEG~~/

D ZO

ga gode reaksjoner ved fornyet injeksjon med 1 mg umodifisert OA 20 min. etter den primære provokasjonen med disse konjugat. Disse resultat viser at OA-PEG-konjugat ikke hadde evnen til å forenes med og nøytralisere anti-OA-IgE-antilegemer in vivo.

I lys av denne tolking kan den minimale PCA-reaksjon, (titer

av størrelsesorden 60) som ble obersvert i forsøk 5 med en dose av 10 mg OA-PEGg,anses avhengig av nærværelsen i den tilbered-ning av OA-PEGg som anvendes for provokasjonen av meget små mengder umodifsert OA eller av noen OA-PEG-konjugat som inneholder meget få PEG-molekyler pr. molekyl OA,og som sådann fortsatt hadde noen tilgjengelige antigene determinanter. På basis av alle disse resultater kan man slutte seg til at mangel på evne hos PEG-konjugatene av OA til enten å utløse en PCA-reaksjon eller nøytralisere de anti-OA-reagine antilegemer som var fiksert ved de sensibiliserte hudstedene ,var avhengig av at de opprinnelige antigene determinantene hos OA i OA-PEG-konjugatene enten var utilgjengelig eller radikalt forandret.

Evnen hos RAG-PEG2Q til å fremkalle PCA-reaksjoner er undersøkt såsom beskrevet ovenfor med anvendelse av et mus-anti-RAG-rea-ginserum for sensibilisering av huden hos rotter. For å pro-vosere de sensibiliserte hudstedene ble en oppløsning av enten RAG eller RAG-PEG20 (i nærvær av Evans' blå fargestoff/injisert i.v. i rottene. Resultatene av disse PCA-tester er sammenfattet i tabell IX, av hvilken man kan trekke slutningen at mens umodifiserte RAG-allergener fremkalte en kraftig PCA-reaksjon, kunne ikke RAG-PEG2Q fremkalle noen PCA-reaksjon. Dessuten viser resultatene fra det siste forsøk som redegjøres for i denne tabell at administrering av RAG-PEG20 ikke innvirket på fremkal-lingen av PCA-reaksjoner ved fornyet injisering av dyrene med umodifisert RAG 20 min. senere. Følgelig kan man trekke slutningen at RAG-PEG2Q-konjugatet ikke hadde lett tilgjengelige antigene determinanter som ble delt av de umodifiserte RAG-allergenene. Dette produkt var derfor uten evne til å utløse mast celler overtrukket med anti-RAG-I<g>E-antilegemer.

(H) Mangel på evne hos OA- PEG- konjugat til å indusere anafylaksi hos rotter sensibilisert med OA

De nedenfor beskrevne forsøkene ble utformet for å gi ytterligere bevis på mangelen på evnen hos OA-PEG-konjugat til å forenes in vivo med anti-OA-IgE-antilegemer. Ettersom mus er motstandskraftige mot histamin fremkaller injisering av det sensibiliserende antigenet i mus, som har IgE-antilegemer mot tilsvarende antigen,ikke lett anafylaksi, Derfor ble rotter som er tilbøyelig til anafylaksi valgt for å undersøke hvorvidt OA-PEG-konjugat hadde evne eller ikke til å forenes in vivo med anti-OA-IgE-antilegemer fiksert til mastceller oa således utløse en anafylaktisk reaksjon. For dette formål ble Chester Beatty-rotter sensibilisert systemiskt ved immunisering med DNP-OA såsom beskrevet ovenfor. For systemreaksjoner ble 2 mg umodifisert OA eller OA-PEG, eller 0A-PEG~^ administrert i 1 ml

6 20

PBS i.v. i hvert sensibilisert dyr 6 timer etter blødning og dyrene ble observert nøye med hensyn til hver virkning av disse forbindelser. Alle sensibiliserte rotter som hadde fått.en. i.v. injeksjon OA døde innen 15 - 30 min. av anafylaktisk sjokk.

Derimot kunne verken OA-PEG, eller OA-PEG„_ indusere noe som

6 20

helst synlig besvær ved administrering til de sensibiliserte dyrene. Disse resultater som står i overensstemmsle med de som redegjøres for ovenfor i avdeling (G), viser videre utve-tydig at de PEG-modifiserte antigenene ikke kunne samarbeide in vivo med IgE-antilegemer hos aktivt sensibiliserte dyr og derfor var uten evne til å utløse en anafylaktisk reaksjon.

Eksempel 3

Konjugat av hundealbumin (DA) med monometoksypolyetylenglykoler

(m.PEG-OH) med forskjellige molekylvekter ble fremstilt med anvendelse av blandet-anhydrid-metoden. Denne metode omfattet 3 trinn.

a) Fremstilling av

Til en oppløsning av m.PEG-OH (0,8 mmol) i 20 ml tørr pyridin ble

tilsatt 800 mg (8 mmol) ravsyreanhydrid og den kombinerte opp-løsningen ble omrørt over natten ved romtemperatur. Oppløs-ningsmidlet ble eliminert ved fordampning i vakuum. Resten ble oppløst i 15 ml benzen og produktene ble utfelt ved tilsetning av 20 ml avkjølt heksan. Utfellingen ble deretter oppsamlet ved filtrering og oppløst i destillert vann. Vann-(r)

oppløsningen ble dialysert mot destillert vann i Quantipore^-gamma-dialyseposer (grensemolekylvekt: 4.000, fremstilt av Quantimetrix Co., Culber City, California, USA), hvoretter

produktene til slutt ble lyofilisert.

b) Fremstilling av

(0,4 mmol) ble oppløst i 10 ml kloroform.

Temperaturen ble holdt ved 0°C med isbad og tørr nitrogen ble boblet gjennom oppløsningen. Trietylamin (0,4 mmol) ble satt til oppløsningen og deretter ble isobutylklorformiat (0,4 mmol) dråpevis tilsatt. Reaksjonsoppløsningene ble holdt ved 0°C i 30 min. og deretter inndampet under vakuum ved romtemperatur. Resten ble vasket flere ganger med petroleumeter og man fikk et hvitt krystallinsk produkt.

c) Konjugering av

til hundealbumin

Hundealtumin (200 mg) ble oppløst i 30 ml boratbuffer (pH 9,6). Temperaturen ble holdt ved 0°C med isbad.

(angående mengde se tabell X)

ble tilsatt porsjonsvis i fast form. Reaksjonsoppløsningen ble omrørt 3 timer ved 0°C og ble deretter oppbevart i kjøleskap 16 timer. Reaksjonsoppløsningen fikk deretter passere gjennom

(R)

en Sepharose-^ 6B-kolonne. De fraksjoner som inneholdt protein og ikke noe fritt m.PEG-derivat ble oppsamlet og lyofilisert. Fritt m.PEG ble påvist med tynnsjiktskromatografi.

Konjugeringsgraden ble bestemt ved kvantifisering av mengden m.PEG-substituenter i det modifiserte hundealbuminet med NMR-teknikk. Antallet frie aminogrupper ble bestemt med O-ftalalde-hyd-metoden (A.R. Torres et al., Biochim. Biophys. Acta Vol.

434 (1976) s. 209). I tabell X angis konjugeringsgraden som antallet PEG-molekyler pr. molekyl DA.

De således fremstilte konjugatene ble testet med hensyn til allergenisitet, tolerogenisitet og antigenisitet og resultatene er sammenfattet i tabell XI nedenfor.

Tolerogenisiteten ble bestemt i overensstemmelse med de ovenfor beskrevne metodene og tolerogenisitetsgraden representerer den gjennomsnittlige reduseringen i IgE-titere etter tredje sensibiliseringen med hensyn til titerene for kontrolldyr som bare har fått de tre sensibiliseringsdosene DA. En redusering med en faktor 6 - 100 medførte god tolerogenisitet.

Allergenisiteten ble bestemt med to metoder, en RAST-basert metode og en PCA-nøytraliseringstest.

Ved den RAST-baserte metoden [Ref. Yman et al., Int. WHO-IABS Symp. on standardization and control of allergens administered to man, Geneve, 1974; Develop. biol. standard. Vol. 29, s. 151-165 (Karger, Basel, 1975)] reagerer de modifserte allergenene med et serum inneholdende allergen-spesifikt IgE. Overskuddet IgE reagerer med umodifserte allergener som er kovalent koblet til en papirskive. Radioaktivt merkede antilegemer mot IgE tilsettes, hvorved det dannes et kompleks. Radio-aktiviteten for dette kompleks måles i en gamma-regner. Puls-tallet er direkte proporsjonalt mot overskuddet IgE i serumet etter reaksjon med ekstrakt (se referansen ovenfor). Aller-genstyrken for modifsert allergen uttrykkes som den prosentu-elle andelen av den for det opprinnelige hundealbjminet

(= 100%).

Antigenisiteten for de modifiserte allergenene bestemmes med omvendt enkel radialimmunodiffusjon. Antisera med høy titer mot de umodifiserte allergenene ble produsert i kaniner.

Spesifikk' presipitatdannelse ble sammenlignet ved forskjellig konsentrasjoner av allergener innlemmet i agarose i petri-

skåler. Den relative aktiviteten ble beregnet fra den laveste konsentrasjon av modifiserte allergener som ga et tydelig pre-sipitat og med anvendelse av minimalt presipitatdannende konsentrasjoner av umodifserte allergener som standard. Antigenisiteten for hundealbumin ble valgt som 100% aktivitet.

Claims

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av allergenholdige forbindelser for anvendelse som immunologisk spesifikke hem-ningsmidler for dannelse av reagine antilegemer av IgE klas-

sen rettet mot det aktuelle allergen, karakterisert ved at ikke-immunogene, vannoppløselige polymerer som er polyetylenglykol, - polyvinylalkoholer, polyvinylpyrrolidoner, polyakrylamidér og homopolymerer av aminosyrer bindes kovalent til allergenmolekylene i en slik utstrekning at de erholdte, vannoppløselige konjugater (ved administrering uten adjuvantia) in vivo blir såvel tolerogene som hovedsakelig ikke-allergene og ikke-immunogene.

2. Fremgangsmåte ifølge krav,. 1', karakterisert véd at det som polymer anvendes en polyetylenglykol med en molekylvekt på 2.000 - 35.000.