NO145563B - Fremgangsmaate for fremstilling av et renset konsentrat av faktor-viii. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte

for fremstilling i stor skala av et renset' konsentrat av fak-

tor VIII. Blant de karakteristiske trekk ved oppfinnelsen kan man nevne en selektiv utfelling av overskuddskvantiteter av fibrinogen og denaturerings- og nedbrytningsprodukter, eliminering av andre uønskede proteiner, såsom isohemaglutini-

ner, og konsentrasjon i et trinn av faktor VIII ved utfelling i kulde under anvendelse av polyol, uten uønsket tap av AHF-aktiviteten (antihemofilifaktoren). Et annet karakteristisk trekk er det forbausende høye utbytte av faktor VIII, mellom 20 og 40% av den teoretiske mengde plasma som blir anvendt.

Videre og til tross for det høye utbytte av AHF, viser pro-teininnholdet seg å være redusert på en vesentlig måte og særlig innholdet av fibrinogen, sammenlignet med andre produkter. Dette er illustrert i tabell I nedenunder. Behovet for et

høyt utbytte av konsentrert lyofilisert AHF med stor renhet er alminnelig anerkjent og har møtt stor internasjonal opp-merksomhet. Man kan referere til "Recent Advance in Hemophilia", Ann.N.Y. Acad.Sci. 240, 1975 (referanse 11); Pool,

J.G. "Recent Chapters in the Factor VIII saga: Perils of

a protein". West J. of Med. 122:406, 1975 (referanse 12) og man vedgår generelt at kommersielle konsentrasjoner gis stort sett som mindre enn 20% av AHF teoretisk tilstede i plasmaet og at utbyttet i de høyest rensede produkter er enda lavere (referanse 11, side 156, 208; referanse 5 og 8).

I den nedenstående tabell I er verdiene, bortsett

fra de som vedrører resultatet ifølge foreliggende oppfinnel-

se, tatt fra en artikkel av Robert Breckenridge "Recent Ad-vances in Hemophilia", Ann.N.Y. Acad. of Science, 1975.

Man har beskrevet flere fremgangsmåter for å fremstille antihemofilifaktoren (AHF eller faktor VIII) for terapeutisk anvendelse, f.eks. selektiv utfelling, fraksjonert absorbsjon og eluering, ekstraksjon i svakt ionisk miljø og kromatografi. De kjemiske produkter som mest anvendes for utfelling omfatter alkohol, garvesyre, ammoniumsulfat, gly-

cin og polyetylenglykol. Skjønt rensingen av faktor VIII medfører elimineringen av et visst antall andre plasmapro-teiner, er fibrinogen blant disse proteiner den mest frem-tredende og den mest generende, særlig siden den denatureres ved fremgangsmåtene, såsom utfelling med alkohol, frysing og smelting. Dette denaturerte fibrinogen skader filtreringen av AHF, fører til tap av AHF under rensingstrinnet og reduserer oppløseligheten av det lyofiliserte produkt i rekon-stitueringsvæsken. Derfor krever alle rensingsmetoder for AHF fjerning av vesentlige mengder fibrinogen. Teknikkene

som omfatter selektiv utfelling er innrettet på dette, men alle har den ulempe å måtte denaturere både fibrinogen og AHF eller å tåle ikke uvesentlige tap av AHF.

De fremgangsmåter som anvender simpel utfelling

under avkjøling uten kjemiske produkter (kryoutfelling) er begrenset til fremstilling av små mengder faktor VIII vanligvis i blodbanker, og leder til høye nivåer av fibrinogen i blodet, noe som anses uønsket av enkelte eksperter for terapeutisk anvendelse.

Fremgangsmåtene som anvender ekstraksjon av faktor VIII med utgangspunkt i kryoutfelling i buffere med svak ionestyrke, noe som til en viss grad reduserer innholdet av fibrinogen i sluttproduktet, gir allikevel et uønsket høyt proteinnivå og krever spesialutstyr og fremgangsmåte for sentrifugering og er begrenset med hensyn til den totale mengde AHF som kan ekstraheres av kryoutfellingen, uten at rensingen skades.

Andre vanlige problemer som er knyttet til stor-skalafremstilling av AHF er spesielt forurensing av sluttproduktet med forskjellige pyrogene stoffer, isohemaglutininer og virus som fremkaller hepatitt (assosiert antigen av hepatitt (HAA)). Enkelte kjemiske utfellingsstoffer favori-serer nærværet av uønskede forurensende stoffer. Polyetylenglykol er nå i utstrakt bruk ved fremstilling av faktor VIII med stor renhet, men disse fremgangsmåter anvender så høye konsentrasjoner av polymeren at sluttrinn som består av vasking og ny utfelling er nødvendig for å eliminere overskudd av etylenglykol fra sluttproduktet. Disse fremgangsmåter fører altså til nye uønskede tap av AHF. I denne for-bindelse skal det henvises til Wickerhauser, M. "Large-scale fractionation of Factor VIII - Concentrate from cryo-ethanol precipitate (referanse 1); Shanbrom, E. & Fekete, L. "Production of stable high-potency human AHF using polyethylene glycol and glycine to fractionate a cryoprecipitate of AHF concentrate", U.S. patent nr. 3.631.018 (referanse 2); Sgou-ris, J.T. og Wickerhauser, M "Use of frozen cryoprecipitate for the preparation of clinical Factor VIII concentrate: Transfusion", 13:399, 1973 (referanse 3); Newman, Johnson, A.J., Karpatkin, M.H. og Puszkin, S "Methods for the production of clinically effective intermediate and high-purity Factor VIII concentrates", Brit.J.Haemat, 1971, 211 (referanse 4); Fekete, L.F. og Holst, S.L. "Stabilization of AHF using Heparin", U.S. patent nr. 3.803.115 (referanse 5).

Fremgangsmåten som er beskrevet her eliminerer stort sett alle de forannevnte problemer og har ingen av de ulemper som er knyttet til de kjemiske utfellingsteknikker som er beskrevet foran, og grunner seg på en enkel selektiv utfelling under avkjøling av fibrinogen og dets denaturerings- og nedbrytningsprodukter og for selektiv konsentrasjon av faktor VIII med små mengder polyol, f.eks. polyetylenglykol eller polyol ("Pluronic"). Elimineringen av fibrinogen vedrører som forklart i det etterfølgende likeledes eliminering av denaturerings- og nedbrytningsproduktene av dette.

Selektiv eliminering av fibrinogen uten tilhøren-de tap i faktor VIII har tidligere ikke vært gjennomført som... praktisk metode for å fremstille et rent konsentrat av AHF i stor skala. Wickerhauser understreker viktigheten av å be-grense varigheten og temperaturen ved ekstraksjon av AHF:"Noe' høyere utbytte av AHF tilveiebringes ved langvarig ekstraksjon med Tris-buffer (på basis av tris (hy drok synre tyl) amino--metan) ved 30°C og 60 minutter, men ekstraktet er langt me: forurenset av fibrinogenaggregater, noe som gjør sluttkon-sentratet vanskelig å filtrere."

En fremgangsmåte som anvender selektiv utfelling av fibrinogen ved lav temperatur for fremstilling av konsentrat av faktor VIII med stort utbytte og med stor renhet i stor skala er formålet med US-PS 4.188.318 med tittelen: "A simple method for the production of high-yield, high-purity Factor VIII", (referanse 7). Det angis at preparate . kan raffineres og konsentreres ytterligere under anvendelse av en utfelling med polyetylenglykol (PEG) under avkjøling.

Inntil nylig var det ved alle fremgangsmåter 'som anvendte PEG for fremstilling av konsentrater av AHF nødven-dig med et tilleggstrinn som bestod av vasking og/eller gjen-utfelling med glycin eller alkohol siden polymeren ble anvendt i høye konsentrasjoner (10 - 12%). (Se de forannevnte referanser). Man har nylig anvendt ideen ved utfelling i kulde med PEG, se Vermeer, C, Soute, B.A.M. og Brummelhuis, H.G.J., "Improvement of the preparation of Factor VIII Concentrates", Proe. of Int. Soc. Haemostasis and Trombosis, Paris, juli 1975, (referanse 8). For å utfelle fibrinogen er konsentrasjonen av PEG som anvendes i dette tilfelle bare 2,5%, noe som fører til at man får et mindre rent produkt. Videre har ikke disse forfattere betraktet konsentrasjonen av proteiner som viktig, de har anvendt mandelat (salt av mandelsyre) for å frembringe en irreversibel utfelling av fibrinogen og har følgelig fått et produkt som er betrakte-lig mindre rent og gir et mindre utbytte. På tilsvarende måte anvender fremgangsmåten til Shanbrom og Fekete (sitert ovenfor) en konsentrasjon av proteinet som er relativt liten under utfellingstrinnet med PEG, dvs. 1 volumdel utfelling pr. 10 volumdeler buffer og dette fører til meget lite utbytte med begrenset renhet. Disse forfattere og likeledes Johnson et al (referanse 4) og Johnson et al "Antihemophilic factor prepared from blood plasma using polyethylene glyeol", US-PS nr. 3.652.530, (referanse 6) har anvendt 10 - 12% PEG for den endelige konsentrasjon av AHF, noe som gjør det nød-vendig med et ytterligere oppløsnings- og utfellingstrinn med glycin eller etanol under avkjøling for å redusere inn-, holdet av PEG i sluttproduktet.

Et annet bevis på at konsentrasjonen av proteiner og utfelling med PEG under avkjøling er viktige og fører til et originalprodukt, ligger i det forhold at "ufullsten-dige" isohemaglutininer (antilegemer) stort sett er eliminert, noe som redusérer risikoen for hemolytiske reaksjoner som kunne opptre siden det er nødvendig med massive injek-sjoner av de aktuelle konsentrater som er tilgjengelige i handelen. (Se: Seeler, R.A., Telischi, M, Langehennig£ P.L, Ashenhurst, J.B.: "Anti-A and Anti-B titers in coagulation concentrates", Abst. of Int. Soc. of Blood Transf., Helsinki, 1975'(referanse 9).

Et annet karakteristisk trekk ved produktet fremstilt ifølge oppfinnelsen er den høye renhetsgrad (dvs. det lave proteininnhold), særlig når det dreier seg om målbare mengder fibrinogen. Den høye renhetsgrad gir et meget opp-løselig produkt, så oppløselig faktisk at ikke noe uoppløst materiale finnes i beholderen etter rekonstitueringen. Dette eliminerer behovet for anvendelse av et spesialfilter eller et nålefilter for å fjerne ikke oppløst protein før injek-sjonen i pasienten. Man unngår derfor forurensing av konsen-tratet av faktor VIII med metallpartikler (Couper, I.A., McAdam, J.H., MacKenzie, M.S. og Davidson, J.F.: "Contamina-tion of Factor VIII oncentrates with metal particles", Lancet, desember 21, 1974, side 1515 (referanse 10).

Den beskrevne fremgangsmåte er likeledes anvende-lig for "rebehandling" av pyrogene mengder av konsentrater med faktor VIII fremstilt med andre fremgangsmåter hvorved kostbar, men pyrogen faktor VIII,som ikke er anvendbar, om-dannes til et terapeutisk anvendbart middel av stor verdi. Det rebehandlede produkt reduseres med hensyn på pyrogent materiale enten i et enkelt trinn ved utfelling under avkjøl-ing med PEG på 6%, eller i to trinn ved den fremgangsmåte som

er beskrevet nærmere i detalj nedenfor.

De meget forbedrede tilveiebragte resultater som er beskrevet står i motsetning til tidligere oppnådde resultater og forslag i tidligere kjente teknikker.

Foreliggende oppfinnelse har til hensikt å oppveie manglene ved den kjente teknikk og således å tilveiebringe

en fremgangsmåte for fremstilling av et renset konsentrat av faktor VIII fra en uren oppløsning av faktor VIII ved utfelling ved hjelp av en polyol og denne fremgangsmåte karakteri-seres ifølge oppfinnelsen ved at man tilsetter polyol til den urene oppløsning av faktor VIII til en konsentrasjon på ca. 6%, og at man holder temperaturen på 0 - 5°C inntil det inntrer utfelling av faktor VIII som opparbeides til et konsentrat av faktor VIII som lyofiliseres.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen gjennomføres fortrinnsvis ved at utfellingen av faktor VIII gjenoppløses i en buffer, den resulterende oppløsning holdes ved en temperatur på 0,5 - 5°C i et tidsrom på 12 - 24 timer og de uopp-løselige produkter som utskilles i dette tidsrom fjernes.

I de foretrukne utførelser har fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen følgende karakteristiske trekk: kilden for faktor VIII er en kryoutfelling oppløst i 2 - 4 ganger sitt volum av buffer;

volumforholdet mellom kryoutfelling og buffer er 1-3;

fremgangsmåten består av etterfølgende trinn hvor man oppløser den utfelte faktor VIII i en buffer og holder den resulterende oppløsning på en temperatur mellom 0,5 og

5°C i en periode på mellom 12 og 24 timer hvoretter den partikkelformede masse som dannes skilles fra den nevnte oppløs-ning for å tilveiebringe en faktor VIII som stort sett er fri for fibrinogen, fragmenter av fibrinogen og deres komplekser;

bufferne er citratbuffere;

polyolene som anvendes omfatter polyetylenglykoler og særlig polyetylenglykol 4000, og blokk-kopolymerer av typen a-hydroksy-ft-hydroksy-poly(oksyetylen)-poly(oksypropy-len)-poly(oksyetylen). Blant disse blokk-kopolymerer kan man

særlig nevne de kommersielt tilgjengelige "Pluronic"-produkter, og spesielt "Piiroriic F68" som er en kopolymer som har følgende særpreg: Molekylvekt av poly(oksypropylen)-gruppen: 1750; vekt-% poly(oksyetylen): 80%.

Utfellingen av faktor VIII i nærvær av 6% polyol utføres fortrinnsvis ved pH 6,8 - 7,2.

Den foregående utfelling av fibrinogen i nærvær

av 4% polyol utføres fortrinnsvis ved pH 6,0 - 6,5 og ved en temperatur på mellom 20 og 30°C.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen tillater spesielt at man eliminerer pyrogene substanser fra en oppløsning av faktor VIII; denne fremgangsmåte er karakterisert ved det forhold at man tilsetter ca. 6% polyol til den nevnte oppløsning og holder oppløsningen på en temperatur mellom 0 og 5°C, for å utfelle faktor VIII og få igjen en oppløsning av pyrogent materiale. Denne fremgangsmåten kan utføres på følgende foretrukne måte: Tilsetning av polyol til bufferoppløsninger av faktor VIII foregår ved at man tilsetter ca. 4% polyol, man skiller utfellingen fra oppløsningen, man tilsetter 2% polyol og holder oppløsningen på en temperatur på mellom 0 og 5°C, inntil man får en utfelling av faktor VIII.

Oppløsningen som skal renses inneholder fortrinnsvis 1-3% protein, og nærmere bestemt 2-3%.

Fremgangsmåten omfatter etterfølgende trinn hvor faktor VIII-utfellingen oppløses i en sitratbuffer, den resulterende oppløsning holdes på en temperatur på mellom 0,5 og 5°C i en driftsperiode på mellom 12 og 24 timer, hvoretter det partikkelformede stoff som har dannet seg i oppløsningen, skilles fra denne for å tilveiebringe en faktor VIII som praktisk talt er uten fibrinogen, fragmenter av fibrinogen og komplekser av dette.

Oppfinnelsen har spesielt til formål en fremgangsmåte for å konsentrere faktor VIII, som består i at man holder en oppløsning av ca. 1 del av en blodfraksjon som inneholder faktor VIII tilveiebragt ved kryolittfelling av plasma, i ca. 3 deler sitratbuffer som inneholder ca. 6% polyol ved en temperatur på mellom 0 og 5°C for å få en utfelling av den nevnte faktor VIII i oppløsningen, hvoretter den nevn-

te faktor VIII oppløses i bufferen for å tilveiebringe en oppløsning av faktor VIII med stor renhet.

De følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.

Eksempel 1

Man smelter frosset plasma f.eks. 100 - 3000 liter

ved en temperatur på mellom -5 - +2°C og plasserer plasmaet i et passende kar. Man kan'behandle større volumer, men operasjonen vil da bli vanskeligere. Den fraksjon som er uoppløselig ved denne temperaturen (kryoutfellingen) samles opp, fortrinnsvis i en sentrifuge (en Sharpless sentrifuge eller tilsvarende apparat) ved en temperatur på under 3°C.

Andre oppsamlingsmetoder kan anvendes, men disse er mindre effektive. Kryoutfellingen veies, deles opp i små stykker,

eller blandes i en blander av Waring-typen i noen sekunder for å fremstille en pasta eller emulsjon. Disse delene av kryoutfellingen eller denne pastaen oppløses deretter i 2 - 4 volumer buffer som består av 0,02M trinatriumcitrat og 0,1M glycin hvor pH justeres til 6,9 ved tilsetning av sitronsyre ved en temperatur mellom 20 og 3 0°C. Etter at opp-løsningen er fullstendig utfelles fibrinogenet selektivt ved tilsetning av 4% "Polyetylenglykol 4000" eller "Pluronic F-68"

ved pH 6,0 - 6,5 og ved en temperatur på 25°C Utfellingen fjernes ved sentrifugering som f.eks. i et apparat av Sharpless-typen og den ovenstående væske justeres til pH 6,8 - 7,2.

En ytterligere mengde på 2% PEG eller "Pluronic F-68" tilset-

tes og suspensjonen avkjøles igjen til 0 - 5°C til man nettopp får en synlig utfelling.

Man anvender et reaksjonskar med dobbelt vegg for

alle disse trinn for oppløsning og utfelling, med kontinuer-

lig omrøring og man forsøker å unngå skumdannelse.

Det annet utfellingstrinn følges av sentrifugering

med kontinuerlig sirkulasjon ved 1 - 2°C og man fjerner den ovenstående væske. Man oppløser deretter utfellingen i en glycin-citratbuffer eller i en citratbuffer, hvor volumet av-henger av kvaliteten på kryoutfellingen og antall enheter. AHF

som er tilstede i den opprinnelige oppløsning: De to føl-gende fremgangsmåter er tilgjengelige for å beregne dette volumet: 1. Oppløse den endelige utfelling i et buffervo-lum som tilsvarer 1/100 av det opprinnelige plasmavolum. 2. Oppløse den endelige utfelling i et volum av buffer som tilsvarer 15 - 25 ganger vekten av utfellingen.

Oppløsningen justeres deretter til en pH på 6,7 - 6,9 ved hjelp av sitronsyre, klargjøres og steriliseres deretter ved å la væsken passere gjennom filtere av mikroporøs membran (høyden på filteret 293 mm tilsvarende en kolonne) hvor porene har en diameter på f.eks. 1,2 - 0,65-0,45 eller 0,3 ym. Den sterile oppløsning som inneholder 20 - 40% faktor VIII i plasmaet lyofiliseres på vanlig måte for lagring.

Man kan anvende varianter av denne fxemstillings-teknikk særlig ved å bruke frosset kryoutfelling eller varianter av fraksjon I etter Cohn, under denne behandling er utbyttet av faktor VIII mindre og avhengig av konsentrasjonen av utgangsmaterialet. Den første oppløsning eller ekstraksjon av AHF kan utføres i destillert vann eller i buffere med svak ionestyrke, såsom Tris-buffer. Avkjølingstiden kan likeledes variere, økes eLler gjennomføres i sekvenser. Likeledes kan ekstraksjonstidene økes opptil 24 timer i de beskrevne prosesser. Likeledes kan prosessene avbrytes på et-hvert trinn og gjenopptas en annen dag. Alle disse varianter kan føre til en viss reduksjon i det totale utbytte av AKF

i utgangsplasmaet.

Eksempel II

Pyrogene mengder av konsentrat av faktor VIII med middels renhet som er fremstilt ved andre fremgangsmåter som ekstraksjon med buffere med svak ionestyrke, utfelling med glycin, utfelling med PEG, kan forbedres etter det skjema som er angitt i eksempel I. De lyofiliserte innhold i flaskene rekonstituteres i et vannvolum fritt for pyrogen til-strekkelig til å gi et innhold av proteiner på 1 - 3%, hvoretter innholdet i flaskene slås sammen i et kar og igjen underkastes en behandling ifølge trinnene som er angitt i eksempel I.

Dersom pyrogennivåene er relativt moderate og dersom produktet allerede har en høy renhetsgrad, kan man som en variant gjennomføre bare ett utfellingstrinn. Flaskene rekonstitueres som beskrevet ovenfor, og man tilsetter 6% PEG ved en pH på 6,8 - 7,2 ved en temperatur på mellom 0 og 5°C. Utfellingen som dannes, behandles deretter som foran, og det er den ovenstående væske som inneholder det pyrogene materialet som er oppløst og som elimineres.

Eksempel III

Man gjennomfører fremgangsmåten som er'beskrevet

i eksempel I.

Men etter at man har gjennomført sluttrinnet med filtrering, plasseres produktet i et kjøleskap (temperatur 0,5 - 5°C) og man lar produktet stå her i 12 - 24 timer.

Det hvite, utfnokkede materiale som danner seg i denne peri-oden elimineres ved dekantering,sentrifugering eller prefil-trering. Sluttproduktet steriliseres ved filtrering eller som tidligere beskrevet og underkastes de samme lyofiliser-ingstrinn. Dette produktet er ennå renere enn de forannevnte produkter og derfor ennå lettere å filtrere. Det oppstår ingen tap av faktor VIII på grunn av dette ekstra trinn.

De resulterende produkter kan lagres ved +5°C i en periode så lang som ett år, og rekonstitueres i destillert vann eller fysiologisk serum. På grunn av sin store renhet og sitt meget lave innhold på fibrinogen, lar det lyofiliserte produkt seg oppløse meget raskt (1-2 minutter). To-taltiden for behandlingen er meget kort, sammenlignet med andre fremgangsmåter for fremstilling fra det øyeblikk hvor plasmaposen åpnes, slik at bakterieutviklingen er begrenset. Det forhold at den opprinnelige oppløsning skjer i små mengder buffer, reduserer mengden av gamma-globuliner som kunne gå inn i oppløsningen, og den optimale utfelling av fibrinogen i overskudd oppstår under anvendelse av en polyolkonsen-trasjon på 4%. Videre vil den tunge, flokkulerende utfelling av fibrinogen antagelig fange pyrogent materiale som er tilstede og redusere hepatitt-antigen (HAA eller hepatittvirus). Ved bare å anvende 6% polyol til utfellingen under avkjøl-ing, vil uønskede proteiner og særlig isohemaglutininer som kan oppløses også i mindre volumer buffer, ikke utfelles med AHF og elimineres derfor med den ovenstående væske. Man opp-når derfor et produkt som er renset 200 - 400 ganger i forhold til plasmaet, og produktet inneholder meget små mengder fibrinogen og isohemaglutininer. Konsentrater av faktor VIII som fremstilles med meget store volumer ekstraksjonsbuffer, f.eks. 10 volumdeler (referanse 2), gir ikke den samme renhet eller samme utbytte av AHF (referanse 1, 2, 3, 4, 8) sannsynligvis på grunn av det forhold at optimale forhold mellom protein og polymer for samfelling ikke er tilveiebragt. Hvis man ønsker dette, kan et slikt produkt renses og konsentreres ved kjente fremgangsmåter eller de nye fremgangsmåtene. En stor fordel i den foreliggende oppfinnelse ligger i det forhold at man kan foreta produksjon i stor skala av meget rent AHF på halvparten av den tiden som tren-ges ved andre fremgangsmåter.

De eksempler som er gitt i det foranstående er de optimale fremgangsmåtet man kjenner for å utføre oppfinnelsen. Selv om det vanligvis ikke er økonomisk å begynne med mindre enn ca. 100 liter plasma, eller en kryoutfelling fra en slik plasmamengde, er det åpenbart mulig å anvende større eller mindre mengder enn angitt i eksemplene og variasjoner på 50% eller tilsvarende i disse verdier vil ikke skade oppfinnelsen. Fremgangsmåtene i det optimale eksempel utføres under anvendelse av kjent utstyr som er lett å bruke, såsom Sharpless sentrifuge, Waring-blander etc, men det anvendte utstyr er ikke nødvendig og et stort antall varianter er til disposisjon for de som kjenner foreliggende teknikker.

Når man har tilveiebragt en væske som inneholder faktor VIII i stor utbytte, behandles denne på kjent måte for lagring og rekonstituering, f.eks. ved klargjøring og sterili-sering gjennom et standard mikroporøst filter, den lyofiliseres for å konsentrere faktor VIII til et lite volum som er lett å lagre og den rekonstrueres under anvendelse av vanlig væske, f.eks. pyrogenfritt, destillert vann eller et fysiologisk serum.

Det fremstilte produkt har orginale egenskaper som er til nytte for pasienten og som skiller produktet fra andre konsentrater av faktor VIII som faktisk fremstilles.

Disse egenskaper er:

1) Meget stor renhet og derfor en meget stor "spesi-fikk aktivitet". 2) Meget stor oppløselighet,' noe som gjør det mulig med en rask oppløsning før behandlingen og som gjør materialet ideelt for krisebehandling. 3) Meget lite proteininnhold, noe som reduserer uøns-kede sekundære reaksjoner. 4) Meget lite innhold av immunoglobuliner, noe som reduserer allergireaksjoner. 5) Neglisjerbart innhold av isohemaglutininer, noe som eliminerer hemolytiske reaksjoner. 6) Meget lite innhold av fibrinogen, noe som reduserer hyperfibrinogene komplikasjoner. 7) Filtreringsnål er ikke nødvendig siden fremmedpar-tikler er eliminert. 8) Elimineringen av pyrogener under prosessene kon-serverer den anvendelige faktor VIII.

Claims (2)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av et renset konsentrat av faktor VIII fra en uren oppløsning av-faktor VIII ved utfelling ved hjelp av en polyol, karakterisert ved at man tilsetter polyol til den urene opp-løsning av faktor VIII inntil en konsentrasjon på ca. 6%, og at man holder temperaturen på 0 - 5°C inntil det inntrer utfelling av faktor VIII som opparbeides til et konsentrat av faktor VIII som lyofiliseres.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at utfellingen av faktor VIII gjenoppløses i en buffer, den resulterende oppløsning holdes ved en temperatur på 0,5 - 5°C i et tidsrom på 12 - 24 timer og de uopp-løselige produkter som utskilles i dette tidsrom, fjernes.