NO143484B - Styrbart, motordrevet hjulunderstell. - Google Patents

Abstract

Styrbart motordrevet hjulunderstell.

Description

Oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte til fremstilling av et anabolisk og østrogent materiale.

Som følge av de vesentlige utgifter som er forbundet med oppforingen av

kjøttproduserende dyr er det. utviklet for-skjellige hjelpemidler for å forøke vekt-hastigheten for slike dyr. Mange av disse hjelpemidler, deriblant visse anabolisk ak-

tive østrogener så som dietylstilbestrol har imldtertid mangler ved den praktiske anvendelse som følge av giftighet, uønskede bivirkninger og vanskeligheter ved admi-nistreringen.

Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er det fremskaffet et hittil ukjent anabolisk aktivt og østrogent materiale med strukturf ormelen:

Dette materialet hjelper ikke alene til å forøke veksthastigheten hos kjøttprodu-serende dyr, men det kan også administreres sikkert og økonomisk uten uheldige bivirkninger. Ifølge oppfinnelsen fremstilles dette materialet ved at man dyrker organismen Gibberella zeae (Gordon) NRRL-2830 under aerobe betingelser i et næringsmedium som inneholder en kornsort, fortrinnsvis mais, hvete, bygg eller havre, hvoretter dette aktive stoff, hvis ønsket, isoleres fra mediet. En levende kultur av nevnte organisme er innlevert til Northern Utilization Research and Development Di-vision under det amerikanske landbruks-departement. Organismen ble isolert fra en maiskultur på en gård i nærheten av Delphi, Indiana, og kulturen ble rendyrket ved adskillige spredninger. I det følgende gis den morfologiske beskrivelse av organ-Fremgangsmåte til fremstilling av et anabolisk aktivt og østrogent materiale. ismen dyrket på Czapek's dekstroseagar av sammensetningen som er vist i tabell 1.

Organismen er en hurtigvoksende sopp, som oppnår en kolonidiameter på 9 cm i løpet av 4 døgn ved 22—25°C. I diffust lys eller mørke utvikler det seg et utstrakt du-net luftmycelium med kolonisentret opp-visende en mørk gul farve, som tenderer mot lyserødt eller hvitt ved koloniperife-rien. Under 4840 lux av fluorescerende lys er kolonien mørkere gul med mindre luftmycelium. Baksiden av kulturen er dyprød som følge av produksjonen av vannuopp-løslig pigment.

Produksjonen av makroconidier er sjelden i mørke og rikelig i lys. Makroconi-diene oppstår i slimete masser varierende i lengde fra 7.6 mikron til 14 mikron og inneholder fra 0 til 5 skillevegger med en veldefinert basiscelle. Bredden av makro-conidiene er mere konstant fra 2.5 til 5 mikron, vanligvis ca. 4,5 mikron. Makroconi-diene er bøyd med 3 til 4 skillevegger med en lengde på 30 til 40 mikron. Chlamydo-sporer forekommer innskutte og er sjeldne.

Perithecier produseres sparsomt i kulturen over 3 uker under normale lysbetin-gelser. Peritheciene er sorte og elliptiske og har en diameter 120 x 170 mikron. Asci innen peritheciene er langstrakte (50—60 mikron lange og 6.6 mikron brede). Ascosporene er rette eller svakt bøyet og har tre skillevegger og er hyaline. Ascosporene er 19 til 22 mikron lange og 2 mikron brede og er tilspisset ved endene.

Den anaboliske forbindelse fremstilt ifølge oppfinnelsen — i det følgende betegnet «det anaboliske stoff» — fremstilles ved å inkubere sporene eller det vegetative mycelium av den nye organisme i et egnet inokulasjonsmedium og derpå innføre det mikroorganismeholdige inokulasjonsmedium i et fermenteringsmedium, som inneholder en av de vanlige kornarter som carbohydratkilde.

Ved utførelsen av fermenteringstrinnet efter oppfinnelsen kan enhver av de van-

lige kornsorter som mais, havre, hvete, bygg o. 1. brukes som carbohydratkilde. Det foretrekkes å bruke mais. Temperaturen for fermenteringsmediet kan varieres fra ca. 22 til 32°C, men det foretrekkes å bruke temperaturer fra ca. 25 til 28°C. pH for fermenteringsmediet kan holdes over et utstrakt område fra ca. 3.5 til 8.5. For mak-simalt utbytte foretrekkes imidlertid en start-pH fra ca. 5.0 til 5.6 og en slutt pH fra ca. 6.0 til 7.6. Skjønt flytende fermen-teringsmedia kan brukes med tilfredsstillende resultat, foretrekkes et fuktig men i det vesentlige fast medium. Det foretrekkes også å utføre fermenteringen i fravær av lys.

Generelt sett kan — under foran-nevnte betingelser — et tilfredsstillende utbytte av det anaboliske stoff oppnås i løpet av en periode på fra 6 til 20 dager. Avhengig av mikroorganismens vitalitet kan imidlertid denne periode være noe kortere eller lengere.

Det slik fremstilte anaboliske stoff kan derpå administreres til dyr ved enhver egnet metode inklusive oral og parenteral ad-ministrasjon. Efter fermenteringsperioden kan f. eks. fermenteringsmediet blandes med vanlig for og således fores direkte til dyr. Det anaboliske stoff kan også utvin-nes efter enhver egnet metode, og det ut-vundne produkt kan suspenderes i et egnet injeksjonssuspensjonsmedium som jordnøttolje og injiseres parenteralt.

For å utvinne det anaboliske stoff foretrekkes først å ekstrahere fermenteringsmediet med etanol, fortrinsvis av omtrent 95 pst.s konsentrasjon, og derpå konsentrere ekstraktet inneholdende det anaboliske stoff. Konsentratet oppløses derpå i kloroform og ekstraheres så med en na-triumkarbonatoppløsning, fortrinnsvis av en konsentrasjon på ca. 5 pst. og med en pH justert til ca. 9—12, fortrinnsvis ca. 11.2, pH for natriumkarbonatekstraktet justeres derpå med saltsyre til ca. 6.5 for å bunnfelle det faste, urene anaboliske materiale. For å oppnå maksimal bunnfel-ling foretrekkes en pH justert til ca. 6.2. Dette urene bunnfall ekstraheres derpå med eter og tørres så for å oppnå et tørt, fast materiale egnet for foring til dyr. Hvis et materiale av høyere renhet ønskes, kan det tørre, faste anaboliske stoff oppnådd som foran beskrevet, utsettes for multippel overførings-motstrømsfordeling under bruk av et egnet oppløsningsmiddelsystem, og den aktive komponent skilles fra efter Craig's metode beskrevet i Techniques of Organic Chemistry, bind 3, kapittel 4, 2. utgave utgitt av A. Weissberger, Inter-science Publications Incorporated. Denne metode består i det vesentlige i å anbringe i hvert av et foreskrevet antall rør en be-stemt og lik mengde av nedre fase av et oppløsningsmiddelsystem, og det første av disse rør inneholder en foreskrevet mengde av materialet som skal separeres og identi-fiseres og så tilsette til det første rør et kvantum av øvre fase av et oppløsnings-middelsystem lik mengden av nedre fase i det første rør, omhyggelig blande de to faser i det første rør og la dem igjen skille seg, derpå overføre øvre fase til et annet rør, hvorpå en identisk mengde frisk øvre fase av oppløsningsmiddelsystemet igjen tilsettes til det første rør. Denne behandling fortsettes for ethvert ønsket antall rør. Røret som inneholder den største mengde aktivt materiale bestemmes, og en fysikalsk, konstant betegnet operasjonskoefisient oppnås derpå. Operasjonskoefisienten beregnes etter følgende formel:

hvor K er operasjonskoefisienten. N er det totale antall anvendte overføringsrør i sy-stemet, og n er nummeret på det rør i hvilket mest aktivt materiale finnes.

Ved bruk av motstrøms fordelingstek-nikken for rensning av det anaboliske stoff fremstilt efter oppfinnelsen, kan det an-vendes ethvert egnet oppløsningsmiddelsy-stem, som har en enkel fordelingskoefisient på ikke mindre enn 0.2 og ikke større enn 0.5. Den enkle fordelingskoefisient kan be-tegnes som forholdet mellom mengden materiale som oppløses i den øvre fase av det anvendte oppløsningsmiddelsystem og mengden funnet i den nedre fase. Blant oppløsningsmiddelsystemer som er funnet anvendelige, er et system som inneholder en nedre fase bestående av to deler CHC13 og to deler CC14 og en øvre fase bestående av tre deler CH.,OH og to deler H20, alle deler efter volum og et system bestående av en nedre fase inneholdende to deler CHC1.} og to deler CC14 og en øvre fase inneholdende fire deler CH3OH og en del H,0 alt som volumdeler.

Ved bruk av Craigs rensningsmetode over 100 rør som beskrevet foran, et opp-løsningsmiddelsystem bestående av to deler carbontetraklorid og to deler kloroform som nedre fase og fire deler metanol og en del vann som øvre fase, alt som volumdeler, på tørt anabolisk stoff oppnådd ved dyrkning av organismen Gibberelle zeae

(Gordon) NRRL — 2830 på med vann fuk-tet maismedium og utvunnet ved å ekstrahere mediet med etanol, konsentrere ekstraktet, løse opp i kloroform, ekstrahere med vandig natriumkarbonat, justere pH med saltsyre for å bunnfelle et fast produkt, som derpå ekstraheres med eter og tørres som foran beskrevet, ble det oppnådd en enkel fordelingskoeffisient på 0.4 og en operasjonskoefisient på 0.54.

Det rensede anaboliske stoff er meget lett oppløselig i metylenklorid, etanol, bu-tylacetat, 1,4-dioksan og etyleter, oppløse-lig i metanol, butanol, kloroform og ace-ton, svakt oppløselig i heksan, petroleter og heptan og uoppløselig i dimetylforma-mid og vann.

Det anaboliske stoff gir negativ nin-hydrinprøve ved tørring på cellulose og absorberes lett på aluminiumoksyd fra en metylenkloridoppløsning. Ultravioletabsorpsjonsstudier er blitt utført på en metanolisk oppløsning av østrogenet. Ultravioletabsorpsjonsspekteret

for materialet er vist i fig. 1 på vedføyede

tegninger. Kurven viser et absorpsjons-maksimum ved 236, 274 og 313 millimikron og et absorpsjonsminimum ved 255 og 300 millimikron.

En oppløsning av det anaboliske stoff, hvor oppløsningen har en pH på 6.0 og består av to volumdeler kloroform, to volumdeler carbontetraklorid, tre deler metanol og to deler vann, gir en klar grønnblå fluorescens, når det utsettes for sterkt in-tenst ultraviolett lys.

Et infrarødt spektrum av det anaboliske stoff fremstilt efter oppfinnelsen pel-letert med kaliumbromid er vist i fig. II på vedføyede tegning. Den følgende tabell viser infrarødt absorpsj onskarakteristika for det anaboliske stoff fremstilt efter oppfinnelsen.

Det anaboliske stoff har et smeltepunkt på 164-165° C.

Det anaboliske stoff viser den føl-gende optiske dreining i metanol [<x]2D5° = 109.5° og har den foran angitte struktur formel.

Det anaboliske stoff fremstilt efter oppfinnelsen er et effektivt vekstfrem-mende materiale for anvendelse ved dyre-foring. Den følgende tabell III viser resultatene av vekststudier på lam utført med åtte lam f6ret med vanlig handelsfor i 28 dager. Den gjennomsnittlige daglige vekst-økning var 0.123 kg.

Tabell IV viser resultatene fra vekststudier på lam under anvendelse av samme handlesfor som i tabell III, men supplert med daglige subkutane injeksjoner på 33 enheter av det anaboliske stoff over 28 dager. En enhet av det anaboliske stoff fremstilt efter oppfinnelsen er den mengde av stoffet som er nødvendig for å gi samme virkning som 1 mikrogram dietylstilbestrol. Den gjennomsnittlige daglige vekts-økning for disse lam behandlet med det anaboliske stoff efter oppfinnelsen var 0.173 kg, hvilket betyr en 40 pst.s forbed-ring i vektsøkning overfor lammene i tabell III.

Den gjennomsnittlige f6romdannelse for de åtte lam til hvilke intet anabolisk aktivt stoff var administrert, var 10.28 kg konsumert for pr. kg vektsøkning, mens den gjennomsnittlige foromdannelse for lammene, til hvilke anabolisk stoff var administrert, var 8.08 kg konsumert for pr. kg vektsøkning.

De følgende eksempler gis for å illu-strere oppfinnelsen. Det første eksempel illustrerer fremstillingen av et egnet inoculum inneholdende organismen Gibberella zeae (Gordon) NRRL — 2830.

Eksempel I

En sporesandkultur inneholdende Gibberella zeae (Gordon) NRRL — 2830 ble anbragt aseptisk i et sterilt rør inneholdende 15 ml Czapek's Dox oppløsning og en liten mengde agar. Dette medium ble inkubert i ca. 168 timer ved omtrent 25°C. Ved utløpet av inkubasjonstiden ble mediet vasket med 5 ml sterilt avionisert vann og overført til et sterilt rør inneholdende 45 ml Czapek's Dox oppløsning. Inn-holdet av røret ble derpå inkubert i ca. 96 timer ved omtrent 25°C, hvoretter materialet var tilgjengelig for anvendelse ved inokulering av et fermenteringsmedium.

Det følgende eksempel illustrerer fermenteringen av organismen Gibberella zeae (Gordon) NRRL — 2830.

Eksempel II

Til en 2-liters flaske ble 300 g finfor-delt mais tilsatt. Flasken og dens innhold ble derpå sterilisert, og etter steriliseringen ble 150 ml sterilt, avionisert vann tilsatt. Til blandingen i flasken ble derpå tilsatt 45 ml inoculum fremstilt efter fremgangsmåten i eksempel 1, og materialet ble omhyggelig blandet. Det blandede materiale ble derpå inkubert i ca. 20 dager ved 25°C i et mørkt rom i en atmosfære mettet med vann.

Eksempel III

Dette eksempel illustrerer utvinningen av det anaboliske stoff fra fermenteringsmediet.

En porsjon på 300 g fermentert materiale, fremstilt efter metoden i eksempel II, ble anbragt i 500 ml avionisert vann og slem-met opp. Oppslemmingen ble så oppvarmet i ca. 15 minutter ved 75°C, 300 g filterhjel-pemiddel ble derpå tilsatt og materialet filtrert. Det faste filtrerte materiale, som inneholder det anaboliske stoff, ble så lufttørret og 333 g av den tørrede kake ble derefter ekstrahert med 500 ml etanol. Denne behandling ble gjentatt ytterligere tre ganger. Etanolekstraktet ble derefter tørret under vakuum og ga 6.84 g fast materiale. Dette faste materiale ble derpå opp-løst i 20 ml kloroform og ekstrahert med 30 ml av en vandig oppløsning inneholdende 5 vektspst. natriumkarbonat med en pH justert til ca. 11.2. Ekstraksjonsprosessen ble gjentatt ytterligere syv ganger. pH for natriumkarbonatekstraktet ble så justert til 6.2 med saltsyre og gir bunnfall inneholdende anabolisk stoff. Bunnfallet og det vandige natriumkarbonatekstrakt ble derefter hver for seg ekstrahert med 75 ml etyleter. Denne behandling ble gjentatt ytterligere tre ganger og gir en lys gul eterisk oppløsning, som derpå ble tørret og ga 116 mg fast anabolisk stoff. Dette materiale ble derpå underkastet multippel overførings-motstrømsfordeling under bruk av 100 rør og et oppløsningsmiddelsystem bestående av to deler kloroform og to deler carbontetraklorid som den nedre fase og fire deler metanol og en del vann som den øvre fase — alle deler som volumdeler. Det faste materiale oppnådd fra denne fordelings behandling ble derefter prøvet på fysiologisk aktivitet efter den velkjente musu-terusprøv. Denne besto i å fore fast materiale fremstilt ved tørring av 5 ml av den øvre fase og 5 ml fra den nedre fase fra hvert av de utvalgte rør i et standardfor på 75 g til fem mus over en femdagers periode, i løpet av hvilken tid alt for var konsumert. Ved slutten av perioden ble dyrene veiet og uteri ble fjernet og veiet. Et po-sitivt svar på prøven fikk man med de mest fysiologisk aktive materialer som innehol-des i rørene 30 til 40. Det faste materiale samlet opp fra rørene 30 til 40 veide 59 mg.

Claims (2)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av et anabolisk aktivt og østrogent materiale med følgende strukturformel: karakterisert ved at man dyrker organismen Gibberella zeae (Gordon) NRRL — 2830 linder aerobe betingelser i et næringsmedium som inneholder en korn sort, fortrinnsvis mais, hvete, bygg eller havre, hvoretter det aktive stoff, hvis ønsket, isoleres fra mediet.

2. Fremgangsmåte ifølge påstand 1, karakterisert ved at dyrkningen foretas i mørke ved en temperatur i om-rådet 25—28°C. Anførte publikasjoner: