NO140691B - Fremgangsmaate for kvalitativt og kvantativt aa bestemme katalase i melk og andre vaesker, fortrinnsvis av biologisk opprinnelse - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en

fremgangsmåte til kvalitativ og kvantitativ

bestemmelse av enzymet katalase i melk og andre væsker, særlig av biologisk opprinnelse, eksempelvis blodserum. Fremgangsmåten er karakterisert ved at det til melken eller de andre væskene settes et første reagens bestående ?.v en substans eller samvirkende substanser som kan danne hydrogenperoksyd med en substans som forekommer i melken eller de andre væskene, samt et annet reagens som under oksydasjon av den dannede hydrogenperoksyd gir en farvereaksjon hvorefter katalaseinnholdet bestemmes ved hjelp av de oppkomne farvenyansene, idet reaksjonene bringes til å finne sted i en porøs struktur.

Det er kjent metoder ifølge hvilke katalase kan bestemmes

både kvalitativt og kvantitativt. En slik metode grunner seg på katalasens egenskap å katalysere nedbrytningen av hydrogenperoksyd under dannelse av fritt oksygen. Det foregår slik at væsken som skal undersøkes, blandes med fortynnet hydrogenperoksydløsning i et gjæringsreagensglass, dette får vanligvis stå i 3 timer, og volumet av den utviklede oksygengassen måles:

Muligheten av raskt, sikkert, og med enkle midler å

kunne bestemme katalase i spesielt melk, er av stor betydning. Katalaseforekomst i melk er nemlig en indikasjon på at det melk-avgivende dyret har jursykdommen mastitt. Denne er spesielt taps-bringende for landbrukerne, og med regelbunden kontroll av jur-

helsen vil det derfor på et tidlig stadium avsløres forekomst av mastitt ved katalasebestemmelse.

På grunn av at den ovennevnte måte å bestemme katalase ved tilsetning av hydrogenperoksyd i et gjæringsreagensglass tar så lang tid, er det blitt utviklet andre metoder. Således finnes metoder som grunner seg på en vurdering av koaguleringsgrad eller økt viskositet hos melk som er blitt tilsatt alkaliske eller overflatespenningssenkende midler. Også disse metoder har den ulempe at de medfører håndtering av reagenser, og dessuten er de usikre om de ikke utføres av meget rutinert personale. Dette gjelder særlig ved lav mastittgrad.

I to artikler, Z. Physiol. Chem. 329 (1962), 40 og

Clin. Chim. Acta 15 (1967), 159-163, har Johann Putter beskrevet

en måte for kolorimetrisk å påvise katalase ved hjelp av et reagenssystem som blant annet inneholder hydrogenperoksyd, peroksydase og en farvedanner. Denne metode går ut på at det til væsken som skal analyseres, tilsettes en mengde hydrogenperoksyd, eventuelt fore-kommende katalase i væsken får nedbryte hydrogenperoksydet,

og reaksjonen avbrytes efter bestemte tidsintervaller, hvorefter gjenværende hydrogenperoksyd bestemmes kvantitativt ved å la dette oksydere farvedanneren med peroksydase som katalysator ifølge reaksjonen:

Også denne metode er imidlertid åpenbart altfor komplisert og tidkrevende til å egne seg for raske og pålitelige katalasebestemmelser av urutinert personale. I motsetning til denne metode er foreliggende fremgangsmåte en enkel, rask og sikker metode til å bestemme katalase.

Svensk patent 354.4 70 angår forbindelser som skal anvendes som kromogener med analytisk anvendelse. Det gis ingen anvisning om hvordan man på en effektiv og enkel måte skal anvende de konkurrerende reaksjonssystemer, slik som man har funnet frem til ifølge foreliggende oppfinnelse.

Norsk patent 116.878 og US-patent 3.558.435 angår diagnostiske midler, men antyder heller ikke hvordan man skal kunne utforme den spesielle fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen for utnyttelse av konkurrerende reaksjonssystemer.

Formålet med foreliggende oppfinnelse er derfor å frembringe en enkel, rask og sikker metode til å bestemme katalase.

Eftersom katalaseforekomsten i melk har vist seg å være vel korrelert med mastittgraden, er det videre et formål med oppfinnelsen å fremskaffe en enkel, rask, sikker og følsom metode til kvantitativt å bestemme katalase.

Et ytterligere formål med oppfinnelsen er å fremskaffe en metode med de nevnte fordelene som gjør det mulig å bestemme katalase ved hjelp av en farvereaksjon.

Endelig er det et formål r.ied oppfinnelsen å fremskaffe en metode som gjør det mulig å utføre den nevnte bestemmelse av katalase med et undersøkelsesmiddel i form av eksempelvis en papirstrimmel hvori det er blitt absorbert nødvendige reagenser for undersøkelsen.

Oppfinnernes tanke var å forsøke å oppnå disse mål ved

å balansere den ovennevnte reaksjon (2), ifølge hvilken en farvedanner ved oksydasjon med hydrogenperoksyd danner et farvet stoff med den ovennevnte reaksjon (1), ifølge hvilken katalase nedbryter hydrogenperoksyd og som følgelig hemmer en slik farvereaksjon.

Formålet å frembringe en fremgangsmåte ved hvilken det kunne anvendes utelukkende et tørt reagenspapir, skulle imidlertid ikke kunne oppnås ved tilsetning av hydrogenperoksyd til dette fordi det er en flyktig og instabil forbindelse. Følgelig må hydrogenperoksydet genereres i væsken som skal undersøkes, eller i reagenspapiret på en slik måte at det inkorporeres et reagens i papiret som kan reagere med en substans som forekommer i væsken under dannelse av hydrogenperoksyd. Et reagens som er egnet for formålet, er et organisk eller uorganisk peroksyd eller en forbindelse som kan frembringe et peroksyd.

En annen mulighet var å utnytte en enzymatisk reaksjon for generering av hydrogenperoksyd. Forutsetningene for dette er særlig gunstige i melk og andre væsker av biologisk opprinnelse. Således gir eksempelvis xantin og hypoxantin hydrogenperoksyd med det i melk inngående enzymet xantinoksydase.

Gunstigst ville det imidlertid være å tilsette til melken eller de andre væskene av biologisk opprinnelse ett enzym eller med hverandre samvirkende enzymer som med et sukker som forekommer i væsken, kan gi hydrogenperoksyd. Således gir enzymet galaktose-oksydase hydrogenperoksyd med melkens laktose.

Imidlertid er galaktoseoksydase egentlig spesifikt for fri galaktose og reagerer tregt med laktose. Fortrinnsvis skulle man derfor også tilsette enzymet Ø-galaktosidase som spalter laktose i galaktose og glukose. I stedet for galaktoseoksydase, eller sammen med dette, kan enzymet glukoseoksydase anvendes sammen med (3-galaktosidase, som er spesifikt for glukose som oppstår ved spaltning.

Et gunstig system for påvisning av katalase i melk skulle da se ut på følgende måte, hvorved et leukofarvestoff ved hjelp av peroksydase oksyderes katalytisk av i den analyserte væske dannet hydrogenperoksyd, mens denne oksydasjon hemmes dersom katalase er nærværende:

Laktose 3-galaktosidase ) glukose glukoseoksydase }

Et lett håndterbart materiale for utnyttelse av dette system kunne være en papirstrimmel i hvilken de angitte reagensene er absorbert og som ved katalasebestemmelsen helt enkelt dyppes i væsken som skal undersøkes. Et annet materiale kunne innbefatte en spesiell struktur, eksempelvis en gel, som reagensene er bundet til. Et slikt materiale kan fremstilles i form av en strimmel av en gel og har lenge vært kjent,' eksempelvis for pH-måling.

Det syntes imidlertid usannsynlig at det skulle kunne frembringe en slik konkurranse mellom katalase og peroksydase om det tilgjengelige hydrogenperoksydet, for helt siden W.E. Knox i Biochem. Biophys. Acta _14 (1954), 117 viste at all generert hydrogenperoksyd i et system bestående av glukose, gluokseoksydase, katalase, peroksydase og et oksyderbart stoff, dvs. en hydrogen-donator, forbruktes i den peroksydasekatalyserte reaksjon og ikke berørtes av nærvær av katalase, har det vanligvis blitt antatt at det skulle være en generell foreteelse at enzymatisk generert hydrogenperoksyd blir tatt vare på av peroksydase uberoende av nærvær av katalase. Denne antagelse blir også understøttet av det forhold at katalase, tross sin evne til i forhold til andre enzymer raskt å omsette sitt substrat, har en meget lav affinitet til dette, mens peroksydase har en høy substrataffinitet og har vist seg meget effektivt å utnytte enzymatisk generert hydrogenperoksyd i lave konsentrasjoner.

Oppfinnerne av den foreliggende metode fant imidlertid til sin overraskelse at systemet og reaksjonen (3) fungerte som de ønsket. Avvikelsen mellom deres resultat og de som ble oppnådd av

Knox m.fl., beror antagelig minst delvis på at disse arbeidet

med visse naturlige hydrogendonatorer, mens oppfinnerne anvendte syntetiske farvestoffer. Enzymatisk generering av hydrogenperoksydet in situ medfører at hydrogenperoksydkonsentrasjonen holdes relativt konstant, hvilket er en forutsetning for at den konkurrerende nedbrytningen av hydrogenperoksyd av peroksydase og katalase skal kunne utnyttes for beregning av katalaseinnholdet.

Oppfinnerne har utført et stort antall forsøk i hvilke katalase er blitt bestemt på den ovenfor beskrevne måten. De reagensblandinger som ble anvendt (ifølge reaksjonsformel 3), har med den analyserte væsken gitt en mørkeblå eller grønnaktig farve dersom ikke katalase har vært til stede. Ved høye katalaseinnhold har farven derimot blitt blekt gul. Følsomheten er omvendt proporsjonal med peroksydaseinnholdet i reagensblandingen. Oppfinnerne har kunnet innstille følsomheten ved forsøk med melk, slik at melk fra en helt frisk ku har gitt mørkeblå farve, mens melk fra kuer med tiltagende mastittgrad har gitt fra mellomblå og over lyseblågrønn til blekgul farve.

Nedenfor gis det eksempler på reagensblandinger hvor de ovenfor foreslåtte substanser inngår, samt fremgangsmåte for deres anvendelse ved bestemmelse av katalase i melk. En dråpe melk blandes med en dråpe av en reagensløsning som er sammensatt ifølge et av følgende alternativer:

Ifølge oppfinnelsen tilveiebringes også et reagenssystem som karakteriseres ved at det omfatter en porøs struktur som er impregnert med et første reagens som ved berøring med væsken eller en bestanddel derav danner hydrogenperoksyd, og et annet reagens som ved oksydasjon med hydrogenperoksyd gir en farveendring. Det kan f.eks. være en strimmel av filtrerpapir, som er blitt impregnert med en av de nevnte reagensløsningene og derefter blitt tørket. Når den senere dyppes i melken for bestemmelse av katalaseinnholdet i denne, suger den opp en mengde melk som er passende i forhold til reagensinnholdet i papirstrimmelen.

Den anvendte peroksydase kan være av normal kommersiell renhet (f.eks. RZ = 0,6). Av glukoseoksydase og galaktosidase må det imidlertid anvendes spesielle preparater med lavt katalaseinnhold. For å sikre reagensenes stabilitet, bør de løses i en passende bufferløsning som har pH nær 7.

Det således beskrevne enfasesystem av reagenser er følsomt nok for påvisning av en utviklet jurbetennelse, såkalt akutt mastitt, og for påvisning av hvor langt den har utviklet seg. Dette enfasesystem har imidlertid vist seg ikke å være følsomt nok for sikker okular bestemmelse av de forstadier av betennelser, såkalt subklinisk mastitt, som det er ønskelig å kunne påvise. Fotometrisk kan de imidlertid påvises med det nevnte enfasesystem.

Nå har det imidlertid vist seg at følsomheten for analysemetoden kan økes til nødvendig nivå om det i stedet bygges opp et flerfasesystem på en slik måte at man fysisk skiller de hydrogenperoksydgenererende og de farvegenererende reagensene fra hverandre ved hjelp av et rom gjennom hvilket det dannede hydrogenperoksyd kan diffundere og i hvilket melken kan opptas. Ved sin passasje fra den hydrogenperoksydgenererende fase hos systemet, gjennom det separerende rommet og til systemets farvegenererende fase, rekker hydrogenperoksydet helt eller delvis å nedbrytes ved forekomst av katalase i melken som har trengt inn i eller blitt tilført til det nevnte rommet.

Ved på denne måten å anordne en diffusjonsstrekning

for det dannede hydrogenperoksydet gjennom den analyserende væsken, fra det hydrogenperoksydgenererende enzymet til det farvegenererende systemet som fortrinnsvis inneholder et katalyserende enzym, er det blitt mulig å påvise også meget små mengder katalase og dermed mastitt i et tidlig begynnelsesstadium.

Nedenfor skal det gis noen eksempler på hvordan fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen gjennomføres i praksis.

Eksempel 1

En prøvecelle har to rom hvorav det ene, som er permanent lukket med en semipermeabel hinne, inneholder 1-10 U galaktose-oksydase (beregnet på laktose som substrat). En liten mengde, 0,5-1 ml, av den væsken hvis katalaseinnhold skal analyseres, tilsettes i det åpne rommet i prøvecellen, og et reagenspapir inneholdende peroksydase og et farvestoff, som beskrevet i eksempel 2 nedenfor, innsettes i væsken på en slik måte at dets nærmeste del befinner seg på en fast avstand på noen millimeter fra den semipermeable hinnen. Beroende på galaktoseoksydasemengden, prøvevolumet og den nevnte faste avstanden, kan det oppnås forskjellige følsomheter for katalase. I den beskrevne utførelsen har det kunnet bestemmes katalasekonsentrasjoner oppgående til 2-20 U pr. ml semikvantitativt på en slik måte at farveutviklingen i reagenspapiret, som er maksimal efter noen minutter i fravær av katalase, oppnår et hele tiden svakere farveintensitetsmaksimum ved stigende katalaseinnhold.

Eksempel 2

Man appliserer det hydrogenperoksydgenererende systemet

på den ene siden av en porøs struktur og det farvegenererende systemet på den andre siden. Den porøse strukturen danner da det rom som skiller de to systemene fra hverandre. Den kan absorbere væske som skal analyseres og danner diffusjonsstrekning for hydrogenperoksyd. Det således separerende rommet kan forsterkes ved hjelp av en semipermeabel membran som isolerer systemene fra hverandre. Den porøse strukturen kan utgjøres av et eller flere skikt av et porøst papir.

Begge reagenssystemene kan appliseres ved å fikseres i

et gelskikt. Følgende to løsninger fremstilles i hensiktsmessig 20-40%ig gelatin eller en annen geldanner ved ca. 40°C.

Eksempel 3

Istedenfor å applisere de to enzymsystemene på forskjellige sider av et porøst skikt ved å inneslutte dem i hvert sitt gelskikt, anbringer man to porøse skikt, eksempelvis av papir, i hvilke man har absorbert de respektive systemene, på forskjellige sider eller på annen måte i forskjellige deler av et tredje porøst skikt, som også eksempelvis er av papir. Derved isolérer man hensiktsmessig de to reagensdannende skiktene fra det mellomliggende skiktet ved hjelp av semipermeable membraner.

Eksempel 4

Reagensene ifølge eksempel 2 kan i stedet for å innesluttes i gelskikt, innkapsles i såkalte mikrokapsler ifølge en av de metoder som er beskrevet i faglitteraturen. Se eksempelvis: Chang, T.M.S, Mac Intosh, R.C. og Mason, S.G. - Semipermeable Aqueous Microcapsules - Can. J. Physiol. Pharmacol. £4_ (1966), 115.

Man fremstiller to løsninger lik de som er angitt i eksempel 2. Løsningene innesluttes hver for seg i forskjellige mikrokapsler, som anbringes i forskjellige skikt på hver sin side av et porøst diffusjonsskikt eller blandes med et inert diffusjonsmedium, eksempelvis cellulose fibre, hvorefter man danner en porøs struktur av blandingen.

Eksempel 5

De semipermeable membranene i eksempel 3 kan utelukkes om de inngående enzymene festes (insolubiliseres) på hver sin side av eller i forskjellige deler av en porøs struktur på en slik måte at de ikke står i umiddelbar kontakt med hverandre. Noen av de metoder for festing av enzymer til eksempelvis papir som er beskrevet i faglitteraturen, kan anvendes. Se eksempelvis: Stasiw, R.O.,

Patel, A.B. og Brown, H.D. - Utilization of Bound Lactase in Clinical Chemistry - Biotechnol. Bioeng. 14 (1972), 629.

Når det i de ovenfor angitte eksemplene sies at de forskjellige enzymsystemene på en eller annen måte anordnes i forskjellige deler av en porøs struktur, menes det ikke bare at de kan være anordnet eksempelvis ved hver sin ende av en papirstrimmel, men det menes også at de kan være anordnet ved forskjellige bestanddeler hvorav den porøse strukturen er oppbygget, eller hvorav den kan bygges opp. Det senere er tilfelle i eksempel 4. De mikrokapsler i hvilke reagensene er innesluttet, utgjør bestanddeler i den struktur som oppstår når de i en utførelsesform blandes med et inert diffusjonsmedium, hvorefter blandingen formes slik at den danner en porøs struktur.

Claims (21)

1. Fremgangsmåte for kvalitativt og kvantitativt å bestemme katalase i melk og andre væsker, fortrinnsvis av biologisk opp-

rinnelse, karakterisert ved at det tilsettes et første reagens bestående av en substans eller samvirkende substanser som kan danne hydrogenperoksyd med en substans som forekommer i melken eller i de andre væskene, samt et annet reagens som under oksydasjon med hydrogenperoksyd gir en farvereaksjon hvorefter katalaseinnholdet bestemmes ved hjelp av de oppståtte farvenyansene, idet reaksjonene bringes til å finne sted i en porøs struktur.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det første reagenset er et organisk eller uorganisk peroksyd eller en forbindelse som kan gi et peroksyd.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det første reagenset er en forbindelse som kan danne hydrogenperoksyd med xantinoksydase som forekommer i melken, f.eks. xantin eller hypoxantin.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det første reagenset er ett, resp. flere, enzymer.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at det første reagenset er enzymet galaktose-oksydase.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at det første reagenset er enzymene fl-galaktosidase og glukoseoksydase.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at det første reagenset er enzymene (3-galaktosidase og galaktoseoksydase.

8. Fremgangsmåte ifølge et av de foregående krav,karakterisert ved at det annet reagens er et leukofarvestoff.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at det andre reagenset dessuten er tilsatt enzymet peroksydase.

10. Reagenssystem for utførelse av fremgangsmåten ifølge et av kravene 1 til 9, karakterisert ved at det omfatter en porøs struktur som er impregnert med et første reagens som ved berøring med væsken eller en bestanddel derav danner hydrogenperoksyd, og et annet reagens som ved oksydasjon med hydrogenperoksyd gir en farveendring.

11. Reagenssystem ifølge krav 10, karakterisert ved at de to reagensene er fysisk skilt fra hverandre.

12. Reagenssystem ifølge krav 10, karakterisert ved at reagensene er isolert fra hverandre ved hjelp av minst en semipermeabel membran.

13. Reagenssystem ifølge krav 10 til 12, karakterisert ved at strukturen består av porøst papir.

14. Reagenssystem ifølge krav 10 til 13, karakterisert ved at de to reagensene er inne-lukket i forskjellige mikrokapsler som er fordelt i den porøse struktur.

15. Reagenssystem ifølge krav 10 til 12, karakterisert ved at de to reagensene er innesluttet i hvert sitt gelskikt.

16. Reagenssystem ifølge krav 10, karakterisert ved at det to reagensene i uløselig form er anbragt på den porøse struktur.

17. Reagens sy s-tem ifølge krav 10, karakterisert ved at det inneholder fra 0,09 til 0,11 mg/ml 3-galaktosidase, fra 0,09 til 0,11 mg/ml glukoseoksydase eller galaktoseoksydase, fra 0,9 til 1,1 ug/ml peroksydase og fra 0,19 til 0,21 mg/ml o-tolidin.

18. Reagenssystem ifølge krav 10 til 16, karakterisert ved at det inneholder fra 0,09 til 0,11 mg/ml galaktoseoksydase, fra 0,9 til 1,1 yg/ml peroksydase og fra 0,19 til 0,21 mg/ml o-tolidin.

19. Reagenssystem ifølge krav 10 til 16, karakterisert ved at det inneholder 0,09 mg/ml til 0,11 mg/ml hypoxantin, fra 0,9 til 1,1 pg/ml peroksydase og fra 0,19 til 0,21 mg/ml o-tolidin.

20. Reagenssystem ifølge krav 10 til 16, karakterisert ved at det inneholder 0,9 til 1,1 mg/ml natriumperborat eller ureaperoksyd, fra 0,9 til 1,1 ug/ml peroksydase og fra 0,19 til 0,21 mg/ml o-tolidin.

21. Reagenssystem ifølge krav 10 til 20, karakterisert ved at reagensene er innarbeidet i den porøse struktur og tørret.