NO139890B - Fremgangsmaate ved fremstilling av n5 -methyltetrahydrohomofolinsyre - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte

ved fremstilling av N<5> -methyltetrahydrohomofolinsyre som er beslektet med 5, 6, 7, 8-tetrahydrohomofolisyre ,som takket være dets ustabilitet har begrenset anvendelse. Folatan-

tagonister har nylig blitt undersøkt av J.R. Bertino:

Folate Antagonists as Chemotherapeutic Agents, Annals of

New York Academy of Science, Vol. 186, 1971, og er også be-

handlet i Goodman and Gilman, Pharmacological Basis for Thera-peutics, 4th Edition, 1970, sider 1431 - 1444.

Fremstilling av tetrahydrohomofolinsyresalter er

ennvidere beskrevet i:

US patentskrift, 3,458,886 og

3,637,695

Folinsyremolekylet angitt nedenfor består generelt

sett av tre segmenter. Det første segment er en pteridindel som er et

kondensert diazin med en pyrimidin-A-ring og en 1,^-diazin-B-ring. En methylenbro ved Cr o forbinder det forste og andre segment. Det andre segment er en paiaminobenzofraksjon, og det tredje er en glutaminsyrerest.

Også angitt er strukturen av 5,6,7,8-tetrahydrofolinsyre og forbindelser i folinserien analoge med foreliggende for-bindelse .

5,6,7,8-tetrahydrofolinsyre (THFA)<FH^)R= --H)

Homofolinsyre avviker fra folinsyre ved å være en analog

hvor en ytterligere methylen- eller CH2-gruppe er innfort mellom C9 7 og N"^ i hovedfolinmoiekylet. Tetrahydrofolinsyre er et derivat av folinsyre hvor 5, 6, 7, og 8 stillingene er er hydrogenert.

De viktigste folinsyrederivater som har blitt isolert fra levende systemer, er 5-methyl, 5,10-methenyl, og 5,10-methylen-tetrahydrofolinsyrer. Homofolinsyrederivatene analoge med disse forbindelser er derfor de mest egnede utgangsmaterialer for fremstilling av folinsyreantagonister for å konkurrere med folinsyre og' påvirke dennes enkle carbonenhets overforingsfunksjon.

Fremstilling av 5-methyltetrahydrofolat er fra litteraturen kjent i det minste fra 1963 da W. Sakami in Biochem. Prep. 10, 103

(1963) fremstilte 5,10-methylentetrahydrofolat ved å omsette tetrahydrofolinsyre med formaldehyd og deretter redusere methylentetra-hydrofolatet med kaliumborhydrid. Det dannede urene 5-methyltetr-a-hydrofolat (MeTHF) -ble renset ved gradiert elueringskromatografi på DEAE cellulose. V.S. Gupta and F.M. Huennekens in Arch. Biochem. Biophys., 120, 712-718 (1967) fulgte en lignende fremgangsmåte med tetrahydrofolatderivater som også innbefattet kondensasjon av formaldehyd med tetrahydrofolat under dannelse av 5,10-methylentetrahydrofolat fulgt av reduktiv spaltning av den sistnevnte med borhydrid. Gupta et al fant at lite eller ingen spaltning foregikk på N tr-siden av methylenbroen.og således at fremstilling av 5-methylformen var praktisk talt utelukket.

Foreliggende oppfinnelse avviker fra den kjente lære ved at homofolinsyre anvendes som utgangsmateriale i stedet for folinsyre og at den etterfølgende prosedyre inneholder flere viktige ulikheter beregnet på å unngå de vanskeligheter som er forbundet med ustabilitet til tetrahydrohomofolinsyre (THHF).

Foreliggende oppfinnelse angår således en fremgangsmåte ved fremstilling av N -methyl-tetrahydrohomofolinsyre fra homofolinsyre hvilken fremgangsmåte som er kjenne-tegnet ved at

a) homofolinsyre reduseres til tetrahydrohomofolinsyre i mørket med et lite overtrykk av hydrogen i nærvær av

redusert platinaoxyd

b) tetrahydrohomofolinsyre omsettes umiddelbart med formaldehyd under dannelse av mellomproduktet 5,11-methylen-tetrahydrohomofolinsyre c) den dannede 5,11-methylen-tetrahydrohomofolinsyre reduseres umiddelbart uten isolering med natriumborhydrid under

dannelse av den ønskede N^-methyl-tetrahydrohomofolinsyre som utvinnes ved utfelling av biprodukter med eddikksyre ved pH 3.8, filtrering og avkjøling av filtratet over natten under dannelse av det ønskede produkt.

Denne fremgangsmåte ved separering av det følsomme 5-methyl THHF produkt overflødiggjor det tidskrevende DEAE kolonnekromato-graferinga-trinn og i forhold til den kjente fremgangsmåte okes utbyttet med en faktor på 5.

En mer detaljert beskrivelse over fremstilling og analyse av N^-methyl THHF og mellomprodukténe angis i det etterfølgende.

Foreliggende fremgangsmåte innbefatter kondensasjon av formaldehyd med tetrahydrohomofolat under dannelse

c il

av r, N -methylentetrahydrohomofolat etterfulgt av reduktiv splitting av den sistnevnte med borhydrid. Som observert ved folatserien er denne splitting meget selektiv og lite eller ingen splitting foregår ved N^siden av methylenbroen. Utgangsmaterialet tetrahydrohomofolinsyre fremstilles ved katalytisk hydrogenering av homofolinsyre ved svakt overtrykk med platinaoxyd. Katalysatoren fjernes ved filtrering og formaldehydet tilsettes øyeblikkelig. Etter oppvarming til 55°C tilsettes en løsning av natriumborhydrid og blandingen oppvarmes til 55°C i 2 timer. For analyse ble den resulterende reaksjonsblanding kromatografert på en DEAE-cellulose-kolonne ved bruk av en ammoniumacetatgradient. N5-methyltetrahydro-

homofolat ble identifisert som en hovedtopp og isolert ved utfelling med absolutt ethanol som et hvitt pulver med h6% utbytte. Produktet ble karakterisert ved elementær analyse, papir- og tynnskikts-kromatografi og absorpsjonsspektra ved pH 1, 7 og 13.

Tetrahydrohomofolinsyrederivatene fremstilt ifølge oppfinnelsen har vist seg å utvise betydelig antileukemi-akti-vitet overfor L1210-FR8 tumor i mus og den terapeutiske fordel er tilknyttet det faktum at disse forbindelser utviser større stabilitet overfor oxydasjon enn moderforbindelsen. Aktiviteten av forbindelsen er antatt i det minste delvis å ha funksjon som en inhibitor overfor thymidylatdannelse (thymidylate synthetase). Hver av disse forbindelser kan fremstilles som den fri syre

eller fortrinnvis som et alkalimetalldisalt av glutamatfraksjonen, slik som dinatriumsaltet.

Produktet foreligger i form av racemater på grunn av nærvær av et asymmetrisk carbonatom i 6-stilling. Følgelig er den stereokjemiske betegnelse (d,l).

EKSEMPEL

Fremstilling av N<5> -methyltetrahydrohomofolinsyre (natriumsalt) NSC- 139490

3,0 g platinaoxyd ble vasket med fire 20 ml porsjoner vann og hydrogenert i 130 ml vann ved h cm overtrykk ved kraftig omroring ved romtemperatur. Reduksjonen var fullfort i lopet av 2 timer og 50 min. med en absorpsjon av ^10 ml hydrogen.

5,5 g homofolinsyre (NSC-792<>>+9) ble suspendert i 200 ml vann og 22 ml 1 M natriumhydroxyd ble tilsatt dråpevis (til pH 7,0) i lopet av 1 time under omroring og utelatelse av lys. Omroringen ble fortsatt i ytterligere en time og den således erholdte gule losning ble innsproytet inn i hydrogeneringskaret. Hydrogenering ved h cm overtrykk ble fullfort i lopet av h timer og 50 min. med en absorpsjon på 590 ml hydrogen. Reaksjonsblandingen ble filtrert under argon-atmosfære gjennom en glassintret trakt og filtratet ble overfort til en 2 1 3-hals kolbe som ble blåst med argon.

2,9 ml 37^-ig formaldehydlosning ble tilsatt og systemet ble spylt med argon og reaksjonsblandingen ble oppvarmet til 55°C under

omrøring og argonatmosfære og under utelatelse av lys, hvor-

ved det erholdes 5,11 -methylentetrahydrohomofolinsyre som ikke isoleres. 90 ml av en 1,0 M natriumborhydridløsning ble tilsatt raskt og reaksjonsblandingen ble deretter oppvarmet til 55°C i 2 timer, etter hvilket tidsrom utvikling av hydrogen var praktisk talt stoppet.

Reaksjonsblandingen ble kjolt til romtemperatur, 8 ml mercaptoethanol ble tilsatt og den således erholdte lysegule losning ble justert til pH 3,8 med iseddik på et pH-meter. Den resulterende blanke losning ble avkjolt ved 3°C over natten.

Et beige-farvet bunnfall inneholdende urenheter ble oppsamlet på en Buchnertrakt og det lyse stråfarvede filtrat ble omrort med 500 mg Norit A i 20 min. og filtrert. Fordampning ved redusert trykk ga en viskos olje. Det oljeaktige residuum ble grundig triturert med 900 ml kald ethanol og det ble derved erholdt en suspensjon av et hvitt, fast materiale som ble avkjolt i en time og deretter omrort i en time under isavkjoling. Det hvite, fnuggede bunnfall ble oppsamlet på en Buchnertrakt, vasket gjentatte ganger med kald ethanol, torket i 5 timer ved hoyvakuum og ble lagret i vakuum.

Produktet, N<5> -methyl-tetrahydrohomofolinsyre, fore-

lå innen de aksepterte kriterier for renhet.

Tynnskiktskromatograri: cellulose, losningsmiddelsystem: 0,1 M fosfatbuffer pH 7, 1% mercaptoethanol

Rf 0,80 avsluttet (quenching)

Claims (1)

1. Fremgangsmåo te ved fremstilling av N 5-methyl-tetrahydrohomofolinsyre fra homofolinsyre, karakterisert ved at a) homofolinsyre reduseres til tetrahydrohomofolinsyre i mørket med et lite overtrykk av hydrogen i nærvær av redusert platinaoxyd, b) tetrahydrohomofolinsyre omsettes umiddelbart med formaldehyd under dannelse av mellomproduktet 5,11-methylen-tetrahydrohomofolinsyre, c) den dannede 5,11-methylen-tetrahydrohomofolinsyre reduseres umiddelbart uten isolering med natriumborhydrid under dannelse av den ønskede N<5->methyl-tetrahydrohomofolinsyre som utvinnes ved utfelling av biprodukter med edikksyre ved pH 3,8, filtrering og avkjøling av filtratet over natten under dannelse av det ønskede produkt.