NO137095B - Fremgangsm}te ved fremstilling av methylcobalamin. - Google Patents

Description

Oppfinnelsen angår en fremgangsmåte ved fremstilling av methylcobalamin fra hydroxocobalamin eller cyanocobolamin.

Methylcobalamin er en kjent forbindelse, og det er også

kjent at denne forbindelse er avledet fra cyanocobalamin eller hydroxocobalamin ved å erstatte cyangruppen (CN) eller hydroxyl-gruppen (OH) med en methylgruppe (CH3). Det er videre kjent at disse cobalaminer kan anvendes for terapeutiske formål som be-rettiger administrering av vitamin B 12.

En fremgangsmåte ved fremstilling av methylcobalamin er dessuten kjent. Ifolge denne fremgangsmåte reduseres cyanocobalamin (vitamin B 12) eller hydroxocobalamin (vitamin B 12b)

for framstilling av det tilsvarende reduserte cobalamin (B 12s). Denne reduksjon utfores ved hjelp av natriumborhydrid i oxygenfri atmosfære, hvorefter det reduserte cobalamin (B 12s) omsettes med methyloxalat eller methyljodid for binding av methylgruppen til koboltatomet i det reduserte cobalamin B 12s.

Det er kjent at det reduserte cobalamins B I2s stabilitet

er dårlig, og under reduksjonen og spesielt for methylgruppen bindes til koboltatomet, overfores cobalaminet B 12s delvis til cobalaminet B 12r som er et mindre redusert cobalamin enn cobalaminet B 12s og som ikke er istand til å inngå binding med en methylgruppe.

For å unngå denne betydelige ulempe som påvirker utbyttet

av methylcobalamin, er det nodvendig å anvende overskudd av re-duksjonsmidler, men dette innebærer også en ulempe fordi det da er fare.for at cobalaminmolekylet angripes irreversibelt under

dannelse av nedbrytningsprodukter som er uheldige for renheten eller utbyttet av det onskede produkt.

Ved hjelp av den foreliggende fremgangsmåte unngås de ovennevnte ulemper samtidig som overforingen av cyanocobalamin eller hydroxocobalamin til methylcobalamin utfores under optimale be-tingelser og med betraktelig nedsatt risiko for dannelse av reduserte cobalaminforbindelser som ikke er istand til å "inngå binding med en methylgruppe, eller for dannelse av nedbrytningsprodukter av cobalamin.

Oppfinnelsen angår således en fremgangsmåte ved fremstilling av methylcobalamin ved samtidig reduksjon og methylering av hydroxocobalamin eller cyanocobalamin i en vandig, methanolisk opplosning i nærvær av sinkpulver og en methylester, og fremgangsmåten er særpreget ved at hydroxocobalaminet eller cyanocobalaminet opploses i en methanolopplosning som inneholder 5-20 volum- vann, og monomethyloxalat, et coboltsalt og sinkpulver tilsettes til opp-løsningen og-omsetningen får finne sted mens blandingen er utsatt for luft^ inntil reduksjonen og methyleringen er avsluttet.

Ved hjelp av denne fremgangsmåte er det mulig samtidig og

i den samme opplosning å gjennomfore en reduksjon og methylering. Derved nedsettes betraktelig varigheten av det reduserte cobalamin da dette methyleres efter hvert som det dannes.

Den foreliggende fremgangsmåte kan representeres ved hjelp av detfolgende reaksjonsskjerna:

hvori (1) representerer hydroxocobalamin, (2) det nascerende hydrogen dannet ved innvirkning av monomethyloxalatet på sinkpulveret, og (3) det reduserte cobalamin som straks methyleres med gruppen CH^ (<*>+) fra monomethyloxalatet med dannelse av methylcobalaminet (5). Det fremgår av det nedenstående at det reduserte cobalamin (3) ikke kan identifiseres i reaksjons-mediumet, og dets varighet er derfor meget kort.

Den i det sure methyloxalat frie syre forer til dannelse

av nascerende hydrogen ved omsetning med sinkpulveret, og methyl-oxalatets methylgruppe frigjores lettere under reduserende be-tingelser.

Ved den foreliggende fremgangsmåte utfores reduksjonen

og methyleringen i nærvær av organiske eller uorganiske koboltsalter, som koboltklorid, koboltnitrat og koboltoxalat.

Disse koboltsalter påskynder omsetningen og regulerer spesielt reaksjonsmediumets Rh. Derved reguleres også reduksjonen.

Hydroxocobalaminet er opplost I en opplosning av vann og methanol inneholdende 5-20 volum- vann. Tilstedeværelsen av vann letter den i methyloxalatet frie syres angrep på sinkpulveret.

Ved hjelp av den foreliggende fremgangsmåte hvor det anvendes opplesninger inneholdende ca. 50 g hydroxocobalamin pr. liter methanol, overfores hydroxocobalaminet praktisk talt kvantitativt til methylcobalamin på under 20 minutter. Reaksjons-forlopet kan folges ved hjelp av et spektrofotometer.

Dersom reaksjonen får fortsette utover 20 minutter, f.eks.

i inntil 1,5 time, viser de spektrofotometriske registreringer ikke noen vesentlig forandring av det dannede methylcobalamin. Det forekommer derfor ingen risiko for at methylcobalaminmolekylet skal odelegges når reduksjonen finner sted.

Reaksjonsforlbpet kan dessuten folges visuelt ved reduksjonen av hydrox'ocobalaminet og methyleringen av dette. Opplosningen som til å begynne med er rod, blir fiolett og derefter kastanje-brun og stabiliserer seg med denne farve.

Den'iakttatte blågrbnne farve ved den kjente fremstilling av methylcobalamin som tilskrives dannelsen av det reduserte cobalamin B 12s, forekommer ikke, og dette utgjor et bevis for at denne forbindelse har en meget kort levetid ved den foreliggende fremgangsmåte og methyleres efter hvert som den dannes.

Ifblge en fordelaktig utforelsesform av den foreliggende fremgangsmåte utfelles det dannede methylcobalamin ved tilsetning av 3~5 volumdeler aceton.

Det utfelte og utvundne methylcobalamin opploses fortrinns-vis i en meget liten mengde vann, hvorefter en sterk base tilsettes inntil det fås en pH av ca. 9, blandingen filtreres, 6-8 volumdeler aceton settes til det erholdte filtrat og den erholdte opplosning får henstå for utkrystallisering.

Tilsetningen av den sterke base bevirker at saltene av sink eller kobolt utfelles som ellers ville ha holdt seg i opplosning.

Det således erholdte methylcobalamin kan gjenopploses og ledes over en harpiksionebytter for å fjerne eventuelle spor av hydroxocobalamin, hydratisert cobalaminklorid eller cobalaminoxa-lat.

Efter denne rensing kan methylcobalaminet rekrystalliseres i aceton.

Det ved hjelp av den foreliggende fremgangsmåte fremstilte

methylcobalamin kan karakteriseres ved sammenligning av den spesifikke elektriske motstand til en konsentrert opplosning av methylcobalamin i avionisert vann med den spesifikke elektriske motstand til avionisert vann som sådant, hvorved innholdet av ioner i det

fremstilte methylcobalamin kan bedommes.

Methylcobalaminet kan også identifiseres ved spektrofoto-metri. Absorpsjonsspektrumet fo.r en noytral eller basisk opplosning av methylcobalamin viser topper ved de folgende bølge-lengder: 267, 3^3 og 525 nm.

Forholdet mellom absorpsjonen ved 267 nm og 525 nm til absorpsjonen ved 3^3 nm er hhv. 1,'+ og 0,65, og absorpsjonen for en opplosning inneholdende 100 y methylcobalamin pr. cm^ til-

• svarer 1^-6-267 nm.

Absorpsjons spektrumet for en sur opplosning av methylcobalamin er annerledes. Den maksimale absorpsjon forekommer ved 300 og !+70 nm. Dessuten er noytrale eller basiske oppløsninger av methylcobalamin rosa mens de sure oppløsninger er gule.

Eksempel 1

1 g hydroxocobalamin ble opplost i 20 cn<H> methanol og 2 cm<J >vann. 5 g surt methyloxalat ble satt til denne opplosning, og blandingen ble omrort inntil opplosningen var fullstendig, hvorefter 0,5 g koboltklorid og h g findelt sinkpulver ble tilsatt.

Omrøringen ble fortsatt i 1 time, hvorefter opplosningen ble filtrert for å fjerne sink eller uoppløselige sinksalter fra reaks jonsblandingen.

80 cm^ aceton ble tilsatt for å utfelle methylcobalaminet,

og utfellingen ble utfort kaldt i 12 timer.

Blandingen ble derefter filtrert gjennom et sintret glass-filter, og det utvundne bunnfall ble gjenopplost i 25 cm^ vann, hvorefter 200 cm^ aceton ble tilsatt. Opplosningen ble utkrystallisert kaldt i lopet av 12 timer. De utvundne krystaller ble efter filtrering vasket'med aceton og derefter torket under vakuum ved omgivelsestemperatur.

Det ble erholdt 0,7 g methylcobalam: n som i en noytral eller basisk opplosning bevirket at denne fikk en rosa farve og i en sur opplosning at denne fikk en gul farve.

På tegningen er vist de erholdte spektrofotometriske avles-ninger, og på tegningen representerer kurven 1 det i noytralt eller basisk miljo erholdte absorpsjonsspektrum og kurven 2 det i surt miljo erholdte absorpsjonsspektrum. De høyeste absorpsjonsverdier forekommer ved bølgelengder av ca. 520, 3<1>+3 og 267 nm for en noytral eller basisk opplosning av methylcobalamin.

Det fremgår også av tegningen at absorpsjonsverdiene ved

267 og 525 nm i forhold til absorpsjonsverdien ved 3^-3 nm er hhv. 1,^3 og'0,63.

Det kan dessuten av kurvene utledes at hydroxocobalamin ikke er tilstede i opplosningen av methylcobalamin da det mellom pH k- og pH 9 ikke forekommer de trinn som er særpregede for en opplosning av

hydroxocobalamin.

Eksempel 2

cmJ 3 van1n0 .g hydroxocobalamin ble opplost i 200 cmJ ■3 methanol og 15

^5 g surt methyloxalat ble satt til opplosningen som ble omrort inntil opplosningen var fullstendig, og derefter ble h g kobolt - klorid og 35 g findelt sinkpulver tilsatt.

Omroringen ble fortsatt i 1 time, hvorefter opplosningen ble filtrert for å fjerne sink eller uoppløselige sinksalter fra reaks jonsblandingen.

h volumdeler aceton ble satt til filtratet under omroring fc å utfelle methylcobalaminet og utfellingen ble foretatt kaldt i lbpet av h timer. .Blandingen ble filtrert på en Buchner-trakt, og det utvundne bunnfall ble gjenopplost i en meget liten mengde vann.

Til denne opplosning ble langsomt og i overensstemmelse med opplosningens pH tilsatt en 5 N natriumhydroxydopplosning inntil c ble oppnådd en pH av 9,2 for å utfelle sinkhydroxyd eller kobolt-hydroxyd som ellers ville ha holdt .seg i opplosning.

Blandingen fikk henstå kald i 2 timer og ble derefter filtre på en Buchner-trakt. 2 1 aceton ble satt til filtratet, og opplosningen ble'utkrystallisert kaldt i lbpet av h timer.

De utvundne krystaller ble efter filtrering vasket i aceton

i ether og derefter tbrket under vakuum ved omgivelsestemperatur.

Det ble erholdt 8,5 g methylcobalamin inneholdende 17% fukl

het.

Det erholdte produkt ble kontrollert ved måling av den spes: fikke elektriske motstand til en opplosning av 5000 y methylcobalamin pr. cm^ avionisert vann.

Den målte spesifikke elektriske motstand var hbyere enn 100( ohm/cm. Dette resultat viser at det i opplosningen ikke forekomme ioner som kunne ha skrevet seg fra den sink eller kobolt som ble :

fort.i reaksjonsblandingen.

Den ovennevnte opplosning efter fortynning til 50 Y methylcobalamin pr. cm 3 viste ved spektrofotometriske malinger de hby-este absorpsjonsverdier ved en bblgelengde av 267, 3^3 og 520 nm, tilsvarende de resultater som ble oppnådd med rent methylcobalamin.

Det fremgår av de ovenstående eksempler at den foreliggende fremgangsmåte ved fremstilling av methylcobalamin er meget enkel å gjennomfore.

Det erholdes et rent methylcobalamin takket være en fullstendig regulert reduksjon av hydroxocobalaminet idet det anvendes et reagens bestående av surt methyloxalat som ved den foreliggende fremgangsmåte spiller en dobbeltrolle ved at det på den ene side utgjor en syre som er istand til å bevirke dannelse av nascerende hydrogen ved omsetning med sinkpulveret, og ved at det på den annen side av-gir frie methylgrupper som kan inngå binding med det reduserte cobalamin.

Det reduserte cobalamin methyleres således efter hvert som det dannes, og derved unngås at dette blir for sterkt redusert eller at det tvertimot omdannes til et mindre redusert cobalamin som ikke er istand til å inngå binding med methylgruppen.

Den foreliggende fremgangsmåte utfores således i ett trinn og er derfor meget hurtig og gjor det mulig å oppnå et meget rent produkt.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av methylcobalamin ved samtidig reduksjon og methylering av hydroxocobalamin eller cyanocobalamin i en vandig,methanolisk oppløsning i nærvær av sinkpulver og en methylester, karakterisert ved at hydroxocobalaminet eller cyanocobalaminet oppløses i en methanol-oppløsning som inneholder 5-20 volum% vann, og monomethyloxalat, et coboltsalt og sinkpulver tilsettes til oppløsningen og omsetningen får finne sted mens blandingen er utsatt for luft, inntil reduksjonen og methyleringen er avsluttet.