NO136204B - - Google Patents

Abstract

Fremgangsmåte for fremstilling av proteaseinhibitoren plasminostreptin.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte til

fremstilling av plasminostreptin, en ny proteaseinhibitor.

Under forsøkene på å finne nye proteaseinhibitorer fra mikrobielle kilder som kunne brukes medisinsk, har man gjennom-ført utstrakte studier og gransket en rekke mikroorganismer fra forskjellige jordprøver og funnet at flere arter av slekten Streptomyces er istand til å akkumulere en forbindelse som i sterk grad inhiberer virkningen av plasmin, trypsin og visse alkaliske proteaser. Ved videre undersøkelser har man blitt i stand til å isolere denne forbindelse som krystaller. Man har kalt denne forbindelsen "plasminostreptin" og etter ytterligere granskning funnet en fremgangsmåte .for å fremstille denne

forbindelse.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det således til-veiebragt en fremgangsmåte til fremstilling av proteaseinhibitoren plasminostreptin, og denne fremgangsmåte er kjennetegnet ved at man dyrker en mikroorganisme av arten Streptomyces antifibrinolyticus under aerobe betingelser i et dyrkningsmedium som inneholder en assimilerbar karbonkilde og en fordøyelig nitrogenkilde, og utvinner plasminostreptin fra mediet.

Arten Streptomyces antifibrinolyticus kan isoleres relativt lett fra jordprøver i henhold til fibrinplate-metoden. Man kan således dyrke en Streptomyces-organisme som er isolert ved hjelp av et vanlig agarmedium for isolering av en stamme av slekten Streptomyces, og denne dyrkes i et flytende medium, hvoretter den plasmininhiberende virkning av den resulterende kultur bestemmes på en fibrinplate hvor fibrin funksjonerer som substrat for plasmin (fibrinolysin).

De plasminostreptinproduserende organismer som er isolert fra jordprøver etter ovenstående fremgangsmåte omfatter blant andre Streptomyces antifibrinolyticus nr. 10123 (IFO 13298), nr. 15807 (IFO 13507) og nr. 21211 (IFO 13508). Disse tre stammer ble isolert fra jordprøver tatt ved henholdsvis Nagao-kakyo, Kyoto, Japan, ved Nishinomiya, Hyogo, Japan og Iyomishima, Ehime, Japan.

Stamme nr. 10123 har følgende mikrobiologiske egenskaper :

1. Morfologiske egenskaper:

Substrat: glukose-asparagin-agar: (28°C, 14 dager)

Rikelig og voluminøst mycel i luften.

Hovedgrenene utvikles godt og er ujevnt forgrenet.

Det dannes en åpen spiral ved enden av hver conidofor som bærer mange sporer i kjede. Sporene er kuleformet til ovale og har glatt overflate. Sporestørrelse: 0,6-1,3 x 0,7-1,5

mikron, hyfebredde: 0,3 — 1,3 mikron.

2. Egenskaper for dyrkningsmediet:

(1) Glukose - asparagin-agar:

Luftmycel: gråhvitt med skygge av brunt.

Substratmycel: gulbrunt til mørkebrunt.

Oppløselig pigment: lyse-gulbrunt.

(2) Glycerol-asparagin-agar:

Luftmycel: gråhvitt med knapt skjelnbart strøk av brunt. Substratmycel: gulbrunt med tone av grått.

Oppløselig pigment: sparsomt, lyse-gulbrunt.

(3) Stivelses-agar:

Luftmycel: sparsomt, gråhvitt.

Substratmycel: gulbrunt.

Oppløselig pigment: uanseelig.

(4) Nærings-agar:

Luftmycel: uanseelig.

Substratmycel: lysebrunt med skygge av grått.

Oppløselig pigment: ubetydelig.

(5) Gjær-malt-agar:

Luftmycel: gråhvitt med stenk av brunt.

Substratmycel: gulbrunt med stenk av grått.

Oppløselig pigment: ubetydelig.

(6) Hvetemel-agar:

Luftmycel: gråhvitt med stenk av brunt.

Substratmycel: gulbrunt med stenk av grått.

Oppløselig pigment: ubetydelig.

(7) Glukosebuljong:

En ringdannelse på rørveggen, med sedimenter.

Oppløselig pigment: brunt.

3. Fysiologiske egenskaper:

(1) Maksimal vekst ved 25-30°C, dårlig vekst ved 37°C, i det vesentlige ingen vekst ved 45°C.

(2) Gelatin: flytendegjort.

(3) Stivelse: hydrolysert.

(4) Melanoidpigmenter: produseres i det vesentlige ikke.

4. Utnyttelse av karbonkilder:

L-arabinose, D-glukose, sukrose, inositol, L-rhamnose og D-mannitol brukes til veksten; utnyttelse av D-xylose, D-fruktose og raffinose er tvilsom.

Sammenligning av de ovenfor angitte bakteriologiske egenskaper med egenskapene til kjente Streptomyces-arter som f.eks. beskrevet i Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, 7. utgave (1957) viser ingen mikroorganismer som fullstendig kan identifiseres med stammen i foreliggende oppfinnelse. Blant kjente Streptomyces-arter som er beskrevet, synes bare Streptomyces aureus å ligne denne stamme når det gjelder følgende egenskaper: (1) konidioforene danner åpne spiraler, (2) de er av kroraogen type og luftmyceliet er gråaktig på syntetisk agar. Stammen adskiller seg imidlertid klart fra Streptomyces aureus ved at dens luftmycelium er rikelig og fnuggaktig med velutviklet hovedstamme og også ved at substratmyceliet nesten alltid er gulbrunt på syntetiske media. Man har således bestemt at den aktuelle stamme er av en ny art og man har betegnet den Streptomyces antifibrinolyticus.

Ettersom de to andre stammer nr. 15807 og 21211 deler mange trekk med nr. 10123, bortsett fra enkelte små forskjeller i fargen på luftmycelet og substratmycelet på gjær-malt-agar, kan sistnevnte også identifiseres som stammer av samme arten.

De nevnte tre stammer er innlevert til Institute for Fermentation (Osaka), Japan, med deponeringsnummere 13507, 13508 og 13298, respektivt.

Ved foreliggende fremgangsmåte blir en plasminostreptin-produserende stamme av Streptomyces antifibrinolyticus dyrket aerobt i et kulturmedium.

Selv om mediet kan være et hvilket som helst fast eller flytende medium, er det vanligvis en fordel å benytte flytende medium og dyrke mikroorganismen i rystekultur eller dyppekultur. Sammensetningen av mediet er valgfri, idet det eneste krav er at den plasminostreptin-produserende stamme kan vokse på mediet og utvikle og oppsamle plasminostreptin.

Man kan på denne måten benytte som karbonkilder ingre-dienser som glukose, glycerol, stivelse, sukrose, dekstrin, melasse, organiske syrer osv., og. som nitrogenkilder bestanddeler som proteinhydrolysater av typen pepton, kasaminosyrer "N-Z-amin A" osv., kjøttekstrakt, gjærekstrakt, soyabønnekake, maisbløt-ningsvann, aminosyrer, ammoniumsalter, nitrater og andre organiske og uorganiske nitrogenholdige stoffer.

Som uorganiske salter kan man tilsette forskjellige fosfater, magnesiumsulfat, natriumklorid, etc. I tillegg kan man for å befordre veksten av mikroorganismen tilsette forskjellige vitaminer, nukleinsyrebeslektede stoffer, osv. Avhengig av den valgte dyrkningmetode og betingelsene kan man også benytte anti-skummidler som silikonoljer, propylenglykolderivater eller soya-bønneolje for å oppnå økt akkumulering av plasminostreptin.

Det er gunstig å dyrke mikroorganismen i en mindre forkultur og deretter inokulere mediet med denne kultur.

Dyrkningsbetingelsene omfatter temperatur, inkuberings-tid og mediets pH og kan velges og reguleres slik at man oppnår maksimal akkumulering av plasminostreptin.

I mange tilfeller er det gunstig å gjennomføre en luftekultur ved 20-37°C i 1-6 dager, hvor mediets pH holdes på 4,0-9,5 i inkuberingsperioden.

Det kulturmedium som fåes ved dyrkning av en plasminostreptin-produserende stamme inneholder plasminostreptin. Når det benyttes et flytende medium, oppsamles en overveiende del av det utviklede plasminostreptin i væskefasen. Det er derfor en fordel å fjerne mycelet fra buljongen ved filtrering eller sentrifugering og deretter opparbeide plasminostreptinet fra filtratet eller den ovenstående væske. Dette betyr ikke at man ikke kan separere plasminostreptinet direkte fra kulturmediet og hoppe over mycelfjerningen. Separering og rensing av plasminostreptinet fra kulturmediet kan lett gjennomføres ved en egnet kombinasjon av teknikker som er kjent i og for seg, idet kombinasjonen avhenger av plasminostreptinets kjemiske og fysikalske egenskaper. Man kan f.eks. benytte slike teknikker som utfelling med et egnet uorganisk salt som ammoniumsulfat, isoelektrisk utfelling i nær-heten av plasminostreptinets isoelektriske punkt, dvs. ved en pH på ca..6, utfelling med vannblandbare organiske oppløsningsmidler som aceton, gelfiltrering i kolonner av forskjellige typer inneholdende dekstrankuler som "Sephadex", ionevekslerkromatografi med slike ionevekslere som "DEAE"-cellulose (Midorijuji), "DEAE-Sephadex" etc; adsorbsjonskromatografi på forskjellige adsorb-sjonsmidler som aktivert kull, silisiumdioksydgel, "Asmit", etc; dialytisk fjerning av forurensninger med lav molvekt ved hjelp av f.eks. en egnet halvgjennomtrengelig membran som cellofanfolie og lignende. Man kan naturligvis i tillegg til de ovenstående metoder benytte andre rensingsprosesser som er egnet i henhold til plasminostreptinets karakter. Ved å benytte disse teknikker i egnet kombinasjon, kan man opparbeide plasminostreptinet fra kulturmediet i ønsket renhet. Det endelige rensede produkt kan fåes i krystallinsk tilstand.

Det krystallinske preparat av plasminostreptin som er fremstilt i henhold til eksempel 1 i det følgende, har følgende fysikalsk kjemiske egenskaper:

1. Utseende: hvite krystaller.

2. Molvekt: 26.000 + 2.000.

bestemt i 0,1M natriumklorid i henhold, til Archibalds ultrasentri-fugemetode (Journal of Physical and Colloid Chemistry, 51, 1204

(1947)), 25.000 - 2.000 bestemt i 0,05 M tris(hydroksymetyl)-aminometan-hydrokloridpuffer (i det folgende kalt Tris-HCl-puffer), 0,1 M kaliumklrid i henhold til Andrews gelfiltrerings-metode (Biochemical Journal, 91, 222 (1964)) på "Sephadex G-75" og • "Sephadex G-100". Når molekylvekten måles i visse opplosningsmidler,faller imidlertid molvekten til ca. halvparten av ovenstående verdi som det fremgår av tabell 1. 3. Sedimenteringskonstant. Sedimenteringskonstanten (S 20,w) målt ved ultrasentri-fugering i en syntetisk ramme-celle er 2,5 - 0,3 S i 0,1 M natriumklorid og 1,2 - 0,3 S i 4 M guanidinhydroklorid respektivt. Sistnevnte prove som gav en sedimenteringskonstant på 1,2 - 0,3 S ble målt igjen etter dialyse ved 5°C mot hundre ganger så stort volum 0,1 M natriumklorid og gav da en sedimenteringskonstant på 2,5 t 0,3 S.

4. Elementæranalyse.

C 51,48 2,0 %, H 6,96 - 0,5 %, N 16,63 i 1,0 %,

S 1,84 <±> 0,5 %.

5. LW^ = -9°°> ca. (1 %, svakt alkalisk vann).

6. Isoelektrisk punkt: ca. 6,3 målt ifolge den isoelektriske fokuseringsmetode fra Acta Chemica Scandinavica, 20, 820 (1966). 7. UV-absorbsjon: I 0,05 !#>ig opplosning i 0,1 M natriumklorid oppnås maks.absorbsjon ved 283 nyu, min.absorbsjon ved 267 nyu, skulder ved 288 - 291 nyu (fig. 1).

8. IR-absorbsjon (fig. 2):

De tydelige absorbsjonsbånd i KBr-skive er som folger (frekvens (cm""*")): 3280, 3070, 2960, 1670, 1640, 1530, 1400, 1240, 1160. 9. Komponenter: Hydrolysert i 100 volumdeler 6N-HC1 ved 105°C i 24 timer gir krystallene folgende aminosyrer: alanin, valin, glycin, threonin, asparaginsyre, glutaminsyre, leucin, fenyl-alanin, arginin, prolin, serin, cystin (cysteinsyre), lysin, tyrosin, histidin og metionin. Isoleucin kan ikke oppdages. Ettersom tryptofan dekomponeres under disse betingelser ble denne aminosyren funnet ved hjelp av UV-absorbsjon (Biochemical Journal 40, 628 (1946)), mens de andre aminosyrer ble analysert kvantita-tivt i aminosyreanalysator. Resultatet fremgår som et middel av tre eksperimenter i tabell 2. ;10. Fargereaksjon: ;Hypoklorittreagens: positiv ;"Folin-Ciocalteu"-reagens: positiv ;11. Opploselighet: Opploselig i vann og vandig ammoniakk, noe opploselig i pyridin, men bare lite opploselig i iseddik, alkoholer, aceton, kloroform, eter, heksan og andre organiske opp-losningsmidler. I vandig opplosning utfelles plasminostreptin praktisk talt fullstendig av ammoniumsulfat i 60 % metning og opp-loseligheten faller i nærheten.av pH 6. ;12. Stabilitet: ;Mer enn 50 % av opprinnelig aktivitet blir intakt selv etter 30 minutters behandling ved pH 4 - 9 ved 100°C. ;13. Dialytiske egenskaper: ;Opplost i vann (pH 8,0) til en konsentrasjon på 10 mg/ml og'dialysert i cellofanpose mot ti ganger så stort volum vann (pH 8,0) ved 4,0°C i 24 timer under roring forble praktisk talt all aktivitet i den indre opplosning. ;De fysikalsk kjemiske egenskaper til plasminostreptin-krystallene er nevnt ovenfor. I det folgende gis en detaljert beskrivelse av den protease-inhiberende virkning av den fremstilte forbindelse. ;Nedenfor oppregnes de forbindelser og fremgangsmåter man har benyttet ved bestemmelse av plasminostreptinets protease-inhiberende aktivitet. ;1. Proteaser ;(1) Plasmin-SK: Euglobulinfraksjonen fra menneskeblodplasma opploses i puffer (1) beskrevet nedenfor og aktiveres deretter med streptokinase (Lederle) (Årsrapport fra Takeda-Forskningslaboratorier, 28, 140 (1969)). ;(2) Plasmin - UK • (Midorijuji, urokinase-aktivert plasmin) ;(3) Trypsin (Sigma, krystallinsk, type III) ;(4) Fusarium. - krystallinsk alkalisk protease (U.S. patent nr. 3.652.399) ;(5) Nagarse (krystallinsk protease, Nagase Sangyo) ;(6) Trombin (Mochida) ;2. Substrater ;(1) Fibrinogen (Armour, kvegfraksjon I) ;(2) Kasein (Merck, Hammarsten-kasein) ;3. Puffere ;(1) 0,02 M Tris-HCl-puffer - 0,145 M natriumklorid (pH 7,4) ;(2) 0,02 M Tris-HCl-puffer (pH 7,4) ;(3) 0,1 M glycin - NaOH-puffer (pH 10,5) ;4. Analysemetoder. ;(1) Plasmin-fibrin-systemet (fibrinplatemetoden): ;10 ml fibrinogenopplosning (1 % puff er (1)) fylles i en petriskål (9 cm i diameter) og bringes til å stivne ved tilsetning av 0,2 ml trombin (50 J.P-enheter (Japanese Pharmacopeia-enheter)' /ml, 0,145 M natriumklorid). Denne gel hensettes ved 30°C i 30 minutter for fremstilling av en fibrinplate. I mellomtiden dyppes små runde papirskiver (8 mm diameter, vannabsorbsjonskapasitet: 0,025 ml) i en plasminostreptinopplosning av varierende konsentrasjon og torkes på filtrerpapir i luft. ;Derpå dryppes 0*015 ml plasmin-SK-opplosning på hver av skivene som anbringes på ovenstående fibrinplate. Etter at systemet har stått ved 37°C i 5 - 10 timer bedommes dannelsen av en lyse-sone. Plasminostreptinets plasmin-inhiberende virkning tas som den konsentrasjon av plasminostreptinopplosning som kreves for fullstendig inhibering av fibriholyse. (2) Plasminfibrin-system (bestemmelse av klump-opplosnings-tiden): I et lite reagensglass fylles 0,4 ml. fibrinogenopplosning (0,25 %, puff er (1), 0,3 ml puffer (l) og 0,1 ml plasminostep-tinopplosning av varierende konsentrasjoner, fulgt av tilsetning av 0,1 ml plasmin-UK-opplosning (0,8 kaseinenheter/ml, puffer (1)). Blandingen blandes godt og umiddelbart etterpå tilsettes 0,1 ml trombinopplosning, (50 J.P.-enheter pr. ml, 0,145 M natriumklorid). Den resulterende gel settes tilside ved 37°C og man bestemmer den nodvendige tid for opplosning (lysis) av klumpen. Den plasmin-inhiberende aktivitet av plasminostreptinet bestemmes etter fremgangsmåten som er anfort i Biochimica Biophysica Acta, 214, 411

(1970). Således bestemmes den mengden plasminostreptin som kreves for 50 % inhibering av virkningen av 0,08 kaseinenheter i plasmin-UK som finnes i reaksjonsblandingen, ut fra den konsentrasjon av plasminostreptin som vil fordoble klump-lyse — tiden i fravær av plasminostreptin, og ovenstående mengde oppfores som TD r- n-enheter.

50

(3) Plasmin-kasein-system:

Man fyller på et reagensglass 1 ml kaseinopplosning

(4 %, puffer (2)), 0,5 ml puffer (2) og 0,3 ml plasminostreptinopplosning av forskjellige konsentrasjoner, fulgt av tilsetning

av 0,2 ml plasmin-UK-opplosning (2 kaseinenheter pr. kl, puffer (2)). Blandingen rystes godt og hensettes ved 37°C i 20 minutter. Reaksjonen avsluttes ved tilsetning av 2 ml 1,7 M perklorsyre og systemet hensettes ved romtemperatur i ytterligere 1 time. Reaksjonsblandingen filtreres gjennom filtrerpapir og man måler absorbsjonen for filtratet ved 280nyu„

Plasminostreptinets plasmin-inhiberende aktivitet bestemmes. Man bestemmer således den mengde plasminostreptin som kreves for 50 % inhibering av aktiviteten for 0,4 kaseinenheter av plasmin-UK i fravær av plasminostreptin, på basis av TD^ q-enheter'.

(4) Trypsin-kasein-system:

Man fyller på et reagensglass 1 ml kaseinopplosning

(2 %, puffer (2)), 0,5 ml puffer (2) og 0,3 ml plasminostreptinopplosning av varierende konsentrasjon, og etter tilsetning av 0,2 ml trypsinopplosning (50 ^ug/ml, puffer (2)) blandes blandingen grundig og hensettes under samme betingelser som ovenfor beskrevet til plasminkasein-systemet. Som ovenfor beskrevet bestemmes deretter den mengden plasminostreptin som kreves for 50 % inhibering av virkningen av 10 ^ug trypsin i fravær av plasminostreptin, og oppsettes i ID^Q-enheter. (5) Fusarium-alkaliprotease - kaseinsystem og Nagarse - kasein-system:

Man fyller et reagensglass med 1 ml kaseinopplosning,

(2 %, puffer (3)), 0,5 ml puffer (3), og 0,4 ml plasminostreptinopplosning av varierende konsentrasjoner og etter tilsetning av 0,1 ml av enten en Fusarium-alkaliprotease-opplosning (40 ^ug/ml, puffer (3)) eller Nagarse-opplosning (100 ^ug/ml, puffer (3)),

blandes blandingen grundig og hensettes på samme måten som beskrevet for piasmin-kasein-systemet. Videre på samme måten som beskrevet ovenfor bestemmes den mengde plasminostreptin som kreves for 50 % inhibering av aktiviteten for 4 ^ ug Fusarium-alkaliprotease og 10 yug Nagarse i fravær av plasminostreptin, respektivt, og oppfores som enheter av IDcri.

Plasminostreptinets aktivitet med hensyn til inhibering av plasmin, trypsin og alkaliprotease, målt i henhold til ovenstående fremgangsmåter fremgår av tabell 3-

Inhibering av kallikrein-aktivitet (Beyer, Depot - Padutin) med plasminostreptin finner praktisk talt ikke sted. F.eks. skjedde 50 % inhibering av esterase-aktiviteten av 0,8 bio-logiske enheter av nevnte kallikrein mot benzoylargininetylester

ikke med mindre enn 800 ^ug plasminostreptin.

Man tok "blodprover av fem rotter (hannrotter SD, 7 uker gamle) for administrasjon av plasminostreptin og også 1 time etter intravenos administrasjon av 0,8 mg plasminostreptin. Man separerte plasma fra hver av blodprbvene og tilsatte ovennevnte plasmin-UK-opplosning til hver plasmaprove i' forskjellige konsentrasjoner.

Umiddelbart etterpå ble aktiviteten for plasmin i hver plasmaprove målt med kasein som substrat. Plasminaktiviteten for blodplasmaprover fra hver rotte for og etter administrasjon av plasminostreptin ble sammenlignet. Resultatene viser at plasminaktiviteten blir signifikant inhibert ved administrasjon av plasminostreptin. Inhiberingsgraden for plasminaktiviteten målt etter tilsetning av 100 kaseinenheter plasmin-UK til 1 ml plasmaprove er 3 - 35 % (18 % i middelverdi)

Plasminostreptinets toksisitet er ekstremt lav og dets LD^Q-verdier målt i henhold til akutt toksisitets-prover på mus ligger på over 5 g/kg oralt, over 5 g/kg intraperitonealt og 2-3 g/kg intravenbst.

Plasminostreptinet karakteriseres ved en utpreget tendens til å inhibere den proteolytiske virkning av plasmin og trypsin og kan finne utstrakt bruk innen medisinen, f.eks. som forebyg-gende og terapeutiske midler i forbindelse med forskjellige pan-kreas-sykdommer, betennelser, utvendige sår og blbdninger basert på fibrinolysinemi som kan avhjelpes spesielt med f.eks. obstre-tiske, urinologiske eller kirurgi-ske inngrep.

Doseringsveien og de anvendte doser til medisinsk bruk varierer med typen sykdom, graden av symptomer, osv., men typisk benyttes plasminostreptin topisk eller ved injeksjon eller dråpe-infusjon. Ved intravenos drypping kan ca. 5 mg til ca. 5 g pr. dag gis til voksen pasient i flere dager.

Man har ovenfor beskrevet fremgangsmåten for fremstilling, de fysikalsk kjemiske egenskaper, de protease-inhiberende virkninger og anvendelser av plasminostreptin, en ny proteaseinhibitor som med hell er isolert fra kulturer

av stammer av Streptomyces antifibrinolyticus og er renset

til krystallinsk form av foreliggende opp-

finnere. I det folgende gis eksempler på fremstilling av denne inhibitor.

I disse eksempler står "vektdeler" i samme forhold til "volumdeler" som "gram" til "ml", og prosentanigivelser er be-regnet på basis av vekt pr. volum.

Eksempel 1

Streptomyces antifibrinolyticus nr. 10123 (IFO 13298) soia er dyrket ved 28°C i 7 dager på agar-medium (pH 7,3) inneholdende 1 % glukose, 0,1 % gjærekstrakt, 0,1.% kjottekstrakt, 0,2 % "N-Z-amin A'-' (Sheffield) og 2 % agar, brukes til inokulering av 40 volumdeler væskemedium (pH 7,0) inneholdende 1 % glukose, 1 % peton, 0,7 % kjottekstrakt, 0,3 % natriumklorid og 0,2 % kalium-monohydrogenfosfat i en kolbe som rommer 200 volumdeler. Systemet inkuberes i roterende rystemaskin ved 28°C i 2 dager og den resulterende kultur overfores til en gjæringsbeholder med volum 2000 deler og inneholdende 500 volumdeler av det samme medium som ovenfor.

Systemet inkuberes under luftgjennombobling og roring ved 28°C i 2 dager og man får 500 volumdeler kulturmedium. Dette medium benyttes til inokulering av 30.000 volumdeler av det samme medium som ovenfor i en fermentor med kapasitet 50.000 volumdeler med tilsetning av 50 vektdeler antiskummiddel, og i denne beholder gjennomføres en dyppekultur ved 28°C i 48 timer.

Etter avsluttet dyrking filtreres kulturbuljonen gjennom en filterpresse inneholdende diatomé-jord som filterhjelpestoff og man får 28.000 volumdeler filtrat. Man tilsetter krystaller av ammoniumsulfat til filtratet inntil 60 % metning og systemet rores ved romtemperatur i ca. 3 timer. Fellingen opparbeides ved filtrering gjennom en filterpresse ved hjelp av "Hyflo Super Cel". Filterkaken inneholder "Hyflo Super Cel". Etter tilsetning av svakt alkalisk vann rores kaken ut i en beholder og filtreres. Filtratet opptas og kaken vaskes med vann. Man gjentar ovenstående fremgangsmåte og filtratene samles (10.000 volumdeler)

og konsentreres under nedsatt trykk ved 50°C til 2.000 volumdeler. Konsentratet dialyseres mot rennende vann i cellofanpose i 2 dager. Etter at ammoniumsulfatet er fjernet absorberes residuet på en kolonne av "DEAE"-cellulose som på forhånd er behandlet med 0,5 N saltsyre og 0,5 N natriumhydroksyd og deretter vasket grundig med vann. Kolonnen vaskes med vann og derpå elueres det aktive stoff med 0,05 M natriumklorid. De aktive fraksjoner oppsamles og frysetorkes og man får et pulver som er hvitt med et stenk av gult.

Pulveret opploses i destillert vann og oppløsningen fores gjennom en kolonne "Sephadex G-15".

De aktive fraksjoner oppsamles, konsentreres og hensettes for utfelling av krystaller. Krystallene frafiltreres og moder-luten konsentreres for utvinning av flere krystaller. Krystallene opploses i svakt alkalisk vann til en konsentrasjon på 3 - 5 %.

Oppløsningen innstilles på pH ca. 6 og man lar blandingen stå ved romtemepratur hvorved det faller ut krystaller på nytt.

Disse krystaller frafiltreres og vaskes flere ganger med destillert vann ved pH 6 og torkes. Fremgangsmåten gir 1,8 vektdeler krystallinsk plasminostreptin. Det ovenstående krystallinske produkt gir et enkelt bånd ved skive-elektroforese på polyakryl-amidgel og en enkelt topp ved ultrasentrifugeanalyse. Man finner videre at konsentrasjonen av dette produkt for oppnåelse av fullstendig fibrinolyse—inhibering i henhold til fibrinplatemetoden som er beskrevet tidligere ligger på 20 yug pr. ml.

Eksempel 2

Streptomyces antifibrinolyticus nr. 15807 (IFO 13507) som er dyrket ved 28°C i 5 dager på agar-medium (pH 7,3) inneholdende 1 % maltose, 0,1 % gjærekstrakt, 0,1 % kjottekstrakt, 0,2 % <;>iN-Z-amin A" (Sheffield), 2 % agar, brukes til inokulering av 40 volumdeler flytende medium (pH 7,0) inneholdende 1 % glukose, 1 % pepton, 0, 7 % kjottekstrakt, 0,3 % natriumklorid og 0,2 % kalium-monohydrogenfosfat i en kolbe som rommer 200 volumdeler. Systemet inkuberes i roterende rystemaskin ved,.-28°C i 3 dager og det dannede medium overfores til en gjæringsbeholder med volum 2000 deler og inneholdende 500 volumdeler av samme medium som ovenfor.

Fermentoren inkuberes under luftgjennomblåsing og roring ved 28°C i 3 dager og man får 500 volumdeler dyrkningsmedium. Dette medium brukes til inokulering av en gjæringsbeholder med 50.000 volumdelers kapasitet og inneholdende 30.000 volumdeler av det samme væskemedium som ovenfor, idet man tilsetter 50 vektdeler antiskummiddel og gjennomforer' dyrkingen som dyppekultur ved 28°C i 60 timer. Kulturmediet overfores til et gjæringskar som har rominnhold 2 millioner volimdeler og inneholder 1 million volumdeler av det samme væskemedium idet man tilsetter 500 vektdeler av samme antiskummiddel og fortsetter dyrkingen ved 28°C i 60 timer under luftgjennomblåsing og roring.

Etter avsluttet dyrking filteres kulturmediet gjennom

en filterpresse med diatomé-jord. som filterhjelpestoff og man får 980.000 volumdeler filtrat. Man tilsetter krystaller av ammonium-sulf at til ovenstående filtrat inntil 60 % metning og systemet rores ved romtemperatur i ca. 3 timer. Fellingen opparbeides ved filtrering gjennom filterpresse ved hjelp av "Hyflo Super Cel". Man tilsetter til filterkaken 50.000 volumdeler vann under roring og filtrerer på nytt. Man gjentar fremgangsmåten og filtratene oppsamles (100.000 volumdeler).

Ammoniumsulfatkrystaller tilsettes til de samlede fil-trater inntil 60 % metning. Systemet filtreres og kaken vaskes to ganger med 15.000 volumdeler vann og filtreres. Filtratene slås sammen og kromatograferes på en kolonne av "DEAE"-cellulose med volum 3.000 deler som på forhånd er behandlet med 0,5 N saltsyre og 0,5 N natriurnhydroksyd og deretter grundig vasket med vann, og kolonnen vaskes igjen med 10.000 volumdeler vann.

Til 40.000 volumdeler av den samlede opplosning av eluat og vaskevann settes krystaller av ammoniumsulfat inntil 50 % metning og det hele filtreres gjennom et Buchner-filter for oppsamling av utfelt stoff. Fellingene opploses i 7.000 volumdeler 0,05 M Tris-HCl-puffer (pH 7,5) og uopplost stoff filtreres fra. Filtratet fores for avsalting gjennom en kolonne av "Sephadex G-15"

(nevnt ovenfor), som på forhånd er vasket med samme puffer som nevnt ovenfor og de aktive fraksjoner slås sammen og fores gjennom en kolonne "DEAE"-cellulose (1.500 volumdeler) som på forhånd er behandlet med samme puffer som ovenfor, og man får 25.000 volumdeler eluat# Til eluatet setter man ammoniumsulfatkrystaller til 50 % metning og fellingen oppsamles ved sentrifugering og opploses i 4.000 volumdeler destillert vann. Opplosningen fores for avsaltning gjennom en kolonne "Sephadex G-15". De re-. sulterende 6.000 deler av aktive fraksjoner hensettes ved 5°C og gir 45 vektdeler hvite krystaller (torrbasis), som har de samme fysikalsk kjemiske og protease-inhiberende egenskaper som plasminostreptinet fremstilt ifolge eksempel 1.

Eksempel 5

På samme måten som i eksempel 2 dyrkes Streptomyces antifibrinolyticus nr. 21211 (IFO 13508) og de resulterende 950.000 volumdeler dyrkningsmedium gjennomgår samme rensingspro-sess som i eksempel 2, men man bruker 5.000 volumdeler "Asmit 173 N" i kolonnen i stedenfor 3000 volumdeler "DEAE"-cellulose som i eksempel 2.

Utbyttet er 30 vektdeler hvite krystaller av plasminostreptin .

Claims (1)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av proteaseinhibitoren plasminostreptin, karakterisert ved at man dyrker en mikroorganisme av arten Streptomyces antifibrinolyticus under aerobe betingelser i et dyrkningsmedium som inneholder en assimilerbar karbonkilde og en fordøyelig nitrogenkilde, og utvinner plasminostreptin fra mediet.