NO135395B

NO135395B -

Info

Publication number: NO135395B
Application number: NO3621/72A
Authority: NO
Inventors: R Kenworthy; P Porter
Original assignee: Unilever Nv
Priority date: 1971-10-14
Filing date: 1972-10-10
Publication date: 1976-12-27
Also published as: AU4761472A; DK144905B; IE37042L; FR2158219A1; DE2250315C2; GB1401280A; IN137496B; AT328280B; NL7213850A; ZA727241B; NO135395C; DK144905C; YU257372A; IT1043895B; FR2158219B1; LU66264A1; BE789864A; DE2250315A1; CA976087A; SE421174B

Abstract

Kalvefor som inneholder vekstfremmende tilsetningsmiddel.Veal feed containing growth-promoting additive.

Description

Oppfinnelsen vedrører et kalvefor som inneholder et vekstfremmende tilsetningsmiddel som består av antigenene av en patogen stamme av bakterien Escherichia coli. Foret er karakterisert ved at de antigener som anvendes, er endotoksiner, videre at de stammer fra en patogen E. co 1 i -stamme som har serotypen08, 09, 1315, 078, 0114, 0137 eller 0139, og tilsetningsmidlet anvendes 1 foret i en.mengde på 10-1000 enheter av endotoksinene av hver serotype pr. kg for. The invention relates to a calf feed containing a growth-promoting additive consisting of the antigens of a pathogenic strain of the bacterium Escherichia coli. The lining is characterized in that the antigens used are endotoxins, further that they originate from a pathogenic E. co 1 i strain that has the serotype 08, 09, 1315, 078, 0114, 0137 or 0139, and the additive is used 1 lining in a .quantity of 10-1000 units of the endotoxins of each serotype per kg for.

Et vekstfremmende kalvefor i henhold til oppfinn-, eisen vil redusere kalvenes -følsomhet overfor tarmforstyrrelser, spesielt .slike forstyrrelser som forårsakes av infeksjon påført dem etter de første levedager. A growth-promoting calf feed according to the invention will reduce the calves' sensitivity to intestinal disturbances, especially such disturbances caused by infection inflicted on them after the first days of life.

En av de tarmforstyrrelser som kalver er utsatt for, «kyldes Infeksjon av patogene stammer av bakterien Escherichia coli, spesielt slike stammer-som har serotypene (internasjonal serotype-klassifisering) 08 og 09, og-d mindre grad 015, 078, 0114, Ol37 og 0139. Patogene stammer av Salmonella, f.eks. Salmonella dublin og Salmonella typhimurium, ér også ofte med-virkende til tarmforstyrrelser hos kalver. One of the intestinal disorders that calves are exposed to is "colds" Infection by pathogenic strains of the bacterium Escherichia coli, especially strains that have serotypes (international serotype classification) 08 and 09, and to a lesser extent 015, 078, 0114, Ol37 and 0139. Pathogenic strains of Salmonella, e.g. Salmonella dublin and Salmonella typhimurium are also often involved in intestinal disorders in calves.

Når kalvens føde eller omgivelser endres, f.eks. When the calf's food or surroundings change, e.g.

når den transporteres, gjeninntas i hus eller tas fra kua, vil de derav følgende påkjenninger gjøre kalvens motstandskraft~mot smitte av-patogene organismer mindre, og hvilken som helst Salmonella eller E. coli som den kan ha fått i seg, vil -sann-synligvis forårsake alvorlig diare. when transported, reintroduced into the house or taken from the cow, the resulting stresses will reduce the calf's resistance to infection by pathogenic organisms, and any Salmonella or E. coli it may have ingested will -indeed- visibly cause severe diarrhea.

Foreliggende oppfinnelse fremkom fra søkerens opp-dagelse av at kalvetarmene kan stimuleres til å produsere antistoffer mot slike patogene organismer som de ovennevnte Salmonella- og E. Coli-stammer ved gjentatt oral administrering til kalven av endotoksinene av organismene som er i alt vesentlig fri for de levende organismer.. The present invention arose from the applicant's discovery that the calf intestines can be stimulated to produce antibodies against such pathogenic organisms as the above-mentioned Salmonella and E. Coli strains by repeated oral administration to the calf of the endotoxins of the organisms which are essentially free of the living organisms..

Ved å spesifisere det materiale som skal innføres By specifying the material to be introduced

i kalvetarmene som "endotoksiner" mener man at endotoksinene er av primær betydning for å oppnå den ønskede immunologiske effekt, mens eksotoksinene og celleavfall (dvs. det cellemateriale i hvilket endotoksinene er. innelukket i den levende bakterie) ikke er det, Av og til vil det imidlertid være hensiktsmessig å la enten eksotoksinene eller cellematerialet eller begge være sammen med endotoksinene, for det første for å spare arbeidet med å skille dem og for det annet for å utnytte den antigene kapasitet som de måtte være i besittelse av. in the calf's intestines as "endotoxins" it is believed that the endotoxins are of primary importance for achieving the desired immunological effect, while the exotoxins and cell waste (i.e. the cell material in which the endotoxins are enclosed in the living bacteria) are not. however, it may be expedient to leave either the exotoxins or the cellular material or both together with the endotoxins, firstly to save the labor of separating them and secondly to utilize the antigenic capacity which they may possess.

Dét er allerede foreslått å gjøre bruk av den antigene evne hos bdktériecélleavfall, som administreres oralt, ved utvikling av en aktiv immunitet i mave/tarmsystemet mot lokal infeksjon. Således dyrkes i henhold til fransk patent 2.015.423, som vedrører flerverdige vaksiner som gir synergistisk aktivitet, en bakterie (f.eks. E. coli 2380; en Salmonella typhimurium-stamme; en Shigella flexneri 2a-stamme). De dyrkede bakterier befris for ekstracellulært materiale ved gjentatt vasking og sentrifugering, suspenderes i fysiologisk saltbppløsning eller destillert vann og oppvarmes i ca . 20 minutter ved 100°c. ' "■-■ varmebehandling dreper bakteriene. (Den forårsaker også oppløsning av bakteriene og frigivning av endotoksinene fra disse inn i den flytende fase.) De således deaktiverte bakterier separeres fra den flytende fase ved. sentrifugering og lyofiliseres deretter slik at man får et tørt materiale hvorav 1 mg inneholder ca. 5 x 10 gdrepte bakterier. Flerverdige vaksiner lages så ved blanding av de deaktiverte bakterier av forskjellige typer. For'immunprofylåkseformål administreres den flerverdige vaksine til voksne mennesker i en dose som er tilstrekkelig til å gi 50 mg av hver bakteriekomponent i 5 påfølgende dager. Én eneste administrering sies'å bskytte barn i sykehus, hjem eller daghjem mot dysepsia-Coli-infeksjoner, og ved en dose og doseringsfrekvens som ikke er angitt angående antigenene av de tilsvarende Coli-patogener', sies unge kalver å være immuniserbare mot den fryktede kalvediaré. It has already been proposed to make use of the antigenic ability of bacterial cell waste, which is administered orally, by developing an active immunity in the stomach/intestinal system against local infection. Thus, according to French patent 2,015,423, which relates to multivalent vaccines providing synergistic activity, a bacterium (eg E. coli 2380; a Salmonella typhimurium strain; a Shigella flexneri 2a strain) is cultured. The cultured bacteria are freed from extracellular material by repeated washing and centrifugation, suspended in physiological saline solution or distilled water and heated for approx. 20 minutes at 100°c. '■-■ heat treatment kills the bacteria. (It also causes dissolution of the bacteria and release of the endotoxins from them into the liquid phase.) The thus deactivated bacteria are separated from the liquid phase by centrifugation and then lyophilized so that a dry material of which 1 mg contains about 5 x 10 g of killed bacteria. Multivalent vaccines are then made by mixing the deactivated bacteria of different types. For immunoprophylaxis purposes, the multivalent vaccine is administered to adults in a dose sufficient to give 50 mg of each bacterial component for 5 consecutive days. A single administration is said to 'protect children in hospital, home or daycare against dyspepsia-Coli infections, and at a dose and frequency of dosing not specified regarding the antigens of the corresponding Coli pathogens', young calves are said to be immunizable against the dreaded calf diarrhea.

En artikkel av W.J. Sojka, Vet. Bull. 41 (7), s. 509 - 522, beskriver effektene av Coli-infeksjon hos nyfødte pattedyr og diskuterer forskjellige eksperimentélle metoder for behandling og forebygging. An article by W.J. Sojka, Vet. Bull. 41 (7), pp. 509 - 522, describes the effects of Coli infection in newborn mammals and discusses various experimental methods of treatment and prevention.

Innføring av endotoksinene ("administrering") av bare én av de foran nevnte Salmonella-stammene eller bare én av de foran nevnte stammer av E. coli i tarmen har nyttig virkning. idet evnen hos denne stamme til å forårsake skade da vil redu-seres. Det foretrekkes imidlertid å administrere endotoksinene av både S. dublin og S. typhimurium, og endotoksinene av alle E. coli-stammene. Endotoksinene som skal administreres, kan oppnås ved å dyrke hver stamme (en prøve av hver stamme kan fås fra Central Veterinary laboratory, Ministry of Agriculture and Fisheries, New Haw, Weybridge, Surrey, UK, eller fra National Collection of Type Cultures), og når veksten av mikroorganismen, og dermed produksjonen av endotoksiner, har foregått tilstrekkelig lenge, drepe de smitteførende mikroorganismene og frigjøre endotoksinene. Dette kan gjøres ved kokning eller autoklavbe-handl-ing. De hele, steriliserte kulturer, som hver inneholder eksotoksiner og cellemateriale så vel som endotoksiner, kan kombineres og administreres. Introduction of the endotoxins ("administration") of only one of the aforementioned Salmonella strains or only one of the aforementioned strains of E. coli into the intestine has a beneficial effect. as the ability of this strain to cause damage will then be reduced. However, it is preferred to administer the endotoxins of both S. dublin and S. typhimurium, and the endotoxins of all E. coli strains. The endotoxins to be administered can be obtained by culturing each strain (a sample of each strain can be obtained from the Central Veterinary laboratory, Ministry of Agriculture and Fisheries, New Haw, Weybridge, Surrey, UK, or from the National Collection of Type Cultures), and when the growth of the microorganism, and thus the production of endotoxins, has taken place for a sufficiently long time, kill the infectious microorganisms and release the endotoxins. This can be done by boiling or autoclaving. The whole, sterilized cultures, each containing exotoxins and cellular material as well as endotoxins, can be combined and administered.

Istedenfor å sterilisere he.le kulturene separeres imidlertid alternativt bakteriene (hensiktsmessig ved sentrifugering) og behandles i et lite volum av et vandig medium (f.eks. vann eller saltløsning) for å drepe bakteriene og forårsake fri-gjøring av endotoksiner. Instead of sterilizing the whole cultures, however, the bacteria are alternatively separated (suitably by centrifugation) and treated in a small volume of an aqueous medium (e.g. water or saline) to kill the bacteria and cause the release of endotoxins.

Den enkleste og mest økonomiske måte å drepe de separerte bakterier på, er å varmebehandle dem. Dersom oppvarmingen skjer tilstrekkelig lenge, f.eks. 1 time ved 100°C eller 20 minutter ved 125°C, frigjøres mye av endotoksinet fra forbindelsen med celleveggene i den drepte bakterie og frigjøres til det medium som oppvarmingen utføres i.. De resterende bundne endotoksiner kan, om ønskes, bringes i oppløsning ved behandling med et enzym som f.eks. trypsin, slik som det fremgår av nederlandsk, patent 7.107.538. The simplest and most economical way to kill the separated bacteria is to heat treat them. If the heating takes place for a sufficiently long time, e.g. 1 hour at 100°C or 20 minutes at 125°C, much of the endotoxin is released from the connection with the cell walls of the killed bacteria and is released into the medium in which the heating is carried out. The remaining bound endotoxins can, if desired, be dissolved by treatment with an enzyme such as trypsin, as disclosed in Dutch Patent 7,107,538.

I praksis skjer administreringen av endotoksinene til kalven naturligvis -gjennom munnen, enten enkelt ved tvungen dosering med sterilisert kulturmateriale, eller via drikkevannet, eller i fast form eller væskeform blandet med en eller flere av de.viktige komponenter i kalvens for, dvs. til protein, fett, karbohydrat, vitaminer og mineralstoffer (f.eks. kalsium og fosfor). Således kan endotoksinene for administrering blandes med skummetmelkpulver, korn eller mineralstoffer, eller de kan innblandes i et fullstendig for, dvs. et som inneholder alle de nødvendige komponenter (protein, fett osv.). In practice, the administration of the endotoxins to the calf naturally takes place - through the mouth, either simply by forced dosing with sterilized culture material, or via the drinking water, or in solid form or liquid form mixed with one or more of the important components in the calf's forage, i.e. to protein , fat, carbohydrate, vitamins and minerals (e.g. calcium and phosphorus). Thus, the endotoxins for administration can be mixed with skimmed milk powder, grains or mineral substances, or they can be mixed into a complete feed, i.e. one containing all the necessary components (protein, fat, etc.).

Tilsetningsmidlet i henhold til opp-finnelsen er spesielt nyttig med hensyn- til å forbedre motstandskraften hos kalver mot infeksjon når de tas fra kua og dermed utsettes spesielt for påkjenninger. Ved å begynne matingen med endo— toksinmaterialet ved tidlig alder, passende 4 til 10 dager, og fortrinnsvis ved den siste matetiden med kua eller like etter, og å. fortsette i en passende periode, passende opptil 4-6 ukers alder, kan kalvetarmene stimuleres til å produsere antistoffer, slik at når kalvene utsettes for alvorlig risiko for infeksjon,, er det enten en så stor antistdff-sirkulasjon i tarmene enten til å beherske smitten fra enhver fordøyet patogen bakterie eller i det minste til å hindre en.alvorlig utvikling av even-tuelle sykdomstilstander som måtte oppstå. Endbtoksinmateri-alet kan i denne hensikt innføres i en såkalt "melkeerstatter", dvs. et for som er sammensatt spesielt for å tilsvare kalvenes næringsbehov når de tas fra kua. Det kan også innblandes i det første tørrforet som anvendes sammen med melken eller melke-erstathingen ved avvenningen. Det er hensiktsmessig å markeds-føre endotoksinene i form av en tørr, fast pre-miks med en eller flere av foringrediensene protein, fett, karbohydrat eller mineralstoffer, og overlate til brukeren å blande pre-miksen med de resterende ingredienser i foret. The additive according to the invention is particularly useful with regard to improving the resistance of calves to infection when they are taken from the cow and thus exposed to special stresses. By starting the feeding of the endo-toxin material at an early age, suitably 4 to 10 days, and preferably at the last feeding time of the cow or soon after, and continuing for a suitable period, suitably up to 4-6 weeks of age, the calf intestines can be stimulated to produce antibodies, so that when the calves are exposed to serious risk of infection, there is either such a large antistdff circulation in the intestines either to control infection from any digested pathogenic bacteria or at least to prevent a.severe development of any disease states that may arise. For this purpose, the endbtoxin material can be introduced into a so-called "milk replacer", i.e. a feed that is specially formulated to meet the nutritional needs of the calves when they are taken from the cow. It can also be mixed into the first dry feed that is used together with the milk or milk replacer at weaning. It is appropriate to market the endotoxins in the form of a dry, solid pre-mix with one or more of the pre-ingredients protein, fat, carbohydrate or mineral substances, and leave it to the user to mix the pre-mix with the remaining ingredients in the feed.

Om ønsket kan det settes sammen for som inneholder endotoksinene av Salmonella-stammene sammen med slike fra E. coli-stammene. If desired, it can be put together for containing the endotoxins of the Salmonella strains together with those from the E. coli strains.

De minste doseringsmengder ligger i området 1 til 10 enheter (for måling av en enhet, se i eksemplene) av endotoksinene av hver bakteriell serotype pr. kalv pr. dag. Søkerne har imidlertid observert at kalver som har fått 1000 ganger så store doser, ikke viste noen bivirkninger. Et meget egnet nivå for innblanding i kalveforet er 10 til 1000 enheter endotoksin av hver serotype pr. kg. for. The smallest dosage amounts are in the range of 1 to 10 units (for measuring a unit, see the examples) of the endotoxins of each bacterial serotype per calf per day. However, the applicants have observed that calves that have received doses 1000 times as large did not show any side effects. A very suitable level for mixing in calf feed is 10 to 1,000 units of endotoxin of each serotype per kg. for.

Oppfinnelsen illustreres ved de følgende eksempler. The invention is illustrated by the following examples.

Eksempel 1 Example 1

Fremstilling og isolering av endotoksin Preparation and isolation of endotoxin

Endotoksiner kan fremstilles fra Salmonella-stammer og de syv E. coli-serotyper ved følgende metode som er i gene-rell overensstemmelse med. metoden til Westphal, Luderitz og Bister (1952) Z. Natur. Forsch., 7, 148. Endotoxins can be produced from Salmonella strains and the seven E. coli serotypes by the following method which is in general agreement with the method of Westphal, Luderitz and Bister (1952) Z. Natur. Forsch., 7, 148.

En frysetørret kultur av mikroorganismen rekonsti-tueres i péptonvann og mkuberes ved 37 oc i 6 timer. Etter passende vekst sjekkes kulturen på renhet på en vasket saueblod-agarplate og brukes så for å inokulere skrå næringsagar ("Oxoid") i Roux-kolber. Kulturen dyrkes ved 37°c natten over, og bakterien høstes i sterilt destillert vann. Den oppnådde bakterie-suspensjon fordeles aseptisk i 30 ml universalflasker og sentrifugeres ved 400O omdr. pr. min. i 10 minutter. Den overstående væske fjernes, og den gjenværende pellet av bakterie suspenderes igjen i 4 ml sterilt destillert vann og frysetørkes så. A freeze-dried culture of the microorganism is reconstituted in peptone water and incubated at 37°C for 6 hours. After suitable growth, the culture is checked for purity on a washed sheep blood agar plate and then used to inoculate nutrient agar slants ("Oxoid") in Roux flasks. The culture is grown at 37°c overnight, and the bacteria are harvested in sterile distilled water. The bacterial suspension obtained is distributed aseptically in 30 ml universal bottles and centrifuged at 4000 rpm. my. for 10 minutes. The supernatant liquid is removed, and the remaining pellet of bacteria is resuspended in 4 ml of sterile distilled water and then freeze-dried.

For å isolere endotoksiner suspenderes 0,5 g av det frysetørkede materiale i 5 ml 0,15 m NaCl, og 10 ml 90%-ig vandig fenol tilsettes som lyserende middel. Blandingen oppvarmes ved 68°C i 30 minutter med kontinuerlig omrøring, hvor etter den sentrifugeres ved 4000 omdr. pr. min. for å presse sammen cellematerialet. Den vandige fase fjernes og kjøles til 4°C, og den tilsettes langsomt 10 volumdeler iskald etanol. Det bunnfall som dannes, gjenoppløses i vann, og nukleinsyrer utfelles fra oppløsningen ved tilsetning av 2 volumdeler etanol og fjernes. Fra res.iiøsningen utfelles endotoksinene ved tilsetning av ytterligere 8 deler volumdeler etanol. De separeres ved sentrifugering, vaskes med iskald etanol og gjenoppløses i 0,15 m NaCl. To isolate endotoxins, 0.5 g of the freeze-dried material is suspended in 5 ml of 0.15 m NaCl, and 10 ml of 90% aqueous phenol is added as a lysing agent. The mixture is heated at 68°C for 30 minutes with continuous stirring, after which it is centrifuged at 4000 rpm. my. to compress the cell material. The aqueous phase is removed and cooled to 4°C, and 10 volumes of ice-cold ethanol are slowly added to it. The precipitate that forms is redissolved in water, and nucleic acids are precipitated from the solution by adding 2 parts by volume of ethanol and removed. From the solution, the endotoxins are precipitated by adding a further 8 parts by volume of ethanol. They are separated by centrifugation, washed with ice-cold ethanol and redissolved in 0.15 m NaCl.

(Denne endotoksinoppløsning betegnes reagens 1). (This endotoxin solution is called reagent 1).

Eksempel 2 Example 2

Prøve på endotoksinene. Test for endotoxins.

a. Fremstilling av antiserum. a. Preparation of antiserum.

Spesifikke hyperimmune sera ("antisera") fremstilles 1 hvite New Zealand-kaniner mot vaskede varme-drepte (100°C, 2 1/2 timer) organismer av hver av E. coli- og Salmonella-serotypene. Specific hyperimmune sera ("antisera") are prepared 1 white New Zealand rabbits against washed heat-killed (100°C, 2 1/2 hours) organisms of each of the E. coli and Salmonella serotypes.

Suspensjoner av den varme-drepte organisme fremstilles i 0,15 m NaCl (omtrent 3 x 10 9 organismer/ml) og inji-seres intravenøst. Immuniseringsprogrammet begynner med et injeksjonsvolum på 0,1 ml og fortsettes på hver fjerde dag med fordoblede volumer til 1,6 ml. Kaninene tappes for blod 10 dager etter fullførelsen av programmet, og det oppnådde blod sentrifugeres. Det øvre lag av hyperimmunt serum oppsamles. (Dette antiserum betegnes reagens 2). Suspensions of the heat-killed organism are prepared in 0.15 m NaCl (approximately 3 x 10 9 organisms/ml) and injected intravenously. The immunization program begins with an injection volume of 0.1 ml and continues every four days with doubled volumes to 1.6 ml. The rabbits are bled 10 days after completion of the program and the blood obtained is centrifuged. The upper layer of hyperimmune serum is collected. (This antiserum is called reagent 2).

b. Måling av antistoff-( anti- endotoksin-) aktivitet i antiserum. b. Measurement of antibody (anti-endotoxin) activity in antiserum.

Saue-erytrocyter sensitiveres ved behandling av 5%ig suspensjon av vaskede, pakkede celler med et like stort volum av endotoksinløsningen, reagens 1, ved 37°C i 30 minutter. De sensitiverte celler separeres ved sentrifugering, vaskes fri for overskudd av endotoksiner og resuspenderes i 0,15 m NaCl for Sheep erythrocytes are sensitized by treating a 5% suspension of washed, packed cells with an equal volume of the endotoxin solution, reagent 1, at 37°C for 30 minutes. The sensitized cells are separated by centrifugation, washed free of excess endotoxins and resuspended in 0.15 m NaCl for

-dannelse av en 2,5%ig suspensjon av endotoksin-sensitiverte saue-erytrocyter. (Denne betegnes reagens 3).. Reagens 2 (antiserumet) fortynnes i serie med 0,15 m NaCl for oppnåelse av en serie løsninger av samme volum (1 vol) med antistoffkonsentrasjoner på 1/5, 1/10, 1/20, 1/40 1/(5 x 2n ^") av den i reagens 2, og til hver av disse oppløs-ninger settes 1/5 vol. av reagens 3. Hemaglutinasjon opptrer i de sterkere antiserumoppløsninger og ikke i de svakere, og endepunktet for titreringen (utført ved 4°c) tas som den løsning hvor hemaglutinasjon nettopp begynner å opptre. i en typisk fremgangsmåte kan endepunktet være ved den tolvte oppløsning, dvs. ved den oppløsning som har en antistoffkonsentrasjon på 1/(5 x 2^"S av den i reagens 2. Reagens 2 sies da å ha en anti-serumtiter på.5 x 2<11> (=10240). c. Måling av endotoksinkonsentrasjon i oppløsninger med ukjent konsentrasjon. - formation of a 2.5% suspension of endotoxin-sensitized sheep erythrocytes. (This is called reagent 3).. Reagent 2 (the antiserum) is serially diluted with 0.15 m NaCl to obtain a series of solutions of the same volume (1 vol) with antibody concentrations of 1/5, 1/10, 1/20, 1/40 1/(5 x 2n ^") of it in reagent 2, and to each of these solutions add 1/5 vol. of reagent 3. Hemagglutination occurs in the stronger antiserum solutions and not in the weaker ones, and the endpoint for the titration (carried out at 4°c) is taken as the solution where hemagglutination just begins to appear. In a typical method, the end point may be at the twelfth solution, i.e. at the solution that has an antibody concentration of 1/(5 x 2^" S of that in reagent 2. Reagent 2 is then said to have an anti-serum titer of 5 x 2<11> (=10240). c. Measurement of endotoxin concentration in solutions of unknown concentration.

Oppløsningen (Y) som skal prøves, fortynnes i serie med 0,15 m NaCl for oppnåelse av en serie av oppløsninger av likt volum (3 volumer) med endotdksinkonsentrasjonene 1/3, 1/6, 1/12, 1/24 osv. av den i oppløsning Y. Til hver av disse oppløs-ninger tilsettes 1 vol. av reagens 2 (antiserum) fortynnet slik at den har en titer på 20 (se b. foran) og så (etter noen få minut.ter) 1 vol. av reagens 3 (sensitiverte saue-erytrocyter) The solution (Y) to be tested is serially diluted with 0.15 m NaCl to obtain a series of solutions of equal volume (3 volumes) with endotoxin concentrations of 1/3, 1/6, 1/12, 1/24, etc. of it in solution Y. To each of these solutions is added 1 vol. of reagent 2 (antiserum) diluted so that it has a titer of 20 (see b. above) and then (after a few minutes) 1 vol. of reagent 3 (sensitized sheep erythrocytes)

som gir endelig endotoksinkonsentrasjoner på 1/5, 1/10, 1/20..... 1/(5 x 2 ) av den i oppløsning Y. Hemaglutinasjon inhiberes i de sterkere endotoksinoppløsninger, men opptrer i de svakere, og endepunkter for titreringen tas som den løsning hvor hemaglu-tinas jonen nettopp er inhibert, i en typisk utførelse kan dette skje ved den sjette oppløsning med endotoksinkonsentrasjon på 1/(5 x 25) av den i oppløsning Y. Oppløsning Y sies da å ha en titer på 5 x 2 5 (= 160), ekvivalent med 160 enheter endotoksin pr. ml (se eksempel 3). which gives final endotoxin concentrations of 1/5, 1/10, 1/20..... 1/(5 x 2 ) of that in solution Y. Hemagglutination is inhibited in the stronger endotoxin solutions, but occurs in the weaker ones, and endpoints for the titration is taken as the solution in which the hemagglutinase ion has just been inhibited, in a typical embodiment this can happen in the sixth solution with an endotoxin concentration of 1/(5 x 25) of that in solution Y. Solution Y is then said to have a titer of 5 x 2 5 (= 160), equivalent to 160 units of endotoxin per ml (see example 3).

Eksempel 3 Example 3

A. Fremstilling av rått endotoksinmateriale A. Preparation of crude endotoxin material

Den følgende fremgangsmåte ble fulgt særskilt for hver av de Salmonella-stammer og E. coli-serotyper som det tidligere er referert til. (I) Bakterien ble strøket ut fra en deponert lagerkultur på vaskede blodagarplater (for E. coli) eller næringsagar-plater (for .Salmonella) og inkubert ved 37°C i 24 timer. Platene ble så undersøkt på vanlig måte på renhet hos stammene. (II) Kolonier av bakterien ble overført fra platene til 50 ml "Oxoid" Næringsmedium nr. 2 (Katalog nr. CM 67). The following procedure was followed separately for each of the Salmonella strains and E. coli serotypes previously referred to. (I) The bacterium was streaked from a deposited stock culture onto washed blood agar plates (for E. coli) or nutrient agar plates (for .Salmonella) and incubated at 37°C for 24 hours. The plates were then examined in the usual way for purity of the strains. (II) Colonies of the bacterium were transferred from the plates to 50 ml "Oxoid" Nutrient Medium No. 2 (Catalog No. CM 67).

Mediet ble holdt på 37°C i 24 timer. The medium was kept at 37°C for 24 hours.

(III) Hele kulturen som ble oppnådd i (II), ble brukt for ino-kulering av 1 1/2 liter "Oxoid" næringsbuljong nr. 2, og buljongen ble inkubert, med omrystning, ved 37 oC i 24 timer. Hver sluttkultur som ble fremstilt på denne måte (III) The whole culture obtained in (II) was used to inoculate 1 1/2 liters of "Oxoid" No. 2 nutrient broth and the broth was incubated, with shaking, at 37°C for 24 hours. Each final culture that was produced in this way

9 10 9 10

inneholdt 10 -10 levende bakterier/ml. Prøver av E. coli-kulturer ga når de ble dampet ved 125 C i 2 timer og underkastet prøvemetoden i eksempel 2, eri titer på 2560 som tilsvarer 2560 enheter endotoksin pr. ml dampet kultur. Prøver av"S. dublin og S. typhimurium-kulturene ga hver, når de ble dampet og prøvet på samme måte som E.'coli-kulturene, en titer på 1280. Hver av de 9 kulturene (7 av E. coli og én av hver av Salmonella-serotypene) ble sentrifugert for å separere bakterien, som så ble resuspender i en del av den separerte overstående væske for oppnåelse av en suspensjon med en konsentrasjon 30 ganger den i kulturen før sentrifugeringen. Hver suspensjon ble dampet separat i 2 timer i en autoklav (125°C) for å drepe bakterien, og de 9 dampede suspensjoner ble contained 10 -10 live bacteria/ml. Samples of E. coli cultures, when steamed at 125° C. for 2 hours and subjected to the test method of Example 2, gave an eri titer of 2560 which corresponds to 2560 units of endotoxin per ml steamed culture. Samples of the S. dublin and S. typhimurium cultures each, when steamed and tested in the same manner as the E. coli cultures, gave a titer of 1280. Each of the 9 cultures (7 of E. coli and one of each of the Salmonella serotypes) was centrifuged to separate the bacterium, which was then resuspended in a portion of the separated supernatant to obtain a suspension with a concentration 30 times that of the culture before centrifugation. Each suspension was steamed separately for 2 hours in an autoclave (125°C) to kill the bacteria, and the 9 steamed suspensions were

samlet. collected.

B. Fremstilling av kalvefor B. Production of calf feed

Det oppsamlede dampende materiale (1 vektdel) oppnådd fra A ble blandet med mysepulver (19 deler), og den resulterende blanding ble innført i en vanlig melkeerstatning med følgende sammensetning: The collected evaporating material (1 part by weight) obtained from A was mixed with whey powder (19 parts), and the resulting mixture was introduced into a regular milk replacer with the following composition:

for å gi et. produkt der konsentrasjonen av endotoksinene var: to give a. product where the concentration of the endotoxins was:

v. v.

Endotoksiner av hver-E-coli-Berotype: 1O0 enheter/kg for Endotoksiner av hver Salmonella-serotype: 50 enheter/kg for. Endotoxins of each E-coli-Berotype: 1O0 units/kg for Endotoxins of each Salmonella serotype: 50 units/kg for.

C. Foringsforsøk C. Lining test

Kalver fra 16 grupper ble henholdsvis gitt for tilsatt antigen og anvendt som kontrolldyr. Vektøkningen etter 5 uker ble bestemt. Resultatene er angitt i nedenstående tabell og viser at de dyr som ble gitt for tilsatt antigen, hadde stør-re vektøkning enn kontrolldyrene, bortsett fra i 2 tilfeller. Calves from 16 groups were respectively given added antigen and used as control animals. The weight gain after 5 weeks was determined. The results are given in the table below and show that the animals that were given added antigen had a greater weight gain than the control animals, except in 2 cases.

Claims

1, Veal feed containing the antigens of a pathogenic strain of the bacterium E. coli as a growth-promoting additive, characterized in that the antigens: I are endotoxins, II originates from a pathogenic E. coli strain that has the serotype 08, 09, 015, L78, 0114 , 0137 or 0139, III is present in the feed in an amount of 10-1000 units of the endotoxins of each serotype per kg for.

2. Calf feed as stated in claim 1, characterized in that it also contains the endotoxins of Salmonella dublin and Salmonella typhimurium in an amount of 10-1000 units of the endotoxins of each serotype per kg for.