NO127694B - - Google Patents

Description

Fremgangsmåte for ekstraksjon av

bakteriefraksjoner.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for ekstraksjon av bakteriefraksjoner (protodyn) som er i stand til å øke motstandskraften mot infeksjoner i varmblodige dyr og' som har lav grad av toksisitet og feberfremkallende virkning, fra "gram-negative bakterier.

Formålet med den foreliggende oppfinnelse er' a fremskaffe bakteriefraksjoner som.er i stand til å øke motstandskraften mot infeksjoner i varmblodige dyr og som har særlig lav grad av toksisitet og feberfremkallende virkning.

Dette.oppnås ved en fremgangsmåte som kjennetegnes ved at bakteriecellene spaltes eller oppløses for å frembringe'bakterie-protoplasmaet fra disse, hvoretter protoplasmaet atskilles fra materialene i celleveggen og protodynet ekstraheres fra protoplasmaet ved ekstraksjon med varm fenol.

Det er blitt oppdaget for en tid tilbake at visse substan-ser, kjent som endotoksiner, kan frembringes fra mikroorganismer, særlig fra gram-negative bakterier. Dette er blant annet kjent fra US-patentskrift 3-132. 995-

Disse endotoksiner, som kan isoleres fra bakterienes celle-vegger ved forskjellige ekstraksjons.met.oder, er generelt kjenne-tegnet ved at de fremstilles hovedsakelig av polysakkarider og inneholder betydelige mengder glukosamin og lipider. I tillegg beholder de forskjellige endotoksiner selv etter omfattende rense-trinn en betydelig grad av toksisitet og feberfremkallende virkning.

Fra US-patentskrift 3>331-7^1 er det kjent å knuse bakterie-materialer, og av det knuste materiale, som også inneholder pro-toplasma kan det utvinnes en fraksjon med terapeutisk effekt. Protodyn har følgende egenskaper: a) Et høyt innhold av proteinholdig materiale, i størrelses-orden 85% eller høyere. b) Et lavt glykosamin-innhold, i størrelsesorden 2%- eller mindre. c) Et lavt lipidinnhold, uttrykt i frie fettsyrer, i størrel-sesorden 2% eller mindre. d) Et lavt innhold av karbohydrat, i størrelsesorden 2% eller mindre. e) Stort sett stabilitet ved oppvarming i destillert vann, 0,ln eddiksyre, 0,01n ammoniumhydroksyd, eller i buffer (pH 8,6)

i 5 minutter ved 100°C.

f) Lett oppløselighet i 0,ln NaOH, dårlig oppløselighet i 4M urinstoffoppløsning samt uoppløselighet. i vann, ln HC1 og 0,ln

HC1. Studiene, over oppløseligheten ble gjennomført med en konsentra-sjon på 10 mg. Protodyn pr. ml oppløsningsmiddél. g) En ekstinksjonskoeffisient. målt ved 280 m jx under benyttelse av en l.?-ig vekt/volum-oppløsning av Protodyn i 0,ln NaOH opp-,

løsning i området fra omtrent 9 til omtrent 22..

Protodyn kan fremstilles av celler av gram-negative bakterier, såsom Escherichia coli, som man, lar vokse i et hensiktsmessig medium. Selv om de detaljerte eksempler som følger er rettet spesi-elt mot Escherichia coli, må det forståes at andre gram-negative bakterier kan benyttes tilsvarende. Por eksempel kan protodyn ut-

trekkes med fordel frå celler frembragt av kulturer av Achromo-

bacter xerosis og Serratia marcescens.

Med det formål å sammenlikne, ble endotoksininfraksjonen i materialet i celleveggen også trukket ut i de fleste eksperimen-

telle forsøk.

Spaltingen eller oppløsningen av cellene kan gjennomføres på

en av flere måter, for eksempel ved Zeolite-cellespaltning, ved oppløsning av cellene med mekanisk trykk eller ved fryse-tine-cellespaltning. Detaljerte eksempler for hver fremgangsmåte vil bli gitt i det følgende.

I det følgende skal det gies eksempler, på fremstillingen av protodyn ifølge den foreliggende oppfinnelse.

EKSEMPEL I.

Oppløsningstrinn.

a) Ved Zeolite-celleoppløsning.

95,5 g nydyrkete E. coli-celler ble frosset og spaltet med

100 g pulverformet ,"3A Zeolite" (dehydratisert krystallinsk natri-um-aluminiumsilikat). Oppdelt tørr is ble tilsatt den tørre masse for å holde temperaturen under 10°C. Blandingen ble omrørt under benyttelse av "Hobart"-blander i omtrent 20-25 minutter ved 4°C

inntil det ble oppnådd en pulverformet masse.

Til den faste masse ble det tilsatt 500 ml fysiologisk salt-oppløsning og suspensjonen ble omrørt ved 4°C i 5 minutter.

Etter sentrifugering ved omtrent 28.0O0 x g i 1 time ved H°C, hadde den klare væske som fløt ovenpå et faststoffinnhold på 19,2

mg/ml (7,68 g) etter uttrekkingen av saltinnholdet.

Celleekstrakten ble ytterligere renset ved sentifugering ved. omtrent 78.000 x g ved. 4°C i 2 timer i en "Spinco Model L"- sentri-fuge .

Ekstrakten som inneholdt 15,8 mg/ml faststoff (5,77 g) ble benyttet i fenolekstraksjonen som skal beskrives i det følgende.

b) Ved mekanisk trykk.

95,3 g (våtvekt) nydyrkete E.coli-celler ble vasket to ganger

ved omtrent 300 ml porsjoner fysiologisk saltoppløsning ved 4 °C

og sentrifugert i 30 minutter ved omtrent 30.000 x g. De vaskete celler (69,5) ble suspendert i 650 ml fysiologisk saltoppløsning og volumet ble øket til 700 ml saltoppløsning. Faststoffinnholdet var 23,8 mg/ml (16.6 g) etter fradrag av saltinnholdet.

Oppløsningen i et "Ribi"-fraksjoneringsapparat (modell CFI) ble utført ved omtrent 2110 kp/cmp- ved en strømningshastighet på 59,5 m ^5 pr. time, idet temperaturen ' varierte fra 7 til 10 oC. Den resulterende suspensjon ble sentrifugert ved omtrent 48.000 x g i en time ved 4°C for å skille celleveggmaterialet fra protoplasma-materialet.

Den rå protoplasmafraksjon ble renset ved séntrifugering ved omtrent 78.000 x g i 2 timer i. en "Spinco Model L"-sentrifuge og deretter, benyttet for fenolekstraksjonen.

c) Ved frysing-tining.

95,5 g nydyrket E.coli-celler ble frosset. De frosne celler

ble suspendert i 250 ml sterilt vann og blandingen ble dispergert i en "Waring"-blander ved omrøring i omtrent 25 minutter ved 4°C. Suspensjonen ble sentrifugert ved omtrent 25-000 x g i 1 time ved 4°C. Den vannholdige væske som fløt ovenpå hadde et volum på 350

ml og et faststoffinnhold på 15,7 mg/ml.

Den vannholdige celleekstrakt ble sentrifugert ved omtrent 78.000 x g i en "Spinco Model L"-sentrifuge i'2 timer ved 4°C.

Den klare væske som fløt ovenpå, som hadde et volum på 290 ml og

et faststoffinnhold på 15,5 mg/ml, ble deretter ekstrahert med fenol ifølge fremgangsmåten i eksempel II.

EKSEMPEL II.

Fenolekstraksj on.

En protoplasmafraksjon frembrakt ved celleoppløsning med mekanisk trykk (1431 ml faststoffinnhold, 9,6 mg/ml eller 13,7 g faststoff totalt) ble foroppvarmet til 68°C og blandet med samme volum (1431 ml) 88$-ig fenol som også var foroppvarmet til 68°C. Blandingen ble omrørt ved 68°C i 30 minutter.og hurtig avkjølt til 8 - 10°C. Etter séntrifugering ved omtrent 4000 x g i 30 minutter ble fasene atskilt fra hverandre. Fenolfasen ble foroppvarmet til 68°C og om-rørt i 10 minutter med samme volum foroppvarmet vann. Fasene ble atskilt ved séntrifugering som foran.

Den vaskete fenolfase ble blandet med 60 ml mettet metanol-natrium-acetat-oppløsning. Fire volumdeler (6000.ml) metylalkohol ble benyttet for å utfelle et bløtt, faststoff som ble isolert ved séntrifugering ved omtrent 2 8.000 x g i 1 time ved 4°C. Resten ble suspendert i vann,' dialysert mot rennende, kaldt destillert vann i 48 timer ved 4°C og lyofilisert. Utbyttet av fenoloppløselig protoplasmamateriale (protodyn) ble 1,46 g fargeløst, amorft faststoff.

Tabell I som følger, angir et representativt antall proto-dynfraksjoner ifølge den foreliggende oppfinnelse i tillegg til deres egenskaper. Biuret-innholdet angir mengden av tilstedeværende proteinmaterialer. Karbohydrat-innholdet angir mengden av tilstedeværende polysakkarider i fraksjonen. Prøven av den frie fettsyre (FFA) er et mål på lipidinnholdet.

Protodynets evne til å øke den ikke-spesifikke motstands-evne mot infeksjon i varmblodige dyr ble undersøkt på mus av "Swiss Webster"-avl, under benyttelse av Salmonella typhimurium, Salmonella typhosa, Salmonella enteritides, Pseudomonas aeruginosa, Diplococcus pneumoniae, og Streptococcus mastididis som infek-sjonsmidler. Protodyn ble administrert iritraperitonealt i 5 forskjellige dosenivåer. Grupper på 20 mus ble benyttet ved hvert do-senivå og protodyn ble administrert i en enkelt injeksjon 24 timer forut for infeksjon. Bakteriene, med unntak av Pseudominas aeruginosa, ble administrert intraperitonealt. I tilfellet med Pseudomonas aeruginosa ble musene infisert intravenøst 48 timer etter behandling med protodyn. Ved alle bakteriene ble antallet administrerte levedyktige celler tilpasset ved innledende titra-sjoner for å bevirke døden for 90% av dyrene i løpet av 48 timer. Når 90% av de ubehandlete kontrolldyr var døde, normalt 24 til 48 timer etter injeksjonen, ble den midlere beskyttelsesdose (PD^q), det vil si den dose hvorved 50% av de behandlete dyr over-levde, beregnet. Hvert eksperiment ble gjentatt tre til fem ganger med like resultater.

Resultatene er ført opp i Tabell II:

Den feberfrembringende virkning til protodyn ble beregnet for hankjønns New Zealand-albinokaniner under benyttelse av den teknikk som er beskrevet av Landy m.fl. (Fed. Proe, 1957, V 16, 857). Protodyn i doser på 0,5 g/kg frembragte en maksimal tempe-raturstigning på 0,44 - 0,055°C, noe som er vesentlig lavere enn de verdier som angis for endotoksiner.

I tillegg synes protodyn å være helt ugiftig. Mus tålte en dose på 400 mg/kg intraperitonealt uten iakttakbare forandringer i utseende eller opptreden.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte for ekstraksjon av bakteriefraksjoner (protodyn) som er istand til å øke motstandskraften mot infeksjoner i varmblodige dyr og som har lav grad av toksisitet og feberfremkallende virkning, fra gramnegative bakterier, karakterisert ved at bakteriecellene spaltes eller oppløses for å frembringe bakteriepro.toplasmaet fra disse, hvoretter protoplasmaet atskilles fra materialene i celleveggen og protodynet ekstraheres fra protoplasmaet ved ekstraksjon med varm fenol.