NO127042B - - Google Patents

Description

Fremgangsmåte til fremstilling av et komplektst antibiotikum.

I patent nr. 93 920 er beskrevet en;

fremgangsmåte til fremstilling av et nytt! antibiotisk middel, der betegnet E. 129, og denne fremgangsmåte består i sine hovedtrekk i at man i et nærende medium inneholdende en assimilerbar kilde for nitrogen! og kullstoff, en energikilde samt nærende salter, dyrker organismen Streptomyces i

129, også kalt Streptomyces ostreogriseus(j hvorpå man skiller det herved dannede I antibiotiske middel fra kulturvæsken.

Som nevnt i patentets beskrivelse viste j

dette antibiotiske middel seg å bestå av! en blanding av flere stoffer av hvilke to eller flere viste seg å ha antibiotisk virkning. E. 129 ble også angitt å ligne et antibiotisk middel som er kalt streptogramin.

I et senere patent nr. 94 895 er beskrevet resultatet av videre forsøksarbeide med! hensyn til sammensetning av E. 129 i form av råprodukt og der er i patentet angitt en j fremgangsmåte til fremstilling av en be-1 standdel av samme, der betegnet Faktor B som er et nytt antibiotisk middel. I patent! nr. 94 895 nevnes der også at E. 129 i form! av råprodukt inneholder to andre bestanddeler med antibiotisk virkning, .der beteg-; net Faktor A og Faktor Z, og at disse ,to bestanddeler av oppfinnerne ble identifi-sert som identiske med to antibiotiske midler betegnet PA114A henholdsvis PA114B: av Chas. Pfizer & Co. Inc. (artikkel av W. D. Celmer og B. A. -Sobin i «Antibiotics Annual», 1955—56, side 437).

Det er angitt at de to antibiotiske midler PA114A og PA114B sammen viser en synergistisk virkning ved at disse to stoffer i blanding gir større antibiotisk aktivitet enn det kan forklares ved en addisjon av aktivitetene av de enkelte bestanddeler i blandingen. Disse observasjoner er bekref-tet av oppfinneren.

Det er nu funnet at det antibiotiske middel Faktor Z av E. 129 (identisk med PA114B) gir en synergistisk virkning også når det bringes sammen med Faktor B .av E. 129. Denne bestanddel er som ovenfor nevnt et nytt stoff. Videre er blandinger av Faktor B og Faktor Z funnet å gi bety-delig større antibiotisk virkning enn sam-menlignbare blandinger av de antibiotiske midler PA114A og PA114B.

Således er der f. eks. ved forsøk med •beskyttelse av dyr mot infeksjon av Staphylococcus aureus funnet en ED50 verdi på 104 for mus ved anvendelse av en blanding i vektsforhold 1 : 1 av Faktor B og FaTitor Z, mens en blanding likeledes i vektsforhbldet 1 : 1 av PA114A og PAT14B ga en ED,(1 verdi på 650.

ED30 verdien er det antall mikrogram antibiotisk middel pr. mus som kreves for å beskytte 50 % av de til forsøket anvendte dyr fra vedkommende infeksjon, når det antibiotiske middel anvendes i tre på hver-andre følgende døgn.

Der er videre funnet at Faktor B og Z bør være tilstede i mengdeforhold innen bestemte grenser for å oppnå særlig fordelaktige synergistiske virkninger. Det er videre funnet at der sammen med de to Faktorer B og Z ikke bør være tilstede forurensninger som dannes ved dyrkningen av Streptomyces ostreogriseus i mengdeforhold over noenlunde bestemte grenser, uansett om slike forurensninger har antibiotisk virkning eller ikke.

Det er således funnet at vektsforhol-dene mellom E. 129 Faktor B og E. 129 Faktor Z i preparater inneholdende disse bestanddeler bør ligge innen området fra 1:5 til 5:1, og at preparatene samtidig ikke bør inneholde mere enn 70 vektprosent forurensninger som skriver seg fra dyrkningen for fremstilling av E. 129, foråt preparatene skal vise en god synergistisk virkning.

Det karakteristiske hovedtrekk ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er at urenset E. 129 for delvis eller fullstendig fjernelse av Faktor A og andre dermed føl-gende stoffer behandles med organiske oppløsningsmidler, såsom metylisobutylke-ton eller etylacetat, særlig i motstrøm, hvoretter en del av den erholdte antibiotiske blanding hvis innhold av Faktor A er redusert, anrikes på Faktor Z, f. eks. ved å underkastes en motstrømsekstraksjon og/ eller kromatografisk adsorpsjon og påføl-gende eluering, hvorpå den antibiotiske blanding som er anriket på Faktor Z, blan-des med den resterende del av blandingen med redusert innhold av Faktor A.

Et trekk ved oppfinnelsen går ut på at den antibiotiske blanding med redusert innhold av Faktor A tilsettes så meget av den på Faktor Z anrikede antibiotiske blanding av vektsforholdet Faktor Z : Faktor B i det erholdte komplekse antibiotikum blir 1:5 til 5:1, fortrinnsvis 1:1. Et annet trekk ifølge oppfinnelsen går ut på at den antibiotiske blanding med redusert innhold av Faktor A tilsettes så meget av den på Faktor Z anrikede blandng at den del som Faktor B utgjør av det erholdte komplekse antibiotikum, minst blir 15 vektprosent. Et ytterligere trekk ved oppfinnelsen går ut på at man ved behandling av det urensede E. 129 med organiske oppløsningsmidler fra skiller i det minste 30 vektprosent, fortrinnsvis minst 50 vektprosent, av andre stoffer enn Faktor B og Z og som foreligger i det urensede E. 129.

Det er å merke at Faktor B synes fortrinnsvis å synergiseres av Faktor Z (PA 114B) og at tilsetning av PA114A (som er identisk med E. 129 Faktor A) til blandinger av Faktor B og Z i alminnelighet ikke gir noe tegn på vesentlig ytterligere syner-gisme. Hvis der imidlertid er tilstede et fremtredende overskudd av Faktor Z, kan tilsetning av PA114A forårsake noen økning i den totale aktivitet.

Det foretrekkes å arbeide slik i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen at meng-deforholdene mellom Faktor B og Z i pro-duktet ligger innenfor området fra 1:5 til 5 : 1. De beste resultater synes å oppnåes med produkter i hvilke vektsforholdet Faktor B til Z er 1 : 1 eller deromkring.

Faktor B og Z lar seg vanskelig frem-stille i ren tilstand av E. 129 i form av råprodukt fremstillet ved dyrkning, men som det vil fremgå av det foregående er det ikke nødvendig at Faktorene befries fra andre stoffer som er dannet under dyrkningen, da sådanne bestanddeler, in-klusive de andre antibiotisk virkende bestanddeler øyensynlig ikke er ufordelaktige når det ferdige preparat gis f. eks gjennom munnen. Som foran nevnt bør ikke de nevnte andre stoffer utgjøre mere enn 70 % av det hele antibiotiske middel og bør fortrinnsvis ikke utgjøre mere enn 50 %. Det mengdeforhold av Faktor B som er tilstede bør være minst 15 vektprosent og fordelaktig mere enn 25 vektprosent.

I E. 129 i form av råprodukt vil mengdeforholdet av Faktor B i alminnelighet være større enn mengdeforholdet av Faktor Z, mens som nevnt produkter inneholdende omkring like vektsdeler av de to Faktorer viser den største synergistiske virkning.

De nye antibiotiske midler fremstillet ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan anvendes på en hvilkensomhelst øn-sket måte. Således kan de avpasses for både oral og parenteral anvendelse. Preparater for oral anvendelse kan foreligge i form av f. eks. tabletter, kapsler, suspen-sjoner, siruper og miksturer.

Da Faktor B og Z ligner andre antibiotisk aktive Faktorer i E. 129, må man ta i betraktning metoder til identifisering og undersøkelse av disse to bestanddeler.

Faktor B er fullt ut karakterisert i patent nr. 94 895 og en fremgangsmåte til utvinning av denne Faktor er beskrevet i dette patent. Faktor Z er som foran nevnt identisk med det tidligere beskrevne antibiotiske middel PA114B, men for å utelukke tvil om denne bestanddels karakteristika angis her følgende angående disse:

Smeltepunkt: 270° C (spaltning) Absorpsjon i spektrets ultrafiolette om-råde: sesmetoder for bestemmelse av mengdefor-holdene av Faktor A, B og Z i E. 129-materiale. Disse metoder er viktige for overveiel-sen av om et bestemt råmateriale inneholder Faktor B og Z i ønskede forhold innenfor de foran angitte områder for vektsforholdet mellom disse Faktorer. Disse under-søkelsesmetoder er mikrobiologiske og er derfor underkastet .slike metoders begrens-ninger med hensyn til nøyaktighet. To me-, toder (I) og (II) er følgende: Metode I: Man :skiller først de tre f ak- i torer (A, B, Z) ved kromatografi på filtrer-1 papirark. Disse legges derpå på agarplater; som er podet med passende mikroorganis-mer, og størrelsen av hemnlngssonene er-j holdt etter inkubasjon sammenlignes med; hemningssoner som er forårsaket av kjente' mengder av de tre bestanddeler. ,

Metode II: Metode II kan bare brukes' til bestemmelse av Faktor Z. Den er i det, vesentlige en utvikling av den vanlige pla-; teteknikk. Der brukes en mikroorganismej som er mere følsom overfor Faktor Z enn! overfor Faktor A eller B. Enhver innvirk-j ning av de to sistnevnte faktorer minskes \ ytterligere ved å føre inn i agarmediet enj mengde av Faktor A som ligger under den! 'hemmende mengde..

Metode I: Utviklingsoppløsningen for den kro-j matografiske adskillelse av de tre faktorer' er toppfasen av en blanding av benzen,! cykloheksan, metanol og vann (5:5:6:4); til hvilken der tilsettes 0,5 % iseddik. Pas-j sende fortynninger av standardmengderj av faktorene utføres samtidig med fortyn-, ningen av de ukjente blandinger. j Ved sammenligning av hemningsso-J nene for de ukjiente blandinger med hem-j ningssonene for standardmegdene får manj kurver fra hvilke den mengde materiale! som er tilstede i prøven som undersøkes kan beregnes på vanlig måte. For bestemmelse av Faktor Z utføres utviklingen i omkring 7 timer, og agarplatene inneholder 0,05 (xg Faktor A pr. m-l. Som organisme for undersøkelsen brukes Staphylococcus aureus N.C.T.C. 7447 eller B. subtilis A.T. CC. 6633. For bestemmelse av Faktor A 'Og B er utviklingstiden 16-^24 timer, agarplatene inneholder 0,1 ^g pr. ml av Faktor Z og organisme for undersøkelsen er Sarcina lutea N.CiT.C. 611.

• Metode II:

Den organisme som brukes til under-søkelsen i denne metode er B. subtilis A.T. CC. 6633 og mediet (bestående av fast agar inneholder 4 ^g pr. ml av Faktor A. En standardoppløsning av Faktor 'Z i etanol fortynnes med citrat-pufferoppløsning med pH-verdi 6,3 så at man får konsentrasjoner på 4,0, 2,0 og 1,0 [xg pr. ml. Oppløsningene i disse fortynninger .påføres agarplaten på vanlig måte sammen med de oppløsninger som skal undersøkes 1 fortynninger. Pla-tene inkuberes natten over ved 37° C og sonenes størrelser måles. Logaritmen for dosenes vekt avsettes på et diaggram mot hemningssonenes diameter, hvorved man får en rett linje fra hvilken de undersøkte prøvers potensial kan bestemmes.

Til ytterligere forklaring av oppfinnelsen gis der i det følgende detaljer fra un-dersøkelser som er utført angående den antibiotiske aktivitet for Faktor B og Z.

Forsøk 1:

Aktiviteten ln vitro av blandinger inneholdende Faktor B og Z i forskjellige mengdeforhold ble bestemt. Resultatene var følgende:

Forsøk 2:

Aktiviteten in vivo av blandinger inneholdende Faktor B og Z i forskjellige mengdeforhold ble bestemt ved beskyttel- sesprøver under anvendelse av eksperimen-telle infeksjoner av mus med Staphylococcus aureus. Blandingene ble injisert subfcu-tant. Resultatene av to sett forsøk var føl-gende :

Forsøk 3:

Effektiviteten av forskjellige blandin ger av Faktor B og Faktor Z gitt oralt i sammenligning med subkutan anvendelse ble studert med følgende resultater:

Forsøk 4:

Innhold av antibiotikum i blodet.

Tre preparater ble sammenlignet ved anvendelse på mennesker. Hvert preparat ble gitt oralt i doser på 2 g. Innholdet av antibiotikum i blodet ble bestemt ved den hemmende virkning på Streptococcus py-ogenes (idet man brukte E. 129 i form av råprodukt, ref. i eksempel 1, som standard-materiale). Resultatene ble uttrykt som E. 129-råprodukt mikrogram-ml ekvivalenter. Preparat I inneholdt 10 % Faktor Z og 25 % Faktor B. Preparat II inneholdt 23 % Faktor Z og 21 % Faktor B. Preparat III inneholdt 50 % Faktor Z og 50 % Faktor B.

I nedenstående tabell angis de resultater som ble funnet hos mennesker ved de i tabellen angitte tidsrom etter at pre-paratet var gitt.

Det vil sees at preparat II tiltross for

et litt lavere innhold av Faktor B er preparat I overlegent, hva der skyldes at Faktor

B og Faktor Z er tilstede omtrentlig i det

optimale mengdeforhold 1:1. Det sees videre at preparat III er begge de andre preparater overlegent. I preparat III er det

fordelaktige mengdeforhold 1 : 1 kombinert

med det høyeste innhold av Faktor B som

er forenlig med disse mengdeforhold.

Disse resultater stemmer således med

forsøkene angående beskyttelse av dyr ved

at de viser at forholdet 1 : 1 mellom Faktor

B og Z er det fordelaktigste.

Claims (4)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av

et komplekst antibiotikum som inneholder faktorene B, Z og eventuelt A som finnes i 'E. 129-antibiotikum, karakterisert ved at urenset E. 129 for delvis eller fullstendig fjernelse av Faktor A og andre dermed føl-gende stoffer behandles med organiske oppløsningsmidler, så som metylisobutyl-keton eller etylacetat, særlig i motstrøm, hvoretter en del av den erholdte antibiotiske blanding hvis innhold av Faktor A er redusert, anrikes på Faktor Z f. eks. ved å underkastes en motstrømsekstraksjon og/eller kromatografisk adsorpsjon og på-følgende eluering, hvorpå den antibiotiske blanding som er anriket på Faktor Z, blan-des med den resterende del av blandingen med redusert innhold av Faktor A.

2. Fremgangsmåte ifølge påstand 1, karakterisert ved at den antibiotiske blanding med redusert innhold av Faktor A tilsettes så meget av den på Faktor Z anrikede antibiotiske blanding at vektsforholdet Faktor Z : Faktor B i det erholdte komplekse antibiotikum blir 1:5 til 5:1, fortrinnsvis 1:1.

3. Fremgangsmåte ifølge påstand 1 eller 2, karakterisert ved at den antibiotiske blanding med redusert innhold av Faktor A tilsettes så meget av den på Faktor Z anrikede blanding at den del som Faktor B utgjør av det erholdte komplekse antibiotikum, minst blir 15 vektprosent.

4. Fremgangsmåte ifølge påstander 1 —3, karakterisert ved at man ved behandling av det urensede E. 129 med organiske oppløsningsmidler fraskiller i det minste 30 vektprosent, fortrinnsvis minst 50 vektprosent, av andre stoffer enn Faktor B og Z og som foreligger i det urensede E. 129.