NO126375B - - Google Patents

Description

Stabilisert enzympreparat og fremgangsmåte til dets fremstilling.

Foreliggende oppfinnelse angår et stabilisert enzympreparat og fremgangsmåte til dets fremstilling hvorved enzymene bindes til en uorgan-

isk bærer inneholdende reaktive silanolgrupper, ved hjelp av hydrogen og aminsilikat-bindinger, hvorved enzymet blir uoppløselig og kan brukes en eller flere ganger etter meget lange lagringstider.

Et enzym er en biologisk katalysator som er istand til å

starte, fremme eller å styre en kjemisk reaksjon uten å bli oppbrukt ved reaksjonen eller bli en del av det dannede produkt. Enzymer er proteinholdige stoffer som syntetiseres av planter, dyr og mikro-

organismer.

Alle hittil isolerte enzymer har vist seg å være proteiner,

dvs. peptidpolymere av aminosyrer. Et enzym kan inneholde proste-tiske grupper som flavinadenin-dinucleotid, porphyrin, difosforpyri-din-nucleotid, etc. Noen enzymer krever metallioner som Mg eller Mn for å oppnå aktivitet. Enzymene er makromolekyler og har van-ligvis en molekylvekt på over 6000. Enzymenes isoelektriske punkt, dvs. den pH-verdi hvor nettoladningen på molekylenes overflate er lik null, varierer fra noe mindre enn 1.0 til 11.0. Ved eller nær denne hydrogenionekonsentrasjon har enzymene en tendens til å koabulere.

Enzymenes spesifisitet og deres evne til å katalysere reaksjoner hvor det opptrer meget lave konsentrasjoner har vært av spe-siell interesse ved kjemisk analyse. Enzymkatalyserte reaksjoner har vært anvendt for bestemmelse av substrater, aktivatorer, inhibitorer og for enzymer selv. Inntil nylig har ulempene ved anvendelsen av enzymene i meget sterk grad begrenset deres anvendelse. Hindringer for en effektiv utnyttelse av enzymer har vært deres ustabilitet, mangel på tilgjengelighet, dårlig renhet samt sterkt arbeidskrevende analyser. Et spesielt vanskelig problem har vært de høye omkost-ninger når man.har anvendt store enzymmengder ved analytisk kjemi, spesielt ved rutineanalyser.

Det har vært gjort en rekke forsøk på å fremstille enzymer

i en immobil form uten at aktiviteten går tapt, slik at en enzym-prøve kan brukes kontinuerlig i mange timer. Det immobiliserte enzym kan brukes på samme måte som et oppløselig enzym, dvs. det kan brukes for å bestemme konsentrasjonen av et substrat som påvirkes av enzymet, en inhibitor som deaktiverer enzymet, eller en aktiva-tor som gir en aksellerasjon av enzymaktiviteten. Enzymer har i denne forbindelse vært diazotert til cellulosepartikler eller til polyaminostyrenperler. Hittil har enzymer blitt immobilisert ved fysikalsk innfanging av enzymene ved absorbsjon, adsorbsjon eller ved ioneutveksling. Enzymene har også vært forsøkt immobilisert ved poly-tyrosylpolypeptider, kolloidale sammensetninger samt innkapslinger i semi-perraeable mikrokapsler fremstilt av syntetiske polymere.

Organiske materialer, spesielt organiske polymere har vært de viktigste bærere ved fremstilling av fysikalsk immobiliserte enzymer. Hovedulempen ved å anvende organiske materialer er at de kan utsettes for mikrobeangrep, noe som er et resultat av nærværet av karbonatomer i polymerkjeden, hvorved bæreren brytes ned og enzymet oppløseliggjøres. Koblingsmekanismen skjer dessuten ved hjelp av en diazobinding via en koblingsgruppe, hvorved enzymmolekylene bindes til bæreren bare ved forskjellige punkter langs enzymkjedens lengde. Når disse molekyler plasseres i vandige oppløsninger, så kan lett proteinet denatureres, hvorved enzymet mister aktiviteten. Det har også vært foreslått i US patent nr. 2 717 852 å adsorbere enzymer på slike uorganiske bærere som aktivert karbon eller leire.

Man har nå oppdaget en fremgangsmåte for å stabilisere enzymer ved at disse bindes til en uorganisk bærer som er i alt vesentlig immun overfor angrep av mikroorganismer, og hvor enzymet ellers bindes meget sterkt til bæreren langs hele kjedens lengde. Ved å anvende disse bærere kan man fremstille meget stabile enzymer som kan brukes en eller flere ganger over meget lange tidsrom uten tap av enzymaktivitet. Det er således mulig å kalibrere enzymets aktivitet og ha en viss sikkerhet for at enzymets aktivitetsnivå ved fortsatt bruk vil være i alt vesentlig konstant. Disse stabiliserte enzymer finner betydelig anvendelse ved analytiske fremgangsmåter, og de kan også brukes for fremstilling av kjemikalier, farmasøytiske stoffer og matvarer.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det således tilveiebragt et stabilisert enzympreparat som i alt vesentlig er vannuoppløselig og istand til gjentatte ganger å katalysere reaksjoner uten tap av aktivitet, og dette enzympreparat er kjennetegnet ved at den omfatter en vannuoppløselig uorganisk bærer med et overflateareal på over 0.1 m /g, idet bæreren utgjøres av porøst glass, et kolloidalt silisium-dioksyd, wollastonitt eller en porøs, tørket silisiumdioksydgel og har flere reaktive silanolgrupper på overflaten, hvilke grupper er ionisk bundet til enzymet ved hjelp av amin-silikatbindinger og ved hjelp av hydrogenbindinger til funksjonelle grupper i enzymet.

Oppfinnelsen omfatter også en fremgangsmåte til fremstilling av enzympreparatet, hvorved enzymet oppløses i en bufferoppløsning for å unngå denaturering, oppløsningen bringes ved en temperatur på opptil romtemperatur i kontakt med den uorganiske bærer med reaktive silanolgrupper, overskudd enzym fjernes og det således oppnådde bundne enzym-bærerprodukt vaskes med vann og bufferoppløsningen, hvilket produkt lagres i vann eller bufferoppløsning ved en temperatur på opptil romtemperatur.

De enzymer som kan stabiliseres ved denne fremgangsmåte omfatter en rekke forskjellige enzymer som kan klassifiseres under tre hovedgrupper: hydrolytiske enzymer, redoks-enzymer og transferaseenzymer. I den første gruppe, dvs. de hydrolytiske enzymer, finner man proteolytiske enzymer som hydrolys<*>erer proteiner, f.eks. papain, ficin, pepsin, trypsin, chymotrypsin, bromelin, keratinase; karbo-hydraser som hydrolyserer karbohydrater, f.eks. cellulase, amylase, maltase, pectinase, chitinase; esteraser som hydrolyserer estere, f.eks. lipase, cholinesterase, lecitinase, fosfatase; nucleaser som hydrolyserer nucleinsyrer, f.eks. ribonuclease, desoksyribonuclease, samt amidase som hydrolyserer aminer, f.eks. arginase, aspariginase, glutaminase og urease. Den annen gruppe er redokssystemer som kata-lyserer oksydasjons- eller reduksjonsreaksjoner. Enzymer i denne gruppe omfatter glucoseoksydase, catalase, peroksydase, lipoksydase og cytochromer. I den tredje gruppe finner man transferaseenzymer som overfører grupper fra et molekyl til et annet. Eksempler på

disse enzymer er glutamin-pyrodruesyre-transaminase, glutamin-oksal-eddiksyre-transminase, transmetylase, og fosfopyrodruesyre-transfos-forylase.

Den foretrukne bærer er porøst glass, enten i partikkelform eller som et helt stykke, f.eks. en skive eller en sylinder. Glass har den fordel at det er dimensjonsstabilt og at det kan renses meget godt for å fjerne forurensninger, f.eks. ved sterilisering. Porøst glass som kan anvendes som bærer er lett tilgjengelig og selges f.eks. kommersielt som "Code 7930 Porous Vycor Glass". Slikt porøst glass kan fremstilles med forskjellige poredimensjoner, f.eks. slik det er beskrevet i US patent nr. 2 106 77^ og fransk patent nr. 1 534 990.

En annen av de nevnte bærere som kan anvendes, nemlig kolloidalt si-lisiumdioksyd er kommersielt tilgjengelig under varemerket "Cab-O-Sil".

Bindingen av enzymet til bæreren er en enkeltrinns reaksjon som ikke omfatter anvendelsen av et koblingsmiddel. Denne reaksjon innebærer en hydrogenbinding og en ionebinding ved hjelp av amin-gruppene i enzymet og silanolgruppene i den keramiske bærer. Hydro-genbindingen opptrer via funksjonelle grupper i enzymet, f.eks. kar-bonyl-, amid-, sulfhydryl- og hydroksylgrupper, mens ionetypebind-ingen er en amin-silikatbinding ved enzymets terminale eller residuale amingrupper. Por å unngå tap av enzymaktivitet bør det være et vesentlig fravær av bindinger ved enzymmolekylets aktive posisjoner.

Ved utførelse av foreliggende fremgangsmåte blir enzym-pulveret oppløst i en bufferoppløsning og prøvet. Enzymet blir deretter bundet til den forbehandlede, reaktive bærer ved en temperatur på opp til romtemperatur. Enzymoverskuddet fjernes og det bundne enzym renses med destillert vann og buffer. Deretter blir den bundne enzym-bærer utlutet og prøvet inntil man oppnår en stabilisert verdi, hvoretter det stabiliserte enzym lagres i vann eller buffer ved romtemperatur eller lavere. Når enzymet skal bindes til bæreren, blir den vandige enzymoppløsning plassert i kontakt med bæreren ved temperaturer under romtemperaturer, fortrinnsvis ca.

5°C, ettersom enzymer er mer stabile ved lave temperaturer. Etter å ha vært i kontakt med bæreren i et tidsrom varierende fra 1 til 72 timer, er det stabiliserte enzym bundet til bærerens overflate, og et eventuelt overskudd av enzym blir deretter fjernet. Det førs-te opptak av protein av bæreren er avhengig av det isoelektriske punkt. Jo høyere isoelektrisk punkt molekylet har, dvs. jo mer bas-isk proteinet er på grunn av nærværet av amingrupper, jo større mengder protein kan bindes i den første reaksjon, som er en kjemisk binding mellom de basiske aminogrupper og de reaktive silanolgrupper i bæreren. Det er viktig at oppløsningens pH under bindingen er slik at enzymet ikke denatureres, og fortrinnsvis bør pH ligge på den sure side av det isoelektriske punkt. Det er viktig at man ut-luter ubundet enzym før det stabiliserte enzym anvendes. Denne utlutning kan ta fra et par timer og opp til et par dager. Lengden på utlutningen synes å være en funksjon av bærerens porestørrelse. Har bæreren meget liten porediameter, dvs. porer hvis dimensjoner er meget nær de molekylære dimensjoner på enzymet, kreves det lengre utlutningsperioder på fra 6 til 16 dager. Storporet materiale som glass og wollastonitt har nesten ingen eller meget liten utlutnings-periodé. Dette synes å indikere at utlutningen er et resultat av en kombinasjon mellom løst bundet enzym inne i porene og nedsatte diffu-sjonshastigheter når poredimensjonene nærmer seg enzymets molekyl-dimensjoner. En indusert, negativ ladning over det første lag av bundet enzym kan løst binde et annet og tredje enzymlag.

Når man skal fremstille enzymets bærermateriale, er det ofte meget nødvendig å forbehandle bæreren for det formål å gjøre silanolgruppene mer lett tilgjengelige og reaktive. Hvis f.eks. porøst glass ikke forbeharidles, så kan det inneholde mange forskjellige forurensende stoffer som okkuperer de tilgjengelige reaktive posisjoner. Ved å rense glassets overflate, blir i vesentlig grad alle de aktive posisjoner tilgjengelige. En typisk rensemåte for porøst glass er som følger. En prøve på det porøse glass blir ren-

set med ultralyd i en fortynnet salpetersyreoppløsning ved ca. 80°C ill/2 time, ble så renset med destillert vann og overført til en ovn. Temperaturen i ovnen heves til ca. 625°C og holdes på denne temperatur i fra 15 til 90 minutter mens man kontinuerlig tilfører ovnen rent oksygen. Prøven blir deretter avkjølt i en strøm av oksygen og ekvilibreres under redusert trykk mot vanndamp. Hvis man anvender wollastonit, så må dette materiale renses med ultralyd i vann inntil pH nærmer seg 7> hvoretter stoffet underkastes en opp-varmning av den type som er beskrevet ovenfor for porøst glass.

Det produkt som oppnås ved foreliggende fremgangsmåte er

et immobilisert enzym som er vannuoppløselig. Enzymet er blitt stabilisert slik at det har et konstant aktivitetsnivå i meget lange tidsrom. Når det lagres ved temperaturer på 5°C eller endog ved romtemperatur i perioder på flere måneder, så viser det bundne enzym et konstant aktivitetsnivå selv ved gjentatte anvendelser ved for-søksbetingelsene. Den mengde enzym som kan stabiliseres er en funksjon av enzymets molekylvekt, bærerens porediameter og overflateareal, slik dette er beskrevet ovenfor.

Følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.

Eksempel 1.

Det ble fremstilt et representativt nucleaseenzym med betegnelsen RNAase og med følgende egenskaper: molekylvekt 12700, isoelektrisk punkt pH 7, 8, preparataktivitet 1530 enheter/mg.

Prøvebetingelser: 4 minutters inkubering ved 37°C i 0,1 molar acetatbuffer pH 5, 0. Substrat - 1 % ribonueleinsyre i buf-

fer. Utfellingsmiddel - 0,75 $ uranylacetat i 25 % perklorsyre.

Definisjon av aktivitetsenhet: en enhet er ekvivalent

til den mengde syreoppløselig oligonucleotid som forårsaker en øk-

ning av den spektrofotometriske absorbsjon ved 260 n<y>u på 1,0 i løpet av 4 min. ved pH 5>0«

Bæreren var en porøs glassprøve med betegnelsen

"Gode 79307.og var en sylinder med ytre diameter 1,2 cm, indre diameter 1,0. cm, lengde 5 cm» vekt 2,0 g, porediameter på 74 Å, overflateareal på 113 m2/g.

Prøven ble renset ved at den ble holdt i 1,2 molar HC1

i 30 minutter. Den ble deretter overført til en ovn og temperaturen

langsomt hevet til 550°C og holdt på denne temperatur i 3 timer. Etter avkjøling ble glasset senket ned i og ekvilibrert mot en 0,1 molar acetatbuffer over natten ved pH 5>0.

Bindingen av enzymet: Glassylinderen ble plassert i et prøverør. Dette rør ble så senket ned i et vannbad hvis temperatur var 5°C, °g en 6 molar oppløsning inneholdende 0,5 mg RNAase/ml i 0,1 molar acetatbuffer.ble tilsatt røret ved pH 5, 0. Man lot enzymet reagere med sylinderen i 6 timer ved 5°C. Sylinderen ble' 6å tatt opp av enzymoppløsningen og ekstrahert to ganger med bufferen.

Prøving og lagring av RNAase-sylinderen: Sylinderen ble prøvet i 20 ml av en 1 : 1 acetatbuffer fortynnet med ribonuclein-syreoppløsning. Etter 4 minutters inkubering ble en 2 ml prøve fjernet for analyse. Mellom de enkelte analyser ble sylinderen først vasket skikkelig med buffer og deretter lagret i buffer ved 5°c.

De oppnådde resultater indikerer en opprinnelig aktivitet på 0,040 mg/g glass. Etter en utlutningsperiode på ca. 12 dager fikk sylinderen et relativt konstant aktivitetsnivå tilsvarende 0,0075 mg RNAase pr. g glass. Aktiviteten holdt seg på dette nivå i 111 døgn.

Det protein som var bundet til glasset ble beregnet ved å bestemme de optiske tettheter ved 280 rryu i den opprinnelige enzymoppløsning, den oppløsningen som ble anvendt for bindingen og for ekstraktene. I begynnelsen var 5 % av det bundne enzym aktivt. Dette tall falt til 1,2 % etter utlutningen.

Eksempel 2.

Det ble fremstilt et representativt proteolytisk enzym, d.v.s. et papain med følgende egenskaper: molekylvekt 21.000, isoelektrisk punkt pH 8,75» preparataktivitet 0,01 enheter/mg.

Prøvebetingelser (modifisert Kunitz-fremgangsmåte): 60 minutters inkubering ved 40°C i en 0,1 molar fosfatbuffer, pH 5>8> som inneholdt 0,005 molar cystein og 0,001 molar etylendiamintetraeddiksyre (EDTA). Substrat - 1 % kokt casein i buffer. Utfellingsmiddel - 5 % trikloreddiksyre.

Definisjon av aktivitetsenhet: en enhet er ekvivalent til den mengde syreoppløselig peptid som frembringer en forandring av den optiske tetthet ved 280 nyu på 0,001 pr. minutt.

Bæreren var i dette tilfelle en porøs glassprøve med betegnelsen<n>Code 7930" og var en sylinder med ytre diameter på 1,2 cm, indre diameter på 1,0 cm, lengde 2,5 cm, vekt 1,27 g> porediameter 68 Å og et overflateareal på 118 m<2>/g. Prøve ble renset med ultralyd i 0,2 normal HNO^ ved 80°C. Prøven ble deretter overført til en ovn, og temperaturen ble langsomt hevet til 100°C og holdt på denne temperatur i 1 time. Sylinderen ble deretter overført til et tørkekammer for ekvilibrering mot vanndamp. Glasset ble ikke buffer-ekvilibrert før bruk.

Binding av enzymet: Glassylinderen ble plassert i et prøverør og dette ble senket ned i et vannbad hvis temperatur var 5°C, hvoretter man tilsatte /\. ml av en 0,1 molar fosfatbuffer inneholdende 4 mg papain og med en pH på 6,95- Enzymet reagerte med sylinderen ill/2 time ved 5°C Den ble deretter fjernet fra enzymoppløsningen og ekstrahert to ganger med vann.

Prøving og lagring av papainsylinderen: Sylinderen ble prøvet i 5 ml av en 1 : 1 bufret, fortynnet substratoppløsning inneholdende 0,005 molar cystein og. 0,001 molar etylendiamintetraeddiksyre, og etter 1 times inkubering ble en 4 ml prøve tatt ut for analyse. Mellom analysene ble sylinderen ekstrahert med vann og deretter enten lagret i vann eller i en 0,1 molar fosfatbuffer, pH 5,8, inneholdende 0,01 molar cystein og 0,002 molar etylendiamintetraeddiksyre ved 5°C (lagringsoppløsningen hadde ingen effekt på resultatene).

Etter en utlutningsperiode på ca. l6 døgn hadde sylinderen et relativt konstant aktivitetsnivå tilsvarende 0,07 mg papain

pr. gram glass. Denne aktivitet holdt seg i en periode på 122 døgn. I begynnelsen var 90 % av det bundne enzym aktivt, men dette tall falt til 4 % etter utlutningsperioden.

Eksempel 3.

Ved å bruke papainenzymet fra eksempel 2 ble følgende

eksperiment utført:

Porøs glassprøve, "Code 7930"» sylinder ytre diameter 1,2 cm, indre diameter 1,0 cm, lengde 2,5 cm, vekt 126 g, porediameter 68 Å og et overflateareal på ll8 m<2>/g. Prøven ble renset med ultralyd i en 0,2 N HNO^-oppløsning ved 80°C i 1 l/2 time. Den ble deretter overført til en ovn og temperaturen ble langsomt hevet til l80°C og holdt på denne temperatur over natten. Glasset ble avkjølt og vanndamp-ekvilibrert. Glasset ble ikke buffer-ekvilibrert før bruk.

Binding av enzymet: Glassylinderen ble plassert i et prøverør og dette ble nedsenket i et 5°c bad, hvoretter 4 nil av en 0,1 molar fosfatbuffer, pH 8,7, inneholdende 1 mg papain/ml ble til-

satt. Enzymet ble reagert med glasset i 2 timer ved 5°C. Den ble deretter fjernet fra enzymoppløsningen og ekstrahert med pH 8,7

buffer.

Lagring av papainsylinderen: Mellom analysene ble sy-

linderen lagret i en 0,1 molar fosfatbuffer, pH 5>8 og inneholdende 0,01 molar cystein og 0,002 molar etylendiamintetraeddiksyre ved romtemperatur.

Sylinderen fikk et konstant aktivitetsnivå tilsvarende

0,04 mg papain pr. g glass. Aktiviteten holdt seg på dette nivå i

86 døgn.

Eksempel 4.

Ved å anvende papainenzymet fra eksempel 2 ble følgende eksperiment utført:

Porøs glassprøve: "Code 7930*. sylinder ytre diameter 1,1

cm, indre diameter 1,0 cm, lengde 3>5 cm> vekt 0,8 g, porediameter

92 Å og et overflateareal på 60 m<2>/g. Prøven ble renset med ultra-

lyd i en 0,2 N HNO^-oppløsning ved 80°C, overført til en ovn og temperaturen blir langsomt hevet til 200°C og holdt på dette nivå

over natten. Glasset ble avkjølt og vanndampekvilibrert. Prøven

ble ikke buffer-ekvilibrert før bruk.

Binding av enzymet: Papain ble bundet til glasset fra

en 0,1 molar fosfatbuffer, pH 6,95. Glasset ble eksponert overfor 5 ml av en enzymoppløsning (4 mg papain/ml) i 1 time ved 5°C. Glas-

set ble ekstrahert 5 ganger med vann og 1 gang med 0,1 molar fosfatbuffer, pH 5>8, inneholdende 0,01 molar cystein og 0,002 molar etylendiamintetraeddiksyre.

Lagring av papainsylinder: Mellom analysene ble sylin-

deren lagret i en 0,1 molar fosfatbuffer, pH 5,8 og inneholdende 0,01 molar cystein og 0,002 molar etylendiamintetraeddiksyre ved 5 C.

Denne sylinder ble prøvet 40 ganger i løpet av 82 døgn.

Etter en utlutningsperiode på 12 døgn fikk den et relativt konstant aktivitetsnivå tilsvarende 0,08 mg papain pr. g glass, og dette holdt seg i " JO døgn.

Eksempel 5.

Ved å bruke papainenzymet fra eksempel 2 ble følgende eksperiment utført:

Porøst glassprøve: "Code 7930'! sylinder ved ytre

diameter på 1,2 cm, indre diameter på 1,0 cm, lengde 2,5 cm, vekt 1,3 g, porediameter 68 Å og overflateareal på 118 m<2>/g. Prøven ble renset med ultralyd i 0,2 N HNO^ ved 80°C i 1 l/2 time. Den ble deretter overført til en ovn og temperaturen langsomt hevet til l80 C og holdt på denne temperatur over natten. Glasset ble av-kjølt og vanndamp-ekvilibrert. Det ble ikke buffer-ekvilibrert før bruk.

Binding og tverrbinding av enzymet: Papain ble bundet til glasset fra en 0,1 molar fosfatbuffer, pH 6,95 ved 5°C. Glasset ble eksponert overfor 4 ml av en oppløsning inneholdende 2 mg papain/ml i 4 timer. Det ble deretter ekstrahert 1 gang med vann. Det bundne enzym ble tverrbundet i en 1 %' s formaldehydoppløsning over natten ved 5°C. Sylinderen ble så ekstrahert 3 ganger med vann og endelig 1 gang med 0,1 molar fosfatbuffer, • pH 5>8 og inneholdende 0,01 molar cystein og 0,002 molar EDTA.

Lagring av den tverrbundne papainsylinder: Mellom analysene ble sylinderen lagret i en 0,1 molar fosfatbuffer, pH 5>8, inneholdende 0,01 molar cystein og 0,002 molar EDTA ved 5°C.

Etter en utlutningsperiode på 9 døgn hadde glasset et konstant aktivitetsnivå tilsvarende 0,09 mg papain pr. g glass. Dette nivå holdt seg konstant i 48 døgn, og synes å være ca. 1,3 ganger større enn ikke-tverrbundet papain.

Eksempel 6.

Ved å bruke papainenzymet fra eksempel 2 ble følgende eksperiment utført.

Finfrittet glassprøve: "Code 7740^-borsilikatglass, fire 20 mm flate skiver, total vekt 4>63 g, porediameter 50*000 Å, overflateareal 0,2 m<2>/g. Prøven ble renset med ultralyd i 0,2 N HNO^ ved 80°C i 1 l/2 time. Den ble deretter overført til en ovn og temperaturen langsomt hevet til 200°C og holdt her i 2 timer. Det ble deretter avkjølt, men ikke bufret eller vanndamp-ekvilibrert.

Binding av enzymet: Papain ble bundet til glasset fra en 0,1 molar fosfatbuffer med pH 6,95* De fire glasskivene ble eksponert overfor 5 ml av en enzymoppløsning (0,84 mg papain/ml) i 17 timer ved 5°C De ble deretter ekstrahert to ganger med buffer og to ganger med vann.

Lagring av de papainfrittede skiver: Mellom analysene ble skivene lagret i 0,1 molar fosfatbuffer, pH 5>8 °g inneholdende 0,01 molar cystein og 0,002 molar EDTA ved 5°C.

Etter et døgns utlutning hadde glasset et konstant aktivitetsnivå tilsvarende 0,014 mg papain pr. g glass. Dette nivå holdt seg konstant i 83 døgn.

Eksempel 7.

Ved å bruke papainenzymet fra eksempel 2 ble følgende eksperiment utført: Porøse glasspartikler - 60 til +80 mesh, vekt 1,0 g, porediameter $ 00 Å, overflateareal 20 m2/g. Prøven ble renset ved at den ble eksponert overfor en temperatur på 625°C i nærvær av oksygen i 15 minutter. Den ble deretter avkjølt i en strøm av Og og deretter ekvilibrert ved redusert trykk mot vanndamp.. Prøven ble ikke buffer-ekvilibrert før bruk.

Binding av enzymet: Papain ble bundet til glasset fra en 0,1 molar fosfatbuffer ved pH 6,95- Et gram av glasspartiklene ble eksponert overfor 4 ml av en enzymoppløsning (4 mg papain/ml) i 70 timer ved 5°C Glasset ble så ekstrahert to ganger med buffer og deretter med vann. Enzym-glasspartiklene ble så overført til et stykke filtrerpapir, hvoretter papiret ble festet rundt stykkene med tråd. De papir-innpakkede partikler ble brukt som en "tepose" for enzymbestemmelser.

Prøving og lagring av papirinnpakkede papainpartikler: "Teposen" ble prøvet i 15 ml av en 1 : 1 buffer fortynnet substrat-oppløsning (pH 5>8) inneholdende 0,005 molar cystein og 0,001 molar EDTA. Etter 1 times inkubering ved 40 C ble 4 ml prøver tatt ut for analyse. Mellom analysene ble "teposen" lagret ved 5°C i en 0,1 molar fosfatbuffer, pH 5>8> inneholdende 0,01 molar cystein og 0,002 molar EDTA.

Etter et døgns utlutning hadde glasset et konstant aktivitetsnivå tilsvarende 0,33 m§ papain pr. g glass. Dette nivå holdt seg konstant i 43 døgn.

Eksempel 8.

Ved å bruke papainenzymet fra eksempel 2 ble følgende eksperiment utført: Porøst siliciumdioksyd-glass ble fremstilt ved å tørke en alkali-fri siliciumdioksydgel med uregelmessig form, og hvis vekt var <0>,793 g> porediameter 75 Å og overflateareal 39^ m<2>/g. Prøven ble renset ved langsomt å heve temperaturen til 625°C i nærvær av en oksygenstrøm. Prøven ble holdt på denne temperatur i 45 minutter og deretter avkjølt i en Og-strøm. Glasset ble vanndamp-ekvilibrert under redusert trykk. Den ble imidlertid ikke buffer-ekvilibrert før bruk.

Binding av enzymet: Papain ble bundet til siliciumdioksyd-gelglasset i en 0,1 molar fosfatbuffer hvis pH var 6,95. Glasset ble eksponert overfor 6 ml av en enzymoppløsning (2 mg papain/ml) i 17 timer ved 5°C Glasset ble ekstrahert en gang med buffer og 10 ganger med vann.

Lagring og prøving av papain-siliciumdioksydgelen: Glasset ble prøvet i 6 ml av en 1 : 1, pH 5»8, buffer fortynnet substratoppløsning inneholdende 0,005 molar cystein og 0,001 molar EDTA. Etter 1 times inkubering ved 4-0°C ble en 4 ml prøve tatt ut for analyse. Mellom analysene ble glasset lagret ved 5°C i en 0,1 molar fosfatbuffer, pH 5»8> inneholdende 0,01 molar cystein og 0,002 molar EDTA.

Etter en utlutning på mer enn 6 døgn fikk glasset et aktivitetsnivå tilsvarende ca. 0,055 mS papain pr. g glass.

E! ksempel 9.

Ved å bruke papainenzymet fra eksempel 2 ble følgende eksperiment utført.

Wollastonitprøve: En sylinder med ytre diameter på 0,9 cm, indre diameter på 0,8 cm, lengde 2,5 cm, vekt 0,925 g» porediameter < 150 Å til 4500 Å, overflateareal 0,1 m<2>/g. Prøven ble renset ved langsomt å heve temperaturen til 625°C i nærvær av rent oksygen. Prøven ble holdt på denne temperatur i 45 minutter og deretter avkjølt i en oksygenstrøm. Wollastoniten ble vanndamp-ekvilibrert under redusert trykk. Den ble ikke buffer-ekvilibrert før bruk.

Binding av enzymet: Papain ble bundet til wollastoniten i en 0,1 molar fosfatbuffer med pH på 6,95- Prøven ble så eksponert overfor 4 ml av en enzymoppløsning inneholdende 2 mg papain/ml, i 17 timer ved 5°C. Den ble deretter ekstrahert en gang med buffer og 10 ganger med vann.

Prøving og lagring av papain-wollastonit-sylinder: Sylinderen ble prøvet i 5 ml av en 1 : 1, pH 5»8, buffer-fortynnet substratoppløsning inneholdende 0,005 molar cystein og 0,001 molar EDTA. Etter 1 times inkubering ved 40°C ble en 4 ml prøve tatt ut for.analyse. Mellom analysene ble sylinderen lagret ved 5°C i en 0,1 molar fosfatbuffer, pH 5>8, inneholdende 0,01 molar cystein og 0,002 molar EDTA.

Skjønt man oppnådde relativt varierende aktivitetsnivåer i denne prøve, så synes utlutningen ikke å ha noen innflytelse. Den totale aktivitet i en 35 døgns periode synes å være 0,11 mg papain pr. g wollastonit.

Eksempel 10.

Det ble fremstilt et representativt redoks-enzym, nemlig glucose-oksidase med følgende egenskaper: molekylvekt 150,000, isoelektrisk punkt 4>3°g preparataktivitet på 45 >5 /u/mg.

Prøvebetingelser: Inkuberingen ble utført ved romtemperatur i en 0,01 molar fosfatbuffer med pH 7,0. Substrat - 22,4 mg {3-D-glucose/ml buffer (endelig konsentrasjon 18 mg/ml). For å bestemme det fremstilte HgOg ble en 2,1 ml prøve av reaksjonsblan-dingen fjernet, hvoretter 0,025 ml av en 1 $ oppløsning av 0-dianisidin i metanol tilsatt, fulgt av 0,5 ml peroksidase-oppløsning (0,04 mg/ml).

Definisjon av aktivitetsenhet: En enhet er ekvivalent til en produksjonshastighet på 1 mikromol HgOg pr. time ved romtemperatur. Produksjonen av H^O,-, bestemmes ved dens dekomponering i

, nærvær av peroksidase og 0-dianisidin. Oksydasjonen av 0-dianisidin bestemmes ved en økning av den optiske tetthet ved 46O nyu.

Porøs glassprøve: "Code 793°" sylinder med ytre diameter på 1,2 cm, indre diameter på 1,0 cm, lengde 2,5 cm, vekt 1,3 g, porediameter 68 Å og overflateareal på 118 m<2>/g. Prøven ble renset med ultralyd i en 0,1 N HNO^-oppløsning ved 80°C ill/2 time. Prøven ble deretter overført til en ovn og temperaturen langsomt hevet til l80°C og holdt på denne temperatur over natten. Glasset ble så avkjølt og ekvilibrert mot en 0,01 molar fosfatbuffer med pH 7,0 i en time.

Binding av enzymet: Enzymet ble bundet til glasset fra en 0,01 molar fosfatbuffer med pH 7,0. Sylinderen ble eksponert overfor 4 ml av en glucoseoksydase-oppløsning (2 mg/ml) i 1 time ved 5°G. Den ble deretter ekstrahert med vann.

Lagring av glucose-oksydasesylinder: Sylinderen ble lagret i en 0,01 molar fosfatbuffer med pH 7,0 ved romtemperatur mellom analysene.

Etter en utlutningsperiode på 3 døgn hadde sylinderen et aktivitetsnivå tilsvarende 0,0001 mg glucoseoksydase.

Eksempel II.

Ved å anvende glucoseoksydaseenzymet fra eksempel 10 ble'

følgende eksperiment utført.

Porøs glassprøve: Partikler - 60 + 80 mesh, vekt 1,0 g, porediameter 900 A, overflateareal 20 m /g. Prøven ble renset ved at den ble eksponert overfor 625°C i nærvær av oksygen i 15 minutter. Den ble deretter avkjølt i en oksygenstrøm og deretter ekvilibrert under redusert trykk mot vanndamp. Glasset ble ikke buffer-ekvilibrert før bruk.

Binding av enzymet: Glucose-oksydasen ble bundet til glasset fra en 0,1 molar fosfatbuffer med pH 6,95* Et gram av glasspartiklene ble eksponert overfor 4 ml av enzymoppløsningen (5 mg glucoseoksydase pr. ml) i 70 timer ved 5°C Glasset ble ekstrahert to ganger med buffer og deretter med vann. Enzym-glasspartiklene ble overført til et stykke filtrerpapir og innpakket i dette. De papirinnpakkede partikler ble brukt som en "tepose" for enzymbestemmelser.

Prøving og lagring av papirinnpakkede glucoseoksydase-partikler: "Teposen" ble prøvet i 125 ral av en 0,01 molar fosfatbuffer, pH 6,95»°g denne inneholdt l8 mg glucose/ml ved romtemperatur. 2,5 ml prøve ble fjernet hvert 3dje minutt for analyse. Mellom analysene ble "teposen" lagret ved 5°C i 0,01 molar fosfatbuffer, pH 6,95.

Etter 17 dagers lagring kunne man ikke påvise noen utlutning og glasset synes å ha et konstant aktivitetsnivå tilsvarende 0,123.mg glucoseoksydase pr. g glass. Først den 21ste dag fikk man et relativt sterkt fall til 40 % av det opprinnelige aktivitetsnivå. Dette aktivitetsnivå skylles antagelig at enzymet ble eksponert overfor damper av CSg og GgH^OH. Ved gjentatte analyser i løpet av de neste 24 timer, kunne man påvise en fornyet aktivitet til et punkt på 78 % av det opprinnelige konstante aktivitetsnivå. Ytterligere tap av aktivitet ble bemerket etter ytterligere 20 døgn og 41 døgn. Etter 64 døgns lagring var aktivitetsnivået tilsvarende 0,04 mg glucoseoksydase pr. g glass. På dette tidspunkt kunne man bemerke en meget sterk mikrobevekst på "teposen". Aktivitetstapet kan derfor skylles at mikrobene fremstilte en inhibitor eller ned-brøt enzymet.

Noen av de ovennevnte resultater er angitt i den følgende tabell. De oppnådde data er sammenlignet med et ikke-porøst glass-rør.

Resultatene indikerer:

(1) at når bærerens overflateareal øker, så øker den tilsvarende mengde enzym som bindes, inntil poredimensjonene nærmer seg enzymets molekylære dimensjoner. På dette punkt vil et mindre overflateareal av bæreren være tilgjengelig for binding, noe som resulterer i en senkning av mengden bundet enzym. (2) at for en gitt porøs bærer, så vil en økende molekylvekt for enzymet gi en synkende mengde bundet enzym. Det er imidlertid en optimal porestørrelse for et gitt enzym, og dette punkt nåes når porediameteren omtrent tilsvarer kvadratroten av enzymets molekyIvekt.

Claims (4)

1. Stabilisert enzympreparat som i alt vesentlig er vannuopp-løselig og i stand til gjentatte ganger å katalysere reaksjoner uten tap av aktivitet, karakterisert ved at det omfatter en vannuoppløselig uorganisk bærer med.et overflateareal på over 0.1 m /g, idet bæreren utgjøres av porøst glass, et kolloidalt silisium-dioksyd, wollastonitt eller en porøs, tørket silisiumdioksydgel og har flere reaktive silanolgrupper på overflaten, hvilke grupper er ionisk bundet til enzymet ved hjelp av amin-silikatbindinger og ved hjelp av hydrogenbindinger til funksjonelle grupper i enzymet.

2. Stabilisert enzympreparat ifølge krav 1, karakter i-s1e r t ved at bæreren utgjøres av porøst glass.

3. Fremgangsmåte til fremstilling av et stabilisert enzympreparat ifølge krav 1, karakterisert ved at enzymet oppløses i en bufferoppløsning for å unngå denaturering, oppløsningen ° bringes ved en temperatur på opp til romtemperatur i kontakt med den uorganiske bærer med reaktive silanolgrupper, overskudd enzym fjernes, og det således oppnådde bundne enzym-bærerprodukt vaskes med vann og bufferoppløsning, hvilket produkt lagres i vann eller bufferoppløs-ning ved en temperatur på opp til romtemperatur.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at det som bærer anvendes et porøst glass som er underkastet en rensende forbehandling for å gjøre silanolgruppene i bæreren lett tilgjengelige og reaktive.