NO125678B - - Google Patents

Description

Fremgangsmåte til fremstilling av et antibiotisk middel.

Det er kjent at antibiotiske midler som først bare ble brukt for terapeutiske formål, nu også brukes for andre formål med tilfredsstillende resultater.

Det er funnet at en actinomycet når

den dyrkes i passende flytende, nærende medier er i stand til å gi et antibiotisk stoff som kan ekstraheres fra kulturmediet ved hjelp av passende metoder.

Det nye aktive stoff som dannes ved

dyrking av actinomyceten er gitt navnet «flavensomycin». De fysikalske og kjemiske karakteristika for flavensomycin er forskjellige fra de hittil kjente antibioti-kas. De nye antibiotiske middel er utvun-net av kulturvæsker av en streptomyces som ble isolert fra jordbunnen i et gårds-bruk i Cavour, Piemonte. Denne streptomyces-art tilhører den kromogene gruppe og er gitt navnet Streptomyces Cavouren-

sis, stamme nr. 829.8.52. Den er deponert i Institute of Microbiology, Rutgers Uni-versity, New Brunswick, New Jersey, USA i desember 1957, og registrert under nr. W. 3758. Dessuten er denne stamme

registrert i Commonwealth Micological Institute, Kew, Surrey under nummer 70852, samt i National Collection of Indu-strial Bacteria, Teddington, Middlesex under nr. 8918.

Denne organismes vegetative mycelium dannes av lange, tynne forgrenede eller sammenbuntede hyfer. Luftmyceliet dannes av lange, rette eller bølgeformede hyfer som bærer avrundede konidier (sporer) som ikke er gruppert som busk-vekster.

Spiraler er ikke observert. Kulturkarakteristika for Streptomyces 829 angis i følgende tabell 1.

Denne streptomyces-art kan dyrkes ved hjelp av vanlige metoder, deriblant med stasjonære og neddykkede kulturer. Sistnevnte gir de beste kulturer. Kultur-mediene må inneholde kullhydrater, en passende kilde for nitrogen samt mineralsalter. Dyrkingen kan utføres ved temperaturer mellom 24 og 32° C og er avhengig av luftningen, omrøringen og det nærende mediums sammensetning. I praksis oppnåes i alminnelighet det maksimale ut-bytte fra det fjerde til det syvende dyrk-ningsdøgn.

Under dyrkningen stiger pH verdien til 7,8—8, og den bør ikke overstige disse verdier.

Den kulturvæske man får tilbake efter dyrkningen av streptomyces-arten som gir flavensomycinet, inneholder forskjellige stoffer som rester av nærende elementer, «lysated» mycelium, foruten det aktive stoff som kan nå en konsentrasjon på 1600 enheter pr. ml eller høyere, avhengig av kulturmediet og dyrknings-betingelsene.

Flavensomycin kan ekstraheres fra kulturvæsken ved hjelp av forskjellige

oppløsningsmidler som ikke. er blandbare med vann, som eter, kloroform, butanol, etylacetat, bensin, benzen, osv., ved en pH verdi mellom 7,5 og 8,5. ,

Det erholdte ekstrakt inneholdende det antibiotiske middel som råprodukt inndampes i vakuum ved temperaturer mellom og inklusive 20 og 30° C.

Rensningen av råproduktet utføres ved kromatografi av den inndampede væs-ke gjennom en aluminiumoksydkolonne som er tilført en av de foran nevnte opp-løsningsmidler, fortrinsvis benzen.

Rensning av det antibiotiske middel oppløst i benzen (rå-ekstrakt) kan utføres på to forskjellige måter: 1) Ved kromatografi av rå-ekstraktet i en aluminiumoksydkolonne. Man tilfører denne kolonne en benzenoppløsning, vasker den omhyggelig med benzen for å fjerne fett og fraksjoner som er inaktive og har gul til rød farve. Man vasker derpå med etylacetat, hvorved en annen inaktiv gulfarvet fraksjon elueres. Sluttelig vasker man med absolutt metanol, hvorved det antibiotiske middel elueres. 2) Rå-esktraktet felles med petroleter, bunnfallet oppløses i aceton, felles på-ny med petroleter, oppløses i benzen og kromatograferes i aluminiumoksyd. Kolonnen vaskes med benzen og etylacetat, hvorpå det antibiotiske middel elueres med absolutt metanol.

Flavensomycin utvinnes fra metanol-oppløsningen ved å fordampe metanolet. Det er et krystallinsk sitrongult pulver.

I det følgende beskrives som eksempel en utførelsesform for fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.

Eksempel: Streptomyces-stammen dyrkes i et agar-asparaginglycerolmedium ved 27° C. På dette medium oppnåes en meget god vekst av sporer. Produksjonsmediet kan podes direkte med sporer eller med et pod-ningsmedium bestående av en 24 timer gammel streptomyces-kultur som.er dyr-ket på et medium av samme sammensetning som produksjonsmediet, ved 27° C og under neddykkede betingelser.

Til hver kolbe eller hvert dyrknings-apparat ble brukt følgende medium: -maltose 20 . g -pepton ................ 5 » -kornstøpvæske ........ 2.5 » -ledningsvann .......... 1 liter

Kolbens eller dyrkningsapparatenes innhold podes med sporer eller podnings-medium og dets pH verdi innstilles på 7 med natriumhydroksyd.

Når dyrkningen er avsluttet, heves pH verdien til 7,5—8,5 og man arbeider ved en temperatur på 27—28° C. Myceliet tas ut og det antibiotiske middel ekstraheres fra dyrkningsmediet med tre porsjo-ner benzen i forholdet benzen og dyrk-ningsmedium på 3 : 1. Herunder passer man omhyggelig at pH verdien ligger mellom 7,5 og 7,8. Under disse betingelser oppløses flavensomycin i benzen.

Ekstraktets volum minskes ved inn-dampning i vakuum innen et temperatur-område mellom 20 og 40° C. Selv de siste spor av vann fjernes ved denne operasjon.

Produktet renses ved kromatografi av det inndampede ekstrakt i en aluminiumoksydkolonne som er tilført benzen.

1) Det antibiotiske middel absorberes sammen med noen fraksjoner med gul til rød farve mens aktive fraksjoner og røde til fiolette pigmenter ikke absorberes. Kolonnen vaskes flere ganger med benzen og derpå med etylacetat, hvorved der elueres en gul, inaktiv fraksjon. Sluttelig vaskes der med absolutt metanol hvorved den aktive

fraksjon (flavensomycin) tas ut. Noen rødfarvede inaktive fraksjoner som kan elueres med aceton og vann blir tilbake i kolonnen.

2) Det konsentrerte benzenekstrakt av det antibiotiske middel felles med petroleter. Bunnfallet som utgjør den aktive bestanddel oppløses i aceton og felles påny med petroleter. De fettaktige pig-menterte fraksjoner med gul til rød farve som ikke adsorberes i alumini-umsoksydkolonnen og således krever

en meget langvarig vaskning av kolonnen med benzen, fjernes nesten full-stendig ved hjelp av denne metode. Bunnfallet oppløses i benzen og kromatograferes i en aluminiumoksydkolonne. Efter vasking med benzen og etylacetat elueres den aktive fraksjon med absolutt metanol.

Flavensomycin utvinnes fra metanol-oppløsningen ved å fordampe metanolen. Man får et sitrongult, krystallinsk pulver uten lukt og ikke hygroskopisk.

Det nye antibiotiske middel viser føl-gende kjemiske og fysikalske egenskaper: Flavensomycinets klare, citrongule farve forandres ikke i alkaliske eller i sure media. Produktet inneholder 2,11 % nitrogen, og inneholder ikke svovel eller halo-gen.

Stoffets absorpsjonsspektrum i det ul-trafiolette område viser bare ett maksi-mum, nemlig ved 251.

Dets absorpsjonsspektrum i det infra-røde område viser hovedmaksima ved 2,90 3,26 — 3,45 — 5,86 — 5,94 — 6,17 — 6,51 — 6,92 — 8,02 — 9,05 — 10,04 — 10,32 — 10,91 — 13,02 — 13,13 mikroner ( se vedføyede tegning).

De angitte første seks maksima tilsva-rer følgende funksjonelle grupper: OH; CH, CO, konjugert CO, konjugert dobbeltbinding, fenyl. Nærværet av sistnevnte gruppe og av konjugert CO er ikke sikker.

Absorpsjonsspektret i infrarødt for flavensomycin i kaliumbromid ved konsentrasjon på 3 % (nederste kurve B) er i vedføyede tegning vist i sammenligning med dette absorpsjonsspektrum for en ka-liumbromidskive (øverste kurve A) bestemt med et Beckmann IR/2 spektrofoto-meter.

Det nye antibiotiske middel som frem-stilles ved hjelp av foreliggende oppfin-nelse er meget lett oppløselig i noen opp-løsningsmidler som metanol, etanol propylenglykol og pyridin. Det er lett opp-løselig i noen alkoholer som normalt pro-panol, normal butanol og amylalkohol. Det er også oppløselig i iseddik og i eddiksy-rens metyl-, etyl-, propyl- og butylestere. Det er også oppløselig i aceton, kloroform, dioksan og benzen, samt vann.

Det nye antibiotiske middel er uopp-løselig i glycerol, kullstofftetraklorid, kullstoffdisulfid, eter, heksan, benzen og vaselinolje.

Vandige oppløsninger av flavensomycin kan fåes ved å blande oppløsninger av stoffet i et oppløsningsmiddel med vann, f. eks. oppløsninger på opp til 0,2 g pr. ml i etanol. Oppløsningene skummer.

Flavensomycin gir farvereaksjoner med Milisch's, Fehling's og Ehrlich's reagenser. Det gir ikke farvereaksjoner med Seliwanoffs, Tollens', Millon's, Lieber-mann's, Sakaguchi's reagenser og heller ikke med biuret. Med FeCl3 gir det et bunnfall uten farvereaksjon.

Flavensomycin er temmelig stabilt når det oppbevares i vakuum som et tørt pulver eller som oppløsninger i organiske oppløsningsmidler.

I vanlige oppløsninger, særlig med lave konsentrasjoner er det tilbøyelig til delvis å tape sin aktivitet. Det er observert at det antibiotiske middel blir raskere inaktivt ved en pH verdi på 8—10 enn ved en pH verdi på 6—4.

En vandig oppløsning av flavensomycin med en konsentrasjon på 100 mikrogram pr. ml, pH verdi 7, taper ved 18° C omkring 40 °/o av sin aktivitet efter tre døgn. En vandig oppløsning på 1 mg pr. ml med pH verdi likeledes på 7, er efter oppbevaring ved 4° C uforandret efter syv døgn. Samme oppløsnings aktivitet minskes hundrede ganger efter seks timers oppbevaring ved 70° C og efter tredve mi-nutters oppbevaring ved 100° C.

Den beste stabilitet i vandige oppløs-ninger har man ved pH verdi på 6,3—7.

Lyset synes å ha liten innflytelse på

inaktivering av flavensomycin.

Flavensomycin har en vesentlig virkning mot fungusarter og er særlig aktivt overfor gjærarter av saccaromyces-typen samt på trådformede fungi av peni-cillium-familien. Det er ikke aktivt overfor Schizomycetes ved konsentrasjoner som er mindre enn 100 mikrogram pr. ml.

I nedenstående tabell angis det antibiotiske spektrum for flavensomycin på basis av følgende bestemmelser: fortyn-ning i agar, vandige oppløsninger av det antibiotiske middel fremstillet av 10 %'s etanoloppløsninger:

Foruten sin sterke fungiside virkning viser flavensomycin også en bemerkelses-verdig insektisid virkning. I nedenstående tabell III vises denne insektiside virkning basert på lokal påføring på husfluer:

Flavensomycinets giftighet er bestemt ved forsøk på hvite mus under anvendelse av intraperitonal injeksjon. Man fikk føl-gende resultater: LD50 = 1 mg/kg, LDo = 350 mikrogram/kg. Ved subkutan injeksjon ble funnet LD50 = 2 mg/kg, LDo = 1 mg/kg.

Kronisk giftighet ved intraperitonal injeksjon: LDo = 250 mikrogram/kg pr. dag i IO dager. Giftighet ved oral innfør-ing: LD50 = 25 mg/kg, akutt (i metanol og vann); i propylenglykol-vann: LD50 = 19 mg/kg.

Claims (3)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av et antibiotisk middel her kaldt flavensomycin som har vesentlig virkning mot fungusarter og som er virksom som insektisid, karakterisert ved at man dyrker organismen Streptomyces Cavourensis (stamme nr. 829.8.52 deponert bl. a. i The Institue of Microbiology, Rutgers Univer-sity, New Brunswick, New Jersey, U.S.A. i desember 1957 under nr. W. 3758) i et flytende medium inneholdende kilder for assimilerbart kullstoff og nitrogen samt mineralsalter, efter dyrkningen fjerner myceliet fra kulturvæsken og derpå eks-traherer flavensomycin i form av råprodukt fra samme med et organisk oppløs-ningsmiddel og renser den erholdte ekstrakt.

2. Fremgangsmåte ifølge påstand 1, karakterisert ved at rensningen av flaven-somycinekstrakten utføres ved å inndampe denne i vakuum, adsorbere det herved erholdte konsentrat i aluminiumoksyd, fjerne de inaktive fraksjoner, eluere den aktive fraksjon med metanol og fordampe metanolen så at man får flavensomycinet i tørr tilstand.

3. Fremgangsmåte ifølge påstand 1, karakterisert ved at kulturvæskens pH-verdi før ekstraksjonen av flavensomycinet fra denne innstilles på 7,5—8,5 med et alkalisk stoff.