NO121391B - - Google Patents

Description

Fremgangsmåte for fremstilling av et nytt

antibiotikum, anthelvencin eller syreaddi-

sjonssalter av anthelvencin eller dets komponenter.

Denne oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstil-

ling av en ny antibiotisk forbindelse som her er gitt det vilkår-

lige navn anthelvencin, og salter av anthelvencin eller dets komponenter. Dette antibiotikum er særlig egnet ved fremstilling av dyrefor-blandinger.

Anthelvencin er en basisk, nitrogenholdig forbindelse

som fremstilles ved at det under regulerte betingelser dyrkes vis-

se hittil ubeskrevne stammer av actinomyceten Streptomyces venezue-

lae. Som den frie base er anthelvencin forholdsvis ustabil, og det anvendes derfor fortrinnsvis som og karakteriseres ved hjelp av sine addisjonssalter med organiske eller uorganiske syrer.

Særlig egnet for karakteriseringsformål er dets salter med 2-nafta-lensulfonsyre og salicylsyre.

Oppfinnelsen tilveiebringer en fremgangsmåte for fremstilling av anthelvencin eller syreaddisjonssalter av anthelvencin eller dets komponenter, og fremgangsmåten karakteriseres ved at en organisme utvalgt fra gruppen bestående av Streptomyces venezuelae ATCC 14583, Streptomyces venezuelae ATCC 14584 og Streptomyces venezuelae ATCC 14585, dyrkes i et kulturmedium inneholdende assimilerbare kilder for karbon, nitrogen og uorganiske salter, under submerse, aerobe betingelser inntil en vesentlig mengde anthelvencin er dannet av nevnte organisme i nevnte kulturmedium, og anthelvencinet omdannes derefter eventuelt til et terapeutisk akseptabelt syre-addis jonssalt derav, og anthe1veneinet, i form av et syreaddisjonssalt, underkastés eventuelt fraksjonert kromatografi, hvorved saltene av anthelvencin A og anthelvencin B erholdes som adskilte stoffer fra fraksjonene oppsamlet fra kromatografikolonhen.

Anthelvencin er egnet for behandling av helminthiasis. Til et parasittbefengt vertsdyr administreres en terapeutisk effektiv mengde av en forbindelse utvalgt fra gruppen bestående av anthelvencin og syreaddisjonssaltene derav med fysiologisk aksep-table syrer.

2-naftalensulfonat-saltet av anthelvencin er et hvitt, krystallinsk, fast stoff som smelter ved ca. 181-183°C, er opplø-selig i varmt vann, metanol, benzylalkohol, dimetylformamid, di-metylsulfoksyd, fenol, metylcellosolve,og vandige oppløsningsmid-delblandinger såsom vandig aceton, vandig alkohol og lignende.

Det er bare litt oppløselig i etanol, og forholdsvis uoppløselig

i oppløsningsmidler såsom kaldt vann, isopropanol, aceton, etyl-acetat, eter, kloroform, benzen og lignende.

Elektrometrisk titrering av anthelvencin 2-naftalensulfonat i 66% vandig dimetylformamid tyder på tilstedeværelse av to titrerbare grupper med pKg-verdier på 9,58 og 11,95. Den tilsynelatende molekylvekt som bestemt ut fra titreringskurven, er ca. 847.

Gjennomsnittet av flere mikroanalyser av anthelvencin 2-naftalensulfonat tydér på den følgende omtrentlige prosentvise sammensetning: 54,78% C. 5,23% H, 14,66% N, 17,38% 0, 7,41% S. Den empiriske formel for saltet som best passer for disse verdier, er<C>39<H>44<N>9°<gS>2'P* grunnlag av hvilken den empiriske formel for den frie anthelvencinbase er beregnet til å være ci<gH>28<N>9°3'

Det infrarøde absorpsjonsspektrum av anthelvencin 2-

naftalensulfonat i en mineralolje-blanding (mull) er vist på

fig. 1. De adskillbare bånd i det infrarøde absorpsjonsdiagram i området 2,0 til 15,0 mikron er som følger: 2,79, 3,04, 3,20, 3,41 (mineralolje), 3,48 (mineralolje), 5,86, 5,91 (skulder), 6,08, 6,26, 6,47, 6,60 (skulder), 6,83 (mineralolje), 6,95, 7,07, 7,22 (hovedsakelig mineralolje), 7,40, 7,55, 7,88, ca. 8,35 (bredt), 8,55, 8,65, 8,79, 9,11, 9,36, 9,64, 10,10 (svakt), 10,30, 10,49 (svakt), 10,58, 10,95, 11,11, 11,25, 11,52, 12,16," 12,39, 12,98, 13,17, 13,38, 13,89 og 14,78 mikron.

Den spesifikke dreiningsevne for anthelvencin 2-naftalensulfonat tørket ved romtemperatur i en vakuumdesikator over fosforpentoksyd, er +11,7° ved en temperatur på 25°C i 95% vandig etanol oppløsning, i hvilken konsentrasjonen av det antibiotiske salt er 1%'på vekt/volum basis.

Det ultrafiolette absorpsjonsspektrum av en vandig opp-løsning av anthelvencin 2-naftalensulfonat viser et maksimum ved 225 nyu med en absorps jonskoeffisient på o E1-^ %cm = 2180, og et annet maksimum ved 285 m , u med en absorpsjonskoeffisient på

lo/ /

Er° = 330.

lem

Et røntgendiffraksjonspulverdiagram av dette salt, under anvendelse av nikkelfiltrert kobberstråling og en bølgeleng-de på 1,5405 Å for bestemmelse av avstandene mellom krystallplane-ne, gir følgende verdier:

Anthelvencin 2-naftalensulfonat gir et positivt resul-tat ved Ehrlichprøven og negative resultater ved ninhydrinprøven for a-aminosyrer og Sakaguchi-prøven for guanidingrupper.

Salicylsyresaltet av anthelvencin er et hvitt, krystallinsk, fast stoff som smelter ved ca. 153-155°e. Oppløselighets-egenskapene for dette salt er de samme som for 2-naftalensulfona-tet bortsett fra en svakt øket oppløselighet i kaldt vann.

Elektrometrisk titrering av anthelvencinsalicylat i 66% vandig dimetylformamid tyder på tilstedeværelse av titrerbare grupper med pK s-verdier på 9,75 og 11,98 og en tilsynelatende molekylvekt på ca. 726. Det infrarøde absorpsjonsspektrum av anthelvencinsalicylat, vist på fig. 2, har adskillbare bånd over området fra 2,0 til 15,0 mikron som følger: 3,05, 3,42 (mineralolje), 3,48 (mineralolje), 3,65 (skulder), 3,73 (skulder), 4,00,

4,25 (svakt), 5,88, 6,IO, 6,26, ca. 6,50 (bredt)-, 6,73,

6,85 (mineralolje), 7,24, 7,40,7,69, 8,00, 8,15 (skulder), 8,31, 8,68 (skulder), 8,76,8,92, 9,40 (svakt), 9,72, 10,43 (svakt), 11,27 (svakt), 11,66, 12,44, 13,22, 13,90, 14,27 og ca. 15,10 mikron.

En vandig oppløsning av anthelvencinsalicylat oppviser to maksima i sitt ultrafiolette absorpsjonsspektrum, et ved 230m7u med en absorpsjonskoeffisient på E1, % = 508 og det annet ved 295nyu med en absorpsjonskoeffisient på „ E1^ %cm<=><4>35.

Elementæranalyse av anthelvencinsalicylat tyder på at saltet har den følgende omtrentlige prosentvise sammensetning: 56,27% C, 5,62% H, 17,97% N, 20,09% 0.

Den empiriske formel beregnet for saltet er C33H4ON9<0>g'som igjen tyder på at den frie base anthelvencin har formelen<C>19<H>28<N>9<0>3.

Anthelvencinsalicylat har en spesifikk dreiningsevne på +7,9° bestemt ved 25°C for en 1% oppløsning av saltet i 95% vandig etahol.

Andre syrer, både organiske og uorganiske , kan anvendes for fremstilling av addisjonssaltene av anthelvencin. Uorga niske syrer som kan anvendes, omfatter saltsyre, svovelsyre, fos-forsyre og lignende. Som eksempler på organiske syrer som kan anvendes for saltdannelse, kan nevnes sitronsyre, maursyre, eddiksyre, vinsyre, p-bromsalicylsyre, pikrinsyre, m-nitrobenzoesyre, flaviansyre, p-nitroftalsyre, p-(2-hydroksy-l-naftylazo)-benzen-sulfonsyre (OrangeII), og lignende syrer. I almindelighet fremstilles addisjonssaltene av anthelvencin med organiske syrer, fortrinnsvis fra et salt med en uorganisk syre, som f.eks. hydrokloridet.

Den fullstendige strukturformel for anthelvencin er ennu ikke bestemt. Studier av hydmLytisk avbygning tyder imidlertid på at anthelvencin inneholder én eller flere pyrrolrester og flere peptidbindinger. Avbygningsstudiene viser videre at anthelvencin-molekylet inneholder én eller flere enheter av/3-alanin og enten glutaminsyre eller et fragment som omdannes til glutaminsyre under avbygningsbetingelsene. Som tilfelle ofte er for peptid-anti-biotika, omfatter anthelvencin, som det normalt erholdes fra fer-menter ing s væsken , minst to nær beslektede forbindelser som her be-tegnes som anthelvencin A og anthelvencin B. Betegnelsen anthelvencin, som her anvendt, henviser til antibiotikumet som er erholdt fra fermenteringen.

De fysikalske egenskaper for anthelvencin A og anthelvencin B er meget like. De antibiotiske forbindelser adskilles hovedsakelig ved hjelp av sin oppførsel i visse kromatografiske systemer. En særlig egnet metode til adskillelse av de antibiotiske forbindelser omfatter anvendelse av tynnsjiktskromatografi over silikagel med et oppløsningsmiddelsystem bestående av 15 deler n-butanbl, 10 deler pyridin, 1 del iseddik og 12 deler vann.

I et slikt system er R^-verdien for anthelvencin A funnet å være 0,5, mens den for anthelvencin B er 0,3.

Anthelvencin har en hemmende virkning på veksten av visse mikroorganismer, inklusive bakterielle og fungale plantepathoge-ner. Kvalitativt er de mikrobiologiske aktiviteter for anthelvencin A og for anthelvencin B faktisk identiske. På basis av samme vekt er imidlertid den mikrobiologiske aktivitet av anthelvencin A-naftalensulfonat funnet å være ca. dobbelt så høy som for det tilsvarende salt av anthelvencin B. De mengder anthelvencin som oppviser hemmende virkning mot veksten av visse organismer, er uttrykt tallmessig i tabell 1. De hemmende konsentrasjoner ble bestemt ved agar-fortynningsprøven, eller ved næringsvæskefortynningsprØ-ven. De hemmende konsentrasjoner for de bakterielle og ,fungale

plante-pathogener ble bestemt over en periode på 72 timer.

Ved agar-fortynningsprøven utstrykes eller plantes prø-veorganismen på en serie av agar-plater som inneholder forskjellige konsentrasjoner av anthelvencin i agaren for å bestemme mini-mumskonsentrasjonen av den antibiotiske forbindelse i mikrogram pr. milliliter (yug/ml) som hemmer veksten av organismen over en periode på 48 timer.

Ved næringsvæskefortynningsprøven innpodes en serie av rør, inneholdende næringsvæske med forskjellige konsentrasjoner av anthelvencin, med prøveorganismen for å bestemme minimumskon-sentrasjonen av anthelvencin i mikrogram pr. milliliter i nærings-substratet som hemmer organismevekst over en periode på ca. 24 timer.

Identiske verdier oppnåes med salicylatsaltet av anthelvencin. Det fremgår av disse data at anthelvencin i form av sine syreaddisjonssalter er nyttig til å undertrykke veksten av forskjellige pathogene organismer.

Syreaddisjonssaltene av anthelvencin er også nyttige til kontroll av helminther og forskjellige andre typer parasitt-organismer. Således er det f.eks. funnet at nevnte salter er ak-tive mot begge arter av mus-nåleorm, Syphacia obvelata og Aspi-culuris tetraptera, og mot svine-helminther,Ascaris summ, Oesophagostumum spp. og Trichuris suis. Når de tilsettes i den daglige forrasjon for svin i minst 35 dager, er anthelvencin-salter i så små mengder som 12 g/tonn forstoff effektive til å redusere ormplagen for dyrene. Kombinasjoner a/ anthelvencin med andre stoffer som har anthelmintisk aktivitet, som f.eks. pipera-zin, hygromycin B og lignende, kan også anvendes. Andre organismer som kan kontrolleres ved hjelp av anthelvencin, omfatter Escherichia coli, Proteus vulgaris, Entamoeba histolytica o.l.

Den akutte giftighet av anthelvencin-salicylat er bestemt hos mus. Oralt er LD^Q-verdien for dette salt høyere enn 500 milligram pr. kilo. LD^Q-verdien for anthelvencinsalicylat er ca. 175 milligram pr. kilo når midlet administreres ved intra-peritoneal injisering.

Anthelvencin fremstilles ved å dyrke hittil ukjente stammer av Streptomyces venezuelae under aerobe betingelser i et kulturmedium inneholdende assimilerbare kilder for karbon, nitrogen og uorganiske salter. Organismene ble først isolert fra jordprø-ver. Noe av jordprøvene ble suspendert i sterilt, destillert vann, og suspensjonene ble strøket ut på næringsagarplater. De tilsådde næringsagarplater ble inkubert ved ca. 25-35°C i flere dager. Ved slutten av inkubasjonstiden ble kolonier av de ant-helvencindannende organismer overført ved hjelp av en steril pla-tinaøse til skråagarplater. De podede agarplater ble inkubert for å tilveiebringe større mengder av podestoff for fremstilling av anthelvencin.

De nye organismer som er i stand til å danne anthelvencin, er deponert hos American Type Culture Collection i Washington, D.C., U.S.A., og er tilgjengelige for publikum underATCCkode-numrene 14583, 14584 og 14585.

På grunn av uvissheten ved taksonomiske studer av organismer av Streptomyces-gruppen er det alltid en viss tvil forbun-det med klassifiseringen av en nyoppdaget organisme. De organismer som danner anthelvencin synes imidlertid å ligne mest, når det gjelder de viktigste karakteristika, på de publiserte beskrivelser av organismene S. cinnamonensis, S. roseoflavus og S. venezuelae (NRRL902), som alle ligner visse stammer av S. laven-dulae med rette sporekjeder. Til tross for visse likheter eksis-terer det imidlertid tilstrekkelige ulikheter til å adskille de nye organismer som anvendes i henhold til oppfinnelsen, fra alle tidligere beskrevne organismer. Organismene som anvende^s i henhold til oppfinnelsen, antas å være nærmere beslektet med den ovennevnte S. venezuelae (NRRL 902) med hensyn til karakteristika enn med noen andre hittil beskrevne organismer. Imidlertid er det mange ulikheter mellom de foreliggende kulturer og S. venezuelae (NRRL 902). De foreliggende nye organismer er derfor be-tegnet som nye stammer av S. venezuelae.

Den her angitte detaljerte beskrivelse skjer med hen-visning til de nylig oppdagete organismer ATCC14583, 14584 og 14585.

De metoder som er anvendt ved de taksonomiske studier av de anthelvencin-dannende stammer av S. venezuelae, ATCC 14583, 14584 og 14585, er de som vanligvis anvendes ved taksonomi av aktinomyceter. Karbon-utnyttelsesprøver blir utført i henhold til metoden beskrevet av Pridham og Gottlieb, J. Bact., 56, 107

(1948). De data man har fått fra de taksonomiske studier, er vist i tabellform i det følgende. Tallene i parantes henviser til farveblokker i Maers og Paul, Dictionary of Color, (1950). Kulturene ble dyrket ved 30°C. Morfologiske, fysiologiske og kultur-

i

messige karakteristika ble bestemt efter 14 dagers inkubering. Karbon-utnyttelse ble iakttatt efter 10 dagers inkubering.

Morfologiske beskrivelser er basert på observasjoner på Czapek's agar ogTomatpuré-havremel agar.

Dataene forNRRL902 (S. venezuelae) er delvis egne observasjoner og er supplementert fra beskrivelsen i Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7th edition, Williams and Wilkins Co.

De anvendte kulturmedier er som følger:

Gjær = gjærekstrakt, maltekstrakt, dekstrose agar,

pH 7,3.

Sålt-stivelse = uorganiske salter, oppløselig stivelse,

(NH4)2S04 agar, pH 7,4.

Næringsagar = pepton, kjøttekstrakt agar, pH 7,2. Czapek's agar = uorganiske salter , NaNO^, sukrose

agar, pH 6,7.

Tomatpuré-havremel agar = Den eneste andre bestanddel er vann, pH 6,8.

Det kulturmedium som kan anvendes ved fremstilling av anthelvencin ved dyrkning av de ovenfor beskrevne organismer, kan være hvilket som helst av flere medier, da, som det fremgår av de ovenfor beskrevne utnytte1sesprøver, organismene er i stand til å utnytte forskjellige energikilder. For å oppnå god økonomi ved fremstillingen, maksimalt utbytte av antibiotikum og lettvint isolering av antibiotikumet foretrekkes imidlertid visse kulturmedier inneholdende forholdsvis enkle nær/Lngskilder. De medier som er egnet ved fremstilling av anthelvencin, omfatter f.eks. en assi-milerbar kilde for karbon, såsom glukose, fruktose, maltose, manno- se, oppløselig stivelse, melasser, dekstrin, brunt sukker, mais-støpe-tørrstoffer o.l. En foretrukken kilde for karbon er glukose. Brukbare medier omfatter dessuten en kilde for assimilerbart nitrogen såsom havremel, oksekjøttekstrakt, peptoner (kjøtt eller soya), hydrolysert kasein, gjær, aminosyreblandinger og lignende. De nitrogenkilder som for tiden foretrekkes, er peptoner, hydrolysert kasein og oksekjøttekstrakter.

Mineralsalter, f.eks. de som tilveiebringer kalsium-, magnesium-, natrium-, kalium-, klorid-, sulfat- og karbonationer, og en kilde for vekstfaktorer, såsom gjær eller gjærekstrakt, kan innføres i mediet med gunstige resultater.

Som tilfelle er med mange mikroorganismer, antas det å være ønskelig å innføre de såkalte "sporelementer" i kulturmediet for dyrkning av acrinomycetene som anvendes i henhold til oppfinnelsen. Slike sporelementer tilføres vanligvis som forurensninger som forekommer tilfeldig i de andre bestanddeler som tilsettes til mediet.

Den opprinnelige pH-verdi for kulturmediet kan varieres i stor utstrekning. Det er imidlertid funnet å være ønskelig at den opprinnelige pH-verdi i mediet er mellom ca. 6,0 og ca. 7,5, og fortrinnsvis ca. 6,5 til ca. 7,3. Som det er iakttatt for andre actinomyceter, øker pH-verdien i mediet gradvis under vekstpe-rioden for organismen mens anthelvencin dannes, og pH-verdien kan komme opp i fra ca. 7,0 til ca. 8,0 eller mer, idet den endelige pH-verdi i det minste delvis er avhengig av mediets opprinnelige pH-verdi, bufrene som er tilstede i mediet og den tid organismen blir dyrket.

Submerse, aerobe dyrkningsbetingelser er de valgte betingelser for fremstillingen av anthelvencin. For fremstilling av forholdsvis små mengder kan rystekolber og overflatekultur i flasker anvendes, men for fremstilling av store mengder foretrekkes submers, aerob kultur i sterile tanker. Mediet i den sterile tank kan podes med en sporesuspens jon, men på grunn av den vekst-forsinkelse som erfaringsmessig forekommer når en sporesuspensjon anvendes som podemateriale, foretrekkes den vegetative form for kulturen. Ved således å unngå vekst forsinkelsen får man en mer effektiv utnyttelse av fermenteringsutstyret. Således er det hen-siktsmessig først å fremstille et vegetativt podemateriale av organismen ved å pode en forholdsvis liten mengde av kulturmediet med sporeformen av organismen, og når et ungt, aktivt, vegetativt

I

podemateriale er oppnådd, overføres det vegetative podemateriale aseptisk til den store tank. Det medium hvori det vegetative podemateriale fremstilles, kan enten være det samme eller forskjellig fra det medium som anvendes for fremstilling av anthelvencin i stor målestokk.

Organismene gror best ved temperaturer i området på ca. 26 til ca. 33°C. Optimal anthelvencin-danneIse synes å finne sted ved temperaturer på ca. 26 til 30°C.

Som det er vanlig ved prosesser omfattende aerob, submers kultur blåses steril luft gjennom kulturmediet. For effektiv vekst av organismen og anthelvencin-dannelse, er volumet av luften som anvendes ved tankfremstilling av anthelvencin, fortrinnsvis fra 0,1 volumdel luft og oppover pr. minutt pr. volumdel kulturmedium. Effektiv vekst og optimale utbytter av anthelvencin oppnåes når det anvendte luftvolum er minst én volumdel luft pr. minutt pr. volumdel kulturmedium.

Konsentrasjonen av anthelvencinaktiviteten i kulturmediet kan lett følges under fermenteringsperioden ved å undersøke prø-ver fra kulturmediet på deres hemmende virkning mot veksten av en organisme som man vet hemmes i nærvær av anthelvencin. Anvendelse av organismenBacillus subtilis er funnet å være egnet for dette formål. Undersøkelsen kan utføres ved velkjente turbidimetris-ke eller kopp-plate-metoder. Maksimal dannelse av antibiotikumet forekommer vanligvis i løpet av ca. 4 til 7 dager efter innpodning av kulturmediet når submers, aerob kultur eller rystekolbekultur anvendes, og i løpet av ca. 5 til 10 dager når overflatekultur anvendes.

Myceliet og uoppløste faststoffer fjernes fra fermente-ringsvæsken eller -buljongen på vanlig måte såsom ved filtrering eller sentrifugering, vanligvis efter regulering av pH-verdien til ca. 3,5. Den antibiotiske aktivitet er tilstede i den filtrerte buljong og kan fjernes fra denne ved anvendelse av vanlig adsorp-sjonsteknikk. En rekke forskjellige adsorpsjonsmidler kan anvendes, men ionebytteharpikser av sur karakter foretrekkes i almindelighet. En særlig foretrukket harpiks er "IRC-50", som er en svakt kationisk karboksylsyreharpiks.

. Ved anvendelse av kolonne-adsorpsjonsteknikken kan anthelvencin utvinnes ved å føre buljongfiltratet over en kolonne fylt med en egnet ionebytteharpiks, f.eks. "IRC-50". Hvis én del harpiks anvendes pr. 30 til 35 deler buijongfiltrat, får man van-

ligvis i alt vesentlig fullstendig fjernelse av anthelvencin fra buljongen når strømningshastigheten gjennom en kolonne med en diameter på 7,5 cm holdes på ca. 5 til 10 ml pr. minutt. Kolonnen vaskes derefter omhyggelig med vann inntil vannet som strømmer ut av kolonnen, er farveløst, og den antibiotiske aktivitet elueres fra kolonnen ved anvendelse av en oppløsningsmiddelblanding omfattende en fortynnet, vandig syre og et vannblandbart organisk opp-løsningsmiddel. således er det f.eks. funnet at en oppløsnings-middelblanding omfattende 80 volumdeler0,5N saltsyre og 20 volumdeler aceton er meget egnet til eluering av anthelvencinaktiviteten.

For å oppnå fjernelse av noen ledsagende forurensninger reguleres pH-verdien av eluatet til ca. pH 5,5 ved hjelp av base, eluatet konsentreres til ca. tre fjerdedeler av sitt opprinnelige volum, ca. tre volumdeler aceton tilsettes under omrøring til det konsentrerte eluat, og pH-verdien av den resulterende blanding reguleres på nytt til ca. 8,5. Blandingen føres deretter gjennom en kolonne fylt med 60-100 mesh "Florisil" (et adsorpsjonsmiddel av magnesiumsilikat) for å fjerne pigment og tjærer.Kolonnen vaskes med 75% vandig aceton inntil væsken fra kolonnen er negativ overfor Ehrlich's reagens, og den opprinnelige utstrømmende væske og vaskevann samles og konsentreres. Natriumklorid tilsettes til konsentratet i en mengde på ca. 250 g natriumklorid pr. liter konsentrat. Det mørke, oljeaktige residuum som adskilles, fjernes, blandingen filtreres og det klare filtrat ekstraheres med benzylalkohol. Vann fjernes fra benzylalkoholekstraktene i vakuum og den resulterende, tørre benzylalkoholoppløsning tilsettes langsomt til ca. 9 volumdeler aceton. Avkjøling av den resulterende blanding frembringer utfellelse av hydrokloridet av anthelvencin. Det således erholdte produkt består hovedsakelig av hydrokloridet av anthelvencin A, med en mindre mengde av anthelvencin B-hydroklorid.

Anthelvencin A som er fritt for anthelvencin B, kan fremstilles i form av et av sine syreaddisjonssalter ved ytterligere behandling av produktet som er erholdt som ovenfor beskrevet. Således kan f.eks. blandingen av anthelvencin-hydroklorider oppløses i et oppløsningsmiddelsystem omfattende n-butanol, pyridin, eddiksyre og vann, og den således erholdte oppløsning føres gjennom en kolonne fylt med forbehandlet cellulosepulver.Cellulosepulveret suspenderes i vann for å utgjøre en oppslemning, og utsettes derefter for filtrering og påfølgende suspendering på nytt i 0,2 N vandig saltsyre, vann og et oppløsningsmiddelsystem omfattende n-butanol, pyridin, eddiksyre og vann i forholdet 15:10:1:12.Elu-

atet som strømmer fra kolonnen, oppsamles med regelmessige mellom-

rom, og forløpet av den kromatografiske fraksjonering holdes under kontroll ved å undersøke fraksjonene ved hjelp av tynnsjiktskromatografi. De første fraksjoner som oppsamles, inneholder kun anthelvencin A-hydroklorid. Disse følges av mellomliggende fraksjoner som inneholder saltene av begge faktorer. Rent anthelvencin B-hydroklorid forekommer i sluttfraksjonene som oppsamles. De fraksjoner som kun inneholder de enkelte faktorer hver for seg, oppsam-

les og konsentreres til tørrhet for å oppnå et rent produkt av hydrokloridet av anthelvencin A eller B.

Andre salter enn hydrokloridet kan anvendes for å adskil-

le blandingen av anthelvencin A og B i sine enkelte bestanddeler. Således kan f.eks. blandingen av hydroklorider omdannes til en

blanding inneholdende naftalensulfonat- eller salicylatsaltene,

som derefter kan utsettes for en lignende kromatografisk fraksjo-

nering for å isolere det tilsvarende salt av anthelvencin A fritt for saltet av anthelvencin B.

Eksempel 1

Fremstilling av anthelvencin

En kultur av Streptomyces venezuelae ATCC 14584 fremstil -

les ved dyrkning av organismen på en skråagar. Næringsagaren fremstilles fra 65 g havremel kokt som en oppslemning, silt og blan-

det med 20 g agar og tilstrekkelig vann til å få et totalt volum på 1 liter. Platen podes med sporer av S. venezuelae ATCC 14584

og inkuberes i 5 dager ved 30°C. Kulturveksten på platen dekkes med ca. 6 ml destillert vann, og platen skrapes forsiktig for å

fjerne organismene og å tilveiebringe en vandig suspensjon derav.

1 ml av den således erholdte suspensjon anvendes til å

pode under aseptiske betingelser en 100 ml porsjon av et sterilt, vegetativt kulturmedium med følgende sammensetning:

Det podede, vegetative medium inkuberes ved ca. 30°C i

48 timer, hvorunder kolbene rystes i en utstrekning av 108 cykler pr. minutt på en frem- og tilbakegående ryster med 5 cm slag.lengde. 5 ml av det vegetative podemateriale anvendes til å pode aseptisk 100 ml porsjoner av et produksjonsmedium som befinner sec i 500 ml Erlenmeyer-kolber, idet mediet er sterilisert ved 120°C i 30 minutter og har følgende sammensetning:

Den podede kultur inkuberes i 5 dager ved ca. 30°C under omrøring på en frem- og tilbakegående ryster som ovenfor beskrevet. Utgangsmediets pH-verdi er ca. 6,9. Ved slutten av inkl beringsperioden har mediets pH-verdi steget til ca. 7,3.

Den således erholdte kulturbuljong filtreres for å fjerne myceliet og uoppløste faststoffer. Den filtrerte buljong inneholder anthelvencinet som dannes av organismene.

Eksempel 2

Fremstilling av anthelvencin- hydroklorid

En kultur av Streptomyces venezuelaeATCC 14584 fremstil les som beskrevet i eksempel 1 under anvendelse av et næringsmedii omfattende 20 g stivelse, 3 g oksekjøtt-ekstrakt, 1 g aspargin, 20 g agar og tilstrekkelig vann til å gi et totalt volum på 1 lite Kulturene på de skråttstilte plater dyrkes i 5 til 7 dager ved en temperatur på ca. 30°C.

Veksten på platen innhøstes derefter som beskrevet i eksempel 1, og 1 ml av den således erholdte suspensjon anvendes til å pode aseptisk en 500 ml Erlenmeyer-kolbe inneholdende 100 ml av et sterilisert, vegetativt kulturmedium med følgende sammensetninc

Det podede medium inkuberes i 24 timer ved 30°C med rysting på 250 cykler pr. minutt på en roterende ryster med 5 cm slaglengde. Ca. 25 ml av den resulterende, vegetative kultur ovei føres derefter ved hjelp av en steril pipette til en 4 liter

I

modifisert Erlenmeyer-kolbe inneholdende 1 liter av et medium med samme sammensetning.Inkubering utføres i 48 timer under de ovenfor beskrevne betingelser. Hele innholdet av kolben inneholdende den vegetative kultur overføres til en ledeplateutstyrt 45 liter gjæringstank av rustfritt stål utstyrt med to 6-bladede skovlhjul 12,5 cm i diameter og inneholdende 28 liter av et produksjonsmedium med følgende sammensetning:

Fermenteringen utføres ved 30°C i 4 dager med en omrø-ringshastighet på 400 til 450 omdr./min. Skumming kontrolleres om nødvendig ved tilsetning av soyaolje. Under fermenteringen luftes mediet ved tilsetning av steril luft i en mengde på ca. 30 l/min. Ved slutten av fermenteringsperioden reguleres hele buljongen til pH ca. 3,5 med 5 N svovelsyre, og ca. 3% (vekt/volum) av et kommer-sielt filtreringshjelpemiddel tilsettes. Efter filtrering får man ca. 22 liter filtrert buljong.

De samlede buljonger fra 4 tankfermenteringer føres over en fyllt kolonne, 7,5 cm i diameter, inneholdende ca. 2650 ml fuk-tig "IRC-50"-harpiks i syreform. Når strømningshastigheten reguleres til ca. 6 ml pr. minutt har væsken fra kolonnen ingen biologisk aktivitet, hvilket tyder på at adsorpsjonen av antibiotikumet på harpiksen er i alt vesentlig fullstendig. Når all den filtrerte buljong, omfattende ca. 88 liter, har passert gjennom kolonne11' vaskes kolonnen gjentatte ganger med vann inntil det utstrømmen-de vann er farveløst.

Anthelvencin utvinnes fra kolonnen som følger: Kolonnen elueres kontinuerlig med en blanding omfattende 30% (volum/volum) aceton og 70% 0,5 N vandig saltsyre så lenge som den utstrømmende væske fortsetter å gi en positiv reaksjon på Ehrlich's reagens. Totalt ca. 10,4 liter eluat oppsamles. Eluatet reguleres til pH ca. 5,5 med 10% vandig natriumhydroksydoppløsning og konsentreres til et volum på ca. 8,5 liter. 3 volumdeler aceton tilsettes under omrøring til det konsentrerte eluat, og pH-verdien av den resulterende blanding reguleres videre til ca. 8,5. Blandingen fø-res gjennom en kolonne inneholdende 1750 ml våt 60-100 mesh "Florisil" for å fjerne pigmenter og tjærer.Kolonnen vaskes derefter med 75% vandig aceton inntil den utstrømmende væske er negativ overfor Ehrlich's reagens. Den opprinnelige utstrømmende væske og vaskevann samles og konsentreres til et volum på ca. 9 liter, og 2250 g natriumklorid tilsettes dertil. Det mørke, tjæreaktige residuum som dannes, fjernes ved filtrering, og det resulterende filtrat ekstraheres 3 ganger med 90 ml porsjoner benzylalkohol. Igjenværende vann fjernes fra de samlede ekstrakter under vakuum, og den resulterende benzylalkoholoppløsning tilsettes langsomt under hurtig omrøring til 9 volumdeler aceton. Efter lagring nat-ten over ved ca. 3°C, utvinnes de utfelte faste stoffer ved filtrering, vaskes omhyggelig med aceton og tørkes i vakuum. Det således erholdte anthelvencin hydroklorid kan anvendes til ytterligere rensning eller til omdannelse til et annet salt av anthelvencin som beskrevet i de følgende eksempler.

Eksempel 3

Fremstilling av anthelvencin- 2- naftalensulfonat

Til en oppløsning av 1 g anthelvencin-hydroklorid, fremstilt som i eksempel 2, tilsettes 40 ml av en 5% vandig oppløsning av natrium-2-naftalensulfonat.Blandingen oppvarmes for å bevirke fullstendig oppløsning, og derefter avkjøles langsomt. En mørk olje som begynner å utskille seg når oppløsningens temperatur når ca. 20°C, fjernes ved sentrifugering, og væsken på toppen avkjøles for å bevirke krystallisering av anthelvencin-2-naftalensulfonat.

Eksempel 4

Fremstilling av anthelvencin- salicylat

Til 30 ml av en 5% vandig oppløsning av natriumsalicylat tilsettes 1 g anthe1venein-hydroklorid, fremstilt som beskrevet i eksempel 2. Blandingen oppvarmes i ca. 10 min. på et dampbad og filtreres i varm tilstand for å fjerne uoppløste faststoffer. Det klare filtrat får avkjøles til romtemperatur, og krystallisering frembringes ved å skrape kolbens sider med en glass-stang. Ved det første tegn på krystallisasjon avkjøles blandingen til ca. 3°C

for å tillate at fullstendig krystallisasjon finner sted. Krys-tallene av anthelvencin-salicylat oppsamles ved filtrering, vaskes to ganger på filtret med 10 ml porsjoner isvann, og tørkes i vakuum over fosforpentoksyd ved romtemperatur. Omkrystallisering

utføres fra en 2% vandig natriumsalicylatoppløsning.

Eksempel 5

Fremstilling av anthelvencin A fri for anthelvencin B

En kromatografikolonne, 3,4 cm i diameter og 43 cm lang er fylt med spesialbehandlet cellulose, fremstilt som følger: En suspensjon av 100 g Whatman-cellulosepulver (CM 70) fremstilles og omrøres godt i ca. 30 minutter. Cellulosen utvinnes ved filtrering og suspenderes derefter suksessivt i 0,2 N saltsyre, vann og en oppløsningsmiddelblanding av n-butanol, pyridin, eddiksyre og vann i forholdet 15:10:1:12.

En oppløsning av 5 g anthelvencin-hydroklorid, fremstilt som beskrevet i eksempel 2, i 40 ml av det ovenfor beskrevne opp-løsningsmiddelsystem føres gjennom kolonnen. Kolonnen er utstyrt med en automatisk fraksjonsoppsamler som er justert til 30 minut-ters mellomrom, og strømningshastigheten fra kolonnen reguleres slik at den gir ca. 5 til 7 ml utstrømmende væske i dette tidsrom. Forløpet av den kromatografiske fraksjonering kontrolleres ved å undersøke den utstrømmende væske i hvert femte rør ved hjelp av tynnsjiktskromatografi på silikagel. De to bestanddeler kan lett adskilles på kromatografiske plater på grunn av at saltene av anthelvencin A beveger seg meget raskere i dette system enn de tilsvarende derivater av anthelvencin B, og R^-verdiene i dette system er henholdsvis 0,5 og 0,3. De fraksjoner som ved denne metode er funnet å inneholde kun anthelvencin A, samles og konsentreres til tørrhet. Det således erholdte, faste anthelvencin A-hydroklorid kan renses ytterligere eller kan omdannes til andre salter av anthelvencin A ved teknikken beskrevet i eksemplene 4 og 5.

Fraksjoner som kun inneholder anthelvencin B, samles og behandles på samme måte. De mellomliggende fraksjoner som inneholder både anthelvencin A og anthelvencin B, kan utsettes for ytterligere kromatografering for å bevirke videre adskillelse som resulterer i isolering av ytterligere mengder av de rene bestanddeler hver for seg.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av et nytt antibiotikum, anthelvencin eller syreaddisjonssalter av anthelvencin eller dets komponenter,karakterisert vedat en organisme utvalgt fra gruppen bestående av Streptomyces venezuelae ATCC 14583, Streptomyces venezuelae ATCC14584 og Streptomyces venezuelae ATCC 14585, dyrkes i et kulturmedium inneholdende assimilerbare kilder for karbon, nitrogen og uorganiske salter, under submerse, aerobe betingelser inntil en vesentlig mengde anthelvencin er dannet av nevnte organisme i nevnte kulturmedium, og anthelvencinet omdannes derefter eventuelt til et terapeutisk akseptabelt syreaddisjonssalt derav, og anthelvencinet, i form av et syreaddisjonssalt, underkastes eventuelt fraksjonert kromatografi, hvorved saltene av anthelvencin A og anthelvencin B erholdes som adskilte stoffer fra fraksjonene oppsamlet fra kromatografikolonnen.