NL8802236A - Geimmobiliseerde antilichamen, alsmede werkwijzen ter bereiding ervan. - Google Patents

Description

N.0. 35320 k

Geïmmobiliseerde antilichamen, alsmede werkwijzen ter bereiding ervan._

De uitvinding heeft betrekking op regio-specifieke conjugaatvor-ming van oligosaccharide bevattende antilichamen door middel van oxyda-tieve modificatie van het koolhydraatgebied van de antilichamen.

De fixatie van biologisch actieve stoffen aan dragers behoort tot 5 de standaardwerkwijzen van het onderzoek en de techniek van de biochemie. Daarbij zijn - afhankelijk van de chemische aard van de te fixeren stoffen en van het doel van de aanhechting - verschillende methoden ontwikkeld (zie b.v. K. Buchholz "Characterization of Immobilized Biocatalysts, Dechema Monographs, deel 84, nr. 1724-1731, Verlag Chemie 10 1979).

Van grote praktische betekenis als dragermaterialen waren vanaf het begin polysacchariden zoals cellulose, zetmeel, dextran, die gewoonlijk ter activering chemisch gemodificeerd worden. Talrijke modifi-ceringsmethoden zijn voorgesteld, daaronder ook de activering van zet-15 meel door oxydatie met perjodaat [zie L. Goldstein, M. Pecht, S.

Blumberg, D. Atlas, Y. Levin, Biochemistry £ (1979) 2322] onder vorming van fornylgroepen onder splitsing van de hemiacetaalring.

De koppeling via de koolhydraatbestanddelen van celmembranen werd b.v. bij rode bloedlichaampjes door oxydatie met perjodaat bereikt. De 20 aldus gevormde reactieve aldehydgroepen koppelen met de aminogroepen van de zijketens van proteïnen. [Zie C.I. Sanderson, D.V. Wilson,

Immunocheraistry 1971 (8) 163]. Oxydatie met perjodaat van antilichamen werd ook voor de conjugatie van antilichamen met enzymmerkers gebruikt (zie A.G. Gaivoronskaya et al. Chem. Abstr. 95, 130 787j). Soortgelijk 25 worden in EP-A-0.175.617 uit antilichamen en therapeutisch werkzame stoffen gevormde conjugaten voorgesteld, die tegen een doel-antigeen zijn gericht.

US-A-4.671.958 heeft betrekking op een werkwijze voor de covalente aanhechting van "linker"‘-groepen aan specifieke plaatsen van moleculen 30 van antilichamen die tegen willekeurige doel-antigenen kunnen worden toegepast.

EP-A-0.088.695 beschrijft verscheidene werkwijzen voor de covalente binding van oplosbare en niet oplosbare conjugaatpartners, zoals chemische stoffen, dragers e.d. aan antilichamen. De gevormde conjuga-35 ten zijn interessant met het oog op affiniteits-scheidings- en zuiveringsprocessen, alsmede voor diagnostische en therapeutische toepassingen. De aanhechting kan o.a. via het koolhydraatbestanddeel van de an- •880223® * 2 ♦ tilichamen plaatshebben. Bijvoorbeeld wordt voor immunobepalingen mono-klonaal IgM met galactose-oxidase en katalase geoxydeerd en vervolgens met fenylhydrazine-glycyl-glycyl-arginyl-7-amino-4-methylcumarine gecondenseerd. [Zie ook J.D. Rodwell et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.

5 83, 2632-36 (1986)/Immunology].

Ook M.M. Chua et al. [Biochem. Biophys. Acta. 800 (3) 291 (1984)] bereiken aanhechting van immunoglobuline aan liposomale membranen door voorzichtige oxydatie (met perjodaat of galactose-oxidase) van koolhy-draatgroepen in het constante gebied van de zware keten van het immuno-10 globuline, tot aldehydfuncties, die vervolgens met hydrazidegroepen kunnen reageren, die aan het membraanoppervlak van de liposomen zijn gefixeerd.

Door D.J. O'Shannessy et al. wordt eveneens de specifieke conjugatie van zowel polyklonale als monoklonale antilichamen door middel van 15 de koolhydraatgebieden ervan voorgesteld, waarbij eerst door voorzichtige oxydatie aldehydgroepen kunnen worden gevormd en deze met hydrazi-nederivaten van het biotine, geschikte fluorescentiekleurstoffen of enzymen in stabiele antilichaam-conjugaten kunnen worden omgezet, die de volledige immunologische activiteit hebben behouden. Ook de mogelijk-20 heid van de fixatie aan met hydrazine gemodificeerde vaste dragers wordt vermeld. Als drager voor immuno-affiniteitschromatografie wordt b.v. (in de handel verkrijgbaar) agarose-adipinezuurhydrazide toegepast. [Zie J. Appl. Biochem. 7_, 347-355 (1985)]. Voorts maken O'Shannessy en W.L. Hoffmann gebruik van de met zwak zuur gekatalyseer-25 de condensatie van oxydatief gevormde aldehydgroepen aan de oligosac-charide-zijketens van glycoprotefnen met met hydrazine gefunctionali-seerde agarose, die door omzetting van in de handel verkrijgbare, geactiveerde, estergroepen bevattende agarose met hydrazinehydraat was bereid. [Zie Biological Chemistry Hoppe-Seyler deel 368 (7) 767, 768 30 (1987)].

Opgave en oplossing

De toepassing van aan polymeer gebonden antilichamen en anti genen voor het aantonen van de aanwezigheid van specifieke stoffen is tot een veel gebruikt biochemisch-analytisch instrument geworden. (Zie 35 Encyclopedia of Polymer Science and Technology, deel 2, J. Wiley 1985, blz. 55-59). De nadruk verdient de toepassing voor het aantonen van speciale hormonen, bloedbestanddelen, normale en abnormale celtypen, ziekteverwekkers tot aan moleculen, die indicatief zijn voor de aanwezigheid van kwaadaardige tumoren.

40 Bovendien vinden monoklonale antilichamen ook toepassing in de .8802236 a 3 therapie. Zo bestaat b.v. een kans, lethaal werkzame agentia, b.v. werkzame stoffen of radio-isotopen aan voor kanker specifieke anti-lichamen te hechten met het doel, dat dit complex de doelcel ervan uit-zoekt en daaraan bindt en deze tenslotte vernietigt zonder de omgeving 5 nadelig te beschadigen.

Bij de omgang met antilichamen moet er van worden uitgegaan, dat deze zowel met betrekking tot de pH-waarde alsook met betrekking tot de ionensterkte van het de antilichamen omgevende milieu een beperkte stabiliteit tonen. Vanzelfsprekend is ook een chemische modificatie van 10 antilichamen met het doel van de covalente fixatie bijvoorbeeld aan dragermaterialen niet zonder problemen, omdat ten minste de bindingsca-paciteit voor het antigeen niet benadeeld mag worden. Niet ten onrechte wordt er op gewezen, dat conventionele methoden van de immobilisatie van antilichamen op vaste dragers door middel van broomcyaan, 1,1-car-15 bonyldiimidazool, perjodaatoxydatie alsmede door middel van de epoxy-chemie potentieel tot vorming via nucleofiel actieve groepen zoals b.v. amino-, thio- of hydroxylgroepen, nabij de bindingsplaats van antigeen leiden en daarmee het bindingsvermogen kunnen benadelen. [Zie K. Yim,

Biological Chemistry, Hoppe-Seyler deel 386 (7) 785 (1987)]. In de 1ΙΣΟ teratuur wordt terecht benadrukt, dat de samenstelling van de polymere drager via de eigenschappen en de geschiktheid ervan als drager beslist (K. Buchholz red., in Characterization of Immobilized Biocatalysts loc. cit. blz. 64). Tengevolge van de voorstellen in de literatuur heerst een buitengewoon rijke keuze aan potentiële dragermaterialen, die zo-25 wel uit in hoofdzaak anorganisch materiaal, gemodificeerde natuurlijke stoffen of synthetische organische polymeren kunnen bestaan. Bij Yim (loc. cit.) vindt de binding van de antilichamen door covalente binding door middel van thiosemicarbazide aan silieagel plaats.

Met het oog op de rol, die aan drager gebonden antilichamen in de 30 biochemie en de geneeskunde reeds spelen, bestond behoefte aan geoptimaliseerde dragersystemen op basis van polymere dragers, waarbij enerzijds de werkzaamheid van de aan drager gebonden antilichamen zo weinig mogelijk benadeeld, anderzijds het dragersysteem met betrekking tot stabiliteit, toepassingsbreedte en doelmatigheid, geoptimaliseerd dient 35 te zijn.

Gevonden werd, dat de eisen van de techniek door de immobilisatie volgens de uitvinding aan specifieke polymere dragers op bijzondere wijze worden vervuld. De uitvinding heeft betrekking op gefmmobili-seerde, door middel van het gemodificeerde koolhydraatgebied ervan co-40 valent aan een matrixpolymeer gebonden antilichamen, waarbij de binding .8802236 * 4 van het antilichaam door de condensatie tussen ten minste een aldehyd-groep van het geoxydeerde koolhydraatgebied en ten minste een epoxy-functie van een reactief, epoxygroepen bevattend matrixpolymeer (MP) door middel van een bifunctioneel reagens (BR), dat aan de eindpositie 5 van een ten minste uit drie leden bestaande, afstand houdende eenheid een voor de condensatie met de aldehydgroep geschikte aminogroep en aan de andere eindpositie een covalent met de epoxyfunctie reagerende groep draagt, wordt bewerkstelligd.

Het matrixpolymeer MP

10 In het bijzonder gaat het bij het matrixpolymeer (MP) om een verknoopt copolymeer uit acrylamide resp. methacrylamide en glycidyl-acrylaat resp. -methacrylaat, dat bij voorkeur uit parel vormige deeltjes bestaat. Dergelijke matrixpolymeren worden in DE-C-2.722.751 resp. US-A-4.190.713 alsmede US-A-4.511.694 beschreven. De parels bezitten in 15 de regel een diameter van 5-1000 /urn, in het bijzonder 30-1000 /urn en bezitten een inwendige holle ruimte (holle parels). Als aanknopingspunt voor het gehalte aan glycidylgroepen in het matrixpolymeer MP, die tot reactie kunnen worden gebracht, wordt een waarde van 0,8-2,5 /umol per mg droog dragermateriaal genoemd. Andere kenmerkende gege-20 vens voor een in de handel gebruikelijk matrixpolymeer (EUPERGIT C van Röhm GmbH), dat voor matrixpolymeren MP van het aangegeven type representatief is, kunnen aan de volgende tabel worden ontleend.

. 8802236 5

Kenmerkende gegevens___Dimensie_

Opzwelvermogen (pH 7) volume vochtige deeltjes 5 - gemiddel de korrel grootte: 140-180 /urn - poriëndiameter: 40 nm - uitsluitingsgrens = Hlim: 2.105 dalton - bindingsactief oppervlak: 180 n^/g (droog) - epoxygehalte: 800-1000 mmol/g (droog) 10 - wateropname: 2,3 ml/g (droog) - dichtheid = t^O; 1,20 - stortdichtheid: 0,34 g/ml - bindingscapaciteit: (bij gebruikelijke omstandigheden) 15 menselijk albumine: 48 mg/g (vochtig) menselijk IgG: 34 mg/g (vochtig) - zwel gedrag t.o.v. water: 1 : 1,4 1 ml (droog) geeft 1,4 ml (vochtig) 20 - oplosbaarheid (in water, buffers en organische oplosmiddelen): onoplosbaar - drukstabiliteit: 300 bar

Onder de elektronenmicroscoop herkent men de macroporeuze struc-25 tuur van de parels met kanalen en holle ruimten, die een diameter van 100-2500 nm bezitten, zodat enzym- resp. substraatmoleculen met een grootte van 1-10 nm het totale inwendige van de macroporeuze matrix kunnen bereiken.

Uitvoering van de uitvinding 30 - Plaats-specifieke modificatie van de antilichamen

In principe zijn in het kader van de onderhavige uitvinding alle antilichamen geschikt, die zoals bekend, een gehalte aan koolhydraat-groepen bevatten en, die voor de chemische modificatie en daarop volgende fixatie toegankelijk zijn. Als aanknopingspunt kan van een gehal-35 te van ongeveer 3% koolhydraatbestanddeel bij de antilichamen worden uitgegaan. In het middelpunt van de belangstelling staan monoklonale antilichamen. Werkwijzen ter bereiding van monoklonale antilichamen zijn voldoende bekend. [Zie Kirk-Qthmer, Encyclopedia of Chemical Technology, 3de dr. deel 23, J. Wiley (1983), blz. 637 tot 643; D.

40 Baron, U. Hartlaub, Humane Molekulare Antikörper, Gustav Fischer *880223« f r 6

Verlag, Stuttgart, New York 1987].

Daarbij kan in het bijzonder als volgt worden te werk gegaan: De bijvoorbeeld door positieve zuiveringsprocessen, zoals affiniteitschro-matografie, of door negatieve zuiveringsprocessen (eliminering van de 5 overmaat aan andere cellen) zoals b.v. Panning, complement-lyse en E-rozetvorming van gezuiverde lymfocyten resp. monoklonale antilichamen worden bij voorkeur vóór de oxydatie gedialyseerd, bijvoorbeeld met een geschikte verenigbare buffer, in het pH-traject van ongeveer 5,5. De oxydatie van het koolhydraatbestanddeel tot formyl groepen kan volgens 10 op zichzelf bekende wijze chemisch door middel van oxydatie met perjo- daat, of - minder de voorkeur verdienende - enzymatisch door middel van de enzymen galactose-oxidase en katalase worden uitgevoerd.

Door werken bij relatief lage pH, bij voorkeur in het traject van ongeveer 5,5, wordt het gevaar van de inwendige verknoping van de anti-15 lichamen verminderd tot uitgesloten. Een oxydatiemethode, die de voorkeur verdient, bestaat in de oxydatie met natriumperjodaat, bij voorkeur 0,1 molair in een geschikte, inerte bufferoplossing, doelmatig in het pH-traject 5,5, bijvoorbeeld in 0,1 mol ai re acetaatbuffer. Bij voorkeur heeft de reactie bij relatief lage temperatuur, ongeveer 0-5eC 20 en in het donker plaats.

De oxydatie, die volgens de orde van grootte .gewoonlijk binnen een uur kan worden afgesloten, wordt afgestopt, bijvoorbeeld door toevoeging van kleine hoeveelheden ethyleenglycol. Daarna worden de antilichamen doelmatig op een kolom gelchromatografisch opgewerkt. (Zie 25 Ullmann's Encyclopedie der techn. Chemie, 4de druk, deel 5_, Verlag Chemie, blz. 167; Gel-Filtration, Theory and Practice, Pharmacia Fine Chemicals 1979, Deutsche Pharmacia GmbH, Freiburg 1979). Daarvoor is b.v. een dextran-gel (b.v. het produkt SEPHADEX G 25 van Pharmacia), bij voorkeur in evenwicht gebracht met een bufferoplossing in het pH-30 traject van 5, geschikt. De concentratie van de antilichamen kan door concentratie, bijvoorbeeld door ultrafiltratie geschieden. De winning van de antilichamen ligt gewoonlijk bij >90%.

- Koppeling van de plaats-specifiek gemodificeerde antilichamen aan polymere dragers 35 De verkregen geoxydeerde en gezuiverde antilichamen worden in een geschikt, enigszins zuur milieu, bijvoorbeeld in acetaatbuffer en in het pH-traject van ongeveer 5,5 in concentraties tussen 60 en 200 /ug met de met hydrazide gesubstitueerde, gemodificeerde, polymere drager (HY-MP) in hoeveelheden van 100 mg gedurende een bepaalde tijds-40 periode, bijvoorbeeld 16±4 uur bij verlaagde temperatuur, bijvoorbeeld • 8802236 ‘i 7 bij 4eC gefncubeerd. Het gehalte aan geïmmobiliseerd antilichaam wordt volgens de Bradford-methode; zie Analyt. Biochem. 72, 248 (1976), uit het verschil tussen het oorspronkelijke en het overblijvende gehalte aan antilichaam bepaald. De via hydrazinederivaten gebonden anti-5 lichamen hebben - in vergelijking met de aan de niet gemodificeerde po-lymere drager P gebonden antilichamen - een verbeterde bindingscapaci-teit van antigeen, die de maximale theoretische waarde van 2 mol anti-geen per mol antilichaam benadert, in het bijzonder, wanneer een relatief geringe belading met antilichaam aanwezig is.

10 - Modificatie van het matrixpolymeer MP

Het uit (meth)acrylamide en glycidyl(meth)acrylaat opgebouwde matrix-polymeer (MP), dat bij voorkeur uit parel vormige deeltjes bestaat (zie boven), speciaal het produkt EUPERGIT® C van Röhm GmbH,

Darmstadt wordt doelmatig in een geschikte bufferoplossing in het alka-15 lische traject, bijvoorbeeld in een fosfaatbuffer en bij pH 8,8 gedurende een bepaalde tijdsperiode, bijvoorbeeld 16±3 uur bij kamertemperatuur met het bifunctionele reagens (BR) bij voorkeur een bishydrazide van een alifatisch dicarbonzuur, in het bijzonder adipinezuurdihydrazi-de, behandeld. Bij voorkeur past men het bifunctionele reagens (BR) in 20 hoeveelheden van 0,1-10 mol BR per gram polymere drager MP, in het bijzonder EUPERGI1©C, droog gewicht, in het bijzonder 1 /umol BR per g droog gewicht toe. Doelmatig wast men het gemodificeerde matrixpolymeer HY-fff» met een standaard fosfaatbuffer (PBS). Er kan bij voorkeur met buffer (b.v. 0,1 molaire acetaatbuffer) pH 5,5 in evenwicht worden 25 gebracht en bij lagere temperatuur, b.v. bij 4eC worden opgeslagen.

Het bifunctionele reagens (BR)

Volgens de definitie bestaat het bifunctionele reagens BR uit een ten minste uit drie leden bestaande, afstand houdende eenheid met een de ene eindpositie markerende, voor condensatie met de aldehydgroep 30 geschikte aminogroep en een covalent met de epoxyfunctie van het matrixpolymeer MP reagerende groep aan de andere eindpositie. Bij voorkeur kan het bifunctionele reagens (BR) wat de formule betreft als: H2N - (X)n - A - Q 35 worden voorgesteld, waarbij A een afstand gevende groep, bij voorkeur een alkyl- of cycloalkylrest, met ten minste 3 en ten hoogste 12 ketenleden, bij voorkeur -CH2-eenheden, waarbij eventueel een of meer van de ketenleden door zuurstof kan zijn vervangen, en waarbij n voor 0 of 40 1, X voor een rest •8802236 8 Η Η Η Η -C-N-, - C - Ν -, - Ν - C - Ν -, - Ν - C - Ν - staat en Q dezelfde ιι i ιι r ii η

O H S H O S

betekenis als -X-NH2 bezit of voor -NH2 kan staan. Bijzonder bij 5 voorkeur stelt het bifunctionele reagens BR het bishydrazide van een carbonzuur (A = (dtoh-fi; X = C- N- Q = -C-N-NH2) Q w II i ιι i

OH OH

voor. Zeer bijzondere voorkeur verdient het adipinezuurdihydrazide. In het geval BR voor een alkyleendiamine staat (n = 0, A = 10 (CH2)3~6* Q = NH2) wordt de dubbele binding van de bij de condensatie gevormde Schiff'se base voordelig gereduceerd, bijvoorbeeld met natri umboorhy dri de.

Bepaling van de immuno-capaciteit van de gefixeerde anti lichamen volgens de uitvinding 15 De bindingscapaciteit van de geïmmobiliseerde anti lichamen volgens de uitvinding wordt bepaald door meting van de anti genen in het bijzonder van enzymen zoals b.v. het anti-carboxypeptidase (CPA), die zich aan de antilichamen binden. Tot dit doel wordt bijvoorbeeld CPA in gelijkblijvende hoeveelheden in PBS aan reageerbuizen toegevoegd, die 20 telkens 100 mg van het gemodificeerde matrixpolymeer HY-MP, echter met verschillende belading aan geïmmobiliseerde monoklonale antilichamen dragen. Het aan de antilichamen van het matrixpolymeer gebonden CPA-be-standdeel werd als volgt bepaald: o) door bepaling van het verschil van het betreffende proteïnegehalte 25 door middel van de BRADFORD-proef en de enzymatische activiteit, die in de uitgangsoplossing en tenslotte in de restoplossing aanwezig was, B) door bepaling van de enzymatische activiteit van het aan de parels van de HY-MP-drager geïmmobiliseerd enzym, bij CPA b.v. met behulp 30 van de ninhydrine-methode. Het aan de drager gebonden bestanddeel aan enzym werd na incubatie met natriumcarbonaatbuffer met pH 10,5 geëlueerd. Nadat de aanpassing van de pH heeft plaatsgevonden, wordt de activiteit van het geëlueerde enzym, bijvoorbeeld van CPA bepaald.

35 De bepaling via de enzymactiviteit is in al die gevallen geschikt, waar antilichamen aanwezig zijn, die de enzymactiviteit niet benadelen. Het blijkt, dat de oxydatief gemodificeerde antilichamen, die aan de parels van de HY-MP-drager zijn gefixeerd, de volledige immunologische activiteit ervan voor de binding van het enzym, bijvoorbeeld CPA, be-40 houden.

* 8802236 9

De mol ai re verhouding van monoklonaal anti lichaam tot CPA bewoog zich in het kader van 2:1 tot 1:1.

Voordelige werkingen

Zoals reeds vermeld strekt de leer volgens de uitvinding zich 5 uit tot specifieke conjugaten van oligosaccharide bevattende antilichamen in de meest algemene zin.

Vermeld worden in het bijzonder monoklonale antilichamen, die tegen antigenen, bijvoorbeeld van de volgende soort, zijn gericht: m ‘8802236 10 r ,

Klasse anti geen_Anti geen_ bacterieel tetanus-toxoide H. influenza type b polysaccharide 5 di fteri e-toxi ne

Chlamydia trachomatis M. leprae lipopolysacchari de/endotoxi ne pneumokokken 10 LPS van P. aeruginosa exotoxine van P. aeruginosa streptokokken groep A koolhydraat viraal X31 influenzavirus-nucleoproteïne mazel envirus

15 HSV glycoprotefne D

mazel envirus, nucleocapside zytomegalie-virus influenza A-virussen rode hondvi rus-anti genen

20 HTLV I

varicella-zoster HBsAg

auto-immuun dubbelstrengig DNA

pancreascellen (diabetes mellitus) 25 Myasthenia gravis, antiidiotypen thyreotropi ne-receptor reuma-faktor acetylcholine-receptor schildklier 30 sperma tumor mamma-Ca prostaat-Ca longen-Ca maag-Ca 35 meianoom GD2 (menselijk meianoom) glioom rectum-Ca leukemie 40 cervix-Ca ‘8802236 4 11

Klasse anti geen_Anti geen_

weefsel/bloed rhesus D

bloedgroepenantigeen A

5 HLA-A,B,C,DR

intermediaire filamenten andere malaria

Forssman-anti geen schaaperytrocyten 10 nitrofenol dinitrofenol trinitrofenol

Keyhole limpet hemocyanin (KLH) reumafaktor 15 insuline

De fixatie volgens de uitvinding biedt een reeks van voordelen ten opzichte van de stand der techniek, in het bijzonder bij toepassing van dicarbonzuurhydraziden, in het bijzonder adipinezuurhydrazide. Voert 20 men bijvoorbeeld de condensatie bij een pH-waarde van ongeveer 5,5 uit, dan verhindert men een condensatie van de aminogroepen van de anti-lichamen met de eigen aldehydfuncties ervan.

De chemische binding via het hydrazide is wenselijk stabiel en inert. Niet specifieke binding van de antilichamen wordt geminimali-25 seerd. Een blokkering na de fixatie van de antilichamen is overbodig.

De onderstaande voorbeelden dienen ter toelichting van de uitvinding.

Voorbeeld I

Koppeling van de aldehydgroepen bevattende monoklonale antilichamen 30 met het gemodificeerde matrixpolymeer HY-MP als drager

Gemodificeerde en geoxydeerde, monoklonale antilichamen uit voorbeeld II worden in concentraties, die tussen 60 en 200 /ug variëren, in telkens 1 ml van een acetaatbuffer met pH 5,5 met 400 /ul van het gemodificeerde matrixpolymeer uit voorbeeld III (100 35 mg) 16 uur bij 4eC gefncubeerd. Het gehalte aan gefmmobiliseerd anti! ichaam wordt volgens de BRADFORD-methode uit het verschil tussen de oorspronkelijke en de overblijvende hoeveelheden aan antilichamen bepaal d.

De volgens de uitvinding gefixeerde antilichamen hebben in verge-40 lijking tot direct via de oxiraanfunctie gebonden conjugaten een hogere < 8802236 I , 12 Ί antigeen-bindingscapaciteit (b.v. ten opzichte van CPA). Deze reikt tot aan de theoretische maximale waarde van twee anti genen per mol anti-lichaam, in het bijzonder wanneer geringe beladingen aan antilichamen worden toegepast (zie tabel B).

5

Tabel B

Binding van de gezuiverde, geoxydeerde, monoklonale antilichamen aan matrlxpolymeer HY-MP

10 Anti- Toegepaste Gebonden Anti geen Mol ai re lichaam antilichamen anti lichamen CPA per g verhouding per g droge per g droge drager MP anti geen drager MP drager MP (mg) tot (mg) (mg) anti lichaam 15 _(mol /mol) CPA 1 0,7 0,7 0,32 2,0 CPA 6 0,5 0,5 0,30 2,5 CPA 6 17,5 7,5 4,5 2,5 CPA 7 1,0 0,7 0,34 2,1 20 CPA 8 0,8 0,8 0,32 1,65 CPA 8 25,0 13,0 4,40. 2,5 CPA 2 3,5 1,0 0,36 1,5 CPA 3 2,2 1,0 0,40 1,7 CPA 5 3,0 2,0 0,40 1,0 25

Voorbeeld II

Bereiding van de aldehydgroepen bevattende monoklonale anti-CPA-antilichamen

Een reeks door affiniteitschromatografie gezuiverde monoklonale 30 anti-CPA-antilichamen werden vóór de oxydatie met perjodaat tegen 0,1 M acetaatbuffer pH 5,5 gedialyseerd. Elk monoklonaal antilichaam werd met 0,1 M natriumperjodaat opgelost in 0,1 M acetaatbuffer van pH 5,5 (10 ml) behandeld. Bij deze lage pH-waarde wordt de inwendige verknoping van de antilichaam-moleculen onderdrukt. De reactie werd gedurende 1 35 uur bij 0eC in het donker uitgevoerd.

Men stopt de oxydatiewerking door toevoeging van drie druppels ethyleenglycol voordat men op een SephadeJ^G 25 kolom, vooraf in evenwicht gebracht met 0,1 M acetaatbuffer van pH 5, brengt. De geoxydeerde anti lichamen worden in een Amicon-ultrafiltratiecel, voorzien 40 van een PM 50-membraan, van 10 ml geconcentreerd en het gehalte aan * 8802236 s' 13 * proteïne wordt door middel van de BRADFQRD-methode bepaald. De winning van de antilichamen komt gewoonlijk boven 90%.

Voorbeeld III

Modificatie van het matrixpolymeer MP 5 2 g van het verknoopte copolymeer van methacrylamide/glycidylme- thacrylaat (EUPERGIT® C, produkt van Röhm GmbH, Darmstadt) wordt met 0,1 M in de handel verkrijgbaar adipinezuurdihydrazide in 20 ml van een 0,2 M fosfaatbuffer, pH 8,8, 16 uur bij kamertemperatuur behandeld.

De gemodificeerde polymere drager wordt uitvoerig met PBS gewassen, met 10 0,1 M acetaatbuffer, pH 5,5, in evenwicht gebracht en bij 4eC bewaard.

‘8802236

Claims (10)

1. Geïmmobiliseerde, door middel van het gemodificeerde koolhy-draatgebied ervan covalent aan een matrixpolymeer gebonden antilichaam, met het kenmerk, dat de binding van het antilichaam door de condensatie 5 tussen ten minste een aldehydgroep van het geoxydeerde koolhydraatge-bied en ten minste één epoxyfunctie van een epoxygroepen dragend matrixpolymeer (MP) door middel van een bifunctioneel reagens (BR), dat aan de ene eindpositie van een ten minste uit drie leden bestaande, afstand houdende eenheid, een voor de condensatie met de aldehydgroep ge- 10 schikte aminogroep en aan de andere eindpositie een covalent met de epoxyfunctie reagerende groep draagt, wordt bewerkstelligd.

2. Werkwijze ter bereiding van de geïmmobiliseerde antilichamen volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men de aldehydgroepen door okydatie van de hemiacetaalgroepen van het koolhydraatgebied met perjo- 15 daat vormt.

3. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat men de oxy-datie met perjodaat bij een pH-waarde in het traject van 5 tot 5,5, bij voorkeur in een geschikte inerte buffer, uitvoert.

4. Werkwijze volgens conclusies 2 en 3, met het kenmerk, dat men 20 voor de afsluiting van de oxydatie met ethyleenglycol behandelt.

5. Werkwijze ter bereiding van de geïmmobiliseerde antilichamen volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men een bifunctioneel reagens BR met de formule

25 H2N - (X)n - A - Q , waarbij A voor een ten minste uit drie leden bestaande, afstand houdende eenheid (spacer), n voor 0 of 1, X voor een rest -C-N ,-C-N ,N-C-N-, - N- C- N- staat en Q dezelfde II I II | I (I i I II i

30 OH SHHOH HSH betekenis als -X-NH2 bezit of voor -NH2 staat, toepast.

6. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat men als bi-functioneel reagens BR een verbinding met de formule

35. O OH H2N - N - C - (CH2)n1 - C - N - NH2 waarin n' voor 3-6, bij voorkeur 3-4 staat, toepast.

7. Werkwijze ter bereiding van de geïmmobiliseerde anti lichamen 40 volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men als epoxygroepen dragend ‘8802236 i f matrixpolymeer MP een copolymeer uit in hoofdzaak acrylamide of methacrylamide en glycidyl(meth)acrylaat toepast.

8. Werkwijze ter bereiding van de geïmmobiliseerde antilichamen volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men het reactieprodukt van 5 een bifunctioneel reagens BR volgens conclusie 5 met het matrixpolymeer volgens conclusie 7 bij pH 8,8-9 bereidt.

9. Werkwijze ter bereiding van de geïmmobiliseerde antilichamen volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men het reactieprodukt van een bifunctioneel reagens BR met het matrixpolymeer MP met de aldehyd- 10 groep van het geoxydeerde koolhydraatgebied van het antilichaam condenseert.

10. Werkwijze volgens conclusie 9, met het kenmerk, dat men de reactie in het pH-traject 5-5,5 uitvoert. +++++++ - 880223 6