NL8500363A - Werkwijze en spectrometer voor het meten van absorptieverschil spectra van radikaalreakties. - Google Patents

Description

• -j> ·! H.O. 33009 1

Aanvraagster noemt als uitvinder: Dr A.J. Hoff

Werkwijze en spectrometer voor het meten van absorptieverschil spectra van radikaalreakties.

Beschrijving

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het meten van absorptieverschil spectra van radikaalreakties onder toepassing van een gemoduleerde verstoring van de concentratie van reaktanten in bijvoorbeeld door straling geïnduceerde 5 radikaalcomplexen, waarbij de opbrengst van door recombinatie en door ontsnappende radikalen veroorzaakte stoffen en/of moleculaire toestanden beïnvloed wordt. De uitvinding heeft eveneens betrekking op een spectrometer voor het uitvoeren van bovengenoemde werkwijze, welk spectrometer voorzien is van middelen voor het bestralen van het te 10 onderzoeken materiaal, middelen voor het opnemen van het genoemde materiaal, koelings- en/of verhittingsmiddelen, en detectiemiddelen voor het detecteren van het resulterende absorptiespectrum van het genoemde materiaal.

Bovengenoemde werkwijze en spectrometer zijn bekend 15 uit het artikel van H.J. den Blanken en A.J. Hoff in Biochem. Biophys.

Acta 681 (1982) blz. 365-374. Bij deze bekende werkwijze wordt de magnetische resonantie van intermediaire triplettoestanden in fotosynthetisch materiaal gedetecteerd door middel van triplet-minus-singlet absorptieverschil (T-S) spectra. Hierbij wordt 20 een gemoduleerde verstoring van de concentratie van intermediaire triplettoestanden veroorzaakt door middel van ingestraalde microgolven die tussen twee van de triplet subniveau's resoneren. De resulterende verandering in de absorptie wordt dan als funktie van golflengte gedetecteerd en geregistreerd. Op deze wijze wordt een 25 absorptieverschilspectrum verkregen en geregistreerd dat de bleking van triplet voerende pigmenten, en bandverschuivingen en het ontstaan van nieuwe banden weergeeft veroorzaakt door tripletgeïnduceerde veranderingen ia de elektrostratische wisselwerking tussen pigmenten die aan het de triplettoestand voerende pigment grenzen.

30 Ofschoon met bovengenoemde werkwijze goede bad original '5 .)0 3 S3 2 resultaten zijn verkregen bij het onderzoek van reakties in fotosynthetisch pigmentmateriaal, zoals planten, algen of bacterieën, kan deze werkwijze alleen in een beperkt temperatuurgebied bij zeer lage temperaturen nabij het absolute nulpunt uitgevoerd worden teneinde 5 spin-rooster relaxatie tussen de triplet subniveau's te vermijden. Hierdoor kunnen temperatuurgeïnduceerde veranderingen in het triplet-minus-singlet absorptieverschil spectrum, die veranderingen in pigmentconfiguratie of de aanwezigheid van andere geëxciteerde toestanden, zoals ladingsoverdrachttoestanden, weergeven, niet 10 gedetecteerd worden. Bovendien is deze werkwijze beperkt alleen tot onderzoek van reakties, waarbij intermediaire triplettoestanden aanwezig zijn.

De uitvinding beoogt bovengenoemde problemen te ondervangen en een werkwijze en een spectrometer aan te geven waarmede 15 absorptieverschil spectra van radikaalcomplexen over een breed temperatuurgebied met grote nauwkeurigheid gemeten kunnen worden, zodat alle aan een radikaalreaktie deelnemende stoffen onderzocht kunnen worden.

Dit wordt bij een werkwijze van de in de aanhef 20 genoemde soort volgens de uitvinding aldus bereikt dat op het materiaal een gemoduleerd magneetveld wordt uitgeoefend en dat de daardoor opgewekte veranderingen in absorbantie van het materiaal over een breed frequentiegebied fasegevoelig worden gedetecteerd, waarbij de temperatuur van het materiaal over een groot instelgebied, dat 25 kamertemperatuur kan omvatten, kan worden gevarieerd.

Volgens de uitvinding is de in de aanhef genoemde spectrometer gekenmerkt verder door een inrichting om een gemoduleerd magneetveld op het materiaal uit te oefenen, waarbij de detectiemiddelen voorzien zijn van een fasegevoelige detector die de 30 opgewekte veranderingen in absorbantie omzet in dc absorptie, en waarbij de koelings- en/of verhittingsmiddelen ingesteld worden op een temperatuur in een breed temperatuurgebied.

Met de werkwijze en spectrometer volgens de uitvinding kunnen met voordeel radikaalreakties onderzocht worden om 35 bijvoorbeeld het verschil in concentratie van reaktanten te bepalen. De onderhavige zogenaamde magneto-optische verschilapectroscopie (MODS) metingen kunnen met grote nauwkeurigheid uitgevoerd worden; zo wordt BAQbORJSgMAJi -ruisverhouding verkregen die 1000 maal beter kan zijn dan 3 in de stand van de techniek. Tevens kan deze werkwijze toegepast worden tot in elk frequentiegebied waar absorptie van straling optreedt.

Zo zijn met de onderhavige werkwijze absorptieverschilspectra gemeten van een fotosynthetische bacterie, het 5 Rhodopseudomonas viridis (afgekort: Rps.viridis). In deze Rps.viridis wordt onder bestraling een triplettoestand op de primaire elektrondonor D gevormd door recombinatie van de fotogeïnduceerde ladingen op de primaire donor en de primaire elektronacceptor Aj_. Bij toepassing van de onderhavige werkwijze blijken betekenisvolle veranderingen in het 10 T-S spectrum op te treden rond 830 nm tussen 300 en 160 K. Elders heeft men door middel van flitsspectroscopie temperatuurafhankelijke veranderingen in dit spectrale gebied reeds waargenomen bij reaktiecenters van Rhodopseudomonas sphaeroides (zie V.A.Shuvalov en W.W. Parson, Proc. National Academy of Science USA 78 (1981) blz.

15 957-961). Deze veranderingen zijn toen toegeschreven aan een ladingsoverdrachttoestand tussen de donor D en een aangrenzende bacteriochlorofyl (BChl) pigment, die mogelijkerwijs als transiëntacceptor Aq functioneert. Van deze toestand werd gemeend dat zij behoorde bij de triplettoestand -¾ bij hogere temperaturen. De 20 volgens de onderhavige werkwijze verkregen nauwkeurig volgens temperatuur gescheiden spectra van Rps.viridis maakt deze interpretatie onwaarschijnlijk. Vrijwel zeker worden deze spectrale veranderingen veroorzaakt door een temperatuurafhankelijke bandverschuiving van één van de bijbehorende bacteriochlorofylmoleculen die als een vroege 25 transiëntacceptor Aq functioneert.

Het is op zich uit de Thesis, Rijksuniversiteit van Leiden, 1982, van H. Rademaker bekend om gemoduleerde magnetische veldverstoring toe te passen echter alleen voor het onderzoeken van de invloed op luminescentie. Hierbij werd slechts in een zeer beperkt 30 frequentiegebied gewerkt.

De uitvinding zal nader worden toegelicht met verwijzing naar de bijbehorende tekeningen, waarin:

Fig. 1 een schematische opstelling toont van de spectrometer volgens de uitvinding; 35 Fig. 2 twee grafieken toont van het absorptieverschil (T-S) spectrum van reaktiecenters in een fotosynthetische bacterie respektievelijk bij temperaturen van ca. 280 K en 110 K;

BAD ORIGINAL

8 5 C 0 s 3 4

Fig. 3 een voorbeeld toont van een genormaliseerd absoluut absorptieverschil als funktie van de magnetische veldsterkte van reaktiecenters in dezelfde bacterie als van fig. 2; en

Fig. 4 een aantal grafieken toont van het 5 absorptieverschil (T-S) spectrum van reaktiecenters bij verschillende temperaturen in dezelfde bacterie als van fig. 2 en 3.

In fig· 1 is de spectrometer volgens de uitvinding in schematische weergave aangegeven. Hierbij geven 1, 2, 3 respektievelijk de stralingseenheid, de eenheid voor het vasthouden, 10 koelen en/of verhitten van het te onderzoeken materiaal, en de detectie- en registratie-eenheid aan. In de stralingseenheid is een stralingsbron 5, bijvoorbeeld een wolfram-jodium lamp van 250 W, opgenomen om via de lens 6, het IR filter 8, en de lens 7 een stralingsbundel af te geven aan de in de eenheid 2 opgenomen cuvet 10. 15 In deze eenheid 2 zijn tevens middelen opgenomen voor het opwekken van een gemoduleerd magnetisch veld, zoals bijvoorbeeld twee Helmholtzspoelen die door de voedingsschakeling 13 gevoed worden met een regelbare spanning, bijvoorbeeld van 50 Hz die van 0 tot 10 volt regelbaar is. Hierdoor wordt een stroom van maximaal 2A rms verkregen 20 waardoor een regelbaar magneetveld van tot aan 25 mT ontstaat. Het is natuurlijk ook mogelijk een permanent magneetveld met daarop gemoduleerde wisselamplitude toe te passen. De modulatiefrequentie kan van laag tot zeer hoog gevarieerd worden; een beperkt frequentiegebied omvat bijvoorbeeld enige tientallen Hz tot enige kHz. Eveneens zijn 25 niet aangegeven middelen aanwezig om de in de cuvet opgenomen monsters te koelen of te verwarmen. Bijvoorbeeld kan een cryostaat bad voor het afgeven van een stikstofgasstroom gebruikt worden, waarbij de temperatuur van het monster bewaakt wordt door middel van een in de monstercuvet opgenomen thermokoppel. Hierdoor kan de temperatuur •30 tijdens het onderzoek bij benadering constant gehouden worden door de gasstroom bij te stellen. In de eenheid 3 is een monochromator 16 opgenomen die het door de lens 15 gepasseerde licht opneemt en aan zijn uitgang afgeeft aan een meetketen. Deze bestaat bijvoorbeeld uit een gelijkrichtdiode 17, een voorversterker 18, een selektieve 35 versterker 21, en fasegevoelige detector (lock-in detectie) 19. Aan deze schakeling wordt eveneens een van de voedingsschakeling 13 afkomstige referentiesignaal toegevoerd. Op de fasegevoelige detector óftlGfRALeêistrat::ie~inr;i-chtin8 20 aangesloten.

O η :) Π 7 £ T

5 . · . ·!

Bij een andere uitvoeringsvorm van de spectrometer kan, in plaats van een zowel voor excitatie van het monster als voor meting van de verschilabsorptie bestemde enkele bundel in fig. 1, een afzonderlijke excitatiebundel en een afzonderlijke meetbundel worden 5 toegepast. Hierbij kan de monochromator 16 in de baan van de meetbundel ook voor het te onderzoeken monster geplaatst zijn.

In de figuren 2, 3 en 4 zijn de resultaten weergegeven van de magneto-optische verschilspectroscopie (MODS) metingen aan een Rps.viridis bacterie. Deze bacterie was bereid zoals 10 beschreven is in het in de aanhef genoemde artikel en was in een 10 mM 4-morfoline propaansulfonzuurbuffer, pH 8, gesuspendeerd. Hierbij werd een reductie van de acceptorketen tot voorbij verkregen door toevoeging van 10 mM ascorbaat. Voor metingen onder de 273 K werden de monsters onder belichting langzaam bevroren, waarbij er voor gezorgd 15 werd dat geen barsten ontstonden. Aan enkele monsters werd voor het afkoelen 60 % v/v ethyleenglycol toegevoegd.

In fig. 2 zijn in de krommen A en B twee bij temperaturen respektievelijk van 280 K en 110 K gemeten MODS spectra van reaktiecenters weergegeven. Ondanks de koeling door de genoemde 20 gasstroom warmde het monster tijdens de belichting langzaam op. Daarom is de temperatuur van het monster tijdens de golflengte-aftasting, die enkele minuten duurde, aangegeven.

Fig. 3 toont een grafiek van genormaliseerde absolute absorptieverschil van het spectrum als funktie van de 25 amplitude van het 50 Hz magnetische veld bij een temperatuur van ca. 300 K. Hierbij is naar de eenheid genormaliseerd bij de waarde van het hoogste magnetische veld. Hieruit blijkt dat alle banden dezelfde magnetische veldafhankelijkheid vertonen, hetgeen aangeeft dat zij alle door hetzelfde fotogeinduceerde radicale paar zijn opgewekt. Bij deze 30 bacterie was geen 60 % v/v ethyleenglycol toegevoegd.

In fig. 4 zijn in de krommen A tot E vijf bij temperaturen van respektievelijk 300, 260, 220, 184, 163 K gemeten MODS spectra van reaktiecenters in het golflengtegebied van 800 tot 880 nm weergegeven. Ter vergelijking is in kromme F een absorptieverschil-35 spectrum aangegeven dat verkregen is met de bekende absorptie-gedetecteerde magnetische resonantie (ADMR techniek) van dezelfde bacterie bij 1,2 K. Uit de krommen A tot E blijkt dat de inkeping bij 828 nm in afhankelijkheid van temperatuur een aanzienlijke

BAD ORIGINAL

8500363 6

* v I

verandering vertoont vanaf absorptie bij hoge temperatuur naar een duidelijke afname van absorptie of bleking bij lagere temperatuur.

Uit bovenvermelde metingen blijkt dat de MODS techniek bij 280 K in gevoeligheid vergelijkbaar is met de ADMR 5 techniek bij 1,2 K. Dit is niet verrassend daar bij bacteriereaktiecenters een magnetisch veld van 20 nff bij 280 K een afname in tripletopbrengst van ongeveer 45 % veroorzaakt, terwijl dit bij de ADMR techniek in de grootte van 1 % bedraagt. Met voordeel kan bij de onderhavige werkwijze de modulatiefrequentie van het magnetische 10 veld hoog ingesteld worden daar deze slechts beperkt wordt door de tripletafnametijd, die bij 300 K enkele ps bedraagt.

In het onderhavige geval is de MODS intensiteit I evenredig met de tripletopbrengst in een nulveld 4 (o) en het relatieve magnetische veldeffekt in veld B(mT): 15 I - 4(o) . £ [«Ko) - / 4(o)^ * 4(o) [(1-R)] waarbij R bij benadering door R =» <É(B) / ^(o) = [3 - 2^(o)]~l gegeven wordt.

20 De vergelijking voor R is afgeleid onder de aanname dat de afname van D+ naar de singlettoestand veel langzamer is dan die naar de triplettoestand ^D, welke conditie geldig is voor het grootste deel van het onderzochte temperatuurgebied. I wordt maximaal voor tf(o)~ 0,7. Bij kamertemperatuur wordt ^(o)^ 0,15, en neemt 25 geleidelijk bij lagere temperatuur toe tot «$(0)--' 0,7 bij 4,2 K.

Derhalve kan van de MODS gevoeligheid verwacht worden dat deze bij lagere temperaturen tot aan temperatuur van het vloeibare helium toeneemt. Uit fig. 1 blijkt dat tenminste tot 110 K deze verwachting bij de metingen uitkomt.

30 Met verwijzing naar fig. 2 wordt opgemerkt dat in het spectrum van kromme A de absorptiebleking in het lagere golflengtegebied bij 960 nm een "schouder" bij 990 nm vertoont. Bij afnemende temperatuur naar 110 K in kromme B neemt deze schouder toe totdat de gehele band een piek bij 990 nm vertoont, hetgeen het gewone 35 aspekt is van de bij lange golflengten optredende absorptiebleking van reaktiecenters van Rps.viridis bij cryogene temperaturen. Deze spectra geven aan dat de overgang voor het primaire elektrondonor geleidelijk BA&ORRSfMdË11 Jkerwijs twee configuratiebestanden van de BChl-dimeer «·? η ητκτ

« ^ I

7 weergeeft die de primaire donor vormt.

In de figuren 2 en 4 is het golflengtegebied van het MODS spectrum tussen 800 en 880 nm het meest interessante. In de krommen A tot E in fig. 4 vertonen bij afnemende temperatuur van 300 5 tot 160 K de pieken bij 822, 838, 852 en 868 nm slechts een kleine variatie in hun relatieve grootte. De inkeping bij 828 nm wordt echter bij afnemende temperatuur steeds dieper en passeert bij 160 K zelfs de nullijn en benadert bij 110 K de diepte van de inkeping bij 828 nm in het in kromme F weergegeven ADMR gedetecteerde T-S spectrum bij 1,2 K.

10 Bij deze spectra worden de verschijnselen bij 822 en 828 nm en bij 852 en 868 nm duidelijk verklaard door bandverschuivingen respektievelijk naar het blauw en rood resp. van de absorptiebanden van de twee bijbehorende BChl pigmenten die aan de donor D grenzen. De piek bij 838 nm wordt toegeschreven aan een band 15 die optreedt als gevolg van één van de twee BChl's, die de primaire donor D vormen, wanneer de excitonwisselwerking tussen de twee componenten van deze donor D gebroken wordt door de vorming van een triplettoestand die in de tijd gezien bij één van de twee BChl’s van D behoort.

20 De bij deze werkwijze verkrijgbare resultaten passen in de eerder gegeven interpretatie. De verandering van de verschijnselen bij 822 en 828 nm in de spectra van fig. 4 bij toenemende temperatuur wordt verklaard uit de afname van de amplitude van de blauwverschuiving veroorzaakt door een verbreding van de 25 absorptieband bij 828 nm te zamen met een verbreding en toenemende asymmetrie van de band bij 838 nm (zoals aangegeven door de gestreepte lijn in fig. 4). Een dergelijke temperatuurgeinduceerde verbreding en asymmetrie van absorptiebanden zijn gebruikelijke kenmerken bij fotosynthetische reaktiecenters. Daaruit kan geconcludeerd worden dat 30 er in reaktiecenters van Rps.viridis geen ladingsoverdracht-triplettoestand van de vont ^(D+Aq) optreedt zoals eerder in de genoemde publikatie van V.A. Shuvalov en W.W. Parson voor Rps.sphaeroides gesteld is. Tevens wordt opgemerkt dat de roodverschuiving bij 860 nm enigszins met temperatuur verandert hetgeen 35 hoofdzakelijk een gevolg lijkt te zijn van de verbreding van de 838 nm band.

In de stand van de techniek is verder aangenomen dat de bijbehorende BChl, die bij 830 nm absorbeert, een transiënte bad original 85 0 0 3 5 3 « \ 8 elektronacceptor A0 is. Uit metingen volgens bovengenoemde werkwijze blijkt dat deze BChl veel gevoeliger is voor temperatuurgernduceerde veranderingen in pigmentconfiguratie dan de andere bijbehorende BChl die bij 850 nm absorbeert. Ofschoon derhalve beide bijbehorende BChl's 5 een vrijwel gelijke wisselwerking met de donor D hebben, zoals blijkt uit de vergelijkbare grootte in nm of bandverschuiving van hun absorptieband bij de vorming van -^D, zijn zij in hun responsie op veranderingen in temperatuur geheel verschillend. Deze asymmetrie komt overeen met de asymmetrie in hun werking daar tot nu toe elk bewijs 10 achterwege is gebleven dat het bij 850 nm absorberende BChl pigment betrokken is bij het elektrontransport.

Experimenten overeenkomstig de onderhavige werkwijze hebben betrekking gehad op Rps.veridis en houden noodzakelijkerwijs niet in dat een 3(D+Aq) toestand geen rol in 15 reaktiecenters van Rps. sphaeroides R-26 speelt. Voorlopige MODS experimenten met deze reaktiecenters geven echter de indruk dat de hoofdoorzaak van temperatuurgeïnduceerde veranderingen in het T-S spectrum een verbreding van absorptiebanden en niet de toevoeging van een ladingsoverdrachttoestand is.

20 Opgemerkt wordt dat de werkwijze niet beperkt is tot bovenvermelde voorbeelden, en dat wijzigingen en varianten mogelijk zijn binnen het kader van de uitvinding. De genoemde werkwijze is van algemeen belang voor het onderzoeken van reakties waarin magneet-veldafhankelijke processen optreden en is niet beperkt tot 25 pigmentsamenstellen. Zo kunnen ook reakties bij fotolyse, thermolyse en elektrolyse onderzocht worden. Ook is de wijze van detectie niet beperkt tot absorptie, maar kan in principe elke optische eigenschap, zoals fluorescentie, vertraagde fluorescentie, fosforescentie, enz. omvatten.

BAD ORIGINAL

o k o n 7 s %

Claims (3)

1. Werkwijze voor het meten van absorptieverschil spectra van radikaalreakties, onder toepassing van een gemoduleerde verstoring van de concentratie van reaktanten in bijvoorbeeld door straling geïnduceerde radikaalcomplexen, waarbij de opbrengst van door 5 recombinatie en door ontsnappende radikalen veroorzaakte stoffen en/of moleculaire toestanden beïnvloed wordt, met het kenmerk, dat op het materiaal een gemoduleerd magneetveld wordt uitgeoefend, en dat de daardoor opgewekte veranderingen in absorbantie van het materiaal voor een breed frequentiegebied fasegevoelig worden 10 gedetecteerd, waarbij de temperatuur van het materiaal over een groot instelgebied, dat kamertemperatuur kan omvatten, kan worden gevarieerd.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij het magneetveld ingesteld wordt in een gebied van 0 - bijvoorbeeld 25 mT 15 met een modulatiefrequentie in het gebied van enige tientallen Hz tot enige kHz, en waarbij de temperatuur ingesteld wordt in een gebied van bijvoorbeeld 160 - 300 K.

3. Spectrometer voor het uitvoeren van de werkwijze volgens conclusie 1 of 2, voorzien van middelen voor het bestralen van 20 het te onderzoeken materiaal, middelen voor het opnemen van het genoemde materiaal, koelings- en/of verhittingsmiddelen, en detectiemiddelen voor het detecteren van het resulterende absorptiespectrum van het genoemde materiaal, gekenmerkt door een inrichting om een gemoduleerd magneetveld op het materiaal 25 uit te oefenen, waarbij de detectiemiddelen voorzien zijn van een fasegevoelige detector die de opgewekte veranderingen in absorbantie omzet in een dc absorptie, waarbij de koelings- en/of verhittingsmiddelen ingesteld worden op een temperatuur in een breed temperatuurgebied. **** BAD ORKgt^lf, 0 3 6 3