NL8401255A - Werkwijze voor de biologische bereiding van l-aminozuren. - Google Patents

Description

/t <i \ -ι-

L

Werkwijze voor de biolbgische bereiding van L-aminozuren.

ƒ ï f /

Hat is? bekend dat een L-aminozuur kan worden bereid uit de overeenkomstige alpha-ketozuurvoorloper door het alpfaa-ketozuur te voegen bij een actieve, logaritmisch groeiende cultuur van een geschikt micro-organisrae in een voedingsmedium.

5 Er zijn talkrijke micro-organismen in staat voor de biotransfor-matie van alpha-ketozuren in L-aminoren.

Gevonden werd nu, dat de optimale snelheid van de alpha-ketozunrvoeding direct kan worden gecorreleerd met veranderingen in de pH van de cultuur, die worden veroorzaakt 10 door veranderingen in de groeisnelheid van de cultuur. Toevoeging van alpha-ketozuur qp deze wijze kan leiden tot een hogere crar zetting van voorloper in L-aminozuur. Bovendien controleert deze werkwijze het cultuurmedium ook cp zodanige wijze, dat de microorganismen worden verschaft met een omgeving, die optimaal 15 is voor het verloop van de logaritmische groeifase.

Het is békend dat alpha-ketozuren enzymatisch in hun overeenkomstige L-aminozuren kunnen worden omgezet. Zo beschrijft bijvoorbeeld het Amerikaanse ocfcrooischrift 2.749.279 een werkwijze, waarbij alpha-ketoglutaarzuur en ammoniak worden 20 behandeld met een biologische enzyme-coenzyme katalysator. Geschikte biologische katalysatoren kunnen worden verkregen uit dierlijk weefsel, uit snelgroeiende planten of uit bacteria in de vorm van autolysaten of extracten van de celcultuur.. . Qp overeenkomstige wijze beschrijft het Amerikaanse octrooischrift 4.304.858 de 25 omzetting van in water oplosbare alpha-ketocarbonzuren in de overeenkomstige aminozuren bij aanwezigheid van een substraat— specifieke dehydrogenase, anrnarrtumionen en nicotinamide-adeniner-dinucleotide (NAD+/NADH). Omzetting van alpha-ketozuren in aminozuren met toepassing van rustende celsuspensies is beschreven 30 in Yamada c.s., The Production of Amino Acids, biz. 440-46 (1972).

Er zijn talrijke micro-organismen in staat tot de biotransformatie van alpha-ketozuren in L-aminozuren. Men kan 8401255 i % -2- gébruik maken van de gekoppelde enzymsystemen in micro-organismen cm de transamineringsreactie te bevorderen, waarbij het alpha-ketozuur wordt omgezet in het L-aminozuur. Door de actief groeiende cultuur op deze wijze te gebruiken blijkt de reactie nagenoeg 5 volledig te verlopen en er is een continue terugvoer mogelijk van de aminodonor (L-glutamaat). en het coënzym (NADPH of NADH). HafcL-aminozuur kan uit de cultuurvloeistof worden gewonnen.

De bekende werkwijze is verbeterd door verband te leggen tussen de snelheid van de toevoer van alpha-ketozuur 10 en de snelheid van de cultuurgroei. Er zijn inicro-organismen geïdentificeerd, die verschillende zuren produceren als zij in de actieve groeifase zijn. De optredende daling van de pH van de cultuurvloeistof dient als een natuurlijke rem op de celgroei en zal de groei en het metabolisme negatief beïnvloeden, indien 15 deze niet wordt gecontroleerd. Volgens de hier beschreven verbetering wordt een basische oplossing van het alpha-ketozuur toegevoegd in hoeveelheden, die voldoende zijn om deze van nature optredende daling van pH. te corrigeren. Derhalve wordt de alpfaa-ketozuurvoorloper aan de cultuur toégevoerd met een 20 snelheid, die ongeveer evenredig is met de groeisnelheid. Deze snelheid is tegelijkertijd ongeveer evenredig met de mate, waarin het gekoppelde enzymsysteera van het groeiende micro-organisme beschikbaar is voor de biotransformatie. Ook is gebleken dat het controleren van de bovenste pH grens van de cultuurvloeistof 25 een optimale cmgeving zal handhaven voor actief metabolisme.

Deze verbeterde werkwijze beoogt de groeiende cultuur mogelijk te maken het tijdstip en de snelheid van de alpha-keto-zuurtoevoeging zelf te regelen.

Een verwante doelstelling is het verschaffen van 30 een werkwijze, waarmee optimale omgevingsomstandigheden voor de groei en het metabolisme van het micro-organisme worden gehandhaafd.

Een bijkanende doelstelling van de uitvinding is het verwijderen van een bewerkingstrap bij de biotransformatie, door het mogelijk te maken de alpha-ketozuur oplossing aan de 35 cultuur toe te. voeren zonder dat het nodig is deze eerst te neutra- 8401255 » i \ -3- liseren.

Ben verwante doelstelling is het verhinderen van het mogelijk verlies aan actieve bestanddelen door het achterwege laten van deze neutralisatietrap.

5 Bovendien wordt beoogd dat de werkwijze van de uitvinding bruikbaar zal zijn net een ruim traject van mirco-orga-nisme en voor de bereiding van een ruim traject van L-aminozuren.

Ode beoogt de uitvinding een werkwijze te verschaffen, waarbij een enkele stam van micro-organisirien voldoende hoeveelheden 10 van alle gewenste enzymen kan produceren cm een bepaald alpha-keto-zuur in L-aminozuur cm te zetten.

Een andere, doelstelling is het verschaffen van een hoge waarde van de omzetting van alpha-ketozuur in L-aminozuur in een korte reactietijd.

15 Nog een andere doelstelling is het verschaffen van een werkwijze, waarbij een hoge opbrengst aan L-aminozuren wordt verkregen bij aanwezigheid van een lage concentratie van de amino-donor.

Beschrijving van de uitvinding 20 Bacteriegroei kan in het algemeen worden onderverdeeld in drie opeenvolgende fasen. De fase met vertraagde groei is een periode, waarin weinig of geen toeneming van het aantal micro-organismen in de cultuur optreedt. In de logaritmische of exponentiële groeifase, neemt het aantal cellen exponentieel met 25 de tijd toe. In de stationaire fase is er wéinig of geen celgroei of verdeling.

Het is gebleken dat de microbiologische transaminering van een alpha-ketozuur in L-aminozuur met verhoogd rendement kan worden uitgevoerd door het alpha-ketozuur te voegen bij een 3Q logaritmisch, groeiende cultuur van geschikte micro-organismen.

De werkwijze maakt met voordeel gebruik van een koppelenzymsysteem, dat in de groeiende micro-organismen aanwezig is cm de transaminerings-reactie volledig te maken.

De hier beschreven uitvinding verbetert deze bio-35 logische transamineringswerkwijze door het regelen van de 8401255 ί » -4- ψ snelheid van de alpha-ketozuurvoeding, zodat deze rechtstreeks overeenkomt met de snelheid van de zuurproductie, die qp zijn beurt nagenoeg overeenkomt met de groeisnelheid van de cultuur. Het alpha-ketözuur wordt aan de cultuur toegevoegd als een waterige basische 5 oplossing. Deze base wordt toegevoegd in hoeveelheden, die in evenwicht zijn met de zuren, die tijdens de groeifase door de micro-organismen worden geproduceerd. Het resultaat is dat de pH van de cultuurvloeistof in een nagenoeg constante toestand wordt gehouden. Deze methode van "behoefte voeding" maakt met voordeel 10 gebruik van de toenemende metabolische mogelijkheden van de cultuur als deze in de logaritmische groeifase karnt. Daarnaast verschaft de constante pH een omgeving, die geoptimaliseerd is voor versterkte bacteriëngroei en mogelijk metabolisme.

Als het fermenteren vollèdig is, kan het geproduceerde L-amino-15 zuur uit de cultuurvloeistof worden gewonnen.

De biotransformatie van het alpha-ketozuur in L-amino-zuur is een enzymatische transamineringsreactie. De biotransformatie wordt bevorderd door een gekoppeld enzyme-co-enzymesysteem, omvattende een·transaminase, een glutamaat-dehydrogenase, het 20 coenzyme NMOP+/NADPH (of NAEH-/NADH) en een dehydrogenase.

Alternatief kan het laatste bestanddeel van het enzymsysteem een hydrogenase zijn voor het terugvoeren van NADP+ (of NAD+) in N&DPH (of NftDHi.

Het gekoppelde reactiesysteem kan als volgt worden 25 weergegeven: (NADPH) L-aminozuur of f hydro- \ (NADHl a-ketoglutaraat ^ genase/ 30 /*Λ

of---/glY \ — -f—V

/ maat ] \inasej

Uydro- / V genase / \ /

' ' w \ genase/ T

35 (®DP+) ' , L-glutaraat “-tetozuur (31 of (Ml» (21 (1)- 8401255 '* » \ -5-

De gewenste transamineringsreactie (trap (1)), alpiha-ketozuur in L-aminozuur, is normaliter arikeerbaar en zal dan in het algemeen ook slechts tot het evenwicht verlopen, waardoor het rendement van de omzetting in aminozuur wordt beperkt. Door 5 de transamineringsreactie te koppelen met andere enzymatische reacties, kan de transamineringsreactie theoretisch volledig worden gemaakt, hoewel chemische afbraakreacties kunnen optreden, die de werkelijke opbrengst verlagen.

De gekoppelde enzymatische reactie, die hierboven 10 is aangegeven als trap (21 voert één van de transaminerings- producten, alpha-ketoglutaraat, terug naar L-glutamaat. Deze trap, een reducerende aminering, wordt bevorderd door glutamaat-dehydro-genase en vereist de aanwezigheid van arrmoniumionen. Het L-gluta-maat, dat voor de transaminering van het alpha-ketozuur in L-amino-15 zuur beschikbaar is, wordt door deze terugvoertrap continu vervangen.

Trap (21 gebruikt één van de coenzymen NADPK of NADH, dat wordt omgezet in NADP+ of t&D+. Een derde enzymatische reactie, trap (3), zet dit NAD+ (NADfl product weer om in NADBH (N&DH) via hetzij een dehydrogenasereactie of een hydrogenase-20 reactie. Derhalve wordt het NADPH (NADHl dat voor trap (2} is vereist ook continu aangevuld·... Het dat voor trap 2 is vereist wordt verschaft in het voedingsmedium.

Het enzymatische reactiesysteem als zodanig is bekend.

Eerdere toepassingen van dit systeem hebben echter de toevoeging 25 vereist van drie verschillende micro-organismen voor het verschaffen van de reactieccsiponenten van de hierboven weergegeven drie trappen, Amerikaans octrooischrift 3.183.170, of. de toevoeging van micro-organismen, amino-donoren en cofactoren (Yamada c.s, The Microbial Production of Amino Acids, biz. 440-46 (1972)1. Bovendien 30 maken deze békende methoden gebruik van rustende celsuspensies .

De eerder beschreven transamineringswerkwijze langs biologische weg maakt gebruik van een enkele micro-organismen stam voor het verschaffen van het gehele gekoppelde enzymatische reactiesysteem. Een logaritmisch groeiende cultuur van geschikte 35 micro-organismen, waarbij in het cultuurmedium aitmoniumionen aan- 8401255 ί * -6- wezig zijn, bevordert alle drie trappen van de biotransforxnatie van alpha-ketozuren in hun respectievelijke L-aminozuren. Trap (3) in het gekoppeld enzymsysteem van de bekende werkwijze naakt gebruik van een dehydrogenasereactie voor het omzetten van 5 NADP+ (NAD+) in NADPH (NADH).

De reagentia

Het gekoppelde enzymatische reaetiesysteem, dat hierboven is beschreven, is aanwezig in- actief groeiende micro-organismen. Dit natuurlijk voorkomende systeem kan nu worden 10 gebruikt voor de doeltreffende omzetting van alpha-ketozuren in L-aminozuren. Door het verschaffen van geschikte micro-organismen met het juiste substraat, wordt de omzetting uitgevoerd met hoge opbrengsten door de micro-organismen zelf.

De typen micro-organismen, die voor deze bio-amzetting 15 geschikt zijn, lopen sterk uiteen. Zo is in de stand van de techniek beschreven dat bactèriënstanmen, die bekend zijn voor het produceren van glutaminezuur, kunnen worden gebruikt. Hiertoe behoren Brevibacterium soorten, Corynebacterium soorten en E. Cöli HB10.1.

Het is gebleken (zie de voorbeelden! dat de verbeterde werkwijze 20 van de uitvinding kan worden toegepast met Brevibacterium thiogenita-lis (ATCC No. 31723)., Brevibacterium lactofermentum (ATCC No. 21420! en Brevibacterium flavum (ATCC No. 138261. Het gegeven ATCC nimmer is het nummer, dat iedere cultuur heeft ontvangen in de American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 25 30852, waar elk van de bovengenoemde culturen is gedeponeerd.

Het is te verwachten dat andere micro-organismen, die in staat zijn de basische bioconversie uit te voeren en die belangrijke hoeveelheden zuur afscheiden tijdens een logaritmische groeifase eveneens geschikt zullen zijn om bij de verbeterde werkwijze te 30 worden gebruikt.

Het is duidelijk dat er een grote reeks micro-organismen bruikbaar is voor deze bio-conversie-werkwij ze. De eerste eis is dat het micro-organisme in staat moet zijn om een alpha-ketozuur -te absorberen en om te zetten in het overeenkomstige L-aminozuur 35 Om de bioconversie zo doelmatig mogelijk te kunnen uitvoeren moet het micro-organisme in staat zijn voldoende hoeveelheden te 8401255 -7- *' * \ i produceren van <3e enzymen, die bij de trappen (1) t/m (3) van het gekoppeld enzymsysteem zijn betrokken can de transaminerings-reactie voorbij het evenwichtspunt naar voltooiing te kunnen doen voortbewegen. Tenslotte moet het micro-organisme bij voorkeur 5 in staat zijn het L-aminozuur in het cultuurmedium af te scheiden, zodat het doelmatig en economisch kan warden gewonnen.

De tweede eis is dat het micro-organisme tijdens het logaritmische of exponentiële groeifase belangrijke hoeveelheden zuur produceert en afscheidt. Voorbeelden van zuren, die 10 het meest kenmerkend worden afgescheiden, zijn melkzuur, glutaminezuur en bamsteenzuur, hoewel de afscheiding van andere zuren eveneens geschikt is voor de doelstelling van deze werkwijze. De afgescheiden hoeveelheden moeten voldoende zijn cm de pH van de cultuurvloeistof te verlagen tot een traject 15 van ongeveer 4 tot 6 indien deze niet wordt geregeld langs uitwendige weg door toevoeging van een base.

Het bij deze werkwijze te gebruiken alpha-ketozuur hangt af van het L-aminozuur, dat men wenst te bereiden. Zo wordt bijvoorbeeld fenylpyrodruivenzuur omgezet in L-fenylalanine, 20 alpha-ketoisocapronzuur in L-leucine, alpha-ketoiscvaleriaanzuur in L-valine, pyrodruivenzuur in L-alanine, oxaloazijnzuur in L-aspartinezuur, β-hydroxy-alpha-ketoboterzuur in L-treonine, p-oxyfenyl pyrodxui/enzuur in L-tyrosine, indoolpyrodruivenzuur in L-tryptofaan, alpha-keto-g-methylvaleriaanzuur in L-isoleusine, 25 enz. Zoals blijkt worden bij deze werkwijze de gebruikelijke Ir-aminozuurvoorlopers gebruikt.

Het bij deze werkwijze gebruikte alpha-ketozuur bevindt zich bij voorkeur in een waterige basische oplossing. Het alpha-ketozuur kan bijvoorbeeld geschikt worden opgelost in 0,1 M

30 tot 0,6 M waterig kaliunhydroxydeOok natriunfoydEoxyde, anmoniumr kunnen hydroj^de of ureum iworden gebruikt, evenals iedere andere base, die verenigbaar is met de groeiende cultuur en de transaminerings- reactie. Het is gebleken dat KÖH de voorkeur verdient bij gebruik van fenylpyrodruivenzuur (PPA). als voorloper, omdat PPA is 35 beter oplosbaar, in KDH. Het is te verwachten dat met het oog op 8401255 -8- de oplosbaarheid bepaalde basen voor bepaalde alpha-ketozuren de voorkeur kunnen verdienen. De concentratie kan variëren cm de gewenste pH in de fermenteerinrichting te handhaven, waarbij de toevoersnelheid overeenkomstig wordt ingesteld.

5 Kenmerkend ligt echter de concentratie van de base tussen ongeveer 0,1% (w/v). en ongeveer 20% (w/vl.

Als het alpha-ketozuur wordt gebruikt in de vorm van een natrium- of kaliumhydrolisaat, is het gewoonlijk niet nodig het alpha-ketozuur in een base op te lossen. Zo geeft 10 bijvoorbeeld een natriumhydrolisaat (natriumfenylpyrodruivezuur) van benzylideenhydantoine (5-EH), dat is bereildv door het 5-BH te koken met waterjNaOH en daarna te koelen in een ijsbad (zie voorbeeld 3), een oplossing met een pH van ongeveer 13,5.

Op overeenkomstige wijze heeft -Na-alpha-keto-isocapronzuur, 15 gehydroliseerd uit isobutylideenhydantoine, een pH van ongeveer 13,5 en Na-alpha-ketovaleriaanzuur, gehydroliseerd uit iso-propylideenhydantoine, heeft een pH. van ongeveer 13,8. Deze zijn geschikt voor het controleren van de pH bij de werkwijze i volgens de uitvinding.

20 Het verdient de voorkeur het alpha-ketozuur aan de cultuur toe te voegen in een waterige oplossing, die een geschikte base omvat, daar deze vorm het ponpen van de voorloper in de cultuurvloeistof vergemakkelijkt. Desgewenst kan iet alpha-ketozuur echter worden gebruikt in een brij, die 25 een geschikte base omvat.

De concentratie van het alpha-ketozuur in de waterige oplossing, indien dit de vorm is, waarin het aan de cultuur wordt toegevoegd, kan belangrijk variëren. Indien deze uitvinding bijvoorbeeld wordt gebruikt bij het continu fermen-30 teren, zal de oplossing verdunder zijn dan voor discontinu fermenteren. De bovengrens van de concentratie zal in de eerste plaats afhangen van de oplosbaarheid van het alpha-ketozuur in het gewenste oplosmiddel. Het is te verwachten dat gehalten van 1,0 tot ongeveer 200 g/1 geschikt zullen zijn, waarbij de 35 concentratie afhangt van het bepaalde alpha-ketozuur, alsmede 8 A 0 1 2 5 5 * ï \ -9- van de hierboven besproken factoren. Het meest geschikte en economische oplosmiddel is water, maar andere oplosmiddelen, verenigbaar met het systeem, cultuurmedium bijvoorbeeld, kunnen desgewenst worden gebruikt. Het voedingsmedium moet zo worden 5 gekozen, dat optimale groeicrastandigheden worden verschaft voor het gebruikte micro-organisme. De keuze van de media, variatie en regeling ligt binnen het bereik van een deskundige en behoeft hier verder niet te worden besproken.

Naast de basis-groeihestanddelen moet echter het 10 medium een bron voor NH^+ bevatten. De aimoniumionen worden door de micro-organismsn gebruikt zowel voor het vergroten van de celmassa en voor trap (21 van het gekoppelde enzymatische i reactiesysteem. De gehalten aan annoniumionen in het cultuurmedium moeten derhalve worden aangepast aan de gewenste produc-15 tie van aminozuur en celmassa. Deze aanpassing van het NH^+ gehalte is voor een deskundige algemeen bekend. Als voorbeeld kunnen ionen geschikt worden geleverd door aan het voedingsmedium ammoniumsulfaat toe te voegen in een concentratie van ongeveer 10 tot ongeveer 50 g/1. Alternatief kunnen ureum, ammoniumchlo-20 ride, amnnaniuranitraat, anmoniumacetaat, enz. als NH + donor worden gebruikt.

De reactiewerkwi j ze

De bio-canversiewerkwijze van de uitvinding vereist een cultuur van actief groeiende raicro-organismen. Deze cultuur 25 kan worden bereid door het inoculeren van een hoeveelheid steriel voedingsmiddel of groeimedium met een entcultuur van de gewenste stam. Men laat de voor het inoculeren van het voedingsmedium gebruikte entcultuur bij voorkeur 6 tot 40 uur groeien voor het gebruik als inoculum. De tijdsduur voor 3d het groeien van de entcultuur voor het inoculeren varieert afhankelijk van de gebruikte' bacteriënstam. Het is gewenst dat de entcultuur een gezonde, groeiende celmassa cravat, die voldoende is om een goede basis te vormen voor het ontwikkelen en de groei van de fermentatiecultuur.

35 De afmeting van de fermenteerinrichting hangt af 8401255 i ψ -10- van de ferrnentatiecultuur. De afineting van de fermenteerinriditing hangt af van de specifieke toepassing van deze werkwijze.

Het ligt binnen het bereik van deskundigen de hoeveelheden medium en entcultuur aan te passen aan de vereiste van een 5 specifieke reactor of een gewenste opbrengst.

Men laat de cultuur in de fermenteer inrichting - groeien tot deze voldoende aan de reactoramgeving is aangepast en is gegroeid tot een celmassa, die voldoende is om weerstand te kunnen bieden aan de toevoeging van het alpha-ketozuur.

10 Dit is van bijzonder belang als onzuivere voorloper wordt gebruikt. Optische dichtheid kan een geschikte maat voor de celgroei zijn. Een optische dichtheid ("O.D.") (640 hm) van ongeveer 10 geeft aan dat de cultuur gereed is voor de toevoeging van het alpha-ketozuur. Dit komt overeen met een 15 groeiperiode van ongeveer 6-40 uur, afhankelijk van het organisme en de groeionstandigheden. Dit kan echter enigszins variabel zijn en moet niet als strikte eis worden beschouwd, maar veeleer worden overgelaten aan de ervaring en het inzicht van de werker.

De cultuur groeit bij een temperatuur, die verenigbaar 20 is met maximale groei van de gébruikte bacteriënstam. Het algemene traject varieert van kamertemperatuur tot ongeveer 37°C. Voor Corynebacteria en Brevibacterium soorten bedraagt de temperatuur bij voorkeur ongeveer 30°C. De pH van de cultuur moet bij voorkeur ongeveer 7-8 bedragen voor de pH daling op-25 treedt, die gepaard gaat met het begin van de logaritmische groei. Beluchten kan plaatsvinden indien dit voor de gekozen bacteriënstam noodzakelijk is.

Tijdens de vertraagde en logaritmische groei produceren vele micro-organismen, bijvoorbeeld Brevibacterium en Corynebac-30 terium soorten, verschillende zuren en scheiden deze af. Tot deze zuren kunnen behoren glutaminezuur, melkzuur, bamsteenzuur en andere. De toevoeging van deze zuren aan het cultuurmedium verlaagt de pH. tot ongeveer 4-6 indien niet gecontroleerd door toevoeging van base. Dit verlaagde pH traject heeft belangrijke 35 nadelige invloed op de bacteriëngroei en de metabolische snel- 8401255 -11- - * \ hederx.

Omgekeerd is gebleken dat indien de groei de stationaire fase begint te bereiken, de zuurproductie door de micro-organismen vertraagt en vrijwel ophoudt. Daar delen 5 van de celpopulatie af sterven, kanen basische componenten, zoals aminen, vrij in de fermentatievloeistof. Indien niet gecontroleerd kan dit vrijkanen van base· ' de pH verhogen tot boven ongeveer 8. Hoge pH waarden zijn nadelig voor de cultuur en ramen zowel het metabolisme en doden tenminste delen van IQ de overblijvende levende celpopulatie.

Het is de actief groeiende en metaboliserende cel-cultuur die het gekoppelde enz^msysteem verschaft, dat de transamineringsreactie van de werkwijze cbetverlopen. Gevonden werd nu, dat het toevoegen van een basische oplossing van de 15 alpha-ketozuurvoorlcper aan de cultuur in antwoord op de pH-behoefte, de voorloper aan de micro-organisme verschaft met een snelheid, die nagenoeg evenwijdig loopt met hun vermogen cm deze om te zetten in het. iraminozuurproduct. Als de cultuur in de logaritmische groeifase komt en de pH begint te dalen, 20 wordt een basische oplossing van het alpha-ketozuur ingeleid met een snelheid, die de pH houdt op of boven een voorafbepaalde waarde, bij voorkeur in het traject van ongeveer 6,5 tot ongeveer 7,5.

Daarnaast kan het gewenst zijn een bovengrens voor 25 de pH in te stellen in het traject van ongeveer 7,5 tot 8. Dit bevordert het handhaven van de gezondheid en de metabolische activiteit van de micro-organismen, zelfs nadat de actieve groei vertraagt. Deze bovengrens van de pH kan worden gehandhaafd door aan de cultuur een zuur toe te voeren, dat met 30 de fermentatie verenigbaar is. Geschikte zuren zijn onder andere geconcentreerd ijsazijn, zwavelzuur, citroenzuur, fosforzuur, enz. Ieder zuur kan worden gebruikt, dat verenigbaar is met de groei of het metabolisme van de micro-organismen en met de transamineringsreactie.

35 Alle geschikte middelen kunnen worden gebruikt voor het 8401255 ~ e * -12- continu registreren van de pE van de cultuurvloeistof en het toevoegen van base of zuur, indien dit nodig is cm de pH binnen bepaalde voorafgestelde grenzen te handhaven. Ter wille van de eenvoud en de nauwkeurigheid verdient het de 5 voorkeur een geautomatiseerde pE-aftaster of ccmtroleerinrichting te gebruiken,, die in staat is tot het signaleren van één of meer parpen voor het uitdrijven van base of zuur in de fermenteer-inrichting met een voorafbepaalde snelheid. Op deze wijze kan een onmiddellijk antwoord worden gegeven op veranderingen 10 of schommelingen in de pE van de cultuurvloeistof. Dit komt overeen met een nagenoeg onmiddellijk antwoord op veranderingen in snelgroei en metabolische snelheden.

De snelheid van de voeding van base of zuur zal natuurlijk afhangen van de pH en de concentratie van de toe te 15 voegen oplossing, alsmede van de pE-behoefte van de cultuurvloeistof. Daarnaast wordt beoogd dat de base of het zuur hetzij continu of in de vorm van een bri.j wordt toegevoegd tot het gewenste gehalte van de pE is bereikt. Het is gebleken dat toevoer snelheden van ongeveer 1 tot 3 rol per minuut geschikt 20 zijn voor een fermenteerinrichting van 700 ml, met voedings-perioden, die uiteenlopen van 1,0 sec. tot ongeveer 10 min., al naar behoefte.

Tijdens de aanvankelijke (vertraagde! groeifase, dat wil zeggen na het enten met de entcultuur, kunnen de 25 benedengrenzen van de pE worden gecontroleerd door toevoeging van iedere base, die met de groeiende cultuur verenigbaar is. Tijdens deze beginperiode heeft de cultuur niet de logaritmische groeifase bereikt, tijdens welke de alpha-ketozuurvoorloper actief wordt omgezet, in L-aminozuur. Eoewel de basische 3Q alpha-ketozuur oplossing kan worden gebruikt voor de regeling van de pH tijdens de beginnende groeifase, kan dit nadelig zijn voor de gezondheid van de cultuur, in het bijzonder als onzuivere voorloper wordt gebruikt. In ieder geval treedt een volledig gébruik van de voorloper niet op tot de logaritmische 35' groei is bereikt. Om deze reden verdient het de voorkeur §401255 -13- , \ tijdens de beginnende groeifase een geschikte base te gebruiken, dat wil zeggen één die verenigbaar is met de groeiende cultuur, die de voorloper niet bevat. Geschikte basoi zijn bijvoorbeeld aimoniumhydroxide, ureum, natriumhydroxide, kaliumhydroxide en 5 amnoniakgas.

Te beginnen na ongeveer 6 tot 10 uur, als de O.D.

(640 nm) een waarde van ongeveer 10 heeft bereikt en de pH is gedaald tot ongeveer 6,8 tot 7,0, worden verdere dalingen van de pH gecontroleerd door toevoeging van het alpha-ketozuur in een IQ basische' oplossing, zoals hiervoor beschreven. De toevoer- snelheid tijdens deze logaritmische groei (of zuur-producerendel fase wordt in wezen bepaald door de pïï-behoefte, maar het is ook gewenst on de alpha-ketoconcentratie in de vloeistof beneden ongeveer 15 g/1 te houden. Hogere concentraties kunnen schadelijk 15 zijn voor de groeiende cultuur, in het bijzonder als onzuivere voorloper wordt gebruikt.

Zo veel mogelijk voorlqperqplossing wordt in de cultuurvloeistof geleid als respons op de pH behoefte. Ms de bacteriële vorming van zuur , - afneemt tot een punt, 20 dat niet langer voldoende is cm de pH van de media te brengen beneden ongeveer 6,8 tot ongeveer 7,5 en bij voorkeur 7,2, kan de grens van de pH worden verhoogd cm extra voorloper toe te voeren cp basis van de pH behoefte. Zo kan bijvoorbeeld de onderste pH grens worden verhoogd tot ongeveer 7,8.

25 Na het afsluiten van het voeden qp basis van de pH

behoef te,wordt de rest van het totale volume alpha-ketozuur, dat men in L-aminozuur wenst cm te zetten, aan de vloeistof toegevoerd. Het is gebleken, dat indien de rest van het alpha-ketozuur wordt toegevoerd in een periode tot 24 uur of 30 langer, bij voorkeur 2 tot 8 uur, het in belangrijke hoeveelheden in L-aminozuur zal worden cmgezet. Indien het bijvoorbeeld gewenst is 300-400 cc van een 80 g/1 oplossing voorloper toe 3 te voeren aan een voluraecultuurvloeistof van 700 cm , kan ongeveer 1/3 tot de helft van de voorloper worden toegevoegd 35 als respons qp de pH behoefte tijdens de logaritmische groeifase.

8401255 .· r -14-

De rest wordt toegevoegd in de volgende 2 tot 8' uur of langer.

De bovengrens van de pH wordt ingesteld op een voorafbepaald punt in het traject van ongeveer 7,5 tot 8,0, 5 bij voorkeur ongeveer 7,8. Zoals beschreven wordt deze grens geregeld voor optimale gezondheid en metabolische activiteit van de cultuur. Evenals bij het regelen van de onderste pH, verdient het de voorkeur een automatische pH aftaster te hébben, die de toevoeging van zuur aan de cultuurvloeistof regelt.

10 Het zuur wordt toegeveegd met een snelheid die voldoende is om de pH van de vloeistof te handhaven beneden de aangegeven bovengrens. De concentratie aan zuur kan bijvoorbeeld variëren van ongeveer 1% (w/vl tot ongeveer 30% (w/vl. Geconcentreerde oplossingen verdienen echter de voorkeur, in het bijzonder 15 bij discontinue werkwijze!), daar zij minder bijdragen tot totale volume van de fermentatiemedia.

Bij een discontinue werkwijze kan het gevormde L-aminozuur uit de cultuurvloeistof worden gewonnen nadat de cultuur de stationaire groeifase heeft bereikt, zoals 20 blijkt O.D. waarden in het traject van ongeveer 20 tot 70.

Als een continue werkwijze wordt gebruikt bij de onderhavige uitvinding, kan continu product worden gewonnen. Het L-amino-zuur kan uit de cultuurvloeistof worden gssonnen op de gebruikelijke wijze.

25 De volgende voorbeelden dienen uitsluitend ter toelichting en zijn niet als beperking bedoeld. In de voorbeelden worden de volgende afkortingen gebruikt.

°C - graden Celcius cc - kubieke centimeters 30 g - gram(menl 1 - liter LEM - liter (sl per minuut μ - micron(s! M - molair 35 min - minuten ml - milliliter (sl 8401255 -15- ' ’ \ * \ mm —' millimeters. (s ï irMolen - millimolen N - normaal *nm - nananeter(s)t 5 % - procent REM - omwentelingen per minuut vol - volume wt - gewicht

Voorbeeld 1 10 Ent- en groeimedia werden per liter gedeioniseerd water bereid cp de volgende wijze:

Ent Bestanddeel Groei 30 g Glucose1 100,0 g 2,5 g Maisweekvloeistof 2,5 g 2 15 2,5 g NZ amine B 2,5 g 1.0 g ^ÜEÜ^ 1,0 g 0,25 g MgSO^T^O 0,2 g 10,0 g (NH412S04 40,00 g 1.0 ml Biotine voorraadoplossing3 1,0 ii 4

20 1,0 ml Tiamtine-HCL-voorraadpplossing 1,0 iriL

20 g CaCO^ — 1 - aan 70% (w/vi glucose voorraadqplossing.

2 - Sheffield Caipany 3 - 100 mg d-biotine per liter gedeioniseerd water.

25 4 - 1,0 g hamine-ïKIEi per liter gedeioniseerd water.

5 - Toegevoegd aan entmedia voor buffer-doeleinden.

Alle bestanddelen werden gecombineerd en 10 min. bij 110°C in een autoclaaf behandeld voor steriliteitsdoeleinden.

Na de behandeling in de autoclaaf werd de pH van de media met 30 NaOH op 7,4 ingesteld.

3 3

Vijftig cm -aliquote monsters van entmedium in 250 cm schudkolven werden geïnoculeerd met Brevibacterium thiogenitalis ATCC No. 31723. De cultures liet men bij 30°C groeien, onder schudden met 300 REM gedurende een periode van 17 uur voor het 35 gebruik als incolum voor de fermenteerinrichting.

% 8401255 -16-

Er werd een door instrumenten gecontroleerde Multigen-fementeerinrichting van twee liter (werkvolume een liter) van de New Brunswick Company gebruikt. Voor het gebruik werd ongeveer 0,2 ml polyethyleen glycol 2000 aan de fermenteer-5 inrichting toegevoegd om schuinen te verhinderen. De inrichting werd daarna 10 min. aan behandeling in een autoclaaf onderworpen. Een beginvolume van 700 ml groeimedium werd in de fermenteer inrichting gebracht. Ongeveer 50 ml entoplossing (O.D. (640 nm) = 22) werd toegevoegd. De fermenteerinrichting 10 werkte bij 30°c, 600 REM, 1,0 - 1,25 liter per min. (LEM) lucht in de fermenteerinrichting voor beluchting.

De fermenteerinrichting werd met de hand op de pH gecontroleerd met geconcentreerde NH4OH (29%) oplossing gedurende de eerste 8 uur groeiperiode. De eerste 4 uur trad weinig of 15 geen verandering in de pH. op. De tweede 4 uur werd de pH-meter constant waargenomen. Zonodig werd NH^OH toegevoegd, waarbij het totaal toegevoegde volume tijdens "deze periode ongeveer 2,0 cc bedroeg.

Na de eerste 8 uur werd de pH automatisch gecontroleerd 20 met een pH-regelaar model 5997 (Horizon Ecology Company) en een pH electrode (200 mm) (INgold). Het systeem, werd zo geprogrammeerd, dat de pH van de cultuurvloeistof bleef boven 6,8 en onder 7,8.

Als de pH van het medium, daalde tot 6,8, werd de pH regelaar voorgeprogrammeerd voor het signaleren van een peristaltische ' ' -----Ί j 25 pomp (Cole Parmer Company) cm basé toe te voegen met een snelheid van ongeveer 1-3 rol per min. om de pH boven '6,8 te houden.

De base omvatte fenylpyruvaat in waterige kaliurohydrox-yde. Gezuiverd fenylpyruvaat (PPA) werd verkregen van de Aldrich Chemical Company in de vorm Na.PPA.H2O (98%, molecuul-30 gewicht 204.16). Dit werd opgelost in 0,6 M waterig KOH om een oplossing te verkrijgen met een concentratie van 98 gram per liter of 0,144 M in een totaal volume van 300 cc.

De waterige PPA oplossing werd door het systeem als pH controle eerst gébruikt na ongeveer 8 uur in het fermenteren ei 35 eindigde bij ongeveer 24 uur. In totaal 175 crn^ van deze oplossing werd automatisch tijdens de logaritmische groei in de 8401255 e - \ -17- fermenteerinrichting geleid. De totaal toegevoerde hoeveelheid Na.PPA.H^O tijdens deze periode bedroeg 17,15 gram (84nMolen).

Op dit moment, na 24 uur fermenteren, was de zuur-productie door de micro-organismen niet langer voldoende 5 cm de pH van het medium op of beneden 6,8 te brengen. Derhalve 3 werd de resterende 125 cm van het waterige PPA, dat 12,25 gram (60 irMolen) bevatte, in de fermenteerinrichting gepoept in de loop van twee uur (62,5 cm?/uur) . Men liet het fermenteren nog 24 uur voortschrijden, hetgeen een totale fermenteert!jd 3 10 opleverde van 48 uur. Tijdens de laatste 17 uur werd 25 cm 5N KDH als controlerende base gebruikt.

De pE regelaar werd ook voorgeprogramneerd cm te voorkomen dat de pH boven 7,8 kwam door het signaleren van een tweede peristaltische pomp (Cole Panter Corporation) voor 3 15 het toevoegen van geconcentreerd ijsazijn. In totaal werd 15 cm toegevoegd.

Glucose (70% w/v) voorraadoplossing werd zonodig toegevoegd cm te voorkomen dat de concentratie aan glucose in de fermenteervloeistof .-..>töt‘ nul daalde. Dit geschiedde 20 cm te verzekeren dat glucose, veeleer dan de voorloper yan^^-i-v, het product, als koolstofbron werd gébruikt.

Het uiteindelijk gewonnen volume bedroeg 1029 cc.

Het uiteindelijke berekende volume was: oorspronkelijk medium 700 cc 25 inoculum 50 cc waterig Na.PPA 300 cc azijnzuur 15 cc NH.OH 2 cc 4 glucose -100 cc 30 5N KDH 25 cc

Semi totaal = :H92 cc verwijderd 7 x 10 cc monsters = 70 cc

Totaal = _;1122 cc

Het verdanpingsverlies over de fermentatieperiode 35 van 48 uur bedroeg ongeveer 8,3 %.

8401255 -18-

Monsters van de fermentatievloeistof wedden geanalyseerd op L-fenylalanine met een hoge druk-vloeistof chramatograaf (HEDC) systeem. Door miliporiën gefiltreerde (0,22 μ poriën-afrreting) cultuurmonsters werden afgeleid met behulp van een 5 Dansylchloride techniek voor injectie op het HELC. De resultaten waren als volgt: 24 uur - 13.20 g/1 L-fenylalanine 28 " - 17.06 g/1 31 " - 19.20 ;.g/l " 10 48 " - 18.69 g/l "

De lagere opbrengst bij 48 uur was een gevolg van ontleding van het product.

üit een totaal van 144 mMolen Na.PPA.^O (29,4 gram) werd in totaal 115,93 itMolen L-fenylalanine (19,15 gram), tijdens 15 het fermenteren geproduceerd. De molaire opbrengst bedroeg:

nM L-fenylalanine x 100 nM Na.PPA.H^O

=5 115.94 x 100 = 80.51 114.00 „„ Voorbeeld 2 20 ——------

De media, micro-organisme-stam en basis-bewerkingen van voorbeeld 1 werden toegepast bij de volgende verschillen in hoeveelheden en controle van de pH. De waterige Na-EPA oplossing werd gebruikt als base-controle, te beginnen ongeveer 7 uur na 25 het inoculeren van de fermenteerinrichting» De voorgeprograirmeer-de pH-controle-instelpunten bedroegen 7,2 en 7,8.

De waterige Na.PPA.H„0 oplossing bevatte 168 nMolen ^ 3 (34,3 gram) in een totaal volume van 350 cm . Het volume van de waterige Na.PPA, die als basiscontrole werd gebruikt in 3Q de periode te beginnen bij ongeveer 7 uur en eindigende na ongeveer 24 uur, bedroeg 175 cm . Azijnzuur werd toegevoegd voor het regelen van de bovengrens van de pH, als in voorbeeld 3 1, waarbij in totaal 41 cm aan de fermenteerinrichting werd toegevoerd. Na het einde van 24 uur werd het onderste instel-25 punt van de pH-regelaar voor de rest van het fermenteren verhoogd tot 7,5. De rest van de Na.PPA oplossing (175 cc), werd vanaf 8401255 ~ - \ -19- dit mcmant in een periode van twee uur in de reactor gepompt.

Men liet het fermenteren nog 24 uur verlopen, waarbij de totale fermentatietijd 48 uur bedroeg.

Het uiteindelijk gewonnen volume bedroeg 1025 cc.

5 _ Het uiteindelijk berekende volume was als volgt: beginmedium 700 cc inoculum 50 cc

Na.PPA 350 cc azijnzuur 41 cc 20 glucose 100 cc NH^Cïï (geconcentreerd, 29% NH).. 2 cc

Semi-totaal = 1.243 cc Verwijderd 11 x 15 cc monsters = 155 cc

Totaal * 1.378 cc

Het verdairpingsverlies tijdens de fermentatieperiode van 48 uur was ongeveer 4,92%.

Monsters van de cultuurvloeistof werden geanalyseerd al.? in Voorbeeld 1.

De HPDC resultaten waren als volgt: 2° 24 uur - 16,7 ;g/l L-fenylalanine 26 -17,4 g/1 29 * - 19,5 -g/1 ” 32 “ - 20,1 g/1 48 “ - 21,8 g/1 2^ Uit in totaal. 168,00 ritolen Na.PPA.H^O (34,3 gram! werd in totaal 145.77 mttolen L-fenylalanine (24,08 graml tijdens het fermenteren geproduceerd. De molaire opbrengst bedroeg 86,8%.

Voorbeeld 3 30 Het volgende entmedium werd bereid:

Bestanddeel Hoeveelheid

Glucose 20 gram

Bacto-Pepton (Difcol 10 gram

Gisfeextract 10 gram 35 NaCl 3 gram 8401255

y' V' V

-20-

De bestanddelen werden gecombineerd en de pH werd met 5N NaOH op 7,2 ingesteld* Het medium werd 10 min. bij 110°C in een autoclaaf behandeld.

Het volgende groeimedium werd bereid: 5 Bestanddeel Hoeveelheid

Rietsuiker Melasse ,.l.JlO% 100,00 gram als glucose) K2HB04 0,50 gram KH^PO^ 0,50 gram 10 MgSO^.T^O 0,25 gram NH^SO^ 20,00 gram

Maisweekvloeistof 5,00 gram

CaCO^ 20,00 gram

De bestanddelen werden gecombineerd en de pH werd 15 met 5N NaOH op 7,2 ingesteld. Het medium werd 10 min. bij 110°C in een autoclaaf behandeld.

De entcultuur weed geïnoculeerd vanaf een 18 uur Auxo-Sy Agar (Difco) "slant" van Brevibacterium lactofermentum ATCC No. 21420 volgens de werkwijze van voorbeeld 1. Men liet 20 de entcultuur 7 uur groeien, waarna de O.D. (640 ïfcn) een waarde 25 had bereikt. De pH van het fermenteer-medium werd met NH^OH ingesteld op 6,5 tot 7,0. Een volume van 20 ml entcultuur-vloei-stof werd gebruikt voor het inoculeren van de fermenteer inrichting, eveneens volgens de werkwijze van voorbeeld 1. De 25 fermenteerinrichting werkt bij 30°C, 400 REM en 1,0 LEM. Het onderste pH-instelpunt bedroeg 6,8 en het bovenste pH-instelpunt was 7,8 gedurende de eerste 24 uur.

Een waterige kaliuith-fenylpyrodruivezuur oplossing (K-PPA) werd gebruikt als alpha-ketozuurvoorloper. De oplossing 30 was een ongezuiverd natriumhydroxide-hydrolysaat van 5-benzyl- ideenhydantoine. Bereiding van het hydrolysaat van 5-benzylideen-hydantoine (Hamsphire Chemical Company) geschiedde als volgt: 1598,85 gram gedioniseerd water en 168,3 gram KOH werden gecombineerd in een roestvrij stalen beker van 3 liter en tot 35 koken verhit. Terwijl het koken werd voortgezet werd 188,2 gram 5-benzylideenhydantoine toegevoegd en gemengd tot opgelost.

8401255 -21- * " \

Daarna werd nog 2 uur gekookt. Water werd toegevoegd om zonodig het oorspronkelijke volume te handhaven. Na het koken werd het mengsel snel afgekoeld in een ijswatefbad. Een ëên molaire oplossing van het kaliumrfenylpyruvaat-hydrolysaat bevatte 5 ongeveer 'vl/2M KDH, ongeveer ^r5M kaliumcarbonaat en ongeveer ^ Q,5M ureum. Het hydrolysaat werd vervolgens gesteriliseerd met een Milli-porienfilter (poriënafmeting 0,22 μ ).

Dit hydrolysaat, met een pH van ongeveer 13, werd gebruikt voor base-ccntrole vanaf het. begin van de fermentatie.

10 In totaal werd in 40 uur 225 ml toegevoegd.

Geconcentreerd ijsazijn werd gebruikt voor het verlagen van de pH. Een volume van 5 ml werd tijdens de eerste 17 uur toegevoegd. De pH van de cultuurvloeistof in de latere stadia van het fermenteren steeg niet boven 7,8, zodat verder geen 15 zuur behoefde te worden toegevoegd.

Na 24 uur fermenteren, werden de pH-instelpunten geregeld op 7,8 en 8,0. Op dit moment werd een hoeveelheid van 50 ml glucose toegevoegd om de concentratie van de vloeistof op 10% te brengen. Na 65 uur werd 20 ml glucose toegevoegd.

20 Monsters van de cultuurvloeistof werden geanalyseerd als in voorbeeld 1.

De HEDC resultaten waren als volgt: 40 uur - 6,8 -3/1 L-fenylalanine 43 - 7,8 S/1 25 45 " - 8,5 g/1 48 " - 9,4 g/1 65 " - 10,2 ..g/1

Uit in totaal 111,23 mMolen K-fenylpyrodruivezuurop-lossing werd in totaal 75,67 xtMolen L-fenylalanine geproduceerd 30 tijdens het fententeren. De malaire opbrengst bedroeg 68,0%.

Voor deze proef werd het verdaitpingsverlies niet bepaald.

Voorbeeld 4

De ent- en groemedia van voorbeeld 1 werden gebruikt, behalve dat in zcwel de ent- als de groeimedia 30 gram (NH^®^ 35 werd gebruikt en 20,9 gram MDPS (morfolinopropaan-sulfonzuurl als buffer in plaats van CaCO^· De kweek- en inoculatie-be- 840 1 2 5 5 / ν' -22- werkingen van voorbeeld 1 werden gevolgd met gebruik van Brevibacterium flavum ATCC Nb. 13626. De fermenteerinrichting, bij deze proef maakte de eerste 18 uur 500-600 RPM en daarna 650 RPM.

5 De voor de controle van de pH gébruikte base was K-fenylpyruvaathydrolysaat als beschreven in voorbeeld 3. De pH werd met C02 op 10 ingesteld. Het onderste instelpunt voor de pH bedroeg 7,2 en het bovenste instelpunt bedroeg 7,8. Het hydrolysaat werd gebruikt als basèscontrole bij het begin van 10 de fermentatie. In totaal 400 ml werd in de fermenteerinrichting geleid als respons qp de pH-behoefte. Na ongeveer 25 uur fermenteren werd 50 ml glucose toegevoegd aan de resterende 60 ml hydrolysaat-base-oplossing, die verder als base-controle werd gebruikt. In totaal werd extra 25 ml glucose toegevoegd bij 15 ongeveer 48 uur.

Geconcentreerd ijsazijn werd gébruikt voor het handhaven van de bovenste ρβ grens en om het mogelijk te maken extra hydrolysaat-base-oplossing aan de cultuur toe te voegen. In totaal werd 42 ml aan de fermenteerinrichting toegevoegd.

20 Monsters van de cultuurvloeistof werden geanalyseerd als in voorbeeld 1.

De HPIC resultaten waren als volgt: 17 uur - 3,33 gm/1 L-fenylalanine 19 " - 3,96 gm/1 25 22 " - 6,19 gm/1 24 " - 7,60 gm/1 42 " - 11,60 gm/1 " 45 " - 14,IQ gm/1 65 " - 11,90 gm/1 30 De lagere opbrengst bij 65 uur was een gevolg van de afbraak van het product.

Uit in totaal 176,33 irMolen K-fenylpyruvaatvoeding werd in totaal 111,99 mMolen L-fenylalanine geproduceerd in 45 uur. De molaire opbrengst bij 45 uur bedroeg 63,5%.

35 Bij deze proef werd geen rekening gehouden met ver- dampingsverliezen.

8401255

Claims (25)

1. Weekwijze ter bereiding van L-aminozuren met het kenmerk dat men (a) in een voedingsmedium miaro-organismen laat groeien, die alpha-ketozuren . anzetten in hun overeen- 5 kemstige Ir-aminozuren en die tijdens de groeifasen zuren produceren en afscheiden, (b) het gewenste alpha-ketozuur toevoert am de groeiende cultuur van micro-organismen met een snelheid, die nagenoeg overeenkomt met de groeisnelheid van de cultuur en 10 (c) de micro-organismen in staat stelt het genoemde alpha-ketozuur in het overeenkomstige L-aminozuur om te zetten.

2. Werkwijze volgens conclusie 1 met het kenmerk dat het L-aminozuur uit de fermentatievloeistof wordt gewonnen.

3. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, 15 dat de snelheid van de alpha-ketozuurtoevoeging in trap (b) wordt bepaald door de pH van de cultuurvloeistof.

4. Werkwijze volgens conclusie 3 met het kenmerk dat met de toevoeging vanhèt alpha-ketozuur wordt begonnen ongeveer 6 tot 10 uur na het inoculeren van het voedingsmedium met de 20 genoemde micro-organismen.

5. Werkwijze volgens conclusie 4 met het kenmerk dat met de toevoeging van het alpha-ketozuur wordt begonnen als de optische dichtheid (640 ran) van de groeiende cultuur een waarde van ongeveer 10 heeft bereikt.

6. Werkwijze volgens conclusie 5 roet het kenmerk dat de pH van de cultuur vöór het begin van de toevoer van alpha-ketozuur wordt geregeld door toevoeging van een base, die verenigbaar is met de fermentatie, welke base vrij of nagenoeg vrij is van het alpha-ketozuur.

7. Weekwijze volgens conclusie 6 met het kenmerk dat de pH van de cultuur vöór het begin van de toevoer van het alpha-ketozuur wordt gehouden in het traject van ongeveer 6,8 tot 7,2 .

8. Werkwijze volgens conclusie 6 met het kenmerk dat ï de base wordt gekozen uit armoniumhydraxyde ,kaliunhydroxyde, 8401255 -24- natriumhydroxide, ureum en ammoniakgas.

9. Werkwijze volgens conclusie 3 met het kenmerk dat het alpha-ketozuur wordt toegevoegd in een oplossing/ die een met de fermentatie verenigbare base bevat.

10. Werkwijze volgens conclusie 9, met het kenmerk dat de base wordt gekozen uit ammorrLumhydroxide, - kaüurrihydroxide en ureum.

11. Werkwijze volgens conclusie 9 met het kenmerk dat met de toevoeging van het alpha-ketozuur wordt begonnen als 10 de pH van de cultuurvloeistof daalt in het traject tussen ongeveer 7/2 en ongeveer 7/5.

12. Werkwijze volgens conclusie 11 met het kenmerk dat het alpha-ketozuur wordt toegevoegd als nodig is voor het handhaven van de pH van de cultuurvloeistof op of boven een vooraf- 15 bepaalde waarde in het traject van ongeveer 6,8 tot 7,5.

13. Werkwijze volgens conclusie 12 met het kenmerk dat de basische alpha-ketozuuroplossing in de cultuurvloeistof wordt gepompt bij een signaal van een geautomatiseerde pH-rege-laar.

14. Werkwijze volgens conclusie 13 met het kenmerk dat de pK-regelaar automatisch een pomp signaleert om met de toevoeging van de basische· oplossing te beginnen als de pE van de vloeistof daalt beneden een vooraf ingestelde grens binnen het genoemde traject.

15. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk dat met de toevoeging van een met de fermentatie verenigbaar zuur wordt begonnen als de pH van de cultuurvloeistof stijgt in het traject van ongeveer 7,5 tot ongeveer 7,8.

16. Werkwijze volgens conclusie 15 met het kenmerk dat 30 het zuur zonodig wordt toegevoegd om de pH van de cultuurvloeistof te houden op of beneden ongeveer 8,0.

17. Werkwijze volgens conclusie 16 met het kenmerk dat de pH van de cultuurvloeistof wordt geregeld door een geautomatiseerde pEï-regelaar.

18. Werkwijze volgens conclusie 17 met het kenmerk dat 8401255 -25- de pH-regelaar automatisch een ραπρ signaleert cm het zuur aan de cultuurvloeistof toe te voegen als de piï van de vloeistof stijgt boven een voorafbepaalde grens in het genoemde traject.

19. Werkwijze volgens conclusie 12 met het kenmerk dat 5 een eerste deel van de totale hoeveelheid alpha-ketozuur die men voor bio-conversie aan de groeiende cultuur wenst toe te voegen aan deze cultuur wordt toegevoegd op basis van pH-behoefte en dat een tweede deel van het alpha-ketozuur aan de cultuur wordt toegevoegd in een periode van tot 24 uur na het ophouden van 10 de toevoer op basis van de pH-behoefte.

20. Werkwijze volgens conclusie 19 met het kenmerk dat het eerste deel ëën derde tot de helft van de totale hoeveelheid omvat.

21. Werkwijze volgens conclusie 19 met het kenmerk 15 dat het tweede deel van het alpha-ketozuur aan de cultuur wordt toegevoegd in een periode tot ongeveer 8 uur. • *

22. Werkwijze volgens conclusie 21 mét het kenmerk dat het tweede deel aan de cultuur wordt toegevoegd in ëen of meer porties of continu.

23. Werkwijze voor het biologisch cmzetten van alpha- ketozuur voorlopers in L-aminozuren door de voorlopers toe te voegen aan een logaritmisch groeiende cultuur van micro-organismen, die in staat zijn de bioconversie uit te voeren en die zuren afscheiden tijdens de actieve groeifase met het 25 kenmerk dat men (ai veranderingen in de sH van de vloeistof van de groeiende cultuur registreert en (bi de alpha-ketozuur-voorloper toevoegt in een basische oplossing in hoeveelheden/ die in evenwicht zijn met 30 de door de micro-organismen afgescheiden zuren.

24. Werkwijze volgens conclusie 21 met het kenmerk dat met de toevoeging van het alpha-ketozuur wordt begonnen als de pH van de cultuurvloeistof daalt tot een voorafbepaalde waarde in het traject van ongeveer 7,2 tot ongeveer 7,5. 35

'25. Werkwijze volgens conclusie 22 met het kenmerk 8401255 #- -w- -26- dat het alpha-ketozuur, zoncdig wordt toegevoegd om de pH van de cultuurvloeistof te houden op of boven een voorafbepaalde waarde in het traject van ongeveer 6,8 tot ongeveer 7,5. 8401255