NL8401226A - Farmaceutisch produkt met anti-tumorwerking; gebruik van een farmaceutisch produkt of van farmaceutische samenstellingen in een anti-tumortherapie. - Google Patents

Description

* ( VO 6239

Farmaceutisch produkt met antitumorwerking; gebruik van een farmaceutisch produkt of van farmaceutische samenstellingen in een anti-tumortherapie.

De uitvinding heeft betrekking op een farmaceutisch produkt met anti-tumorwerking, alsmede op het gebruik van een farmaceutisch produkt of van farmaceutische samenstellingen in een anti-tumor-therapie.

5 Het is bekend dat endotoxinen - toxische stoffen welke inte grale componenten van de celwand van gram-negatieve bacteriën zijn, in hoofdzaak zijn samengesteld uit lipide en polysaccharide en daairom ook wel lipopolysacchariden (LPS) of glycolipiden worden genoemd -* vele typen antitumorwerking bezitten, waaronder inductie van hemorra-10 gische necrose en regressie van tumoren in dieren. Voor klinische toepassing zijn ze vanwege hun hoge toxiciteit echter niet geschikt.

Inmiddels zijn ook gedetoxificeerde endotoxinen, zoals non-toxisch lipid ·Α, verkregen door bijvoorbeeld zure hydrolyse met zoutzuur (Westphal en Lüderitz, Angew. Chem. 66, 407, 1954) of bestraling 15 met 150 kGy ^Co gamma-straling (Füst et al, Infect. Immun. 16, 26-31, 1977), en synthetische, niet-toxische analoga daarvan (Kotani ) et al, Infect. Immun. 41, 758-773, 1983; Kiso et al, Agric. Biol.

Chem. 45, 1523-1525, 1981; Behling et al, J. Immunology 117, 847, 1976; Ponpipom et al, J. Med. Chem. 23, 1184-1188, 1980) beschreven, 20 die zich door een aanzienlijk lagere toxiciteit gunstig onderscheiden van de endotoxinen. Helaas gaat deze afname van de toxiciteit gepaard met een aanzienlijke afname van de antitumorwerking.

Door Ribi et al (Cancer Immunol. Immunother. 7, 43-58, 1979; Cancer Research 41, 2654-2657, 1981; Cancer Immunol. Immunother. 12, t 25 91-96, 1982) is vastgesteld dat gedetoxificeerde endotoxinepreparaten bij intralesionale toediening (d.w.z. toediening in de tumor) een sterke antitumorwerking vertonen bij cavia's met een subcutaan getransplanteerd lijn-10 hepatocellulair carcinoom die door een carcinogeen geïnduceerd is, mits de gedetoxificeerde endotoxinepreparaten gecom- , ·' . 30 bineerd werden met trehalosedimycolaat, muramyldipeptide of een bac-

* S

8401226 -2- teriële peptidefractie, en olie. Tevens werd vastgesteld dat door toevoeging van muramyldipeptide de lethaliteit van endotoxinen dramatisch wordt verhoogd, maar dat de combinatie van muramyldipeptide met gedetoxificeerd endotoxine geen toxiciteitsverschijnselen zoals sterf-5 te en lethargie van de testdieren veroorzaakt.

De noodzaak van het mede-toedienen van olie en van intrale-sionale applicatie maken echter een direkte overdracht van de door Ribi et al bij cavia's opgedane onderzoeksresultaten naar de geneeskunde onmogelijk.

10 Het door Ribi et al mede toegepaste muramyldipeptide (MDP, chemische naam N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine) is een bekend immuno-adjuvans voor de vorming van specifieke antilichamen tegen oplosbare en deeltjesvormige antigenen (Chedid et al, Progr. Allergy, 25, 63-105, 1978), waarvan o.a. bekend is dat het bij toevoeging van 15 minerale olie, bijvoorbeeld Freund's incomplete adjuvans, een goed adjuvans wordt voor specifieke, door cellen gemedieerde immuunreacties (Chedid et al, J. Reticulo-endothel. Soc., 26, 631-640, 1979). Zelf is MDP niet immunogeen. Ook kan MDP verscheidene niet specifieke effector-mechanismen van het immuunsysteem, waaronder resistentie tegen patho-20 genen en produktie van interleukinen stimuleren (Parant, Springer

Semin. Immunopathol. 2, 101-118, 1979; Wood et al, Cell. Immunol. 70, 407, 1982). MDP op zich vertoont echter geen significante antitumor-werking.

Samenvattend zijn de volgende eigenschappen van MDP bekend: A. stimulatie van de vorming van specifieke antilichamen (humoraal 25 adjuvans) B. stimulatie van de specifieke cellulaire immuniteit (cellulair adjuvans) C. stimulatie van de niet-specifieke weerstand D. interferon inductie (lymfocvten en/of monocyt/macrofaag factor) 30 E. interleukinen inductie (leukocyt-factoren) F. macrofaag-activatie G. ongewenste effecten, zoals pyrogeniteit (koortsverwekkend vermogen), inductie van tijdelijke leukopenie (tekort aan circulerende witte bloedcellen), inductie van gewrichtsontsteking (arthritis) en ver- 35 hoogde gevoeligheid voor de toxiciteit van endotoxinen.

Sommige van deze eigenschappen zijn gekoppeld aan het gebruik van olie.

8401226 -3-

Er zijn verscheidene niet-pyrogene analoga en prodrug vormen van MDP beschreven (Kiso et al, Carbohydrate Research 90, C8-C11, 1981; Lederer, . Prog. Iimmmol. IV, 1194-1211, 1980; Krueger et al, J. Exp. Med. 159, 68-76, 1984; Durette et al. Carbohydrate Research 5 108, 139-147, 1982; Matsumoto et al, Infection and Immunity 39, 1029-1040, 1983; Ogawa et al. Infection and Immunity 35, 612-619, 1982; Saiki et al, Infection and Immunity 39, 137-141, 1983; Chedid et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 2472-2475, 1976; Lederer, J. Med. Chem. 23, 819, 1980; Matsumoto et al, Infection and Immunity 10 32, 748-758, 1981; Tsujimoto et al, Microbiol. Immunol. 23, 933-936, 1979; Durette et al, J. Med. Chem. 25, 1028-1033, 1982; Lefranchier et al, J. Med. Chem. 25, 87-90, 1982; Masihi et al, Infection and Immunity 43, 233-237, 1984; Kusumoto et al, Buil. Chem. Soc. Japan 52, 1665-1671, 1979; Arnon et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 6769-15 6772, 1980). De eigenschappen van al deze bekende analoga en prodrug vormen lopen nogal uiteen. Zo is het analogon 6-0-(2-tetradecyl-hexadecanoyl)-N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine, vergeleken met MDP zelf, een sterkere stimulator van de cellulaire immuniteit en zwakkere stimulator van de niet-specifieke weerstand; is het analogon 20 6-0-acetyl-N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine inactief als stimulator van de niet-specifieke weerstand en equivalent met MDP als ct cellulair adjuvans, en is het analogon N -(N-acetylmuramyl-L-alanyl-ε D-isoglutamyl)-N -stearoyllysine een sterkere stimulator van de niet-specifieke weerstand dan MDP.

25 Thans is verrassenderwijze gevonden, dat de toepassing van een combinatie van gedetoxificeerd endotoxine (of een synthetisch, niet of aanvaardbaar toxisch analogon daarvan) en muramyldipeptide (of een niet of aanvaardbaar pyrogeen analogon of prodrug vorm daarvan) zonder de volgens Ribi et al noodzakelijke olie en trehalose dimycolaat, bij 30 een andere dan intralesionale toediening, in het bijzonder bij intraveneuze, intramusculaire en/of subcutane toediening, leidt tot'een synergistisch effect wat de antitumorwerking betreft, zonder gepaard te gaan met een sterke toename van de toxiciteit.

De uitvinding heeft dan ook betrekking op een farmaceutisch 35 produkt met antitumorwerking, omvattende een of meer farmacologisch aanvaardbare dragers, oplosmiddelen, verdunningsmiddelen en/of hulp- 8401226 -4- stoffen, alsmede (a) ten minste één gedetoxificeerd endotoxine of een synthetisch, niet of aanvaardbaar toxisch analogon daarvan, en (b) mu-ramyldipeptide (MDP), of een niet of aanvaardbaar pyrogeen analogon of prodrug vorm daarvan, in hoeveelheden die enerzijds toxicologisch aan-5 vaardbaar zijn en anderzijds een effectieve antitumorwerking bezitten.

Volgens een uitvoeringsvorm van de uitvinding heeft het farmaceutisch produkt de vorm van ééi) enkele oplossing voor intraveneuze, intramusculaire of subcutane toediening.

Volgens een voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding heeft 10 het farmaceutisch produkt echter de vorm van een oplossing voor intraveneuze, intramusculaire of subcutane toediening van ten minste één gedetoxificeerd endotoxine of een synthetisch, niet of aanvaardbaar toxisch analogon daarvan, en een afzonderlijke oplossing voor intraveneuze, intramusculaire of subcutane toediening van MDP of een niet of 15 aanvaardbaar pyrogeen analogon of prodrug vorm daarvan. Door afzonderlijke toediening, dat wil zeggen toediening op verschillende plaatsen, kan een al te sterke vorming van antilichamen tegen component (a), welke een gevolg is van de immuno-adjuvanswerking van (b), en daarmee een neutralisatie van de werking bij een volgende injectie of eventuele 20 anafylactische reacties tegen (a), worden vermeden.

De uitvinding heeft verder tevens betrekking op een gebruik van het farmaceutisch produkt volgens de uitvinding in een antitumortherapie.

Meer in het bijzonder heeft de uitvinding betrekking op het gebruik van een farmaceutische samenstelling, welke ten minste één gede-25 toxificeerd endotoxine of een synthetisch, niet of aanvaardbaar toxisch analogon daarvan bevat, in combinatie met het gebruik van een farmaceutische samenstelling, welke MDP of een niet of aanvaardbaar pyrogeen analogon of prodrug vorm daarvan bevat, in een antitumortherapie, waarbij de twee_ samenstellingen gelijktijdig of vrijwel gelijktijdig op 30 verschillende plaatsen worden toegediend in hoeveelheden, die enerzijds toxicologisch aanvaardbaar zijn en anderzijds een effectieve antitumorwerking bezitten.

Eij voorkeur zijn de twee bedoelde samenstellingen oplossingen voor intraveneuze, intramusculaire en/of subcutane toediening, in het 35 bijzonder waterige oplossingen. Andere toedieningsroutes, bijvoorbeeld intraperitoneale toediening, zijn echter ook mogelijk.

8401226 -5-

De uitvinding wordt aan de hand van de onderstaande voorbeelden nader toegelicht.

VOORBEELD I

In dit voorbeeld werd het effekt onderzocht van intraveneus 5 (iv) geïnjecteerde waterige oplossingen van MDP in combinatie met een gedetoxificeerd endotoxine preparaat tegen solide subcutane (sc) Meth A fibrosarcoma transplantaten in syngene BALB/c muizen. Ter vergelijking werden ook de effekten van iv injecties van waterige oplossingen van MDP alleen, gedetoxificeerd endotoxine alleen, endo-10 toxine alleen, MDP + endotoxine en van alleen een fysiologische zoutoplossing onderzocht.

Voor de experimenten werden 11 weken oude BALB/c vrouwtjesmuizen gebruikt. Het Meth A sarcoma van BALB/c oorsprong werd verkregen bij het Clinical Research Centre (Harrow, Middlesex, 15 Groot-Brittannië) en door seriegewijze intraperitoneale passage in de ascites-vorm aangehouden.

Het MDP werd verkregen bij het Institut Pasteur Production (Marnes-la-Coquette, Frankrijk). Endotoxine (LPSw) van JE. coli 0111:B4 (Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA) werd geprepa-20 reerd volgens de fenol/water extractiemethode (Westphal et al,

Angew. Chem. 66, 407-417, 1954 en Z. Naturforsch. 76, 148-155, 1952). Gezuiverd toxisch en gedetoxificeerd endotoxine van de heptose-loze (Re) mutant Salmonella typhimurium (Ribi Immuno Chem. Inc., Hamilton, Montana, USA) werden geprepareerd en gezuiverd zoals beschreven door 25 Ribi et al, Cancer Immunol. Immunother. 12, 91-96, 1982, hetgeen in het kort neerkwam op extraheren van endotoxische glycolipiden uit cel-wanden met behulp van fenol/chloroform/petroleumether, fractioneren door middel van preparatieve microparticulaire gelchromatografie en verder zuiveren op Sephadex LH-20. Aldus werden gedisaggregeerde 30 endotoxische glycolipiden verkregen die vrij waren van fosfolipiden en nucleïnezuur en een eiwitgehalte van minder dan 0,3% bezaten. Detoxificatie van het gezuiverde endotoxine werd uitgevoerd door hydrolyse bij 100°C in 0,1 N HC1. Het verkregen preparaat was 1000 keer minder toxisch, gemeten naar de lethaliteit voor kuikenembryo's, 35 was praktisch vrij van KDO (keto-3-deoxyoctonaat) en bezat ongeveer de helft van het fosfaatgehalte van het gezuiverde endotoxine.

8401226 -6-

Het MDP werd opgelost in pyrogeenvrije fysiologische zoutoplossing. De endotoxinen werden opgelost in 0,5% triëthylamine (2 mg endotoxine/0,4 ml) en in fysiologische zoutoplossing verdund. Geïnjecteerd werd een totaal volume van 0,5 ml.

5 5 De muizen werden subcutaan in het abdomen met 3 x 10 levens krachtige Meth A cellen geïnjecteerd en 9 dagen later, toen de tumor een diameter van ongeveer 7,5 mm had bereikt, behandeld. De necrose werd op de elfde dag gemeten en uitgedrukt in de verhouding van de gemiddelde diameters van het necrotische gebied en de tumor, maal 10 honderd (omvang). Het optreden van donker en licht gekleurde necrose werd afzonderlijk aangegeven. Groeiremming werd genoteerd indien de tumor binnen 2 dagen na de injectie niet groter was geworden. Volledige genezing werd genoteerd indien de tumoren binnen 19 dagen van de behandeling geheel waren verdwenen. De gegevens zijn uitgedrukt als 15 de gemiddelde waarde ± SEM (SEM = standard error of the mean).

De resultaten zijn in onderstaande tabellen A en B samengevat .

8401226 -7-

TABEL A

Antitumoractiviteit van 12. coli endotoxine en/of MDP.

, , ... frequentie (%) behandeling necrose ___ _ _van_

Endotoxine MDP aantal frequentie (%) omvang* groei- volledige 13. coli 0111:B4 dosis -— inhibi- dosis (yg) (yg) muizen licht donker tie genezing 25 0 10 30 70 57 ± 5 80 30 10 100 10 0 100 75 ± 4 100 90 10 30 20 0 100 68 ± 2 100 80 10 10 5 0 100 66 ± 3 100 100 10. 3 5 0 100 57 ± 3 100 80 10 0 20 50 35 46 ± 3 65 15 3 30 10 0 100 61 ± 4 100 60 3 10 10 0 90 66 ± 2 100 60 3 0 14 50 7 49 ± 3 43 7 1 30 5 0 100 63 ± 5 100 80 1 0 5 40 0 36 ± 1 0 0 0,3 30 5 20 80 56 ± 7 100 60 0 100 10 0 0 30 20 0 30 15 0 0 77 0 10 4 0 0 25 25 0 3 5 0 0 0 0 0 0 20 0 0 5 0

♦gemiddelde ± SEM

8401226 -8-

TABEL B

Antitumoractiviteit van toxisch en gedetoxificeerd endotoxine van typhimurium Re alleen of met MDP.

behandeling necrose frequentie (%) --_ n _ _van_ endotoxine dosis MDP frequentie omvang groei- volledige £>. typhimurium dosis (%)__ inhi-

Re (yg) (yg) licht donker bitie genezing gedetoxificeerd 50 05 20 0 31 0 0 " 25 0 10 60 0 36 ± 6 10 0 " 10 30 10 10 90 61 ± 3 80 70 " 10 0 10 10 0 47 40 10 toxisch 10 30 51 20 80 73 ± 4 100 80 " 10 0 10 50 50 57 ± 5 90 40 fysiologische zoutoplossing 0 30 1000 0 0 " 0 0 10 0 0 0 0 8401226 van de tisn behandelde muizen stierven er vijf binnen 24 uur -9-

Verder werd ook de toxiciteit van i.v. geïnjecteerd toxisch en gedetoxificeerd typhimurium Re endotoxine, alleen of gemengd met uiteenlopende MDP doses, bepaald. De resultaten worden getoond in de bijgaande figuur. Groepen van 5 muizen kregen laboratorium-5 voedsel en water ad libitum en werden in een omgeving van constante temperatuur (18QC) en vochtigheidsgraad gehouden. De verandering van het lichaamsgewicht, gemeten 24 uur (open bolletjes) respectievelijk 48 uur-(zwarte bolletjes) na de injectie, werden proportioneel uitgedrukt ten opzichte van de individuele gewichten, zoals die onmiddellijk 10 voorafgaand aan.de injectie waren en weergegeven als gemiddelde ± SEM

(verticale balken). De cijfers tussen haakjes duiden op het totale aantal dode muizen na 24 en 48 uur. Diarree en lethargie werden na 5 uur beoordeeld.

De gegeven cijfers duiden op het aantal muizen met deze symptomen.

De aanduiding nd betekent: niet bepaald.

15 Bij de experimenten, waarvan de resultaten in tabel A worden getoond, bleek dat injectie van 25 yg J3. coli endotoxine in BALB/c muizen met 9 dagen oude Meth A tumoren in 100% van de gevallen een sterke tumor necrose, gevolgd door groeiremming van de meeste tumoren en volledige genezing bij 30% van dé muizen veroorzaakte. Lagere 20 doses waren in alle opzichten minder actief. MDP alleen veroorzaakte in uiteenlopende doses geen tumor necrose, doch induceerde enige regressie. Toevoeging van 3-100 yg MDP aan 10 yg 12. coli endotoxine leidde tot een aanzienlijke versterking van alle gemeten parameters van de antitumoractiviteit van het endotoxine. Met uitzondering van 25 de necroseomvang kon geen duidelijk verband tussen dosis en effekt worden waargenomen. Verlaging van de endotoxine dosis bij een constante MDP dosis van 30 yg leidde niet tot een duidelijke afname van de antitumoractiviteit.

Bij de experimenten, waarvan de resultaten in tabel B en de 30 figuur worden getoond, bleek dat gedetoxificeerd Sh typhimurium Re endotoxine in uiteenlopende doses een zeer geringe necrose veroorzaakte en de groei van de tumor nauwelijks beïnvloedde. Het toxische endotoxine vertoonde reeds in een dosis van 10 yg een aanzienlijke activiteit, maar de toevoeging van MDP was vaak lethaal.

35 Combinatie van het gedetoxificeerde endotoxine preparaat met MDP

leidde daarentegen tot een zeer sterke antitumoractiviteit, terwijl 8401226 -10- geen van de onderzochte combinaties lethaliteit of diarree veroorzaakte en lethargie slechts bij hogere MDP doses werd waargenomen.

Het gewichtsverlies nam met toenemende doses van beide componenten toe, maar kwam nooit boven 10%. Het lichaamsgewicht was na 48 uur 5 steeds hoger dan na 24 uur, hetgeen op herstel lijkt te wijzen.

Zoals in de figuur wordt duidelijk gemaakt, veroorzaakten alle doses van toxisch endotoxine, al dan niet gecombineerd met MDP, lethargie en diarree, hoewel MDP verrassenderwijze enige bescherming tegen diarree bleek te bieden. Het gewichtsverlies was groot, soms meer dan 15%, en 10 na 48 uur groter dan na 24 uur. Hogere MDP doses leidden tot een kleiner gewichtsverlies, hetgeen zou kunnen duiden op vloeistofopho-ping in de weefsels als gevolg van shock. Bij hogere doseringen werd lethaliteit waargenomen. De LD^ waarde van toxisch endotoxine alleen is meer dan 160 yg per muis, van een combinatie met 30 yg respec-15 tievelijk 100 yg MDP echter 28,3 yg respectievelijk 24,6 yg (berekend volgens de door Nowotny, Basic Exercises in Immunochemistry, blz. 303-304, 1979, Springer Verlag, Berlijn, gemodificeerde Spearman-Karber methode).

VOORBEELD II

20 In dit voorbeeld werd het effekt onderzocht van het tijdstip en de wijze van toediening van het gedetoxificeerde endotoxine en het MDP. Voor de dierproeven werden dezelfde soort muizen en tumoren gebruikt als in het voorgaande voorbeeld.

Behalve endotoxine van JE. coli 0111:B4 werden ook endotoxine 25 (LPSw) van E. coli 089 en een door bestraling (150 kGy bestraling 60 met Co gammastraling) gedetoxificeerd preparaat van hetzelfde endotoxine gebruikt, beide verkregen bij prof. dr. L. Bertók van het "Frédéric Joliot-Curie" National Research Institute for Radiobiology and Radiohygiene, Boedapest, Hongarije. De detoxificatie procedure 30 is beschreven door Füst et al, Infect. Immun. 16, 26-31, 1977; het ge- p detoxificeerde preparaat is in de handel onder het merk Tolerin .

De LDj.q waarden van deze twee preparaten in CFY-random vrouwtjesratten waren respectievelijk 2 mg/kg en 21 mg/kg. Tenzij anders aangegeven werden de preparaten iv geïnjecteerd in 0,5 ml pyrogeenvrije fysio-35 logische zoutoplossing.

8401226 5 -11-

De muizen werden op dag 0 subcutaan met 3 x 10 levenskrachtige Meth A cellen in het abdomen geïnjecteerd. De behandeling werd begonnen op dag 9 (toen de tumor een diameter van ongeveer 7,5 mm had), tenzij anders is aangegeven. De omvang van licht en donker ge-5 kleurde necrose werd op dag 11 gemeten en uitgedrukt in de verhouding van de gemiddelde diameters van het necrotische gebied en de tumor, maal honderd. De diameters werden met een schuifmaat gemeten. Groei-inhibitie werd genoteerd indien de tumor binnen twee dagen na de behandeling niet groter was geworden. Volledige genezing werd genoteerd 10 indien de tumoren binnen 19 dagen na de behandeling volledig waren verdwenea De gegevens zijn uitgedrukt als de gemiddelde waarde ± SEM. Significantie- analyse geschiedde met Student's t-test. P-waarden boven 0,05 werden niet-significant geacht.

De resultaten zijn in onderstaande tabellen C-F samengevat.

TABEL C

Effekt van variatie van het tijdstip van MDP toediening op de Antitumoractiviteit van endotoxine (E. coli 0111:B4) 1 2 behandeling necrose frequentie (%)van frequentie . ......

I omvang groei- volledige -^- inhi-3 4 licht donker bitie genezing

Endotoxine (dag 9) 60 30 50 ± 3 60 20 MDP (dag 9) 10 0 43 10 10 MDP (dag 9)/endotoxine (dag 9) 0 100 66 ± 3^ 90 60 MDP (dag 7)/endotoxine (dag 9) 50 30 41 ± 3 20 10 MDP (dag 8)/endotoxine (dag 9) 80 0 49 ± 4 80 30

Endotoxine (dag 9)/MDP (dag 10) 70 30 44 ± 3 50 0 fysiologische zoutoplossing 00 00 (dag 9)

Groepen van 10 BALB/c muizen met 9 dagen oude Meth A transplantaten werden i.v. geïnjecteerd met 3 yg endotoxine (LPSw van _E. coli 0111:B4)in fysiologische zoutoplossing. MDP (30 yg) in fysiologische zoutoplossing 2 werd i.v. geïnjecteerd vóór, samen met of na endotoxine.- Necrose werd gemeten op dag 11. De omvang wordt gegeven als de gemiddelde waarde±SEM. 3

Geen toename van de tumorgrootte binnen 2 dagen na de injectie.- 8401226 -12- .(vervolg tabel C) 4

Volledige verdwijning van de tumor binnen 19 dagen van de behande-5 ling.- p < 0,05 vergeleken met alle andere behandelingen.

TABEL D

’Antitumoractiviteit van MDP en endotoxine (E. coli 0111:B4), gelijktijdig langs verschillende routes geïnjecteerd.

1 2 behandeling necrose frequentie (%) --- van_ . , . _ ...... omvang groei- volledige voetzool ï.v. frequentie (%) . , .

--- inhi-_ 4 __licht donker_bitje3 gene*ing fysiologische endotoxine 90 0 41 ± 5 40 30 zoutoplossing MDP fysiologische 00 00 zoutoplos sing MDP endotoxine 10 90 62 ± 4^ 70 50 endotoxine fysiologische 00 00 zoutoplossing endotoxine MDP 0 100 59 ± 4^ 70 20 fysiologische fysiologische 10 0 00 zoutoplossing zoutoplossing

Groepen van 10 BALB/c muizen met 9 dagen oude s.c. Meth A tumoren op het abdomen werden gelijktijdig met 3 yg endotoxine en 30 yg MDP s.c.

2 in de voetzool resp. i.v. of omgekeerd geïnjecteerd.- Necrose werd gemeten op dag 11. De omvang wordt gegeven als de gemiddelde 3 waarde ± SEM.- Geen toename van de tumorgrootte binnen 2 dagen na 4 de injectie.- Volledige verdwijning van de tumor binnen 19 dagen vain de behandeling.- ^ p < 0,05 vergeleken met de overeenkomstige behandeling zonder MDP.

8401226 -13-

TABEL E

tumoractiviteit van E. coli 0111:B4 endotoxine en MDP bij s.c. injectie op verschillende plaatsen.

1 2 behandeling necrose frequentie (%) van linker rechter frequentie omvang groei- volledige voetzool voetzool _' ' inhi-^ ^ licht donker bitie genezing endotoxine fysiologische 00 00.

zoutoplossing endotoxine MDP 80 0 42 ± 4 40 60 -------«

Groepen van 5 BALB/c muizen met 9 dagen oude Meth A transplantaten werden s.c. met 3 yg endotoxine (LPSw van 13. coli 0111:B4), en 30 yg MDP of fysiologische zoutoplossing in respectievelijk de linker en 2 de rechter voetzool geïnjecteerd.- Gemeten op dag 11. De omvang 3 wordt uitgedrukt als gemiddelde waarde ± SEM.- Geen toename van de 4 tumorgrootte binnen 2 dagen na de injectie.- Volledige verdwijning van de tumor binnen 19 dagen van de behandeling.

8401226 -14-

____________________I

Φ Φ ft Ρ Ό cn o p c 00 O ld O Q) -^r poop θ' σ ιΰ ρ ρ φ •η ·η c ns φ θ' λ Η - Ό ·Ρ Ρ φ Ρ ο c ον οοοοοοο ο (β-ΡΟΦ υ Ιτηφ oicNin ft ο ε Ό ^ γη c φ c Β _ Ο Φ Ρ Φ Ρ *« η * > O' ft α 2 W <Ν φ ^ C Φ Τ3 2 φ cic Π η χ ό φ ο Φ ΐ! φ ο ρ > ο C m ·Η Ρ φ Ό •η a 4-ΐ ο φ φ χ ά ι -η οοοοοοο ο Ό-ρεσ ο £ ·ρ ρ ^rfoo^no ¢0(0^

Ρ £ φ ·Ρ t-i φ φ C

Ο ή] O Ρ ·η φ C

'O^PC C C Ο Φ c σ ·η φ η +J c Φ φ φ c 0> C ·Ρ Η -Ρ Φ Λ (β φ σ φ S a c ο ρ S LD ιη ·Η ΓΟ ο ρ σ ιρ rn co ιη ττ σ . οι ε ο c > οι ι 3 c φ +ι +ι +ι +ι +ι +ι . ο · ρ

> ·Ρ Γ-Η S

C ε co νο ο ο co ·~ι a Η Φ Φ ο •d' co ιη m ο cow'd Φ Ρ ft *σ Ο +ι c (¾ c cn ρ ο <d ρ •Ρ Φ _ φ Ν Φ > 2 Ρ 0) rfS Ρ % Ό Φ Ο ft. φ ρ Ρ Ο Ρ Η Ρ X ΟΟΟΟΟΟΟ Ο C Ο id C Φ O Ο Λ1 C *-< Ο Ο Cd Ο φ 01 id ·Ρ Ό

.Η Φ .S Ο -Η «Η Ρ -Ρ s C C

s~-/ C η Ό (d Ο το Ο Ό ρ Ρ ο Φ ·ρ Ν

Ρ m C Η Ό ES

φ 2 (ΰ ο ή ό σ

Φ & 4J ι—I ·Η Φ Ρ C

ϋ ^ Ρ ΟΟΟΟΟΟΟ Ο ft 0) Τ3 Φ ·Ρ Η r OO'd'CMt" ΙΟ >1 Ό > Ρ Ρ ηΐ ·Ρ C Ρ -Ρ Φ •ρ ^ rP id ε Φ Ό

X Ρ -Ρ Φ Ο C

ο ρ ε θ' ·ρ <d Ρ Ό Ρ Φ < W φ φ φ Ό C ΙΟΟΟΙΤΙΟΟΟΟ - Ό Η Ρ

(1) τΗ νΗ *Η 1 *—< ^ Ο pH

σ ρ μ ο φ _ Φ C Η > Ό σ 2 ·ρ <d π· c ρ ρ * φ ft C I φ pp λ το ο φ · ε (dg ft 3 g > φ

Ρ S Q ΙΙ + ΙΙ++Ι ο φ ·Ρ C

ρ 2 σ σ ρ φ w c ρ- φ ο Μ φ φ σ φ φ ρ ε σ ο τι γρ ο φ η ρ c φ οφ «η ω σσσσσσ ό ή-ρο Ό-Ρ σ ·Ρ 3 3 3 3 3 3 Ρ ρ Ρ pcoi' οφοφφ c <ο ·ρ ο ιηοοιοοο ε s ό >

(dC rp Q Ν Η rt Μ Η Η +J

>·Ρφ φ Ό Ο (d m , ·9 ό ε O' c c ο ρ g c c (d X Ο id c φ > e ο φ ο ρ φ σ φ σ φ s ε φ ρ _ φ ρ c ρ c Νφοσν pc ρ οοου·ρυ·ρ ·ρ σ ιβ Φ ·ρ Φ 00 CD CD 01 0] 01 01 ρ φ Ό ft Ρ, · C Ο Ο Ο ·Ρ 01 ·Ρ 01 - ε ρ ο 0¾ >·ρ σ ο σ ο ocNLTi εο . χ c c c -ρ ·ρ ·ρ ο ή ο ρ ο

ft 3 'Ρ Ο ·Ρ·Ρ*ΡγΡτΡγΡγΡ£1|γΡΡι ν c '-I C I

pc ρ ΡΡΡΟΟΟΟΟΟΟ CQ φ >-ι φ · ^ j J ο ΦΦΦϋΟϋ-ρρ-ρρ ρ φ c σ

(Β Π Φ 13 Η Η Η 013013 CHftCC

ft C Η C ΟΟΟ·, ·, ·, >ι Ο >ι Ο (QrPid-P-P

<1 a ρ Μ Ei Εη Η Η| Η| Β| Ρ Ν Ρ Ν *η (d Ό Ρ Η Εη 03 8401226

A

« -15-

Bij de experimenten bleek dat louter i.v. toediening van een suboptimale dosis van 3 yg E. coli 0111:B4 endotoxine aan Meth A dragende muizen leidde tot een hoog percentage van overwegend licht gekleurde necrose, gevolgd door groeiremming van de tumor in 60% 5 van de muizen en volledige genezing in 20% van de muizen. MDP alleen veroorzaakte slechts incidentele necrose en regressie. Gemengde toediening leidde tot 100% donker gekleurde en significant uitgebreidere necrose en een hoog percentage volledige regressie (60%), bij vergelijking met behandelingen met elk van beide componenten alleen.

10 Toediening van MDP één of twee dagen vóér of één dag na endotoxine leidde niet tot een versterking van de anti-tumoractiviteiten van endotoxine.

Gelijktijdige toediening van endotoxine en MDP langs i.v. respectievelijk s.c. route veroorzaakte een vergelijkbare anti-tumor-15 werking als gecombineerde i.v. toediening. Langs de s.c. route geïnjecteerd endotoxine miste elke anti-tumoractiviteit. Wanneer tegelijkertijd echter MDP i.v. werd geïnjecteerd, werd een even sterke necrose en tumor groeiremming bereikt als in het geval van een combinatiebehandeling langs de omgekeerde route, maar deze werd minder 20 vaak gevolgd door regressie. Simultane injectie van endotoxine en MDP langs s.c. route in respectievelijk het linker en het rechter voetkussen veroorzaakte zowel necrose als een hoog percentage regressie, terwijl opnieuw endotoxine alleen onwerkzaam was.

Tabel F laat zien dat een dosis van 25 yg E_. coli 089 endo-25 toxine een redelijke mate van necrose en 20% regressies opriep. TolerinR was in dezelfde dosis minder actief. Hoewel kleinere hoeveelheden (10 Ug) van beide stoffen een geringere activiteit bezaten, werd de antitumoractiviteit door toevoeging van MDP aan deze lage doses van endotoxine preparaten versterkt tot een hogere waarde dan bij toe-30 diening van 25 yg van elk endotoxinepreparaat alleen werd waargenomen.

8401226

Claims (6)

1. Farmaceutisch produkt met antitumorwerking, omvattende een of meer farmacologisch aanvaardbare dragers, oplosmiddelen, verdun-ningsmiddelen en/of hulpstoffen, alsmede (a) ten minste één gedetoxi-ficeerd endotoxine of een synthetisch, niet of aanvaardbaar toxisch 5 analogon daarvan, en (b) muramyldipeptide (MDP), of een niet of aanvaardbaar pyrogeen analogon of prodrug vorm daarvan, in hoeveelheden die enerzijds toxicologisch aanvaardbaar zijn en anderzijds een effectieve antitumorwerking bezitten.

2. Farmaceutisch produkt volgens conclusie 1 in de vorm van één 10 enkele oplossing voor intraveneuze, intramusculaire of subcutane toediening.

3. Farmaceutisch produkt volgens conclusie 1 in de vorm van een oplossing voor intraveneuze, intramusculaire of subcutane toediening van ten minste één gedetoxificeerd endotoxine of een synthetisch, 15 niet of aanvaardbaar toxisch analogon daarvan, en een afzonderlijke oplossing voor intraveneuze, intramusculaire of subcutane toediening van MDP of een niet of aanvaardbaar pyrogeen analogon of prodrug vorm daarvan.

4. Gebruik van een farmaceutisch produkt volgens een of meer van 20 de conclusies 1-3 in een antitumortherapie.

5. Gebruik van een farmaceutische samenstelling, welke ten minste één gedetoxificeerd endotoxine of een synthetisch, niet of aanvaardbaar toxisch analogon daarvan bevat, in combinatie met het gebruik van een farmaceutische samenstelling, welke MDP of een niet of aanvaard- 25 baar pyrogeen analogon of prodrug vorm daarvan bevat, in een antitumortherapie, waarbij de twee samenstellingen gelijktijdig of vrijwel gelijktijdig op verschillende plaatsen worden toegediend in hoeveelheden, die enerzijds toxicologisch aanvaardbaar zijn en anderzijds een effek-tieve antitumorwerking bezitten. 30

6. Gebruik volgens conclusie 5, waarbij de twee samenstellingen oplossingen zijn voor intraveneuze, intramusculaire en/of subcutane toediening. 8401226