NL8202638A - Kankercellenbestrijdende lymfocyten, werkwijze voor de produktie daarvan en antikankermiddelen, die deze lymfocyten bevatten. - Google Patents

Description

ν' 4 '5 4 -

Kankercellenbestrijdende lymfocyten, werk-wijze voor de produktie daarvan en antikankermiddelen, die deze lymfocyten bevatten.

De uitvinding heeft betrekking op kankercellenbestrijdende lymfocyten (hiema aangeduid als "dodende cellen") en een werkwijze voor de produktie daarvan. Zij heeft in het bijzonder betrekking op dodende cellen, die spe-5 cifiek inwerken op kankercellen met een glycoverwant antigeen, dat van de kankercellen afkomstig is (dit antigeen wordt hiema aangeduid als "GRA") en de kankercellen vernietigen en op een werkwijze voor de produktie van deze dodende cellen.

Bovendien heeft de uitvinding betrekking op een nieuw anti-10 kankermiddel, dat met name de dodende cellen of GRA als aktief bestanddeel bevat.

Immuunresponseffektorcellen, in het bijzonder T-lymfoeyten, die een voomame rol bij immuunrespons en cel-medium spelen, veroorzaken afstoting van enten, die aan vreem-15 de celantigenen zijn toe te schrijven, maar vertonen geen waameembare of zeer beperkte inhibitie tegen kankercellen.

Aldus worden de kankercellen niet vemietigd en vermenigvul-digen zich in vivo, hetgeen tenslotte leidt tot de dood van de aan kanker lijdende gastheer.

20 Het mechanisme, dat verantwoordelijk is voor de herkenning van eigen of niet eigen is echter niet geheel duidelijk en men heeft verschillende onderzoekingen gedaan voor het krijgen van inzicht in de aard van de bij een der-gelijk systeem betrokken materiele basis, bijvoorbeeld cel-25 oppervlakmerken aan muisleukemiecellen of embryonaal casi- noomcellen onder gebruikmaking van lectinen, zoals Dolichos biflorus agglutinine (DBA) en peanut pinda agglutinine (PNA) als beschreven in Biochem. Biophys. Res. Comm. 8£ (2) 448-455 (1979), Ibid. 96 (4) 1547-1553 (1980), J. Biochem. 89 30 473-481 (1981) en Cell 18 183-191 September 1979.

8202638

Ifc * * - 2 -

Er zijn echter geen pogingen van betekenis gedaan tot het verschaffen van nieuwe lymfocyten, die kanker-cellen specifiek kunnen bestrijden en ook antikankermiddelen geven onder gebruikmaking van immuunrespons van lymfocyten.

5 Als resultaat van uitgebreide onderzoekingen aan de immuunrespons van de gastheer op kankercellen en zijn toepassing op de behandeling van kanker, werd gevonden, dat er in een kankercel specifiek antigeen, GRA, is, dat niet in gedifferentieerde normale cellen wordt aangetroffen, dat 10 als een immunogeen voor de gastheer werkt en een zeer hoge immunogeniciteit heeft, die een voor de kankercellen speci-fieke immuunrespons veroorzaakt. Bovendien werd gevoiiden, dat wanneer GRA voor het sensitiseren van lymfocyten wordt gebruikt, er dodende cellen kunnen worden verkregen, die 15 specifiek inwerken op kankercellen, die GRA bevatten en wan neer de dodende cellen aan de gastheer worden toegediend, herkennen zij GRA en werken vemietigend op de GRA bevattende kankercellen in en dus, dat zij een uitstekend effekt verto-nen bij de behandeling en voorkoming van kanker.

20 Een uitvoeringsvorm van de uitvinding behelst dan ook dodende cellen.

Een andere uitvoeringsvorm behelst een werk-wijze voor de produktie van dodende cellen.

Nog een andere uitvoeringsvorm van de onder-25 havige uitvinding behelst een antikankermiddel, dat dodende cellen of GRA als aktief bestanddeel bevat.

Van bijgaande figuren is figuur 1 een mikrofoto van Daudi kankercellen, figuur 2 een mikrofoto, die de vorming laat 30 zien van plaatjes door GRA-1-K-T van de kankercellen van fi guur 1, figuur 3 een mikrofoto van Kato-III kankercellen, figuur 4 een mikrofoto, die de vorming laat 35 zien van plaatjes door GRA-1-K-T van de kankercellen van fi- 8202638 * 4 - 3 - guur 3, figuur 5 een mikrofoto van BT-I kankercellen, figuur 6 een mikrofot, die de vorming laat zien van plaatjes door GRA-1-K-T van de kankercellen van f i-5 guur 5, figuur 7 een mikrofoto van MKN-45 kankercellen, figuur 8 een mikrofoto, die de vorming laat zien van plaatjes door GRA-1-K-T van de kankercellen van fi-10 guur 7, figuur 9 een mikrofoto van MOLT kankercellen, figuur 10 een mikrofoto, die de vorming laat zien van plaatjes door GBA-1-K-T van de kankercellen van figuur 9, 15 figuur 11 een mikrofoto van BT-1, behandeld met een mengsel van ongesensitiseerde menselijke perifere bloedlymfocyten, figuren 12 en 13 telkens een mikrofoto van het kankercelweefsel van een aan kanker lijdende muis, waar-20 aan GBA-M-1-K-T is toegediend, figuur 14 een mikrofoto, die de toestand toont van kanker in een aan kanker lijdende groep muizen, waaraan GRA-M-1 is toegediend, figuur 15 een mikrofoto, die de kankertoe-25 stand toont in een aan kanker lijdende groep muizen, waaraan geen GRA-M-1 is toegediend, figuur 16 een mikrofoto, die het kankercelweefsel toont van een aan kanker lijdende groep muizen, waaraan geen GRA-M-1 is toegediend, 30 figuur 17 een mikrofoto van het kankercel weefsel van de groep, waaraan GRA-M-1 is toegediend, figuur 18 een SDS gel elektroforesediagram van GRA onder gebruikmaking van proteinevlekken volgens C.B.B. methode, 35 figuren 19 tot en met 21 telkens een SDS gel 8202638 -4- * * $ elektroforesediagram van GRA onder gebruikmaking van suiker-kleuring volgens de PAS methode, figuur 22 een schematische voorstelling van de resultaten van een SDS gel elektroforesediagram van GRA 5 onder gebruikmaking van proteinevlekken volgens de C.B.B.

methode en figuur 23 een grafiek, die tumorgroei toont in C3H/HE muizen, getransplanteerd met X5563 immune muize-miltcellen en X5563 cellen.

10 De doden§e/van de uitvinding kunnen bijvoor- beeld worden bereid volgens een methode, waarbij GRA voor het sensitiseren van lymfocyten wordt gebruikt.

GRA als gebruikt bij bovenstaande methode kan uit GRA bevattende kankercellen van mensen of dieren, 15 bijvoorbeeld gekweekte kankercellen, getransplanteerde kanker cellen, spontaan optredende kankercellen, met chemische stof of virus opgewekte kankercellen en kankercellen, afkomstig uit geopereerde weefsels, op de volgende wijze worden verkre-gen.

20 Celmembraankomponenten worden als boven beschreven van kankercellen afgescheiden en behandeld met een lectine, dat specifiek kombineerd met een eindstandige galactose of een eindstandig N-acetylgalactosamine, waardoor waardoor GRA met de lectine wordt gekombineerd en gemakkelijk 25 kan worden afgescheiden.

Geschikte voorbeelden van galactosebindend lectine zijn pindalectine en ricinus communis lectine (zie J.B.C., 250, 8518-8523 (1975), Biochem, Biophys. Res. Comm., 62, 144 (1975), Z. Immunitaetsforch, 138, 423-433 (1969), 30 Br. J. Exp. Pathol, 27, 228-236 (1946), Proc. Nath. Acad.

Sci. USA, 75, No. 5, 2215-2219 (1978), Biochemistry, 13, 196-204 (1974) en Carbohydrate Research, 51, 107-118 (1976). Geschikte voorbeelden van N-acetylgalactosebindend lectine zijn Dolichos boon (Dolichos biflorus) agglutinine, vlecht-35 sinaasappel lectine,Helix pomatia lectine, lima-boon (Phaseolus 8202538

A K

* ' 4 - 5 - limensis) lectine, soja (Glycine max) lectine en Bauhinia boon (Bauhinia purpurea) lectine.

De afscheiding van kankercelmembraankompo-nenten kan op bekende wijzen geschieden, zoals door homoge-5 nisering en solubilisering onder gebruikmaking van een op- lossend middel. Het is voordeliger een methode te gebruiken, waarbij kankercellen in fysiologische zoutoplossing of in een geschikte buffer worden gehomogeniseerd, een geprecipi-teerd gedeelte bijvoorbeeld door centrifugering wordt ver-10 wijderd en opgelost in fysiologische zoutoplossing of een buffer met behulp van een oplossend middel en de bovenstaande vloeistof overbiijft. Te gebruiken oplossende middelen zijn bijvoorbeeld oppervlakteaktieve stoffen, waarvan algemeen bekend is, dat zij celmembraan oplossen, zoals nietionogene 15 oppervlakteaktieve stoffen, bijvoorbeeld Triton X-100 (gepro-duceerd door Wako Pure Chemical Industries Ltd.), NP-40 (geproduceerd door Shell Co, Ltd.), digitonine en ureum en anionogene oppervlakteaktieve stoffen, bijvoorbeeld natrium-dodecylsulfonaat (SDS).

20 Uit de aldus verkregen celmembraankomponen- ten kan GBA, dat met lectine kan kombineren, onder gebruikmaking van de eigenschappen van lectine op de gebruikelijke fysisch chemische en biochemische wijzen worden gewonnen.

Voorbeelden van dergelijke werkwijzen zijn affniniteitschro-25 matografie onder gebruikmaking van een lectinebevattende dragerkolom, immuunprecipitatie onder gebruikmaking van GBA antilichaam of iets dergelijks, dialyse, gelfiltratie, elek-troforese, fysische precipitatie onder gebruikmaking van een suiker proteine-precipiteermiddel, bijvoorbeeld poly-30 ethyleenglycol en aceton en een kombinatie daarvan. De voor- keur verdient affiniteitschromatografie onder gebruikmaking van een lectinebevattende dragerkolom, waarbij de dragerkolom gemakkelijk kan worden vervaardigd door immobilisatie van lectine aan een onoplosbare drager. Een dergelijke immo-35 bilisatie van lectine aan een onoplosbare drager kan op be- 8202638 'i - 6 - kende wijzen voor de immobilisatie van biostoffen worden uit-gevoerd. Van deze methoden verdienen een aktivering van polysaccharide met cyaanbromide en een immobilisering van de gebruikmaking van N-hydroxysuccimideesters de voorkeur. De 5 aktivering van polysaccharide met cyaanbromide is een methode, waarbij een onoplosbare drager met cyaanbromide wordt behan-deld en het aldus verkregen geaktiveerde produkt ter immobilisering van lectine onder zachte omstandigheden wordt on-derworpen aan een koppelingsreaktie met lectine. Bij de 10 behandeling van de onoplosbare drager met eyaambromide ge-bruikt men bijvoorbeeld basische verbindingen als natrium-hydroxyde en natriurawaterstofcarbonaat voor het instellen van de pH op 7,5 tot 12 en behandelt de drager 1 tot 12 minu-ten bij kamertemperatuur in een oplosmiddel als water, azijn-15 zuumitril of een op pH 7,5 tot 12 gehouden buffer, bijvoorbeeld 0,1 M natriumwaterstofcarbonaatbuffer (pH ongeveer 8,7) en 0,01 M fosfaatbuffer (pH ongeveer 7,7). Gewoonlijk is de gebruikte hoeveelheid cyaanbromide bij voorkeur gelijk aan die van de onoplosbare drager, 20 Elke bekende onoplosbare drager met lage niet specifieke adsorptie voor alle biostoffen, grote poreus-heid, met een funktionele groep, die biostoffen onder zachte omstandigheden kan immobiliseren en chemisch en fysisch vol-doende stabiel is, kan bij de uitvinding worden gebruikt.

25 Onoplosbare dragers, die men kan gebruiken, zijn bijvoorbeeld een drager, vervaardigd uit cellulose, bijvoorbeeld amino-ethylcellulose, carboxymethylcellulose, broomacetylcellulose en p-anilinocellulose, een drager van verknoopte dextran, bijvoorbeeld Sephadex en CM-Sephadex (vervaardigd door 30 Farmacia Corp.), en een drager van agarose, bijvoorbeeld

Sepharose 2B, Sepharose 4B en Sepharose 6B (vervaardigd door Farmacia Corp.).

Bij de koppelingsreaktie van de met cyaanbromide geaktiveerde drager als boven beschreven met lectine, 35 gebruikt men de met cyaanbromide geaktiveerde drager in een 8202638

V

i - 7 - hoeveelheid van 30 tot 80 maal de lectine en voert de reaktie 10 tot 20 uur bij een temperatuur van 0 tot 40°C, bij voor-keur van 2 tot 8°C uit in een geschikt oplosmiddel, zoals een 0,1 mol/1 natriumwaterstofcarbonaatoplossing in water 5 (die 0,5 mol/1 natriumchloride bevat, pH: 8,4). Op deze wijze kan een lectinebevattende drager voor affiniteitschromatogra-fie worden vervaardigd.

Door chromatografie onder gebruikmaking van de boven vervaardigde lectinebevattende drager, kombineert 10 het gewenste GRA met de in de drager aanwezige lectine en wordt in de kolom ingevangen. Vervolgens kan men stoffen, die met bijvoorbeeld lectine kunnen kombineren door de kolom leiden teneinde een uitwisselingsreaktie te bewerkstelligen, of eventueel kan men een adsorptiescheider (elueeroplossing), 15 bijvoorbeeld een hoog geconcentreerde zoutoplossing, een kaliumthiocyanaatoplossing in water of een hydraatbuffer, ter dissociatie door de kolom leiden en bet gewenste GBA ver-krijgen.

Voorbeelden van bij de uitwisseling te ge-20 bruiken stoffen, die met lectine kunnen kombineren, wanneer een galactosebindend lectinebevattende drager voor affiniteits-chromatografie is gebruikt, zijn diegene, die kunnen kombineren met een eindstandig galactosekombinerend lectine, bijvoorbeeld galactose, disacchariden met een eindstandige ga-25 lactose en oligosacchariden met een eindstandige galactose en voorbeelden van stoffen, die met lectine kunnen kombineren, wanneer een N-acetylgalactoseaminebindende lectine voor affi-niteitschromatografie is gebruikt, zijn die, die kunnen kombineren met een eindstandig N-acetylgalactosaminekombinerend 30 lectine, bijvoorbeeld N-acetylgalactosamine, disacchariden met een eindstandig N-acetylgalactosamine en oliesacchariden met een eindstandig N-acetylgalactosamine.

Het aldus verkregen GRA bevat glycoproteine met een galactose en/of N-acetylgalactosamine in eindstand, 35 glycolipide en/of saccharide, 8202638 - 8 -

Het aldus bereide GRA kan desgewenst worden gevriesdroogd en verder worden gezuiverd onder gebruikmaking van de gewone scheidingsmethode. Zo kunnen bijvoorbeeld de GRA preparaten, die met een galactosebindend lectine zijn 5 gebonden worden onderworpen aan een scheidingsmethode onder gebruikmaking van een N-acetylgalactosaminekombinerend lectine en diegene, die met een N-acetylgalactosaminekombinerend lectine zijn gewonnen, kunnen worden onderworpen aan een scheidingsmethode onder gebruikmaking van een galactosebindend 10 lectine.

De hier gebruikte lymfocyten zijn niet kritisch en men kan allerlei lymfocyten van normale of aan kanker lijdende mensen of dieren gebruiken. Voorbeelden zijn lymfocyten, afkomstig uit periferaal bloed, beendermerg, lym-15 feklieren, milt, tonsillen en thymus. Deze lymfocyten worden op fysische of chemische wijze of volgens een oppervlakte-membraanmethode, of lets dergelijks gewonnen.

De sensitisering van lymfocyten met GRA wordt uitgevoerd door de lymfocyten 1 tot 10 dagen, bij voorkeur 20 2 tot 7 dagen te kweken op een GRA bevattend kultuurmedium.

Als kultuurmedium voor de sensitisering van lymfocyten kan men verschillende gebruikelijke voedingsmedia voor een dergelijke celkweek gebruiken. Voorkeursvoorbeelden zijn een RPMI 1640 medium, een Eagle MEM kultuur, enzovoort, 25 waaraan menselijk serum, kalffoetusserum (KFS), kalfserum, paardeserum of iets dergelijks is toegevoegd. De aan de kultuur toe te voegen hoeveelheid GRA bedraagt gewoonlijk 1 tot 1000 ng/ml en bij voorkeur 1 tot 500 ng/ml, als berekend als g een hoeveelheid suiker per 1 x 10 /ml lymfocyt.

30 De kweek geschiedt op de gebruikelijke wijze, bijvoorbeeld bij een pH van ongeveer 7,2 en een temperatuur van ongeveer 37°C.

De als boven bereide dodende cellen van de uitvinding zijn nagenoeg normale lymfocyten en hebben een 35 GRA-specifieke celbestrijdende werking. Zo heeft bijvoorbeeld 8202638 * V 4 - 9 - GRA-1-KT, dat een van de dodende cellen van de uitvinding is, eigenschappen, die voor menselijke periferaal bloed T-cellen gewoon zijn en vertonen een celbestrijdende werking, die specifiek is voor GRA bevattende kankercellen, hetgeen in 5 onderbeschreven voorbeeld wordt aangetoond.

Goede voorbeelden van de nieuwe dodende cellen van de uitvinding zijn GRA-1-KT en GRA-M-1, die in onderstaande voorbeelden worden bereid. Alle dodende cellen van de uitvinding zijn bij aanvrager verkrijgbaar.

10 De dodende cellen van de uitvinding kunnen onbeperkt worden vermenigvuldig op bovenbeschreven kultuur-medium, dat een T-celgroeifaktor (TCGF, IL-2) bevat. In dit geval kan selektieve kultuur van kloning van de dodende cellen volgens de gebruikelijke ultraverdunningsmethode worden 15 uitgevoerd. Deze dodende cellen kunnen lange tijd stabiel worden bewaard, bijvoorbeeld in vloeibare stikstof.

Het GRA kan afzonderlijk als aktief bestand-deel worden gebruikt en kan bovendien in kombinatie met an-dere bakteriele en kankerinhibiterende middelen worden ge-20 bruikt. Kankerinhibiterende middelen, die het GRA van de uitvinding als aktief bestanddeel bevatten, kunnen in elke vorm verkeren, mits zij in zodanige toestand zijn, dat zij het GRA in doeltreffende hoeveelheden bevatten. Gewoonlijk wordt het middel intraveneus, subcutaan, intradermaal of 25 intramuskulair toegediend als een oplossing, een suspensie of een emulsie. Voorts kan het worden geleverd als een droog-produkt, dat vloeibaar kan worden gemaakt door voor het gebruik een geschikte drager toe te voegen. Dit vloeibare middel kan een suspendeermiddel bevatten, bijvoorbeeld methyl-30 cellulose, een emulgator, bijvoorbeeld lecithine, konserveer- middelen, bijvoorbeeld methyl-p-hydroxybenzoaat, een stabi-lisator die als zodanig geen nadelige invloed op de immunise-rende werking op mensen en dieren heeft, een buffer, enzo-voort.

35 Een te gebruiken waterige drager is bijvoor- 8202638 * - 10 - beeld fysiologische zoutoplossing en te gebruiken niet wateri-ge dragers zijn bijvoorbeeld plantaardige olie, bijvoorbeeld sesamolie, minerale olie, bijvoorbeeld paraffine, dierlijke olie, bijvoorbeeld squalleen en propyleenglycol. Bovendien 5 kan men ter verhoging van de immunologische werking geschikte toevoegsels opnemen. Te gebruiken toevoegsels zijn bijvoorbeeld volledige toevoegsels van Freund, saponine voor dieren en aluminiumhydroxyde voor mensen.

Het antikankermiddel van de uitvinding kan 10 een maal of herhaaldelijk gedurende een lange tijd ter behan- deling aan een kankerpatient worden toegediend of kan ter voorkoming van kanker worden toegediend aan iemand, die het gevaar loopt kanker te krijgen.

Aangezien de LD,_q (muis, intraperitoneaal) 15 van GRA tenminste 500 mg/kg bedraagt, berekend als een hoe- veelheid suiker, heeft het antikankermiddel van de uitvinding een geringe toxiciteit en kan dan ook in een groot doseer-trajekt worden toegediend. Hoewel de GRA-concentratie in het antikankermiddel van de uitvinding niet kritisch is, verdient 20 het gewoonlijk de voorkeur, dat deze 0,001 tot 100 ^ug/ml bedraagt als berekend als een hoeveelheid suiker. Ten aanzien van de dosis van het antikankermiddel verdient het gewoonlijk de voorkeur het middel toe te dienen in een hoeveelheid van 0,001 tot 1000 ^ug/kg/dag tegelijkertijd of in verschil-25 lende porties, hoewel deze dosis varieert met de omvang van de ziekte en de leeftijd en het geslacht van de patient.

Het aldus bereide antikankermiddel, dat de dodende cellen als aktief bestanddeel bevat, wordt bij voorkeur gebruikt als een injekteerbare oplossing in kombinatie 30 met dragers, die bij de bereiding van dergelijke bloedmedi- cijnen worden gebruikt. De gebruikte dragers zijn niet kritisch,, maar dragers met een aan die van bloed gelijke tonus verdienen de voorkeur. Fysiologische zoutoplossing verdient de bijzonder voorkeur. Bij de bereiding van het middel ver-35 dient het de voorkeur, dat de dodende cellen voldoende worden 8202638 t % .

- 11 - gewassen met fysiologische zoutoplossing of iets dergelijks, opdat boven beschreven kultuurmedium wordt verwijderd en daama worden de cellen in een drager geflotteerd.

De concentratie van de dodende cellen in het 5 middel is niet specifiek beperkt maar bedraagt bij voorkeur 5 9 10 tot 10 per milliliter. Als de dodende cellen intraperi- g toneaal worden toegediend in een dosis van 10 per muis, wordt geen toxiciteit waargenomen. Hoewel de dosis van het antikankermiddel van de uitvinding varieert met de ernst van 10 de ziekte en de leeftijd en het geslacht van de patient, verdient het gewoonlijk de voorkeur dat het middel wordt toe- 5 12 gediend in een dosis van 10 tot 10 /kg/dag, in een portie of in deelporties.

De volgende voorbeelden lichten de uitvinding 15 toe.

Referentievoorbeeld I Lokaliteit van GRA - 1A. Bereiding van met FITC gemerkt lectine (PNA-FITC).

20 Tien mg pindalectine (PNA, geproduceerd door EY Co.) werd opgelost in 2 ml 0,01 M fosfaatbuffer, die 0,85%

NaCl bevatte (pH 7,2). In 1 ml 0,5 M waterstofcarbonaatbuffer (pH 9,0) werd 2 mg FITC (geproduceerd door Sigma Laboratories Inc.) opgelost en 0,5 ml van de resulterende oplossing werd 25 toegevoegd aan boven bereide PNA buffer. Het mengsel werd daama 2 uur bij kamertemperatuur geroerd en vervolgens ge-scheiden over Sephadex G25 (10 mm x 300 mm, geproduceerd door Farmacia Corp.). De beginpiek werd opgevangen. FITC/PNA verhouding 1,0.

30 1B. Bereiding van met FITC gemerkt lectine (DBA-FITC).

Op dezelfde wijze als onder 1A boven werd DBA-FITC verkregen onder gebruikmaking van DBA geproduceerd door EY Co. FITC/DBA verhouding 0,9.

35 8202638

,. V

« % · - 12 - 1C. Sojaagglutinine-FITC (FITC-SBA) is ver-krijgbaar van EY Co. FITC/SBA verhouding 1,4.

2. Lokaliteit van GRA in verschillende 5 kankercellen.

a. Gekweekte menselijke kankercellen (1 x g 10 ) werden drie maal met een 0,05 M triszoutzuurbuffer, die 0,85% NaCl (pH 7,2) bevatte, gewassen volgens een centri-fugaalmethode en daarna voegde men 100 yul PNA-FITC, DBA-FITC 10 of SBA-FITC (200 yUg/ml) als boven bereid onder 1. toegevoegd.

Men liet het resulterende mengsel 30 minuten bij kamertempera-tuur staan teneinde het te laten reageren. Toen de reaktie voltooid was werd het reaktiemengsel drie maal gewassen met 0,01 M fosfaatbuffer, die 0,85% NaCl (pH 7,2) bevatte en 15 daarna werden de cellen op een glasplaat gebracht en onder een fluorescerende mikroskoop onderzocht.

De resultaten zijn weergegeven in tabel A.

De gebruikte kankercellen zijn alien bekend en zijn verkregen van de First Pathology Laboratories, Medical Department of 20 Niigata University.

TABEL A

Kankercellen positieve verhouding -K-a.n5.erce.fien van GRA (%)

PNA DBA SBA

25 Raji (Burkitt lymfoom) 98,3 1,4

Dauji (Burkitt lymfoom) 93,1 5,2 BT-1 (Burkitt lymfoom) 50,1 0 P-12 (T-cel lymfoom) 44,3 6,7 MOLT (T-cel leukemie) 0,6 4,8 30 Fujimaki (B-cel lymfoom) 19,1 5,3

Oda (IgD myeloom) 0,6 10,0 QG-56 (longkanker, geschubd) 70,4 2,0 PC-1 (longkanker, geschubd) 78,4 0,4 PC-3 (longkanker, adenocarcinoom) 77,1 0 35 QG-90 (longkanker, kleine cel) 68,0 0 8202638 * « - 13 - TABEL A (vervolg) ,, ,, positieve verhouding

KaAercellen van GBA (%)_

PNA DBA SBA

PC-13 (longkanker, grote cel) 17,0 0 5 MK-2 (maagkanker, slechte 63,7 0,1 diff erentiatie) KATO-III (maagkanker, signet ringkanker 57,3 0 MKN-45 (maagkanker, slechte 1,0 40,3 differentiatie) 10 MKN-1 (maagkanker, adenocarcinoom 4,6 0,4 geschubd) MKN-28 (maagkanker) 0,4 0,1 MKN-74 (maagkanker) 0,5 0 MGH-U1 (urineblaaskanker) 37,4 0 15 KU-2 (urineblaaskanker) 4,5 21,4 T-24 (urineblaaskanker) 14,6 0 NBT-2 (urineblaaskanker) 13,1 1,0 NRC-12 (nierkanker) 23,9 0 KU-1 (nierkanker) 3,3 0,6 20 Kuramochi (ovariumkanker) 80,0 0 NB-1 (neuroblastoom) 50,9 1,7 YT-nu (neuroblastoom) 3,6 0,5 TGW-nu-1 (neuroblastoom) 4,1 0 TGW-nu-11 (neuroblastoom) 2,0 1,0 25 GOTO (neuroblastoom) 0,5 0 ITO (embryonaal carcinoom) 96,9 12,3 NEC-8 (embryonaal carcinoom) 44,6 0 SCH (choriocarcinoom, maag) 14,6 3,1 GCH (chriocarcinoom, uterus) 5,4 0 30 YN-1 (rhabdomyosarcoom) 5,7 1,7

Mouse X5563 (plasmacytoom) 92,0 0 90,6

Mouse MH134 (hepatoom) 18,6 0 6,4 35 8202638

V

- 14 - b) De kwaadaardige weefsels van kankerpa-tienten werden door een roestvrij stalen zeef ($ 150) geleid teneinde een enkele cellensuspensie te verkrijgen. Na twee maal wassen met 0,01 M tris-HCl buffer (pH 7,4), die 2 mM 5 CaCI^, 2mM MgCl^ en 0,85% NaCl bevatte, werd 5x10^ cellen in 100 ^ul buffer hersuspendeerd.

Honderd ^ul FITC-PNA of FITC-DBA (100 ^ug/ml) werd aan de cellensuspensie toegevoerd en bet mengsel werd 20 minuten bij kamertemperatuur geinkubeerd. Na drie maal 10 wassen met koud PBS werden de cellen onderzocht onder een fluorescentie mikroskoop.

De resultaten zijn weergegeven in tabel B.

De kwaadaardige weefsels van kankerpatienten zijn verkregen van de Kansai Medical University.

15

GSA

No. Kankerpatientweefsel PNA DBA - 1 maagkanker + + 2 maagkanker + + 20 3 maagkanker 4 maagkanker + 5 maagkanker + + 6 maagkanker + 7 borstkanker + 25 8 borstkanker + 9 borstkanker + 10 borstkanker + + 11 darmkanker + + 12 darmkanker - + 30 13 Esofaguskanker + 14 hepatoom - +

Noot: Symbool "+" betekent GEA is uitgedrukt op het celopper-vlak.

Symbool betekent GRA is niet uitgedrukt op het cel-35 oppervlak.

8202638 i + v · - 15 -

Referentievoorbeeld II

Bereiding van GRA

IA. Bereiding van geimmobiliseerd lectine (PNA-Sepharose).

5 Drie gram met CNBr geaktiveerd Sepharose 4B

(geproduceerd door Farmacia Corp.) werd grondig gewassen met 1 mM HC1 en gesuspendeerd in 200 ml 0,1 H natriumwaterstof-carbonaat (pH 8,5). Daama werd 5 ml 0,01 M fosfaatbuffer (pH 8,5), die 20 mg PNA bevatte, toegevoegd en men liet het 10 gebeel 2 uur bij 25°C reageren waarbij men af en toe roerde, teneinde PNA-Sepharose te bereiden.

IB. Op dezelfde wijze als in 1A. boven, behalve dat men DBA gebruikt in plaats van PNA, werd DBA-Sepharose verkregen.

15 2. Bereiding van GRA.

a. BT-1 (Burkittlymfoom) cellen (1,3 x 10 ) werden drie maal gewassen met fysiologische zoutoplossing en men voegde 30 ml 0,01 M triszoutzuurbuffer (pH 7,4) toe, die 20 2% "TRITON X-100" (geproduceerd door Wako Pure Chemical Indus tries Ltd.), 0,85% NaCl, 2 mM CaCl2 en 2 mM MgCl2 bevatte.

Het mengsel werd 15 rainuten bij 4°C geroerd en daama onder-worpen aan ultracentrifugescheiding bij 100.000 x g. Van 28 ml aldus verkregen bovenstaande vloeistof leidde men een por-25 tie van 14 ml door een kolom (middellijn 0,5, lengte 1 cm) voor affiniteitschromatografie, gevuld met PNA-agaroseparels (geproduceerd door Maruzen Co., Ltd.), die in evenwicht waren gebracht met een triszoutzuurbuffer (pH 7,4), die 0,1% TRITON X-100, 0,85% NaCl, 2 mM CaCl2 en 2 mM MgCl2 bevatte. Na te 30 zijn gewassen met dezelfde buffer als boven gebruikt, elueerde men de kolom met 0,01 M triszoutzuurbuffer (pH 7,4), die 0,1 M lactose, 0,85% NaCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 en'0,1% TRITON X-100 bevatte. De aldus geelueerde portie werd 48 uur gedialy-seerd met 0,01 M triszoutzuurbuffer, die 0,85% NaCl, 2 mM 35 MgCl2 en 2 mM CaCl2 bevatte onder verkrijging van 17 ml GRA- 8202638 % - 16 - oplossing. Met deze GRA oplossing werden de hoeveelheid pro-teine en de hoeveelheid suiker respektievelijk gemeten volgens de Folin-Lowrymethode en de fenol-zwavelzuurmethode en zij bleken respektievelijk 644 ^ug en 120 jug te bedragen. Dit 5 wordt hiema aangeduid als "GRA-1".

b. C3H/He muismamma tumor (MMT) cellen (1 x 10^) werden drie maal gewassen met fysiologische zoutoplos-sing en men voegde 30 ml 0,01 M triszoutzuurbuffer (pH 7,4) toe, die 2% TRITON X-100, 0,85% NaCl, 2 mM CaCl2 en 2 mM

10 MgCl2 bevatte. Het mengsel werd 30 minuten bij 4°C geroerd.

Vervolgens werd het mengsel onderworpen aan ultracentrifuge-scheiding bij 100.000 x g gedurende 2 uur en de bovenstaande vloeistof werd een nacht gedialyseerd met 0,1 M triszoutzuurbuffer (pH 7,4), die 0,85% NaCl, 2 mM CaCl2 en 2 mM MgCl^ 15 bevatte. De aldus gedialyseerde vloeistof werd geconcentreerd tot 3 ml en een 1 ml portie werd daama geleid door een kolom (middellijn 0,5, lengte 2 cm) voor affiniteitschromatografie, gevuld met dezelfde PNA-Sepharose als boven gebruikt, dat in evenwicht was gebracht met een triszoutzuurbuffer (pH 7,4), 20 die 0,005% TRITON X-100, 0,85% NaCl, 2 mM CaCl2 en 2 mM MgCl2

bevatte. Na volledig te zijn gewassen met dezelfde buffer als boven gebruikt, elueerde men de kolom met een 0,01 M triszoutzuurbuffer (pH 7,4), die 0,1 M lactose, 0,85% NaCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 en 0,005% TRITON X-100 bevatte en de aldus 25 geelueerde portie werd 48 uur gedialyseerd met een 0,01 M

triszoutzuurbuffer (pH 7,4), die 0,85% NaCl, 2 mM CaCl2 en 2 mM MgCl2 bevatte onder verkrijging van 2 ml GRA oplossing. Met de aldus verkregen GRA-oplossing bedroeg de hoeveelheid proteine en de hoeveelheid suiker respektievelijk 156 j\xg en 30 94 j\ig. Dit wordt hiema aangeduid als "GRA-M-1".

c. Ongeveer 120 g (nat gewicht) KATO-III werd met een Waring blender gehomogeniseerd in 100 ml PBS.

Na 1 uur centrifugeren bij 100.000 g werd het persstukje opgelost in 100 ml 2% Triton X-100 in 0,01 M tris-HCl buffer 35 (pH 7,6), die 0,15 M NaCl bevatte. De bovenstaande vloeistof 8202638 % 4 - 17 - na t uur centrifugeren bij 100.000 g werd geleid over een kolom van PNA-Sepharose 4B (0,8 x 15 cm), die in evenwicht was gebracht met 0,015% Triton X-100 in 0,01M tris-HCI (pH 7,6), dat 0,15 M NaCl bevatte. Na wassen-met 50 ml van de 5 buffer werd het GRA geelueerd met de buffer, die 0,1 M lactose bevatte. Het geelueerde GRA werd gedialyseerd tegen 0,85%

NaCl, geconcentreerd met Sephadex Pharmacia Co. en opgeslagen bij -20°C voor gebruik.

De op dezelfde wijze als onder a. boven be-10 paalde hoeveelheden proteine en suiker bleken respektievelijk 2,0 mg en 0,8 te bedragen. Dit wordt hiema aangeduid als "GBA-2n.

d. Op dezelfde wijze als onder c. boven wer-den de volgende GRA monsters verkregen.

15

TABEL C

PRA

GRA Materiaal -r—^^- -- proteine- suiker- monster bron hoeveelheid (g) gehalte (mg) gehalte(mg) GRA-3 BT-1 33 0,5 0,09 20 GRA-4 Borstkan- 5 0,24 0,5 ker (uit-gesneden) GRA-5 QG-56 24 0,6 0,38 GRA-6 QG-90 26 1,0 0,54 GRA-7 Raji 29 0,78 0,45 25 GRA-M-2 MMT 200 11,3 28,4 GRA-M-3 LLC 14,4 0,06 0,07 GRA-M-4 MH-134 85 0,65 0,35 GRA-M-5 X-5563 25 0,56 0,23 30 e. Op dezelfde wijze als onder c. boven, behalve dat MKN-45 (ongeveer 29 g) werd gebruikt in plaats van Kato-III en DBA-Sepharose verkregen onder 1B. boven werd gebruikt in plaats van PNA-Sepharose en eluering werd uitge-voerd met N-acetylgalactosamine, werd een GRA-preparaat met 35 een proteinegehalte van 0,03 mg en een suikergehalte van 0,01 8202638 - 18 - mg verkregen. Dit wordt hierna aangeduid als "GRA-8".

f. Vijf ml GRA-3, bereid onder d. boven werd gebracht in een DBA-Sepharosekolom en geelueerd met tris-HCl buffer (0,015% Triton X-100, 2 mM MgCl2 CaCl2, 0,85% 5 NaCl) onder verkrijging van 4 ml frakties nos. 1-12. Frakties 1-3 worden aangeduid als "GRA-3-A" en frakties 4-11 als "GRA-3-B". Daarna werd de kolom geelueerd met dezelfde buffer, die echter 0,1 M N-acetylgalactosamine bevatte onder verkrijging van frakties, aangeduid als "GKA-3-C".

10 g. SDS gel elektroforese.

Elk van de GRA-preparaten, die volgens bovenstaande werkwijzen waren verkregen, werd onderworpen aan elektroforese volgens de methode, beschreven in Fairbanks et al: Biochemistry 10, 2606, 1971.

15 De verkregen resultaten worden getoond in figuren 18 tot 22.

In figuren 18-19 betekenen de cijfers 1 tot 5 het volgende: 1: standaard, 2: GRA-M-3, 3: GRA-7, 4: GRA-1 20 en 5: GRA-5.

In figuur 20 betekenen cijfers 1 tot 4 het volgende: 1: standaard, 2: GRA-M-2, 3: GRA-6 en 4: GRA-5.

25 In figuur 21 betekenen cijfers 1 tot 3 het volgende: 1: GRA-M-4, 2: GRA-M-5 en 3: standaard.

In figuur 22 betekenen nummers 1 tot 4 het volgende: 30 1: GRA-3, 2: GRA-3-A, 3: GRA-3-B en 4: GRA- 3-C.

Figuur 18 toont de toestand van GRA, dat is onderworpen aan proteinevlekreaktie volgens de C.B.B. methode (Fairbanks et al: Biochemistry 10, biz. 2606, 1971).

35 Figuren 19-21 tonen de toestand van GRA, dat 8202638 * · - 19 - onderworpen is aan suikerkleurreaktie volgens de PAS-methode (R.M. Zacharius et al: Anal. Biochem. 30, biz. 148 (1962)).

Figuur 22 toont een schematische voorstelling van de resultaten van de vlekvorndng volgens de boven beschre- 5 ven C.B.B. methode.

Van de onder opgesomde standaardstoffen werden de volgende gebruikt van Biorad Lab. Calif. U.S.A..

200 K dalton; myosine 116 „ ; fy-galactosidase 10 92,5 π ; fosforylase

66,2 „ ; BSA

45 „ ; eivalbumine 21,5 i, ; soja-trypsine inhibitor.

Referentievoorbeeld III

15 Bereiding van TCGF.

a. Vier kg milt van Japanse apen (verkregen van Japan Plymates Co., Ltd.) werd gesneden en twee maal ge- wassen met een RPMI-1640 kultuurmedium (geproduceerd door

Flow Laboratory Co., Ltd.). De cellen werden gefiltreerd 20 met behulp van Mesh (geproduceerd door Millipore Inc., 150 mesh) en onderworpen aan een specifieke graviteitcentrifuge- methode (specifieke graviteit, 1,076) onder verkrijging van 9 2 liter 2 x 10 /ml lymfocyten. De aldus verkregen lymfocyten werden 3 maal gewassen met een RPMI-1640 kultuurmedium en 25 het lymfocytengetal werd ingesteld op 5 x 10^ per ml onder gebruikmaking van hetzelfde medium als boven, dat 10% FCS bevatte. Men liet het geheel daama 1 uur bij 37°C staan in een kooldioxydefermenteerinrichting. De lymfocyten uit de bovenstaande vloeistof werden gewonnen en het lymfocyten- g 30 getal werd ingesteld op 1 x 10 per ml door gebruik van het zelfde kultuurmedium als boven, dat 1% FCS bevatte. Vervolgens werd 1 ^ug/ml indomethacine (geproduceerd door Sigma Laboratories, Inc.) en 0,2% PHA-P (geproduceerd door Difco Co.) toegevoegd en onderwierp het geheel 48 uur bij 37°C aan 35 kultuur in een kooldioxydegasfermenteerinrichting. Men centri- 8202638 - 20 - fugeerde 10 minuten bij 3000 rpm af en won de resulterende bovenstaande vloeistof, die werd gesteriliseerd door filtratie door een Millipore filter (geproduceerd door Millipore Inc., 0,2 ^um) onder verkrijging van 2 liters TCGF.

5 b. De bron van TCGF was de bovenstaande vloeistof van aan mengkultuur onderworpen periferale bloedlymfocyten van tien gezonde donors. Niet adherente lymfocyten, bereid uit C.F. (Conray. Ficol (Japan Immunoresearch Co.)) afgescheiden lymfocyten door adsorptie aan plastik oppervlak 10 bij 37°C gedurende 1 uur werden gesuspendeerd in RPMI-1640 medium, dat 1% FCS bevatte (1,5 x 10 cellen/ml) en geinku- beerd met 0,2% PHA.-P, indomethacine (1 ,ug/ml) en menselijke 5 B-cellenlijn (BT-1) (1,5 x 10 cellen/ml) voorbehandeld met mitomycine C (50 ^ug/ml). Na 48 uur werd de bovenstaande 15 vloeistof van de kultuur gewonnen en gebruikt als TCGF-bron.

(H. Inoue et al, Scand. J. Immunol. 12, biz. 149-154 (1980)).

Referentievoorbeeld IV.

Bereiding van lymfocyten.

1. Menselijke periferaal bloedlymfocyten.

20 Vijftig ml bloed, verkregen van een gezonde volwassene of verschillende kankerpatienten door beparinisatie, werd aan centrifugaalscheiding onderworpen door het gebruik van Ficol Pack (geproduceerd door Farmacia Japan Co., Ltd.) onder verkrijging van 5 x 10^ periferaal bloedlymfocyten.

25 2. Muismiltlymfocyten.

De milt van een C3H/He muis (manmetje, 6w) werd uitgesneden en twee maal gewassen met een RPMI-1640 kultuurmedium. De milt werd daama losgemaakt met een injek-tienaald en geleid door een roestvrijstalen zeef (100 mesh) 30 ter verwijdering van grote stukken. De aldus gefiltreerde cellen werden twee maal gewassen met hetzelfde kultuurmedium als boven en onderworpen aan centrifugaalscheiding bij 1200 rpm gedurende 10 minuten onder verkrijging van 4 x 10^ milt-lymfocyten.

35 8202638 * - 21 -

Voorbeeld I

GRA.-1 (hoeveelheid proteine: 40 ^ug/ml, hoeveelheid suiker: 7,5 ^ug/ml) als verkregen in referentie-voorbeeld II onder Ila. werd tot 1000 maal het oorspronkelijke 5 volume verdund met een KPMI-1640 kultuurmedium, dat 15% FCS

bevatte ter bereiding vein een sensitiseerkultuaxrmedium.

Menselijke periferaal bloedlymfocyten (5 x g 10 /5 ml) als verkregen in referentievoorbeeld IV onder 1. werden toegevoegd aan 5 ml van het sensitiseerkultuurmedium, 10 bereid als boven, dat op een laboratoriumschaal werd gebracht en twee dagen bij 37°C werd gekweekt. Men kweekte nog 5 dagen verder op het KPMI-1640 kultuurmedium, dat 20% JTCGF en 15% FCS bevatte als verkregen in referentievoorbeeld III, onder g verkrijging van 20 ml dodende cellenoplossing, die 1 x 10 15 dodende cellen per ml bevatte. Dit wordt hierna aangeduid als "GBA-1-K-T".

Voorbeeld II

De muismiltlymfocyten als verkregen in referentievoorbeeld IV onder 2. werden ingesteld op een getal g 20 van 5 x 10 /ml door gebruik van een KPMI-1640 kultuurmedium, dat 15% FCS bevatte. Daama werd GRA.-M-1 als verkregen in referentievoorbeeld II onder lib. toegevoegd, zodat de defini-tieve hoeveelheden proteine en suiker respektievelijk 1,5 ^ug/ ml en 0,9 yUg/ml bedroegen. Een 5 ml portie van het resulte-25 rende mengsel werd twee dagen bij 37°C gekweekt op een labora toriumschaal (6 ml x 15 ml, vervaardigd door Falcon Co.). De vorming van klonen werd geobserveerd. De portie werd nog vier dagen verder gekweekt op een KPMI-1640 kultuurmedium met 15% FCS, dat 25 vol% TCGF (geproduceerd door Japan Immuno 30 Research Laboratories Co., Ltd.) bevatte onder verkrijging g van 50 ml dodende cellenoplossing, die 1 x 10 dodende cellen per ml bevatte. Dit wordt hierna aangeduid als "GRA-M-1-KT".

Voorbeeld III

Periferaal bloedlymfocyten (5 x 10 ) van een 35 gezonde donor werden bij 37°C geinkubeerd in RPMI-1640 medium, 8202638 ψ - 22 - dat 50 ng/ml (proteinegehalte) GRA-2 en 15% FCS bevatte.

Op dag 2 werd het boven beschreven menselijk TCGF toegevoegd aan het medium totdat de concentratie 20% bereikte en de inkubatie werd nog 3 dagen voortgezet teneinde dodende cellen 5 te verkrijgen. Dit wordt hiema aangeduid als "GRA-2-K-T".

Voorbeeld IV.

Dodende cellenpreparaten GRA.-8-K-T, GM-3-A-K-T en GRA-3-C-K-T werden op dezelfde wijze als in voorbeeld in bereid onder gebruikmaking van respektievelijk GRA-8, GEA-10 3-A en GSA-3-C (proteinegehalte: 50 ng/ml) en het in referen- tievoorbeeld Illb verkregen TCGF.

Voorbeeld V.

Bij C3H/He muizen (wijfjes, 8 weken) werden g intradermaal X5563 cellen (10 ) van dezelfde stam ingeplant 15 en na 7 dagen werd de tumor chirurgisch uitgesneden. Na nog 7 dagen werden X5563 cellen (10^) van dezelfde stam ingeent en de tegen inenting resistente -muizen werden immune muizen genoemd.

De miltcellen van de immune muizen en normale 20 C3H/He muizen werden geprepareerd volgens de gebruikelijke methode.

g

Elke lading miltcellen (5 x 10 /bron) werd ter verkrijging van dodende cellen 5 dagen gesensitiseerd met 40 ng/ml (proteinegehalte) GRA-M-5 in RPMI-1640 medium, 25 dat 15% FCS bevatte.

Uit normale miltcellen verkregen dodende cellenpreparaat wordt hiema aangeduid met "GRA-M-5-K-T-1" en dat, verkregen van immune miltcellen wordt hiema aangeduid met "GRA-M-5-K-T-2".

30 Voorbeeld VI.

Menselijke periferaal bloedlymfocyten (5 x 10^) werden twee dagen bij 37°C geinkubeerd RPMI-1640 medium, dat 50 ng/ml (proteinegehalte) GRA-1 bevatte. Op dag 3 werden de lymfocyten overgedragen aan RPMI-1640 medium, dat 10% 35 serum van de donor van de lymfocyten en 0 tot 100 ng/ml 8202638 - i - 23 - (proteinegehalte) GBA-1 bevatte en de inkubatie ward nog 5 dagen voortgezet ter verkrijging van dodende cellenprepara-ten als getoond in onderstaande tabel D.

5 TABE1 D

GRA concentratie (ng/ml)

Begindag Dag 3 Dodende cellen.

50 0 GRA-1-K-T-1 50 1,6 GBA-1 -K-T-2 10 50 3,2 GBA-1-K-T-3 50 6 GBA-1-K-T-4 50 12,5 GBA-1-K-T-5 50 25 GRA-1-K-T-6 50 50 GBA-1-K-T-7 15 50 100 GBA-1-K-T-8

Voorbeeld VII

a. Periferaal bloedlymfocyten (PBL) van ver-schillende kankerpatienten na operatie werden gesensitiseerd 20 met GRA-3 ter verkrijging van dodende celpreparaten. PBL

g (5 x 10 ) van de patienten werd 2 dagen geinkubeerd in BPMI-1640 medium, dat 50 ng/ml (proteinegehalte) GRA-3 bevatte en daama nog 5 dagen in RPMI-1640 medium, dat 20% TCGF en 15% FCS bevatte, ter verkrijging van dodende cellen als ge-25 toond in tabel E.

TABEL E

Periferaal bloedlymfocyten. , ----- dagen na

Ranker P-GBA D-GRA operatie dodende cellen 30 maagkanker + + 14 GBA-3-K-T-1 maagkanker ++ 35 GRA-3-K-T-2 borstkanker + - 21 GRA-3-K-T-3 borstkanker +- 7 GRA-3-K-T-4 borstkanker +- 35 GBA-3-K-T-5 35 maagkanker + - 21 GRA-3-K-T-6 8202638 - 24 -

In de bovenstaande tabel geven P-GRA en D-GRA de GRA lokaliteit aan op het kwaadaardige weefsel (uit-gesneden door operatie) van de kankerpatienten, waaruit PBL werd verzameld als bepaald op dezelfde wijze als in referen-5 tievoorbeeld I onder 2b. P-GRA en D-GRA zijn resultaten, die zijn verkregen onder gebruikmaking van respektievelijk FITC-PNA en FITC-DBA. De dagen na opera.tie geven de tijd aan, waarin PBL na de operatie werd verzameld.

g b. PBL (5 x 10 ) verzameld van borstkanker- 10 patienten 21 dagen na operatie werd 7 dagen geinkubeerd in RPMI-1640 medium, dat 50 ng/ml (proteinegehalte) GRA-3 en

10% serum van de patient bevatte, ter sensitisering van PBL

en ter verkrijging van dodende cellenprepraat. Dit wordt hierna aangeduid als "GRA-S-K-T-y".

15 Voorbeeld VIII

8 GRA-1-K-T (10 ) als verkregen in voorbeeld I werd opgelost in 10 ml fysiologische zoutoplossing teneinde een injekteerbare oplossing te bereiden.

Voorbeeld IX

20 I. GRA-M-1 als verkregen in referentievoor- beeld II onder lib. werd met fysiologische zoutoplossing zodanig verdund, dat de hoeveelheden suiker en proteine respektievelijk 1,0 yUg/ml en 1,6 yug/ml bedroegen teneinde daardoor een antikankermiddel no 1 te bereiden.

25 II. Een tumorlob van C3H/He spontaan optre- dende borstkanker werd steriel uitgesneden tot een kubus van 5 mm en getransplanteerd onder de rughuid van elk van tien C3H/He muizen van dezelfde stam als boven (7 weken oud, man-net jes). Zeven dagen na de transplantatie werden fixering en 30 multiplikatie van de tumor bevestigd. Aan 5 van de muizen werd elk subcutaan antikankermiddel no 1 als boven bereid onder I. toegediend in een dosis van 3 yul per dag bij tussen-pozen van twee dagen. De resterende 5 muizen werden als onbehandelde kontroledieren gebruikt. Tien dagen na de eerste 35 toediening werd de tumor uitgesneden door operatie en werd 8202638 - 25 - het gemiddelde gewicht gemeten. Tegelijkertijd werd patho-histologisch onderzoek uitgevoerd.

Tumorvolume:

Toegediende groep 22,3 mm3 (figuur 14) 5 Kontrole 162,7 mm3 (figuur 15).

Dit betekent dat er een 86,3% vermindering in de tumor optrad.

Pathohistologisch onderzoek:

In de kontrolegroep (figuur 16) waren vogel-10 nestlichamen van kanker gevormd, bet weefseltype was gelijk aan medullaire canaliculaire kanker en de multiplikatie van tumorcellen werd over bet gehele weefsel waargenomen. Ander-zijds veroorzaakten de kankercellen in de met het middel be-handelde groep (figuur 17) vervloeiingsnecrose op de plekken, 15 waar de kankercellen waren gevormd en er trad verkalking en firose op onder achterlating van slecbts een zeer beperkte boeveelheid kankercellen. Aldus werden de antitumoreigenschap-pen van het antikankermiddel van de uitvinding waargenomen.

Proefvoorbeeld I.

20 GRA-1-K-T (1 yUl) als verkregen in voorbeeld I werd gebracht op een mikroplaat (geproduceerd door Falcon Corp.) en men liet bet geheel 15 minuten bij kamertemperatuur staan. Daarna werd 4 yul FCS (geproduceerd door Falcon Corp.) toegevoegd en men liet het mengsel 30 minuten bij kamertempe-25 ratuur staan. Men voegde met neuraminidase behandelde rode bloedcellen van schapen (SRBC^) ingesteld op een getal van

Q

1 x 10 per milliliter en 5 yul 0,01 M fosfaatbuffer (pH 7,2), waaraan 0,85% NaCl was toegevoegd, toe en onderwierp de plaat aan een centrifugaalscheiding bij 600 rpm gedurende 5 minuten.

30 De plaat werd daarna omgekeerd en niet gereageerd hebbend

N

SRBC werd verwijderd. Een verfoplossing (Brilliant Cresyl Blue, van Merck & Co.) werd ter kleuring van de lymfocyten toegevoegd en men zag een positief rosetteeffekt. Aldus werd gevonden, dat tenminste 98% rosettevorming positief is 35 (T-cellen).

8202638 - 26 -

Proefvoorbeeld II

Specifieke kankercellen dodende werking. a. Van de in tabel A getoonde cellen werden de volgende vijf celstammen met verschillende GRA positief 5 verhoudingen gebruikt als menselijke doelwitkankercellen.

Doelwitkankercellen:

No. 1 BT-1 (Burkittlymfoom)

No. 2 Daudi (Burkittlymfoom)

No. 3 KATO-III (maagkanker) 10 No. 4 MKN-45 (maagkanker)

No. 5 MOLT (T-cel leukemie).

Op een mikroplaat (geproduceerd door Falcon

Corp.), werden 5 x 10^ per put doelwitkankercellen gelami- neerd volgens een centrifugaal procedure bij 800 rpm gedurende 3 15 5 minuten. Daama werd 4 x 10 per put GRA-1“K-T als verkregen in voorbeeld langzaam toegevoegd en 1 uur geinkubeerd.

De dodende werking werd bepaald volgens de mate van plaatjesvorming en werd als volgt beoordeeld: ++ dodende werking wordt duidelijk waargeno- 20 men.

+ dodende werking waargenomen.

± dodende werking enigszins waargenomen.

- dodende werking niet waargenomen.

In een kontrolegroep werden ongesensitiseerde 25 menselijke periferaal bloedlymfocyten gebruikt, die op dezelf- de wijze als in voorbeeld I waren verkregen, behalve dat er geen GRA was gebruikt. De resultaten zijn weergegeven in tabel F.

Uit tabel F blijkt, dat de dodende T-cellen, 30 die volgens de werkwijze van de uitvinding zijn geproduceerd een sterke GRA specifieke cytotoxische werking hebben.

35 8202638 - 27 -

TABEL F

Doelwitkanker- GRA-positief Bepaling plaat- eel______ verhouding (%) j esvorming_ GRA-1-K-T Daudi (fig. D 93,1 ++ (fig. 2) 5 §roep KATO-III (fig. 3) 57,3 + (fig. 4) BT-1 (fig. 5) 50,1 ++ (fig. 6) MKN-45 (fig. 7) 1,0 ± (fig. 8) MOLT (fig. 9) 0,6 - (fig.10)

Kontrole- BT-1 50,1 - (fig.11)

Ϊ o §roeP

b. Dezelfde doelwitkankercellen als gebruikt 6 5 onder a. boven (3,2 x 10 ) werden vermengd met 8 x 10 GRA- 1-K-T (celverhouding: 5/1) en het resulterende cellenmengsel 6 (totaalgetal: 4 x 10 ) werd gekweekt op een RFMI-1640 medium, 15 dat 15% FCS bevatte. Na een uur werd het aantal overblijvende cellen geteld en het % cytotoxiciteit werd berekend met <ie volgende vergelijking: aantal cellen na % cytotoxiciteit = (1 - (---- 1 ........... ) x 100).

20 aantal cellen voor kweek (4 x 10^)

De resultaten worden gegeven in tabel G.

TABEL G

25 _Aantal cellen

Doelwit- Voor Na % Cytotoxi- cellen kweek kweek citeit_

Daudi 4 x 106 2,9 x 106 91 r £ KATO-III 4 x 10 3,7 x 10 24 30 BT-1 - 4 x 106 3,2 x 106 65 MKN-45 4 x 106 3,9 x 106 7,2 MOLT 4 x 106 4,2 x 106 -3 c. De procedure van b. boven werd herhaald 35 met uitzondering, dat de mengverhouding van GRA-1-K-T tot 8202638 - 28 - doelwitkankercellen werd veranderd in 5/3. De resultaten wor-den gegeven in tabel H.

TABEL H

5 _Aantal cellen_

Doelwit- Voor Na % Cytotoxi- cellen kweek kweek citeit_

Daudi 4 x 106 3,6 x 105 91 KATO-III 4 x 106 3,6 x 106 24 10 BT-1 4 x 106 1,4 x 106 65 MKN-45 4 x 106 3,7 x 106 7,2 MOLT 4 x 106 4,1 x 106 -3

Bij bovenstaande proef werd waargenomen, 15 dat GBA-1-K-T een sterk bindende aktiviteit uitoefent op

Daudi, KATO-III en BT-1, maar slechts een geringe bindende werking op MKN-45 en MOLT.

Proefvoorbeeld III

C3H/He aan spontane borstkanker lijdende 20 muizen ontvingen subcutaan GRA-M-1-K-T als verkregen in voor- g beeld II in een dosis van 3 x 10 /0,3 ml/muis 3 maal per week, om de dag. Na 10 dagen werd de focus uitgenomen en on-derzocht.

Zoals in figuur 12 wordt getoond trad er 25 infiltratie van lymfocyten in kankercellen op en werd er breuk in het tumorgebied waargenomen. Ook blijkt uit figuur 13, dat werd waargenomen, dat er verkalking van het tumorgebied optrad en dat men dus kan zien, dat de dodende cellen van de uitvinding antitumorwerking hebben.

30 Vergelijkend voorbeeld I

In dit voorbeeld werden kankercellen als zodanig als specifieke antigenen bij de werkwijze van de uitvinding gebruikt in plaats van GRA.

Er werden voor kankercellen gevoelig gemaakte 35 lymfocyten verkregen op dezelfde wijze als in voorbeeld I, 8202638 * t - 29 - behalve dat in plaats van GEA gebruik werd gemaakt van BT-1,

Daudi, KATO-III of MKN-45 in een hoeveelheid van 1x10"* per laboratoriumschaal.

Bij deze lymfocyten werd de cytotoxische 5 werking onderzocht op dezelfde wijze als in proefvoorbeeld II

onder a. De resultaten worden gegeven in tabel I.

Uit tabel I ziet men, dat de boven bereide lymfocyten geen enkele cytotoxische werking hebben.

10 TABEL I

Celle voor gebruik bij sensitisering van lymfocyten.__

Doelwitcellen BT-1 Daudi KATO-III MKN-45 BT-1 15 Daudi ---- KATO-III -- MKN-45 ----

Proefvoorbeeld IV

20 Op dezelfde wijze als in proefvoorbeeld II

onder b. werd de kankercel dodende werking van GRA-8-K-T, GRA-3-A-K-T en GRA-3-C-K-T, verkregen in voorbeeld I bepaald.

De resultaten worden gegeven in tabel J.

25 TABEL J

_Cytotoxiciteit_

Doelwitcellen GRA-8-K-T GRA-3-A-K-T GKA-3-C-K-T

KATO-III 8,0 5,0 5,0 BT-1 4,3 5,0 4,0 30 MKN-45 20 5,0 20 MOLT 000

Proefvoorbeeld V

a. De cytotoxiciteit van elk van de dodende 35 cellenpreparaten, verkregen in voorbeeld VI, werd bepaald 8202638 51 - 30 - met de Cr afgifteproef (J. Immunol. 122, 2527-2533 (1979).

51

Dat wil zeggen 50 ,uCi radioaktief Cr (Japan Isotope Asso- ' 7 ciation) werd toegevoegd aan KATO-III (2x10) en de cellen werden 1 uur bij 37°C geinkubeerd in RPMI-1640 medium en voor 51 5 het verkrijgen van met Cr-gemerkte doelwitcellen voldoende gewassen door centrifugering. Dodende cellen (effektorcellen) 6 5 (2 x 10°) werden toegevoegd aan de doelwitcellen (1 x 10J) (aldus E/T = 20/1) en het mengsel werd 4 uur bij 37°C geinkubeerd in RPMI-1640 medium. De bovenstaande vloeistof werd 10 afgecentrifugeerd en haar radioaktiviteit werd bepaald door vloeistofskintillatietelling.

51

De specifieke Cr afgifte (%) die overeen-komt met de cytolitische werking van effektorcellen werd berekend volgens de volgende vergelijking.

15 Specifieke ~^Cr afgifte (%) (afgifte bij proef) - (spontane afgifte) χ (maximum afgifte) - (spontane afgifte) (De maximum afgifte betekent de radioaktiviteit wanneer alle cellen gelyceerd worden).

20 De verkregen resultaten worden gegeven in tabel K.

TABEL K

51

Dodende cellen Specifieke Cr afgifte (%) 25 GRA-1-K-T-1 13 GRA-1-K-T-2 25 GRA-1-K-T-3 22 GRA-1-K-T-4 20 GRA-1-K-T-5 22 30 GRA-1-K-T-6 25 GRA-1-K-T-7 27 GRA-1-K-T-8 32

Uit de resultaten van tabel K blijkt, dat 35 TCGF en FCS geen verband houden met de opwekking van dodende 8202638 - 31 - * *> ψ cellen.

b. De cytotoxiciteit van, GRA-2-K-T, verkre- .. 51 gen bij voorbeeld III werd bepaald volgens Cr afgifte- proef op dezelfde wijze als boven onder a. Een specifieke ^Cr . 51 5 afgifte van 14,3% werd waargenomen aan met Cr gemerkt KATO- III als doelwitcellen (E/T = 20/1).

Proefvoorbeeld VI

a. Onder gebruikmaking van KATO-III (E/T = 20/1) als doelwitcellen werd de cytotoxiciteit van in voor- 10 beeld VII onder a. verkregen dodende cellen bepaald op de zelfde wijze als in proefvoorbeeld II onder b.

De resultaten worden gegeven in onderstaande tabel L.

15 TABEL L

Dodende cellen % Cytotoxiciteit GRA-3-K-T-1 38,0 GRA-3-K-T-2 18,2 GRA-3-K-T-3 20,9 20 GRA-3-K-T-4 23,2 GRA-3-K-T-5 24,5 GRA-3-K-T-6 20,2

b. De cytotoxiciteit van in voorbeeld VII

51

25 onder b. verkregen GRA-3-K-T-7 werd bepaald met Cr-KATO-III

(E/T = 20/1) als doelwitcellen op dezelfde wijze als in . 51 proefvoorbeeld V. De specifieke Cr afgifte van de dodende cellen bleek 25,5% te zijn.

Proefvoorbeeld VII

30 De cytotoxiciteit van de in voorbeeld V

51 verkregen dodende cellen werd bepaald met de Cr afgifte- proef op dezelfde wijze als in proefvoorbeeld V. De gebraikte 51 doelwitcellen waren met Cr-gemerkte X5563 cellen. Als kon- trole werden lymfocyten gebruikt, verkregen op dezelfde wijze 35 als in voorbeeld V, behalve dat sensitisering van miltcellen 8202638 - 32 - werd uitgevoerd met 1 x 10^/put met mitocyne C-behandelde g X5563 cellen (5 x 10 /ml X5563 cellen werden 60 minuten be-handeld met 50 ^ug/ml mitomycine C) in plaats van GRA-M-5 te gebruiken.

5 De verkregen resultaten zijn weergegeven in onderstaande tabel M.

TABEL M 51

Specrfieke Gr afgifte 10 E/T verhouding

Dodende cellen 40:1 20:1 10:1 GRA-M-5-K-T-1 12,7 6,3 5,7 GRA-M-5-K-T-2 18,4 20,6 13,7

Kontrole 0,0 0,0 0,0 15

Proefvoorbeeld VIII (H-2 proef) GRA-M-1, GRA-M-3 en GRA-M-4, verkregen in bovenstaand referentievoorbeeld II, werden in serie verdund met PBS (0,85% NaCl) teneinde monsters te bereiden.

20 Anti-H-2 serum van National Institute of

Genetic Research en bovenstaand monster werden vermengd en 2 uur bij 4°C geinkubeerd waama men doelwitcellen toevoegde overeenkomend met het gebruikte anti-H-2-serum. Miltcellen of lymfekliercellen, die op de gebruikelijke wijze van 25 B10 (H-2 ) en B10.Br (H-2^) muizen waren verkregen, werden als doelwitcellen gebruikt. Nadat de cellen met PBS waren gewassen werd komplement (konijn) aan de cellen toegevoegd en werden de cellen 1 uur bij 37°C geinkubeerd en gevlekt met 0,2% tryptaan blauw-PBS ter bepaling van % cytotoxiciteit.

30 Het anti-H-2-serum werd in een zodanige maximum verdunning gebruikt, dat het tenminste 95% cytotoxiciteit vertoonde in afwezigheid van GRA.

Het blokkerend effekt door GRA werd bepaald voor in onderstaande tabel N getoonde systemen.

35 8202638

F

% I

- 33 -

TABEL N

GRA Anti-H~2-serum, concentratie Doelwitcellen GRA-M-1 D-23 (anti-H-2Kk), X80 B10BR (H-2k) D-32 (anti-H-2Dk), X300 miltcellen 5 GRA-M-3 D-33 (anti-H-2Kb), X600 B10 (H-2b) T. of D-" (anti-H-2D ), X80 miltcellen GRA-M-4 D-23 , X80 B10.BR (h-2k) of D-32 , X300 lymfekliercellen 10 De verkregen resultaten worden gegeven in tabel 0.

TABEL 0 % Cytotoxiciteit 15 Anti-H-2 _Verdunning van monster _ GRA serum X2 X4 X8 X16 X32 X64 X128 X256 X512 0 * I - - 13 14 12 13 14 13 14 13 14 13 D-23 - 97 99 96 97 97 96 97 96 96 14 D-32 - 95 95 95 95 94 95 95 96 95 13 20 Π 19 15 14 12 15 12 11 12 13 14 D-33 - 98 98 99 99 98 99 99 99 99 15 D“2 - 95 96 95 95 97 95 97 95 95 17 III D-23 100 100 100 100 --- - - 100 10 D32 99 99 99 99 -- - - - 99 10 25 Opmerkingen: GRA I : GRA-M-1 GRA II : GRA-M-3 GRA III: GRA-M-4 * betekent % cytotoxiciteit wannear alleen komplement werd gebruikt.

30

Uit de resultaten van bovenstaande tabel 0 kan men zien, dat GRA-M-1, GRA-M-3 en GRA-M-4 H-2 missen.

Proefvoorbeeld IX

35 C57BL/6 muizen ontvingen subcutane transplan- 8202638 - 34 - tatie van LLC (2 x 10 ) van dezelfde stam en na 6 dagen werd subcutaan 1 mg (proteine) GRA-M-3, verkregen in referentie-voorbeeld II onder d. toegediend. Daama werd de toediening gedurende 4 dagen 1 maal daags herhaald bij dezelfde dosis.

5 De dag na de laatste toediening werden tumorcellen uitge- sneden en gewogen. Ter kontrole gebruikte men dieren, waar-aan fysiologisehe zoutoplossing was toegediend. Elke proef-groep omvatte 5 dieren.

Als resultaat vond men een gemiddeld tumor-10 gewicht van de kontrolegroep van ongeveer 500 mg. In de groep, waaraan GRA-M-3 was toegediend, vertoonden drie dieren ver-dwijning van tumor en twee hadden een gemiddeld tumorgewicht van 100 mg.

Proefvoorbeeld X

15 C57BL/6 muizen werden gedurende drie dagen 1 maal daags subcutaan geimmuniseerd met 1 ng (proteine) GRA-M-3, verkregen in referentievoorbeeld II onder d. en op dag 5 werden miltcellen van het dier gewonnen teneinde effektorcellen te verkrijgen. Er werd een mengsel bereid van 20 de effektorcellen en Lewis longcarcinoom (LLC) als doelwit- cellen in een verhouding van E/T = 50:1 en een portie 5 (1 x 10 ) daarvan werd getransplanteerd bij muizen van dezelfde stam en men voerde de proef van Winn uit (J. Immunol.

86, biz. 228-239 (1961)).

25 De verkregen resultaten zijn weergegeven in onderstaande tabel P.

TABEL P

Effektor- Tumorgroei (%) Dag 20 mor- taliteit/ 30 cel_ Dag 15 Dag 17 Dag 18 Dag 19 Dag 20 groep A 5,7 5,5 5,7 3,1 1,4 0/10 B 21,4 39,5 37,1 55,4 76,8 4/10 C 39,3 65,1 61,7 98,1 96,4 4/10

Opmerkingen: 35 Groep A zijn miltcellen van GRA-M-3 immune 8202638

• I

- 35 - muizen.

Groep B zijn miltcellen van normale muizen.

Groep C zijn miltcellen van muizen 10 dagen g na transplantatie van LLC (1 x 10 ).

5 De Tumorgroei werd berekend volgens de vol- gende vergelijking:

T - T

Tumorgroei (%) = —--— x 100

T

N

waarin T. de dikte voorstelt van de voetzool aan de kant waar A

10 de tumor getransplanteerd werd en T^. de dikte voorstelt van de normale voetzool.

Proefvoorbeeld XI

C3H/He muizen werden geimmuniseerd met 4,5 ^ug (proteine) van GRA-M-4, verkregen in referentievoorbeeld 15 II onder d. en 0,1 ml kompleet toevoegsel van Freund bij het sacrococcygeale gedeelte. Na twee weken werden op de gebrui-kelijke wijze lymfekleircellen gewonnen en gebruikt als responsiecellen voor het bepalen van proliferatieve respons bij GRA-M-4.

20 Voor dit doel werden responsiecellen (5 x 10^) 5 dagen in aanwezigheid van GRA-M-4 geinkubeerd in RPMI-1640 medium, dat 15% FCS bevatte. Tijdens de laatste 18 uur van 3 3 de inkubatieperiode werd 1^uCi H-thymidine ( H-TdR) aan het medium toegevoegd en de opneming daarvan in de cellen geteld.

25 De verkregen resultaten worden gegeven in onderstaande tabel Q.

TABEL Q

Concentratie 3H-TdR. opneming GRA-M-4 (ng/ml) (gemiddeld cpm + S.E.) S.I.

30 Kontrole 0 5.302+1.761 - - 0,5 7.903 ± 1.290 1,5 1 10.076 ± 936 1,9

Experiment 5 10.686 ± 429 2,0 20 10.615 ± 1.270 2,0 35 40 8.565 + 1.419 1,6 8202638 « - 36 -

Opmerking: "S.I." betekent stimulatieindex in termen van experiment/kontrole.

Proefvoorbeeld XII

Men bepaalde hypersensitiviteitrespons / 5 van het vertraagde type (DTH) van normale C3H/He muizen, X5563 immune muizen en MH134 immune muizen, verkregen op dezelfde wijze als in voorbeeld V en GRA-M-4 immune muizen en GRA-M-5 immune muizen, verkregen op dezelfde wijze als in proefvoorbeeld XI door voetzoolreaktie (FPR). Dat wil 10 zeggen met GRA of MMC behandelde tumorcellen werden geent op de voetzoolhuid van de achterpoot van het dier en de zwel- ling van de voetzool werd 24 uur na de enting bepaald. De DTH respons werd berekend door de zwelling voor de enting -2 af te trekken van die na enting (10 mm).

15 De verkregen resultaten zijn weergegeven in tabellen R-V.

TABEL R

-2 _Gemiddelde voetzoolzwelling (10 mm)

Enting Normale muizen ME134 Immune muizen 20 1 2,8 13,6 2 12,4 32,0 3 3,6 3,6 4 3,2 22,0 5 6,8 27,0 25 Opmerkingen: g

Groep 1: syngeneisch normale milt 1 x 10 / 20 ,ul medium (Hanks oplossing).

/ g

Groep 2: MH134 cel 1 x 10 /20 ^ul medium. Groep 3: medium 20 ^ul.

30 Groep 4: GRA-M-4, 0,8 ^ug (proteine)/20 ^ul medium.

Groep 5: „ 0,4 yUg „ !! · 35 8202638 - 37 -

TABEL S

_2 _Gemiddelde voetzoolzwelling (10 mm)_

Eating Normale muizen X5563 immune muizen MH134 immune muizen I 5,4 4,3 1,1 5 2 0,9 - 24,3 3 2,0 16,9

Opmerkingen:

Groep 1: medium (Hanks oplossing) 20 yUl.

Groep 2: GRA-M-4, 4 yUg (proteine)20 yul 10 medium.

Groep 3: GRA-M-5, „ „ „

II

TABEL T

15 -2

Gemiddelde voetzoolzwelling (10 mm)

Enting Normale muizen GRA-M-4, immune muizen 1 1,7 -0,3 2 5,1 24,6

Opmerkingen: 20

Groep 1: medium (Hanks oplossing) 20 yul.

Groep 2: GRA-M-4, 4 yUg (proteine)/20 yul medium.

TABEL U

25 . .-2

Gemiddelde voetzoolzwelling (10 mm)

Enting Normale muizen GRA-M-4, immune muizen 1 -1,8 0,6 2 6,3 20,0 3 6,8 6,3 30

Opmerkingen:

Groep 1: medium (Hanks oplossing) 20 yul.

Groep 2: GRA-M-4, 4 yUg (proteine)/20 yul medium.

Groep 3: 4 ,ug (proteine/20 ,ul medium fraktie, 35 1 ' 8202638 ο - 38 - die door PNA-kolom was geleid ten tijde van GRA-M-4 (hierna "C.P.").

TABEL V

-2 5 Gemiddelde voetzoolzwelling (10 mm)_

Enting Normale muizen GRA-M-4, immune muizen 1 2,4 -1,0 2 2,6 17,7 3 2,4 1,8 10 4 5,5 18,9

Opmerkingen:

Groep 1: medium (Hanks oplossing) 20 yul. Groep 2: GRA-M-4, 3,8 yUg (proteine)/20 yul medium.

15 Groep 3: 3,8 yUg (proteine)/20 yul medium "C.P." boven.

Groep 4: 3,8 yUg (proteine) GRA-M-4 en 3,8 yUg (proteine)/20 yul medium "C.P.".

20 Referentieproef♦ X5563 Immune muizen werden op dezelfde ma-nier verkregen als in voorbeeld V. Miltcellen van deze immune muizen werden als effektorcellen gebruikt en de effektor-cellen (10^) en doelwitcellen (X5563, 10 ) werden samen ge-25 transplanteerd op muizen van dezelfde stam. De proef van

Winn werd op dezelfde wijze uitgevoerd als in proefvoorbeeld X.

De verkregen resultaten worden getoond in figuur 23, waarin de X-as de dagen aangeeft en de Y-as de 30 gemiddelde tumorafmeting (cm2) ± S.E. en de verschillende tekens het volgende betekenen: # - -> : Groep, waarbij geen effektorcellen werden toegevoegd.

0-0 : Groep, waarbij niet behandelde 35 effektorcellen werden toegevoegd.

8202638 ο - 39 - Δ-Δ: Groep, waarin effektorcellen, behandeld met konijnkomplement werden toegevoegd.

x-x: Groep, waarbij effektorcellen, behandeld met anti-Thy 1 (New England Nuclear Co., U.S.A.) en 5 konijnkomplement werden toegevoegd.

0-□: Groep, waarbij effektorcellen, behandeld met anti-Lyt (New England Nuclear Co., II.S.A.) en konijnkomplement werden toegevoegd.

-1: Groep, waarbij effektorcellen, 10 behandeld met anti-Lyt 2 (New England Nuclear Co., U.S.A.) en konijnkomplement werden toegevoegd.

Uit de in figuur 23 getoonde resultaten kan men zien, dat Lyt 1 type T-cellen een belangrijke rol spelen bij het mechanisme van in vivo effektor bij tumorimmuniteit. 15 Voorts is het bekend, dat DTH respons wordt bemiddeld door Lyt-1 T-cellen, (J. Exp. Med. 143, biz. 1534-39 (1976)).

20 8202638

Claims (35)

1. Voor kankercellen cytotoxische lymfocyt, die specifiek is voor een van kankercellen afkomstig, glyco-verwant antigeen.

2. Lymfocyt volgens conclusie 1, 5 met het kenmerk, dat hij is verkregen door sensitisering van de lymfocyt met het van kankercellen afkomstige glycoverwante antigeen.

3. Lymfocyt volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat het glycoverwante antigeen een kankercel-10 membraankomponent is, die kombineert met lectine, dat speci fiek kombineert met een eindstandige galactose of N-acetyl-galactosamine.

4. Lymfocyt volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat het glycoverwante antigeen een kanker-15 celmembraankomponent is, dat kombineert met lectine, dat spe cifiek kombineert met een eindstandige galactose.

5. Lymfocyt volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat het glycoverwante antigeen een kanker-celmembraankomponent is, die kombineert met lectine, dat spe-20 cifiek kombineert met eindstandig N-acetylgalactosamine.

6. Werkwijze voor het bereiden van voor kankercellen cytotoxische lymfocyten, met het kenmerk, dat men lymfocyten sensitiseert met een van kankercellen afkomstig, glycoverwant antigeen.

7. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat het glycoverwante antigeen een kankercel-membraankomponent is, die kombineert met lectine, dat specifiek kombineert met een eindstandige galactose of N-acetylgalactosamine.

8. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat het glycoverwante antigeen een kanker-celmembraankomponent is, die kombineert met lectine, dat spe- t » 8202638 - 41 - cifiek kombineert met een eindstandige galactose.

9. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat het glycoverwante antigeen een kanker-celmembraankomponent is, die kombineert met lectine, dat spe-5 cifiek kombineer met een eindstandig N-acetylgalactosamine.

10. Antikankermiddel, met het kenmerk, dat het als aktief bestanddeel voor karikercellen cytotoxische lymfocyten bevat, die specifiek zijn voor een van kankercellen afkomstig, glycoverwant antigeen.

11. Antikankermiddel volgens conclusie 10, met het kenmerk, dat de voor kankercellen cytotoxische lymfocyten zijn bereid door sensitisering van de lymfocyten met een van kankercellen afkomstig glycoverwant antigeen.

12. Antikankermiddel volgens conclusie 10 of 15 11, met het kenmerk, dat het glycoverwante antigeen een kanker- celmembraankomponent is, die kombineert met lectine, dat spe-cifiek kombineert met een eindstandige galactose of N-acetylgalactosamine.

13. Antikankermiddel volgens conclusie 12, 20 met het kenmerk, dat het glycoverwante antigeen een kanker- celmembraankomponent is, die kombineert met lectine, dat specifiek kombineert met een eindstandige galactose.

14. Antikankermiddel volgens conclusie 12, met het kenmerk, dat het glycoverwante antigeen een kanker- 25 celmembraankomponent is, die kombineert met lectine, dat specifiek kombineert met een eindstandig N-acetylgalactosamine.

15. Antikankermiddel, met het kenmerk, dat het een van kankercellen afkomstig glycoverwant antigeen als aktief bestanddeel bevat.

16. Antikankermiddel volgens conclusie 15, met het kenmerk, dat het glycoverwante antigeen een kanker-celmembraankomponent is, die kombineert met lectine, dat specifiek kombineert met een eindstandige galactose of N-acetylgalactosamine.

17. Antikankermiddel volgens conclusie 16, 8202638 t τ - 42 - met het kenmerk, dat het glycoverwante antigeen een kanker-celmembraankomponent is, die kombineert met lectine, dat spe-cifiek kombineert met een eindstandige galactose.

18. Antikankermiddel volgens conclusie 16, 5 met het kenmerk, dat het glycoverwante antigeen een kariker- celmembraankomponent is, die kombineert met lectine, dat specifiek kombineert met een eindstandig N-acetylgalactosamine.

19. Werkwijze voor het behandelen van kanker, met het kenmerk, dat men aan een kankerpatient voor kanker- 10 cellen cytotoxische lymfocyten, die specifiek voor een van kankercellen afkomstig glycoverwant antigeen of een van kan-kercellen afkomstig glycoverwant antigeen toedient.

20. Glycoverwant antigeen, met het kenmerk, dat het is gewonnen uit menselijke kankercelmembraankomponent 15 en kan kombineren met een lectine, dat kan kombineren met een eindstandige galactose of een eindstandig N-acetylgalactosamine.

21. Glycoverwant antigeen volgens conclusie 20, met het kenmerk, dat het glycoverwante antigeen is bereid 20 door een glycoverwant antigeen uit menselijke kankercel membraankomponent te winnen met een lectine, dat specifiek kan kombineren met een eindstandige galactose of een eindstandig N-acetylgalactosamine.

22. Glycoverwant antigeen volgens conclusie 25 21, met het kenmerk, dat het lectine een lectine is, dat specifiek kombineert met een eindstandige galactose.

23. Glycoverwant antigeen volgens conclusie 22, met het kenmerk, dat het lectine pindalectine, Ricinus communis lectine of sojalectine is.

24. Glycoverwant antigeen volgens conclusie 23, met het kenmerk, dat het lectine pindalectine is.

25. Glycoverwant antigeen volgens conclusie 21, met het kenmerk, dat het lectine een lectine is, dat specifiek kombineert met een eindstandig N-acetylgalactosamine.

26. Glycoverwant antigeen volgens conclusie 8202638 c' - 43 - ’ ♦· 25, met het kenmerk, dat het lectine is geselekteerd uit de groep, bestaande uit Dolichos boon agglutinine, sinaasappel-lectine, Helix pomatia lectine, limaboonlectine, sojalectine en Bauhinia boon lectine,

27. Glycoverwant antigeen volgens conclusie 26, met het kenmerk, dat het lectine Dolichos boon agglutinine is.

28. Glycoverwant antigeen, met het kenmerk, dat het is bereid door een glycoverwant antigeen te winnen 10 uit menselijke kankercelmembraankomponent, eerst met een eer- ste lectine, dat specifiek kombineert met een eindstandige galactose en daama met een tweede lectine, dat specifiek kombineert met een eindstandig N-acetylgalactosamine.

29. Glycoverwant antigeen volgens conclusie 15 28, met het kenmerk, dat het eerste lectine pindalectine en het tweede lectine Dolichos boon agglutinine is.

30. Werkwijze voor het bereiden van een glycoverwant antigeen met het kenmerk, dat men een glycoverwant antigeen wint, dat kan kombineren met een lectine, 20 dat specifiek kan kombineren met een eindstandige galactose of een eindstandig N-acetylgalactosamine.

31. Werkwijze volgens conclusie 30, met het kenmerk, dat men een glycoverwant antigeen uit een menselijke kankercelmembraankomponent wint met een lectine, 25 dat specifiek kombineert met een eindstandige galactose of een eindstandig N-acetylgalactosamine.

32. Werkwijze volgens conclusie 31, met het kenmerk, dat het lectine specifiek kombineert met een eindstandige galactose.

33. Werkwijze volgens conclusie 31, met het kenmerk, dat het lectine specifiek kombineert met een eindstandig N-acetylgalactosamine.

34. Werkwijze voor het bereiden van een glycoverwant antigeen, met het kenmerk, dat men een glyco-35 verwant antigeen wint uit menselijke kankercelmembraankompo- 8202638 /-ί* »> - 44 - r nent, eerst met een eerste lectine, dat specifiek kombineert met een eindstandige galactose en daarna met een tweede lec-tine, dat specifiek kombineert met een eindstandig N-acetyl-galactosamine.

35. Werkwijze volgens conclusie 32, met het kenmerk, dat het eerste lectine pindalectine en het tweede lectine Dolichos boon agglutinine is. 10 8202638 Inlas in de beschrijving behorende bij de octrooiaanvrage no. 8202638 Ned. voorgesteld door aanvrager dd 30 September 1982. Invoegen tussen regels 9 en 10 van bladzijde 9 van de op 30 juni 1982 ingediende beschrijving: "Op 27 September 1982 werd een monster van de GRA-1-KT cellenlijn gedeponeerd bij ATCC 12301 Parklawn Drive Rockville, Maryland USA en ontving ATCC No. CRL 8175." 8202638