NL8100177A

NL8100177A - 3'-amino- of -azidoderivaten van e-5-(2-halogeenvinyl)-2'-deoxyuridine.

Info

Publication number: NL8100177A
Application number: NL8100177A
Authority: NL
Original assignee: Stichting Rega V Z W
Priority date: 1981-01-15
Filing date: 1981-01-15
Publication date: 1982-08-02

Description

* '4 i

Br/lh/11 Rega.

3'-amino- of-azidoderivaten van E-5-(2-halogeenvinyl)-2'-deoxyuri öine

De uitvinding heeft betrekking op een groep nieuwe deoxyuridine-verbindingen, alsmede op de chemische synthese daarvan en op het gebruik van deze stoffen in farmaceutische preparaten.

5 De deoxyuridine-verbindingen volgens de uitvinding kunnen worden weergegeven door formule 1 van het formuleblad, waarin Hal een halogeenatoom, X een amino- of azidogroep en de kartellijn een erythro- of threo-configuratie weergeeft.

10 Bij onderzoek is gebleken, dat de genoemde deoxy- uridines een antivirale werking hebben. Vooral de verbinding van formule 1 met Hal = Br en X = in erythro-configuratie onderscheidt zich door een krachtige antivirale werking, die zeer specifiek is ten opzichte van herpes simplex-virus.

15 Daarnaast hebben deze verbindingen een opmerkelijk lage giftigheid en daardoor een hoge antivirale index tegen het genoemde type virus. De verbindingen zijn dan ook bruikbaar voor het bereiden van farmaceutische preparaten en voor het behandelen van ziekten die door herpes simplex bij mens 20 en dier worden veroorzaakt.

De stand der techniek omvat reeds vele deoxyuridine-verb indingen met antivirale werking. Een algemeen overzicht hiervan is gegeven door E. De Clercq c.s. in J. Carbohydrates, Nucleosides, Nucleotides, 5 (3} , 187r224 (1978). waarnaar 25 verwezen wordt voor verdere bijzonderheden. Hierbij moet echter worden opgemerkt, dat de antivirale werking van de meeste van deze verbindingen niet bijzonder specifiek is omdat zij een evengoede activiteit vertonen tegen uiteenlopende DNA-virussen zoals vaccinia en herpes simplex. Bovendien 30 is de giftigheid van de meeste van deze verbindingen en in het bijzonder van de gewoonlijk toegepaste standaardverbinding 5-jood-2'-deoxyuridine niet te verwaarlozen. Het is daarom een gunstige omstandigheid dat de verbindingen volgens de uitvinding voor een deel wel een dergelijke specifieke 810 0 17 7 .* 0 -2-

JU

L·-:· *" antivirale werking tegen één type virus (herpes simplex) bezitten en dat de giftigheid van deze verbindingen uiterst laag is, zoals hierboven vermeld. Vooral de verbinding van formule 1 met Hal = Br en X = NH2 in erythro-stand, oftewel 5 E-5-(2-broomvinyl)-31-amino-21,3'-dideoxyuridine steekt door zijn hoge antivirale index ver boven de standaardverbinding 5-jood-2'-deoxyuridine uit.

Opgeme'fckt wordt, dat een specifieke antivirale werking tegen herpes simplex-virus alsmede een geringe giftig-10 heid in een cellenkweek onlangs ook vermeld zijn voor E-5- (2-broomvinyl)-21-deoxyuridine en E-5-(2-joodvinyl)-2'-deoxy-uridine. Vergelijk E. De Clercq c.s. in Proceedings National Academy of Science USA, 76, no. 6, 2947-2951 (1979). Vergeleken daarmee blijkt de verbinding E-5-(2-broomvinyl)-31-15 amino-2',3'-dideoxyuridine ten minste even specifiek en even weinig giftig te zijn, terwijl bovendien sprake lijkt te zijn van een zekere depotwerking. De verbindingen, volgens de uitvinding vormen dan ook een welkome uitbreiding van het arsenaal van de medicus ter bestrijding van ziekten die.door 20 herpes simplex worden.veroorzaakt.

De uitvinding verschaft dan ook deoxyuridine-ver-bindingen, zoals weergegeven door formule 1, waarin Hal een halogeenatoom, X een amino- of azidogroep, en de kartelüjn een erythro- of threo-configuratie voorstelt. In het bijzon— 25 der verschaft zij de verbinding E-5-(2-broomvinyl)-3'-amino-2',3'-dideoxyuridine. Verder wordt volgens de uitvinding een farmaceutisch, preparaat met antivirale werking verschaft, dat gekenmerkt is doordat het een verbinding van formule 1 als actief bestanddeel bevat. Daarnaast verschaft de uitvin-30 ding ook een werkwijze voor het bereiden, van de 'deoxyuridine-verbindingen van formule 1 en een werkwijze 'voor het bereiden van het genoemde farmaceutische preparaat.

De verbindingen volgens de uitvinding kunnen in principe op diverse wijzen worden bereid.

35 Een bij voorkeur toegepaste chemische synthese is weergegeven op het formuleblad door het schema met de formules 2-10. Deze synthese omvat twee varianten A en B, die beide het invoeren van een amino- of azidogroep op de 31 - 8100177 .. 1 ^ -3- plaats van een E-5-(2-halogeenvinyl)-2 Γ-deoxyuridine beogen.

Bij Variant A'wordt, nadat de 5'-hydroxylgroep is beschermd, eerst op de plaats 3' een mesylgroep (itethylsulfonyl-groep) of een tosylgroep ingevoerd, diedaarna door een azidogroep 5 wordt vervangen, gevolgd door deprotectie van de 5*—hydroxylgroep en desgewenst omzetting van de azidogroep tot een aminogroep. Bij het vervangen van de mesyl- of tosylgroep door de azidogroep kunnen twee isomeren worden afgezonderd, namelijk het ejythro-isaneer en het threo-isomeer, afhankelijk van de 10 stand van de azidogroep op de plaats 3 ’, welke isomeren daarna afzonderlijk aan de volgende bewerkingen kunnen worden onderworpen.

Bij variant B Wordt het uitgangsmateriaal eerst, nadat de 5’-hydroxylgroep is beschermden een 3'-iresyl- of tosyl-15 groep is ingevoerd, in een inwendige 2,3'-anhydré verbinding omgezet, waarna deze 2,3r-anhydroverbinding wordt behandeld met een azide ter invoering van een 3’-azidogroep, gevolgd door deprotectie van de 5’-hydroxylgroep en desgewenst omzetting van de azidogroep tot een aminogroep. Deze variant 20 heeft een trap meer, maar levert het eindprodukt uitsluitend in erythro-vorm.

Thans worden de beide varianten van de synthese volgens het formuleblad meer in bijzonderheden beschreven.

In de eerste trap van beide varianten wordt het 25 uitgangsmateriaal, van formule. 2 eerst behandeld met een middel ter bescherming van de 5'-hydroxylgroep. Dit kan bijvoorbeeld geschieden met tritylchloride in pyridine bij een 'temperatuur van kamertemperatuur tot aan het kookpunt van het oplosmiddel. Onmiddellijk daarna wordt de 3*-hydroxyl-30 groep omgezet tot een mssyloxy- of tosyloxygroep door behandeling net mesyl- of tosylchioridein hetzelfde of esnander oplosmiddel. Aangezien deze reaktie exotherm is, kan zij het beste bij kamertemperatuur of lager worden uitgevoerd.

In de tweede trap van variant A wordt het verkregen 35 produkt van formule 3 direkt behandeld met een azide ter vervanging van de S’-mesyloiny- of tosyloxygroep door een azidogroep. Dit kan bijvoorbeeld geschieden met natriumazide in dimethyl-formamide, bij een temperatuur tussen kamertemperatuur en 8100177 ψ 9 * Λ ---- -4- het kookpunt van het oplosmiddel. De tijdsduur dient betrekkelijk kort te zi-jn (1-30 minuten)#ten einde ongewenste omleggingen te voorkomen. Niettemin ontstaat hier altijd een mengsel van twee isomeren# het threo-isomeer,van formule 5 en het 5 erythro-isoraeer van formule 6# die met gebruikelijke middelen zoals kolomchromatografie van elkaar gescheiden kunnen worden.

In de derde trap van variant A wordt de hydroxyl-beschermende groep op de 51-plaats.van de verbinding van 10 formule 5 of 6 verwijderd# hetgeen bijvoorbeeld met behulp van azijnzuur of een ander zuur in water kan geschieden.

• Verkregen wordt.dan een azidoverbinding volgens formule 8 of • 9, die onder de definitie van formule 1 valt.

Wenst men een verbinding met een 3’-aminogroep 15 te bereiden, dan.wordt het produkt.van formule 8 of 9 in een vierde trap behandeld met een middel, ter omzetting van de azidogroep tot , een aminogroep. Dit.kan bijvoorbeeld ge-, schieden met tr±Eeny]fosflne in droog pyridine# gevolgd door behandeling met ammoniak. De reaktle verloopt reeds goed 20 bij kamertemperatuur en het verkregen produkt van formule 7 i of .10 behoeft s-lechts weinig gezuiverd te worden.

Bij de variant.B wordt het in de eerste trap verkregen produkt van formule 3 in een tweede trap omgezet tot een inwendige : 2#3'-anhydroverbinding van formule 4. Dit ; 25 kan bijvoorbeeld geschieden met. een base# zoals natriumhydroxide# in waterige ethanol. Een overmaat-base dient vermeden te worden‘in verband met het gevaar van omlegging tot een 2'-deoxyxylofuranosylderivaat.. De reaktie kan bij elke temperatuur tussen kamertemperatuur en het kookpunt 30 van het oplosmiddel, plaatsvinden.

In de derde trap van variant B wordt de verkregen 2,3'-anhydroverbinding van formule 4 rechtstreeks in een verbinding met een 3'-azidogroep omgezet, hetgeen geschieden kan met een azide·, bijvoorbeeld lithium- of natriumazide 35 in dimethylformamide. De temperatuur kan tussen kamertemperatuur en het kookpunt van het oplosmiddel liggen. Het verkregen produkt van formule 6 wordt uitsluitend in erythro-vorm verkregen.

8100177 -5-

Hierna kan in een vijfde trap de hydroxy1-beschermende groep op de plaats 5' worden verwijderd en in een zesde trap desgewenst de 3'-azidogroep worden omgezet tot een aminogroep, op dezelfde wijze als besproken bij variant 51- A.

Volgens variant B kunnen de verbindingen van formule 9 en 10 in redelijk goede opbrengst worden verkregen. Wil men deze verbindingen met variant A bereiden, dan is de opbrengst uiteraard minder, omdat daar in de tweede trap 10 altijd een mengsel van het erythro- en het threo-isomeer wordt verkregen.

Bij gebruikmaking van de beschreven synthese ligt de stand van de uracilkern ten opzichte van de suikerrest ^-configuratie) en de stand van de groepen rondom de vinyl -15 groep (E-configuratie) reeds vanaf het begin vast, zodat in dit opzicht geen scheiding tussen isomeren behoeft plaats te vinden.

Het uitgangsmateriaal van formule 2 is reeds eerder beschreven (vergelijk E. De Clercq et al, Proc. Nat. Acad.

20 Sc. USA, 76. 2947-2951, (1979)) en kan op diverse wijzen worden gesynthetiseerd, bijvoorbeeld door koppeling van de-oxyribosederivaat aan E-5-(2-halogeenvinyl)-uracil, of door invoering van een E-5-(2-halogeen.vinyl) groep in 2*-de-oxyuridine;· 25 De bij voorkeur gebruikte chemische synthese als mede de fysische konstanten van de eindprodukten worden nader toegelicht aan. de hand van de volgende voorbeelden, die evenwel niet als een beperking van de uitvinding kunnen 'worden opgevat.

30 Voorbeeld I

a) E-5-(2-broomvinyl)-21-deoxy-31-0-mesyl-5'-O-trityluridine. (formule 3).

7 gram (21 mmol) E-5-(2-broomvinyl)-2'-deoxyuridine van formule 2 werd met 6,960 g (25 mmol) chloortrifenyl-35 methaan in 50 ml watervrije pyridine gedurende 90 minuten op 100°C verhit. Daarna werd de oplossing tot 0°C afgekoeld en werd in een periode van een half uur 9,6 ml (14,4 g, 124 mmol) nethaansulfonylchloride toegedruppeld. Nadat de 8100177 -6-.

; I

oplossing is-.nachts,· ;bij 0-5°C was doorgeroerd, werd 4 ml water toegevoegd en werd het reaktiemengsel.langzaam.;uitgegoten in .1,5 liter krachtig doorgeroerd ijswater. Het mengsel werd geextraheerd met 4 x 250 ml ethylacetaat, waarna de organi-5 sche laag tweemaal, roet 150 ml 2N HC1 ter verwijdering van resten pyridine, tweemaal met een 5%'s natriumbicarbonaatoplossing en ten slotte met water werd gewassen..Na drogen op Na2S04 werd de ethylacetaatlaag onder verminderde druk drooggedampt.

De. verkregen bruine olie werd gezuiverd.door kolomchromato-10 grafie op silicagel, met benzeen-aceton (9:1) als elutie-middel. De gecombineerde eluaten werden drooggedampt en als zodanig, voor volgende omzettingen gebruikt. De opbrengst was 11 g (80%).

De verbinding)kon ook worden gekristalliseerd uit 15 propanol-2, waarbij een. wit produkt ontstond dat homogeen was blijkens dunne-laagchromatografie- (TLC) . op silicagel (Rf: 0,47 met benzeen-aceton (8:2) en 0,85 met chloroform-methanol (8:2)) en smolt bij 105-107°C (dec). Bij staan werd het produkt langzaam gedetrityleerd, zoals bleek bij TLC-analyse.

20 b) E-5-(2-broomviny1)-3’-azido-21,3’-dideoxyuridine.(formule 9)en E-5-(2-broomvinyl)-1-(3-azido-2,3~dideoxy-^>-D-threo-pento-furanosyl)uracil (formule 8) .

Een oplossing van 3,265 g (5 mmol) verbinding van formule 3 in 13 ml droog dimethylformamide werd in een 25 periode van 10 minuten toegedruppeld, aan een onder terug-vloeikoeling verhit.mengsel van 1 g.(15 mmol) natriumazide in 40 ml droog dimethylformamide. Na.het voltooien van de toevoeging werd de verhitting nog 25 minuten voortgezet.

Daarna werd het reaktiemengsel snel in een ijsbad afgekoeld 30 en werd het oplosmiddel onder verminderde druk bij kamertemperatuur .verwijderd. Het residu- werd getritureerd met chloroform en gefiltreerd. Het filtraat werd ingedampt en 1 uur bij de temperatuur van een stoombad behandeld met 80%’s waterig azijnzuur ter verwijdering van de tritylgroep.

35 Na afdampen van het oplosmiddel in vacuo werd het residu gechromatografeerd over een kolom, silicagel, met benzeen-aceton (9:1) als elutiemiddel. Het erythro-isomeer van formule 9 werd het eerst geelueerd in de vorm van een olie.

8100177 -7-

Opbrengst 0/540 g. Bij TLC op silicagel bleek het produkt zuiver te zijn (Rf 0,27 met benzeen-aceton (8:2) en 0,77 met chloroform-methanol (8:2))- IR-spectrum,*/ , 2100 cm*"1 (N3) . Het produkt is . 5 nog niet in kristallijne vorm verkregen.

Het produkt van formule 8 werd als tweede van de kolom ^eelueerd en gekristalliseerd uit water-methanol (2:1). De opbrengst was 0,610 g en het smeltpunt 153-155°C.

TLC op silicagel leverde Rf 0,06 met benzeen-aceton (8:2) 10 en 0,65 met chloroform-methanol (8:2). IR-spectrum,*^ , 2120 cm”1 (N3); m/e 357 (M+) .

c) E-5- (2-broomvinyl) -1- (3-amino-2,3-dideoxy-/£-D-threo-pento-furanosyl)uracil (formule 7) .

Een mengsel van 0,250 g (0,7 mmol) threo-azido-^ derivaat van formule 8 en 0,325 g trifenylfosfine in droog pyridine werd 1 uur bij kamertemperatuur doorgeroerd. Vervolgens werd 0,3 ml geconcentreerd ammoniurahydroxide toegevoegd en mocht het mengsel een nacht blijven staan. Het oplosmiddel werd in vacuo verwijderd waarna het residu werd 20 opgelost in 1M.ammoniumhydroxide en werd geextraheerd met benzeen (3 x) en met ether (3 x). Het organische extract werd met water gewassen waarna de 'gecombineerde waterlaag werd drooggedampt en door kolomchromatografie op silicagel werd gezuiverd. De kolom werd geelueerd. met chloroform-25

methanol (1:1) waarna de frakties met het gewenste produkt werden gecombineerd en drooggedampt. Ten slotte werd het residu gekristalliseerd uit water-ethanol (10:1), hetgeen 0,090 g witte kristallen met smeltpunt 143-145°C opleverde. Bij TLC op silicagel werd Rf 0,19 met chloroform-methanol (8:2) verkregen, m/e 331 (M+) . = + 42,5° (c 0,2 in IN

NaOH) .

Voorbeeld II

a) E-5- (2-broomvinyl) -21 -deoxy-31 -O-me.s.yl-51 -O-trityluridine (formule 3)

De genoemde verbinding werd verkregen op dezelfde wijze als in voorbeeld I (a).

' 8100 17 7 4 *· “ : -8- b) E-5-(2-broomvinyl)-2,31-anhydro-2'-deoxy-5'-O-trityl-uridine (formule 4).

mtmmm“ 11 g (16,8 mmol}'van het niet gekristalliseerde derivaat van formule 3 werd opgelost in 200 ml 80%'s waterige 5 ethanol. Vervolgens werd een equivalente hoeveelheid natriumhydroxide (16,5 ml/ .Ί,Ο N) toegevoegd en werd de oplossing 1 uur bij kooktemperatuur döorgeroerd, waarna de reaktie blijkens TLC voltooid was. De verkregen oplossing werd af gekoeld en drooggedampt. Het residu werd opgenomen in water i 10 waarna de gevormde vaste stof werd af gefiltreerd en met water en ether werd gewassen tot zij kleurloos was. De opbrengst was 7,520 g of 13,5 mmol (80%) en het smeltpunt was 186-188°C. Bij TLC op silicagel vertoonde het produkt slechts ëên vlek (Rf: 0,13 met benzeen-aceton (8:2) en 0,79 met 15 chloroform-methanol (8:2)). Dit produkt werd zonder verdere herkristallisatie voor de volgende trap gebruikt.

• c) E-5-(2-broomvinyl)-3'-azido-21,3dideoxyuridine (formule 9).

7,5 g (13,5 ramcbl) van de anhydro ver binding van formule 4 werd opgelost in 200 ml dimethylformamide. Vervol-20 gens werd 10,5 g lithiumazide enl,7g benzoëzuur toegevoegd en werd de verkregen oplossing bij 100°C. een nacht doorgeroerd. Het verloop van de reaktie werd gevolgd met TLC onder gebruikmaking van chloroform-methanol -(8:.2) als - oplosmiddel-systeem, en daarbij bleek dat de reaktie vrijwel voltooid 25 was aangezien slechts een spoor van het uitgangsmateriaal was overgebleven. Het dimethylformamide werd bij kamertemperatuur in vacuo verwijderd. Het residu werd gekristalliseerd uit water-ethanol (2:1) hetgeen 7,0 g lichtelijk onzuiver produkt van formule 6 leverde, dat onmiddellijk werd gede-30 'trityleerd,

De ruwe verbinding van formule 6 werd hiertoe'opgelost in 150 ml 80%'s waterig azijnzuur waarna het mengsel 0,5 uur onder roeren op een stoombad werd verhit.. Bij. TLC bleek geen uitgangsmateriaal te zijn overgebleven. Het mengsel 35 werd onder verminderde druk drooggedampt waarna het residu werd gezuiverd door kolorachromatografie op silicagel met chloroform-methanol (95:5) als elutiemiddel. Bij verdamping van de gecombineerde frakties werd 2,0 g (5,6 mmol'·, 41% / 8100177 1 « » -9- S.--' totale opbrengst) van de betrekkelijk zuivere verbinding van formule 9 in de vorm van een olie verkregen. Dit produkt was in elk opzicht identiek aan de overeenkomstige verbinding uit voorbeeld I (b). Bij TLC werd Rf: 0,77 met chloro-5 form-methanol (8:2) verkregen.

d) E-5-(2-broomvinyl)-3*-amino-2 *,31-dideoxyuridine (formulelO) .

Een mengsel van 1,8 g (5,0 mmol) azido-derivaat van formule 9 en 2,36 g trifenylfosfine in 20 ml droog pyridine werd 1 uur bij kamertemperatuur doorgeroerd. Daarna werd 2 ml geconcentreerd ammoniumhydroxide toegevoegd en werd de oplossing een nacht bij kamertemperatuur.bewaard. Onder verminderde druk werd het pyridine verwijderd, waarna water werd toegevoegd, en eveneens verdampt. Het residu werd opgelost in 1M ammoniumhydroxide en geextraheerd met benzeen en 15 tweemaal met ether. De waterlaag werd drooggedampt en het residu werd gezuiverd door kolomchromatografie op silicagel. Elutie van de kolom met. chloroform-methanol (1:1) leverde een produkt met positieve ninhydrinreaktie, dat ten slotte werd gekristalliseerd uit methanol en toen 0,900 g (54%) 20 witte kristallen met smeltpunt 192-193°C (dec).leverde.

2 4 q

Dit produkt had.de volgende eigenschappen: Z?*7D = +13,5 (c 0,5 in IN NaOH) ; m/e 331 (M+) ; TLC (Ef :-0,20 met chloroform-methanol (8:2)); NMR (il^SO-dg) 8,1 (s, 1H, H-6) , 7,18 (d, 1H, vinyl-H, J=.l3Hz) , 6,72 (d, 1H, vinyl-H, J= 25 13Hz), 5,98 (t, 1H, Η—1'), 4,55 (uitwisselbare protonen), 3,60 (m, 4H, H-5*, H-4*, H-31), 2,08 (m, 2H, H-2’).

8100177 ' - ' I · : . .-10-

• N

Biologische proeven.

Onderstaand wordt een reeks biologische proeven beschreven, waaruit de antivirale werking, de geringe giftigheid en de hoge antivirale index van de verbindingen 5 volgens de uitvinding blijken.

Bij deze proeven werd het effekt van de verbindingen van formule 1 en verwante verbindingen op de groei en de opbrengst.van virussen in cellenkweken gemeten.

• De onderzochte verbindingen waren: de derivaten '10 van formule 7-10 en. formule 4 van het formuleblad (bereid volgens de voorafgaande voorbeelden), E-5-(2-broomvinyl)-2'-deoxyuridine (zie Proc. Nat. Acad. Sc. USA 76_, 2947-2951 (1979)) en 5-jood-21-deoxyuridine (geleverd door Ludeco, Brussel). Al deze verbindingen waren β-anomeren.

15 De verbindingen werden onderzocht op vaccinia-virus, drie stammen van herpes simplex-1 virus (stam KOS, stam Malntyre. en stam F) en drie stammen van herpes simplex-2 virus (stam. G, stam Lyons en stam 196) . Deze virussen werden gedeeltelijk in.'cellenkweken van primaire konijneniercellen 20 (PRK) en gedeeltelijk ook in een groot aantal.andere cellenkweken gekweekt.

De techniek voor het meten van de virusgroei in cellenkweken is beschreven door E.De Clercq c.s. Biochem. Pharmacol. 24, 523-527, (1975) .

25 Proef 1

Bij deze proef werd de remmende werking van de verbindingen- volgens de uitvinding en verwante verbindingen op virussen van het type vaccinia, Herpes simplex-1 en herpes simplex-2 in PRK-cellenkweken gemeten. De cellen 30 werden tot samenvloeiing gekweekt op microplaten (PRK) van kunststofmateriaal. Bij samenvloeiing werden de cellen geënt met 100 CGID^g van het betreffende virus.· Eén CCID^g of "cell culture infecting dose-5Q" is de dosis van het virus die vereist is om 50% van de cellenkweken te infec-35 teren. Eén uur na het enten van het virus werden de verbindingen toegevoegd in diverse concentraties (lopende van 0,001^ug/ml tot 400/9-5,/ml) . Voor elk virus-cellen-systeem werd de ID^q bepaald. De ID^-g of "inhibitory dose-50" is 8100177

* J

* -11- de concentratie van de verbinding, die vereist is om het cytopatische effekt op het virus met 50% te verlagen- Dit cytopatische effekt (CPE) werd geregistreerd zodra het bij de niet-behandelde, met virus besmette cellenkweken vol-5 komen was (in het algemeen 3 dagen na het enten van de cellen met het virus). De resultaten zijn vermeld in onderstaande tabel A, waarin de gegevens gemiddelde waarden zijn van telkens drie afzonderlijke proeven.

8100177 -12- H W · L— «

O O O O O CM

* <Ö O O O O O o

'Η Μ1 N Μ· .η M1 CM O

•H /\. /s -Λ- 0 1 .

CM

£ vd r-* cm fll B σν o o o o o »· »

a+J'HCMr-OOOOO

S en -Μ1 ή ^ +> . yv • fj C H _ m -H £ en cm i v« > rad 00000 '·-)*· I * «g, " s s § dl · «d &> rH *« jf m S1 »

Q) A

• ' O ^ W

v; O a OOOOO H

• - S LOM+JOCM'sl'OinO O

K q ei ui co ή ^

Aj Η K ^ d

•H

d ; a> ω M r-t *3 3 r—I 1" 3 <J1 £ CM O' o o o dl Ή PU B o o o - " K3> p^-dfoor-i'^enri o o § d ,-pm Λ E-i <D p I 'S _ a r- ™ O O o r- . Xrn-P» in o o o O' <U 4-5 id <d> CM ί—1 -^3» ^ — •Η g, Μ H A O o I w £ en l§ en o oo.oo fj dl -p- o - *· o en o «. ~- B .txj en ai o o · cm · <H ^ o . o 3 I .___ -H- > •3

P

d

§ CM *H

Λ g i i H* ° •3 g 01 01 'S o d 'p d o O -d 1 -3 ipoi>co^ 3 ό - 'S 010)0)0)01^15 2 g llll^vii

O 0 0 O 0 J . CL) I

pq S · f3 · (3 Η|Ό . en 8100177 α» ¢, -13- * #

Uit tabel A blijkt, dat de verbinding van formule 10 een krachtige en zeer specifieke antivirale werking tegen herpes sinplex virussen vooral -van het type 1 vertoont, maar nauwelijks :enige werking tegen vaccinia virus. In deze opzichten 5 komt de verbinding nagenoeg overeen met het bekende E-5-(2-broomvinyl)-2'-deoxyuridine, terwijl zij zich door de specifieke werking tegen type 1 van herpes sinplex virus duidelijk onderscheidt van het 5-jood-2’-deoxyuridine. Ook de verbindingen van formule 9,7 en 8 vertonen een gedeeltelijk spe-10 cifieke antivirale werking, die echter ten opzichte van de verbinding van formule 10 geleidelijk minder wordt. De anhydroverbinding van formule 4 is onwerkzaam.

Proef 2

Bij deze proef werd de remmende werking van de ver-15 binding van formule 10 en enkele verwante verbindingen op de stam KOS van herpes simplex-1 in een groot aantal cellen-kweken gemeten. De meetmethode was gelijk aan die van proef l.en de resultaten zijn weergegeven in tabel B.

810017 7 -14- £

<D

m ·' H

£H o d h S S h £ © G ©

m v x v P H © O

□ O O O A H -P P

S g 0) -P ©

W © O (d H

A A £ ,¾ CQ © n ö β a ·- ö

•Η H rd (Ö λ <U

71 .. ^ . Η Λ > CO N

Λ 4 ® Pi © O χ ft H

£ o5 · o o co p £ r-n o £ •H fQ £ A © I -P g

(D -H H O A

' co g a η co a o 0 03 © ra © '-x p ^ (\j £ h o cd m H &y en cm o ui 3 tJi *s ra > ra p χ ra· > A £ —· co ,< ra>. o o o M 5 ffl

-x £ x H 0 O

CO Ή © H > © £ 0 H CM x A fd « !&1 Γ"- CM H I ra ·· -p > 3 ra ° ra· © ε-c ra n -p ε κ ra· ° ö O ft tn

(d o ° tJi «· ·' ö o -H

A m £ o ra o υ A

ui Q o >i cm 03 P co '-Ö H ^ Hp '-'(Dg . © ' cm oo AS O 0

-HA I x v * g o co A

1 (D H O O A © O £ A

X £ H CO <D ft (d (DA PI A O g (d £) H £ r-, Ή g id χ

ft CD Γχ O Γχ ·* -P 0 © O

raSH S o O O £ H p 03 © >,

ra-HH W x x © © A £ P

SCO <D ra O OO H CQ O £ © A

o- ra £ , id o S

<D <D O g g Ö» I

<D(D tvK o οα· ·Ρ (d A -H CQ £ A > W ° OO £ > U H £ g 1 H (ü CQ CD fÖ ft-Ö £ £ -P O iti £ O rx. -π CD g’ A A (d ËP; £ HHOCOH> ° k 'ft M ® (d p s-i Pi o O -· <-0 © -P H A £

•P A O p A <3 CD

A--PAO H

P <D <D P £ H

(D P H x A (ti (D

g. -H ft CQ -H > O

Ό I Η H g -P Η H

g <*—<* -H *. k. s o fQ

P | ö| | -H

^ B lo o ·ο o J§ ώ|>$ ΙΛ |j 8100177 -15- üit tabel B blijkt dat de verbinding van formule 10 tegenover herpes simplex virus type 1 een nagenoeg evengoede werking als E-5-(2-broomvinyl)-2'-deoxyuridine en 5-jood-2'-deoxyuridine heeft.

5 Proef 3

Verder werd het remmende effekt van de verbinding van formule 10 en E-5-(2-broomvinyl)-2'-deoxyuridine op de vermenigvuldiging van herpes simplex-1 (stam KOS) virus in PEK-cellenkweken gemeten.

' Samenvloeiende enkelvoudige lagen van PKK-cellen in Petri-schalen van kunststofmateriaal (diameter 55 mm) werden met herpes simplex-1 (4,5 log-^PFE/0,5 mm/Petrischaal)geënt en gedurende 1 uur bij 37°C bebroed. Onmiddellijk daarna werden de te onderzoeken verbindingen toegevoegd, elk in doses van 15 0,01, 0,1, 1, 10 en 100 ,ag/ml. De cellen werden of op de dag 0 (onmiddellijk na het bebroeden met virus), of op de dag 1, 2 of 3 (na verder bebroeden bij 37°C) geoogst. De virusopbrengst in de cellen werd bepaald aan de hand van de plakvor-ming in Vero-cellenkweken (VERO = een continue niercellenkweek 20 van groene apen). De resultaten zijn verzameld in figuur 1 en 2, waarbij figuur 1 voor de verbinding E-5-(2-broomvinyl)-2'-deoxyuridine en figuur 2. voor de verbinding van formule 10 geldt. Met PFE worden plakvormingseenheden bedoeld.

Uit figuur 1 en 2 blijkt dat de remmende werking van 2beide verbindingen in geringe concentratie (0,01 ^ög/rnl) nagenoeg gelijk is, maar dat bij hogere concentratie verschillen gaan optreden? terwijl, de remmende werking van de bekende ver-• binding slechts geleidelijk toeneemt,’ naarmate de concentratie stijgt, heeft de verbinding van formule 10 bij een kleinere 30 concentratie (bijv. 0,1 Jig/ml) een geringer en bij hogere concentraties (bijv. 10 en 100 jog/ml) een sterker remmend effekt dan de bekende verbinding. Dit laatste wijst op een sterkere antivirale werking van de verbinding van formule 10 aan hogere concentraties.

35 Proef 4

De antimetabolisehe werking van de verbinding van formule 10 en verwante verbindingen in PRK-cellenkweken werd gemeten.

8100177 y+ ·- ** ; 7 -i6- ' ”

Daartoe werd de opname van bepaalde radio-actief-gemerkte DNA-voorprodukten in DNA van de cellen en het effekt van de genoemde verbindingen hierop onderzocht. De techniek is beschreven door De Clercg c.s. in Biochem. Pharmacol., 26, 5 794-797 (1977) en door De Clercq c.s. in Molecular Pharmaco-. logy, 14, 422-430 (1978).

3

De toegepaste DNA-voorprodukten waren.(methyl- H) (21 -deoxythymidine) (TdR) ön (Ι'^’-^Η) (21-deoxyuridine) (UdR).

De cellen werden 16 uren blootgesteld aan 0,12.^1101 10 per 0,01 nmol (methyl-3H)TdR (per 10^cellen) of 0,25^UCi per 0,006 nmol (i1^1- H) UdR (per 10 cellen) bij aanwezigheid van de verbindingen in diverse concentraties (lopende van 1 tot 200jüg/ml). De opname van het radio-actief-gemerkte voorpro-dukt werd daarna op de beschreven wijze gemeten, waarna de 15 1Dj-q werd bepaald. De ID,-q komt overeen met de remmende dosis-50, dat de concentratie van de verbinding die vereist is om de opname van hetzij (methyl-^H)TdR of (1’,2*-^H)UdR met 50% te remmen. De resultaten zijn onderstaand in tabel C vermeld.

TABEL"C

20

Antimetabolische werking in PRK-cellenkweken.

7“ Γ ID50 (pg/ml)

Verbinding (Methyl-'3H)TdR (11,2'-3H)UdR

opname opname 25 —----—-

Formule 10 >100, 90, 80 >100, 90 E-5-(2-broomviny1)-2'- deoxyuridine 90, 75, 60 20, 15 5-jood-2’-deoxyuridine 2,1,5,1 0,3, 0,2 30

Uit tabel C blijkt dat de stof van formule 10 geen 3 3 remming van de opname van (methyl- H)TdR of (1 *,2 * — H)UdR in het DNA van de cellen veroorzaakt, tenzij de concentratie wordt 35 opgevoerd tot 80, 90 of lOO^ftg/ml of hoger. In dit opzicht is de nieuwe verbinding zelfs iets beter (d.i. minder giftig) dan het bekende E-5-(2-broomvinyl)-21-deoxyuridine, en aanzienlijk beter dan de bekende stof 5-jood-2'-deoxyuridine.

8100177 -17-

Proef 5

Ten slotte werd de antivirale index van de verbinding van.formule 10 en verwante verbindingen in PRK-cellen-kweken bepaald als een resultaat van de bij de voorafgaande 5 proeven uitgevoerde metingen.

De antivirale index A werd bepaald als de verhou- 3 ding van ID^ voor de opname van (methyl- H)TdR in DNA van de cellen tot de ID^-q voor de remming van herpes simplex-1 (stam KOS) virus (.vergelijk tabellen A en C) . De antivirale 10 index B werd bepaald als de verhouding van ID5Q voor ^e opname van (1*,2'-3H)UdR in DNA van de cellen tot de ID5Q -voor de remming van herpes simplex-1 (stam KOS) virus (vergelijk tabellen A en C). De resultaten zijn hieronder in tabel D vermeld.

15 TABEL D

Antivirale index in PRK-cellenkweken.

Antivirale index

Verbinding ~ ^ B

Formule 10 ^900 >950 E-5-(2-broomvinyl)-21-deoxyuridine 3750 875 5-jood-2,-deoxyuridine 15 2/5 j--

Uit tabel' D blijkt dat de antivirale index voor de verbinding volgens de uitvinding zeker meer dan 900 ö'f 950 bedraagt. Aangezien deze verbinding bij de hoogste onderzochte concentratie (100 fig/ml) weinig of geen giftigheid 20 vertoonde, kon de exacte antivirale index niet nauwkeurig worden bepaald. Zij ligtechter in dezelfde orde van grootte als die van E-5-(2-broomvinyl)-2'-deoxyuridine.

Uit het voorafgaande zal duidelijk zijn, dat de verbindingen volgens de uitvinding een duidelijke antivirale 25 werking, en de stof E-5-(2-broomtinyl)-31-amino-21,3'-dide-oxyuridine zelfs een uitmuntende en zeer specifieke antivirale werking tegen herpes simplex virus bezitten, terwijl 8100177 V- ·“" -18- de giftigheid daarvan in een cellenkweek bijna nihil is. De verbinding van formule 10 komt in dit opzicht sterk overeen met de bekende verbinding E-5-(2-broomvinyl)-2'-deoxyuridine, maar lijkt zich daarvan te onderscheiden 5 door een krachtigere werking bij hogere concentraties. De verbindingen volgens de uitvinding kunnen derhalve met voordeel worden gebruikt voor het bereiden van farmaceutische preparaten en voor de behandeling van ziekten, die bij mens » en dier veroorzaakt worden door herpes.simplex virus.

10 Farmaceutische preparaten die de stoffen volgens de . uitvinding als werkzame stof bevatten, kunnen de vorm hebben van. poeders, suspensies, oplossingen, emulsies alsmede van zalven en. pasta’sen kunnen voor parenterale (intradermale, intramusculaire, intrathecale,...} injecties, orale, rectale, 15 intravaginale en intranasale toedieningen of .topicale toediening (bijvoorbeeld op huidletsels, slijmvliezen,of het oog) worden gebruikt. Deze preparaten kunnen worden bereid door het werkzame bestanddeel of de werkzame bestanddelen te verenigen met farmaceutisch toelaatbare excipientia, die 20 gewoonlijk voor dit doel worden gebruikt. Deze excipientia kunnen bestaan uit waterige of ,niet-waterige oplosmiddelen, stabiliseermiddelen, suspendeermiddelen, dispergeermiddelen, bevochtigingsmiddelen en dergelijke,en zullen aan de deskundige op farmaceutisch gebied bekend zijn. Verder kan het 25 preparaat elk geschikt toevoegsel, zoals polyethyleengly-colen en desgewenst kleurstoffen, parfums en.dergelijke bevatten.

De farmaceutische preparaten zullen het werkzame bestanddeel gewoohlijk in een concentratie van.ten minste 30 0,1% (gewichtsdeel/volumedeel) bevatten. De eigenlijke concentratie zal afhankelijk zijn van de te behandelen ziekte en de gekozen wijze van toediening. In het algemeen zal deze concentratie tussen 0,1 en 100% liggen.

8100177

Claims

1. Deoxyuridine-verbindingen, zoals weergegeven , door formule 1, waarin Hal een halogeenatoom, X een amino- of azidogroep en de kartellijn een erythro- of threo-confi-guratie voorsteIt. 5

2. E-5-(2-broomvinyl)-31-amino-2’ , 31-dideoxyuri- dine.

3. Werkwijze voor het bereiden van deoxyuridine-verbindingen, met het kenmerk, dat verbindingen van formule 1, waarin Hal, X en de kartellijn de aangegeven betekenis 10 hebben, worden bereid op een voor analoge verbindingen bekende wijze.

4. Werkwijze volgens conclusie 3, met-het kenmerk, dat zij worden bereid door invoering van een azido- of aminogroep op de 3'-plaats van een E-5-(2-halogeenvinyl)- 15 21-deoxyuridine.

5. Werkwijze volgens conclusie '4, met het kenmerk, dat de verbindingen van .formule 1 worden bereid door (a) in-een uitgangsverbinding van formule 2, nadat de 5 1-hydroxylgroep beschermd is, een iresyl- of tosvlgroep op de 20 plaats 3’ in te -voeren, deze itesyl- of tosylgrcep door een azidogroep te vervangen, gevolgd door deprotectie van de 5'-hydroxylgroep en desgewenst omzetting van.de azidogroep in een aminogroep, (b) door een uitgangsverbinding van formule .2, nadat de 5 * -25 hydroxylgroep beschermd is, om te zetten tot een inwendige 2,3‘—anhydroverbinding, deze 2,31-anhydroverbinding te behandelen met een azide .ter invoering van een 3'-azidogroep, gevolgd door deprotectie en desgewenst omzetting van de azidogroep.tot een aminogroep.

6. Farmaceutisch preparaat met antivirale werking, met het kenmerk, dat het een verbinding van formule 1, waarin Hal, X en de kartellijn de aangegeven betekenis hebben, als actief, bestanddeel bevat.

7. Preparaat volgens conclusie 6, met speciale 35 toepassing voor het behandelen van herpes simplex.infecties, met het kenmerk, dat het E-5-(2-broomvinyl)-3*-amino-21,3 dideoxyuridine als actief bestanddeel bevat. 8100177 -20-

8. Werkwijze voor het bereiden van een farmaceutisch preparaat met antivirale werking, met het kenmerk, dat men één of meer verbindingen van formule 1, waarin Hal,. X en de kartellijn de aangegeven betekenis hebben, in een voor 5 therapeutische toepassing geschikte toedieningsvorm brengt.

9. Werkwijze volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat men de genoemde verbinding vermengt met een farmaceutisch aanvaardbare drager.

10. Werkwijze voor het behandelen van. virusinfec-10 ties bij mens en dier, met het kenmerk, dat men deze infecties behandelt met een therapeutisch doeltreffende hoeveelheid van een verbinding van formule 1, waarin Hal, X en de kartellijn de aangegeven betekenis hebben. 8100177