NL8005738A - Werkwijze voor de bereiding van de carbamylderivaten van alfa-hydroxyzuren alsmede van de overeenkomstige alfa-hydroxyzuren. - Google Patents

Description

if a 803317/vdV/mk

Korte aanduiding: Werkwijze voor de bereiding van de carbamylderivaten van -hydroxyzuren alsmede van de overeenkomstige *>-hydroxy- zuren.

5 De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor de bereiding van «-hydroxyzuren door hydrolyse van een verbinding met de algemene formule 1 van het formuleblad, waarin R een al of niet gesubstitueerde aromatische of alifatische groep voorstelt.

Volgens de onderhavige werkwijze kunnen de verbindingen 10 met formule 1, bijvoorbeeld 5-gesubstitueerde 2,oxazolidinedionen, gehy-drolyseerd worden waardoor de ring volgens het reaktieschema 1 van het formuleblad geopend wordt.

De door hydrolyse verkregen verbinding met formule 2 is het carbamylderivaat van -hydroxyzuur, waaruit men ίλ-hydroxyzuur kan berei-15 den door de verbinding verder te hydrolyseren volgens reaktieschema 2 van het formuleblad, onder vorming van het eindprodukt in de vorm van een öï-hy-droxyzuur met formule 3.

De onderhavige uitvinding heeft verder betrekking op een belangrijke werkwijze voor de direkte bereiding van D-carbarayl-v’i-hydroxy-20 zuur door stereoselektieve enzymatische hydrolyse van een racemisch mengsel van verbindingen met formule 1.

Hierbij heeft men geheel onverwachts gevonden dat het mogelijk is 5-gesubstitueerde DL-2,4-oxazolidinedionen zodanig enzymatisch te hydrolyseren dat uitsluitend D-carbamyl-Ci'-hydroxyzuur ontstaat, dat 25 wil zeggen slechts één van de twee mogelijke optische isomeren. Het vrije Ot-hydroxyzuur met D-configuratie kan men door eenvoudige hydrolyse uit het optisch aktieve carbamylderivaat bereiden. De verbindingen met formule 1 kan men gemakkelijk bereiden uit de overeenkomstige ?>'-hydroxyzuren door reaktie met ureum, zoals beschreven door Helge Aspelund in Acta Acad.

30 Aboensins Math, and Phys. 22 (7) 12 (1961).

Omzetting van het racemisch mengsel bereikt men door stereoselektieve hydrolyse van de oxazolidinering met behulp van enzymen die gemakkelijk uit kweken van verschillende micro-organismen of uit extrak-ten van dierlijke organen, bijvoorbeeld kalfslever, verkregen kunnen worden. 35 Een bijzonder zeer belangwekkend geval, dat evenwel de boven beschreven werkwijze niet beperkt, is de bereiding van D(-)-amandel-zuur met formule 4, dat een belangrijk tussenprodukt is bij de bereiding van half-synthetische antibiotica.

Dit tussenprodukt bereidt men gewoonlijk door omzetting 2f0 van het reacemische mengsel onder vorming van diastereo-isomere zouten -2- met een optisch aktieve natuurlijke base, bijvoorbeeld brucine.

Deze methoden leveren in alle gevallen een maximale theoretische opbrengst van 50# waarbij het L-enantiomeer vóór de recirculatie racemisch gemaakt moet worden.

5 Volgens de werkwijze der uitvinding bereidt men het car- bamylderivaat van D(-) amandelzuur bij voorkeur door stereoselektieve enzymatische hydrolyse van het overeenkomstige 5-fenyl-2,i»-oxazolidinedion.

De onderhavige uitvinding bezit nog het aanzienlijke voordeel dat het enzymatische reaktiesubstraat onder de hydrolyse-omstandigheden vanzelf in 10 de racemisehe vorm overgaat, zodat na afloop van de reaktie het carbamaat van D-amandelzuur met betrekking tot het uitgangssubstraat in stoechiome-trische hoeveelheid verkregen wordt.

De reaktie verloopt volgens schema 3 van het formuleblad, waarbij men het D(-) amandelzuur uit het D-amandelzuurcarbamaat door hydro-15 lyse in een zure omgeving verkrijgt.

De voor de bereiding van D(-) amandelzuurcarbamaat vereiste enzymatische werking kan zowel in gehomogeniseerde kalfslever als in de volgende micro-organismen gevonden worden.

Pseudomonas, Achromobacter, Corynebacterium, Brevibacte** 20 rium, Microbacterium, Arthrobacter, Agrobacterium, Aerobacter, Klebsiella, Serratia, Proteus, Bacillus, Micrococcus, Sarcina, Protaminobacter, Strep-tomyces, Actinomyces, Candida, Rhodotorula, Pichia en Paecilomyces.

De volgende micro-organismen blijken bijzonder geschikt te zijn: 25 Agrobacterium radiobacter NRRL B 11291

Bacillus Brevis NRRL B 11080 Bacillus stearothermophilus NRRL B 11079 Pseudomonas sp CBS 1^5«75 Pseudomonas sp CBS 1*1-6.75 30 Pseudomonas sp ATCC 11299

Pseudomonas desmolytica NCIB 8859 Pseudomonas fluorescens ATCC 11250 Pseudomonas putida ATCC 12635

Volgens de werkwijze der uitvinding worden de bovengenoem-35 de micro-organismen onder aerobe omstandigheden in een kweekmedium, dat stikstof, koolstof, fosfor en minerale zouten leverende verbindingen bevat, bij een temperatuur tussen 20 en 80°C gedurende 10-72 uren bij een pH tussen 6,0 en 8 gekweekt.

Als koolstofleveranciers kunnen glucose, lactaat, acetaat, ko maiskweekvloeistof en lactose gebruikt worden.

8005738 -3- 0

Als stikstofbron kan men gehydrolyseerd vlees, caseine of soja, ammoniumzouten, ureum, hydantoine enzovoort gebruiken.

Een geschikt kweekmedium bezit bijvoorbeeld de volgende samenstelling: 5 Vleespepton 5 g

Vleesextract 5 g

Glucose 5 g

Gedestilleerd water 1000 cc pH 7,0 i 7,2 10 Men kan het D(-) carbamaat van amandelzuur direkt berei den in het fermentatiemedium dat het overeenkomstig DL 2,^-oxazolidion bevat of door de microbenpasta van de resterende cellen of de extrakten daarvan te gebruiken. Men extraheert de enzymatische complexen.volgens de uitvinding volgens de bekende in enzymologie gebruikelijke methoden uit de 15 bacterienpasta.

Hiertoe worden de cellen met behulp van een geschikt apparaat, bijvoorbeeld de French Pressure-Cell Press, de Manton Gaulin Homo-genizer, een roterende disintegrator enzovoort of ultrasonisch gedesintegreerd.

Men kan de hydrolyse van 5-gesubstitueerde DL-2,^-oxazo-20' lidinedion uitvoeren door het enzym in de volgende vormen aan het reaktie-mengsel toe te voegen: verse cellen, uit de bevroren toestand gedroogde cellen, cellen in tolueen, acetonpoeder of ruwe of gezuiverde extrakten.

Een andere technische en economische vooruitgang bereikt men door het immobiliseren van de enzymen door vermengen met macromoleculaire verbindingen 25 en het vormen van chemische bindingen met de matrix of van ionenbindingen, of door fysische immobilisatie.

De uitvinding wordt nu aan de hand van de volgende geen beperking inhoudende voorbeelden nader toegelicht.

VOORBEELD I

30 Men bereidt een kweekmedium dat als volgt is samengesteld:

Vleespepton 5 g

Vleesextract 3 g

Glucose 5 g

Gedestilleerd water 1000 cc 35 Men stelt de pH met natriumcarbonaat in op 7,2 en verdeelt het medium in 500 ml kolven in hoeveelheden van 100 ml. Na 30 minuten steriliseren bij 110°C worden de kolven geent met een cultuur van de Pseudo-monasstam CBS 1^5*75 op een schuine bodem, die hetzelfde medium bevat met 2% agar (DIFCO) en daarna 2h uren bij 30°C onder rondschudden (220 opm) 40 geincubeerd.

-4-

Van deze eerste kweek (D.O. bij 550 nm = 0,250 verdunning x 1 : 10) brengt men 1 ml in vijf 500 ml kolven over, die 100 ml van hetzelfde medium bevatten, en incubeert de kweek onder rondschudden 24 uren bij 30°C (220 opm) (D.O. bij 550 nm = 0,450 verdunning 1:10.

5 Men verzamelt de cellen, wast in een fysiologische op lossing en suspendeert tenslotte bij een temperatuur van 50°C in 100 ml 0,1 M pyrofosfaatbuffer met pH 8,7, die 2 g DL-5-fenyl-2,4-oxazolidinedion bevat.

Na een 70 uren durende incubatie is onder deze omstandig-10 heden, zoals uit de polarimetrische analyse van het reaktiemengsel blijkt, de hydrolyse van D-amandelzuurcarbamaat voltooid.

Men verwijdert na verwijdering van de celpasta door een» trifugeren het carbamaat uit het reaktiemengsel, koelt af en stelt de pH met geconcentreerd HC1 in op 2,5- Men filtreert het gevormde neerslag, wast 15 met koud water en droogt onder vacuum. Men verkrijgt 1,8 g carbamaat dat door het I.R.- en NMR-spectrum, alsmede door elementairanalyse geïdentificeerd is.

• ~ 25

Het soortelijke optische draaiingsvermogen Λ ^ van een alcoholoplossing van het op de bovenbeschreven wijze bereide carbamaat be-20 draagt —141.

Het smeltpunt (onder ontleding) ligt bij 169°C.

Men suspendeert 1,4 g carbamaat in 100 ml H^O en kookt 4 uren onder terugvloeikoeling. De verkregen waterige oplossing wordt aangezuurd en met ethylether geextraheerd waarna men de organische fase onder ^ 25 25 vacuum tot droog indampt. Men verkrijgt 1,10 g ruw amandelzuur met Λ. ^ = -120 (optische opbrengst 76%).

Na herkristalliseren uit water bezit het ruwe produkt een smeltpunt van 130°C en bedraagt jjx] jp in water -154,5, tegenover een in de literatuur beschreven smeltpunt van D(-)amandelzuur van 133°0 en 30 iKI D5 = ’158·

VOORBEELD II

Men voegt 1 g van het acetonpoeder van gehomogeniseerde kalfslever toe aan een oplossing van 500 mg DL-5-fenyl-2,4-oxazolidinedion in 50 ml van een 0,1 M pyrofosfaatbuffer met een pH van 8,5·

35 Het aldus verkregen reaktiemengsel wordt 40 uren bij 30°C

geincubeerd.

Daarna wint men het D-amandelzuurcarbamaat zoals beschreven in Voorbeeld I. Men verkrijgt 3Ö0 mg ruw carbamaat met een soortelijk optisch draaiingsvermogen *<j ^ in ethanol van -136. Het ruwe carbamaat ItO wordt aan zure hydrolyse onderworpen en het amandelzuur zoals beschreven 8005738 -5- in Voorbeeld I geëxtraheerd, waarbij men 300 mg ruw D-amandelzuur met *-*' pc ;Ci ^ = -116 (optische opbrengst 73i3$) verkrijgt.

8005738

Claims (10)

1. Werkwijze voor de bereiding van carbamylderivaten van C\ -hydroxy zuren, met het kenmerk, dat men een 5-gesubstitueerde 5 2,^f-oxazolidinedion met de algemene formule 1 van het formuleblad, waarin R een al dan niet gesubstitueerde aromatische of alifatische groep voorstelt, hydrolyseert.

2. Werkwijze volgens conclusie 1,met het kenmerk, dat men D-carbamyl- -hydroxyzuur bereidt door een 5-gesubstitueerd DL-2, 10 oxazolidinedion met de algemene formule 1 van het formuleblad aan stereo-selektieve enzymatische hydrolyse te onderwerpen.

3. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat de enzymatisch werkzame middelen voor de stereoselektieve hydrolyse van een 5-gesubstitueerd 2,^-oxazolidinedion uit gehomogeniseerde kalfs-15 lever bereid worden.

4. Werkwijze volgens conclusie 2 en 3i o e t het kenmerk, dat de enzymatisch werkzame middelen bij de stereoselektieve hydrolyse van 5-gesubstitueerde 2,^-oxazolidinedion uit één van de volgende micro-organismen bereid worden: Pseudomonas, Achromobacter, Corynebacterium,

20 Brevibacterium, Hicrobacterium, Arthrobacter, Agrobacterium, Aerobacter, Klebsiella, Serratia, Proteus, Bacillus, Micrococcus, Sarcina, Protamino-bacter, Streptomyces, Actinomyces, Candida, Rhodotorula, Pichia en Paecilo-myces.

5. Werkwijze volgens conclusie 2, 3 en 4, met het 25 kenmerk, dat de enzymatisch werkzame middelen bij de stereoselektieve hydrolyse van 5-gesubstitueerde DL-2,^-oxazolidinedion bij voorkeur uit de volgende micro-organismen bereid worden: Agrobacterium radiobacter NRRL B 112911 Bacillus Brevis NRRL B 11080, Bacillus stearo thermophilus NRRL B 11079» Pseudomonas sp CBS 1^5*75, Pseudomonas sp CBS 1^6.75, Pseudomonas 30 sp ATCC 11299, Pseudomonas desmolytica NCI B 8859, Pseudomonas fluorescens ATCC 11250 en Pseudomonas putida A!PCC 12633·

6. Werkwijze volgens conclusie 2, 3 en 5, net het kenmerk, dat de micro-organismen onder aerobe omstandigheden bij een temperatuur van 20-80°C gekweekt worden.

7. Werkwijze volgens conclusie 2, 3, 5 en 6, met het kenmerk, dat de micro-organismen 10 tot 72 uren gekweekt worden.

8. Werkwijze volgens conclusie 1 tot 7, net het ken merk, dat de pH van het kweekmedium van de micro-organismen tussen 6 en 8 ligt. ifO

9. Werkwijze volgens conclusie 1-8, met het ken- 8005738 -7- m e r k, dat het D- ¢(-hydroxyzuur: D-(-) amandelzuur is en het substraat met de algemene formule 1 : DL-5-fenyl-2, ^f-oxazolidinedion is·

10. Werkwijze voor de bereiding van D(-) amandelzuur, met het kenmerk, dat men het overeenkomstige carbamaat in een waterige 5 omgeving bij een temperatuur tussen ko en 100°C en een pH tussen 1 en 5,5 aan zure hydrolyse onderwerpt. 8005738 R Ηί\ i Ο = G _ 2 C = ο H (1) Schema lr * HO I R I , HC — OC—NH_ » 1 + H,0 _v l 2

0. CN /C = 0 2 ^ 0 a C ? OH H (1) (2) Schema 2: R HOOC - CH - OCONH + H 0 _* R “ CH - COOH + CO. + HH_ 2 2 ^ I 2 3 OH (3) 0 —- CH - COOH OH (4) Schema 3: H (¾ Q Q—\ J *"] ] H'| 2 {*-CN ^C\\ ^.C\ /·%. » °H N O w o I ' Η H L D D 8005738