NL7907939A

NL7907939A - Gecombineerde heterogene specifieke bindingsproeven.

Info

Publication number: NL7907939A
Application number: NL7907939A
Authority: NL
Original assignee: Ames Yissum Ltd
Priority date: 1978-10-30
Filing date: 1979-10-29
Publication date: 1980-05-02
Also published as: US4315907A; AU5218679A; AU519877B2; FR2440556B1; IT7950687A0; JPS5585252A; IL55816A0; DE2943648C2; CA1128856A; GB2034466A; SE7908936L; DE2943648A1; GB2034466B; IL55816A; FR2440556A1

Description

* * ïfw 8615

Titel Gecombineerde heterogene specifieke bindingsproeven.

De uitvinding betreft een kwantitatieve bepaling van liganden, zoals antilichamen, antigenen of haptenen, in vloeistofmedia met inbegrip van lichaamsvloeistoffen als sera, gebaseerd op specifieke bindingsprceftechnieken. In het bijzonder betreft de’-uitvinding het 5 aantonen van antilichamen, antigenen of haptenen, gebaseerd op immunotechnieken onder toepassing van gemerkte reagentia, zoals radio-gemerkte of enzym-gemerkte reagentia. De uitvinding betreft een specifieke bindingsproefmethode van het heterogene type, d.w.z. waarbij een gebonden stuk van het gemerkte reagens fysisch -wordt gescheiden 10 van het vrije stuk daarvan, voor een simultane bepaling van elk van een aantal, verschillende liganden in een enkel vloeistofmonster.

Een levend systeem is in staat de aanwezigheid van vreemd materiaal (antigenen), zoals proteïnen, virussen, bacteriën enz. binnen het systeem te ontdekken, herkennen^en daarop te reageren.

15 Deze respons heeft o.m. de vorm van de produktie van een antilichaam.

dat specifiek is tegen het betreffende antigeen. Vervolgens treedt een specifieke reactie op tussen antilichaam en antigeen, waarbij een cduplex wordt gevormd.. Een eenmaal geproduceerd antilichaam kan tevens een hapteen binden, d.w.z. een betrekkelijk kleine en een-20 vcudige verbinding, die de determinantgroep van het betreffende anti geen kan zijn, welk hapteen een binding kan aangaan met'het specifieke antilichaam, maar zelf geen aanleiding geeft tot de produktie van een antilichaam, tenzij het is gebonden aan een antigene drager.

De bindingsinteractie tussen antigeen of hapteen en antilichaam 25 is specifiek en gevoelig. Andere typen materialen, die deelnemen hij overeenkomstige specifieke en gevoelige bindingsinteracties zijn enzymen en hun substraten, materialen als hormonen, vitaminen, netabolieten en farmacologische middelen, alsmede hun receptoren en hindingsstoffen, alsmede andere stoffen die uit de wetenschap bekend 30 zijn. Deze specifieke en gevoelige bindingsreacties hebben een snel opgekcmen analytische techniek opgeleverd, die bekend staat als de specifieke bindingsprceftechniek. Indien een radioactief merk wordt 790 79 39 4 1 2 toegepast en de bindingsreactie immunologisch is, staat de methode "bekend als radioimmunoproef (BIA)-methode. Onlangs zijn diverse merk-materialen bekend geworden ter vervanging van radioisotopen, t.w. enzymen, coënzymen, enzymsubstraten, enzymmodulatoren, zoals rem- 5 stoffen en allosterische. effectoren, fluorescerende moleculen, lumincescerende moleculen en andere.

Bij een conventionele specifieke bindingsproeftechniek wordt het proefmonster gecombineerd met reagentia van diverse samenstelling, met inbegrip van een gemerkt bindingsmiddel met een aantoonbare merk-10 component en een bindingscomponent die met andere bestanddelen, indien aanwezig, deelneemt in het reagens en met de aan te tonen ligande een bindingsreactiesysteem vormt met twee soorten vormen van het gemerkte bindingsmiddel, t.w. een gebonden deel en een vrij deel. De relatieve hoeveelheid aan gemerkt bindingsmiddel dat optreedt in 15 het gebonden deel vergeleken met. het vrije, deel is een functie van de aanwezigheid of de hoeveelheid van de aan te tonen ligande in het monster.

Ter illustratie wordt hieronder een gebruikelijke competitieve bindingsproeftechniek beschreven. Bij een dergelijke proef omvat het 20 reagensf^ln gemerkt bindingsmiddel in de vorm van dev adn te tonen ligande, b.v. een antigeen of hapteen, welke ligande de bindings-ccmponent van het merkmiddel vormt, chemisch gebonden aan de merk— component,, b.v. een radioactief atoom of een enzym, en (2) een vaste fase-bindingsmiddel voor de ligande, b.v. een vaste fase vorm 25 van een antilichaam. Bij combinatie van monster en reagens con curreren de aan te tonen ligande en de bindings component van het gemerkte bindingsmiddel (hier een gemerkte vorm van de ligande), op een nagenoeg niet discriminerende wijze voor het niet covalënt binden- van de vaste fase-bindingspartner (hier een antilichaam).

30 Als resultaat kunnen ofwel de hoeveelheid gemerkt bindingsmiddel, dat aan de bindingspartner wordt gebonden, d.w.z. dat terecht komt in de vaste fase, of de hoeveelheid die vrij blijkt (dus ongebonden door de bindingspartner) worden gemeten als een functie van de hoeveelheid van de aanwezige concurrerende ligande. De hoeveelheid 35 gemerkt bindingsmiddel optredend in elk deel wordt bepaald door een 790 7 9 39 3 » # scheiding Tan de in de raste-fase gebonden delen en de in de vloeistof-fase optredende delen en meting ran de merkccmponent in een ran de afgescheiden fasen.

Ter rerdere illustratie wordt hieronder een andere specifieke ? bindingsproeftechniek beschreren, bekend als de indirecte vaste-fase- techniek. Dit type proef wordt gewoonlijk toegepast indien de te bepalen ligande een multiralent geheel is, zoals een antilichaam.

Bij de indirecte raste-fasetechniek omvat het reagens (l) een gemerkt bindingsmiddel in de rorm ran een bindingspartner (b.r. een antilichaam LO tegen een antilichaam) roor de aan te tonen ligande (b.r. een anti- lichaam) chemisch rerbonden met de merkccmponent, en (2) een raste-fasebindingsmiddel (b.r. een antigeen orereenkamend met het betreffende antilichaam dat gebonden is aan een raste-fasestructuur).

Het proefmonster wordt hierbij eerst geincubeerd met het vaste-fase-15 bindingsmiddel waarbij de ligande uit het monster wordt gebonden aan het raste-fasebindingsmiddel, waardoor een raste-faseligande-bindings-middelccraplex ontstaat. Dergelijke complexen worden dan rerrolgens geincubeerd. met het gemerkte bindingsmiddel waarbij gemerkte raste-fasecomplexen (het gebonden deel) ontstaan, die fysisch worden ge-20 scheiden ran de rest ran het gemerkte bindingsmiddel (rrij) in de rbeistoffase. De hoereelheid merkmiddel rerbonden met de raste-fase (gebonden deel) is een directe functie ran de hoereelheid ligande -in- het monster.·; ·. .·

Pogingen zijn ondernomen cm gecombineerde heterogene specifieke 15 bindingsproeren te ontwikkelen, waarbij een aantal liganden simul taan in een enkel monster kunnen worden bepaald. Dergelijke gecombineerde proeven sparen tijd en kosten vergeleken met afzonderlijke proeven, en vereisen minder monster roor de bepalingen, hetgeen bij lichaamsvloeistoffen als serum belangrijk kan zijn. Gecombineerde 50 proeven zijn bijzonder gunstig indien het screening-proeven betreft.

Sen voorbeeld is de diagnose van de immuniteit van vrouwen tegen virussen en andere antigenen, die verantwoordelijk zijn voor congenitale misvormingen, zoals Rubella, Cytomegalovirus, Herpes Simplex virus en parasitaire toxoplasma. Bij een gecombineerde proef kan de 55 immuniteit van de patiënt tegen twee of meer van deze antigenen, 7907939 v % “* aangegeveh door de aanwezigheid van antilichamen. tegen dit soort antigenen. in het serum van de patient, in een enkele proef onder toepassing van een enkel serum monster worden bepaald. Dergelijke ccmbinatieproeven kunnen worden toegepast hij een groots opgezette 5 immunologische screening van vrouwen, b.v. in de eerste stadia van zwangerschap of in een. later stadium van de zwangerschap of zelfs hij een onderzoek van zowel moeder als kind na de geboorte. Dergelijke immunodiagnostische proeven zijn tot dusver afzonderlijk uitgevoerd wat betreft elk van de bovengenoemde antigenen, waarbij 10 elke proef een afzonderlijk serummonster kostte.

Diverse immunodiagnostische proeven zijn beschreven voor de afzonderlijke aantoning en de serologische bepaling van Rubella virus specifieke antilichamen en Cytomegalovirus (hieronder CMV) specifieke antilichamen, met inbegrip van de radioimmunoproef en 15 enzym-immunoproef (EIA). Voller en Bidwell (Br. J. Exp. Path.

56, 338 (1975) en jTT, 2h3 (1916.)) gebruikteneen enzymgebonden immunosorbensproefprocedure voor de afzonderlijke bepaling van antilichamen tegen. Rubella en CMV'. Volgens deze werkwijze werden poly-styreenmicroplaatjes, bekleed met Rubella-antigeen met menselijk 20 serum met Rubella-antilichaam geïncubeerd, gevolgd door incubatie met anti-(menselijk globuline) gemerkt met een alkalische fosfatase. De activiteit van het gebonden enzym werd colorimetrisch gemeten...

.w' Amerikaans octrooiachrift"ü';01^.6^3 beschrijft de 'bepaling van Rubella-antilichamen door de vorming op een microtiterplaat, 25 bekleed met Rubella-antigeen, van een z.g. sandwich bestaande uit de volgende opeenvolgende lagen: (vast viraalantigeen)-antilichaam-(viraal antigeen-enzym).

Kirsti beschrijft in J. Clin. MicrobiolΛ, 117 (1976) een indirecte vaste-fase RIA-procedure voor het aantonen van tegen 30 Rubellavirus specifieke antilichamen (igG en IgM) in menselijk serum. Gezuiverd Rubella-virus werd geadsorbeerd op polystyreen-korrels en de antilichamen die aan. dit virus na incubatie met het serum werden gebonden, werden aangetoond door vervolgens binden van met 125 J-gemerkt anti-(menselijk IgM) of anti-(menselijk IgG). 35 Ook Forghani (J.Clin. Microbiol, k, 1+70 (1976) gebruikte vastgelegde i 790 7 9 39 m * * 5 met virus geïnfecteerdecellen als een "bron van antigeen voor het hinden van de antilichamen in de onderzochte sera, terwijl 125 J-geiten-anti-(humaan IgG) werd gebruikt voor het aantonen van de specifieke antilichamen (met inbegrip van Rubella-antilichaam) dat zich aan het 5 antigeen hechtte. Overeenkomstige indirecte vaste-fase RIA-proeven op CMV-antilichamen zijn onlangs beschreven door Forghani (infect, and Immunity ik, ll8k (1976) en Knez (J. Immunol. UT, 2006 (1976) waarbij de eerste met CMV geïnfecteerde cellen als antigeenbron gebruikte en de ander viraal oplosbaar antigeen, gefixeerd op micro-10 titerplaten. In beide gevallen werd 125 <I-anti.-(humaan globuline) gebruikt voor het aantonen van de gevormde antigeen-antilichaamccmplexen.

In al deze bovenbeschreven proeven is een afzonderlijk proef-specimen en een afzonderlijke procedure nodig voor het aantonen van elk antilichaam. Sen gecombineerde specifieke bindingsproef voor het 15 simultaan aantonen of bepalen van meer dan een antilichaam in een enkel monster is tot dusver niet eerder beschreven. Wel zijn bepaalde pogingen vermeld voor het ontwikkelen van gecombineerde heterogene specifieke bindingsproeven in het algemeen.

De Amerikaanse octrooischriften 3.720.760 en 3*952.091 be-20 schrijven simultane multipele radioimmunoproeven voor een kwalitatieve indicatie omtrent de aanwezigheid van een of meer specifieke groepen antigenen. Deze proeven zijn echter eenvoudige ja-nee-proeven die een antigeen.niet van het-andere kunnen'onderscheiden en al helemaal.· geen kwantitatieve resultaten opleveren. Indien de proef positief 25 is moet een afzonderlijke proef worden uitgevoerd cm te bepalen welk specifiek antigeen of welke specifieke antigenen werkelijk aanwezig zijn (zie US.patent 3.720.760, kolom k, regels 56-6b en 3*952.091, kolom, regels k$-53).

Gecombineerde specifieke bindingsproeven voor verwante haptenen 30 ondertoepassing van een verschillend merk voor elk hapteen zijn weer gegeven in Amerikaans octrooischrift 3.928.553 en Acta Endocrinol. 81, U87-^-9^- (1976) voor de thyroid-hormonen T-3 en T-k en in Offenlegungs-schrift 2.803.15^ voor vitamine B-12 en folaat. Een ander type merk, t.w. 125 J en 131 <J5 wordt daarbij gebruikt voor elk te bepalen hap-35 teen. Dergelijke proeven hebben dus het uitgesproken nadeel dat 790 7 9 39 -6-..

afzonderlijke of ingewikkelder instrumentatie moet worden gebruikt voor het meten van de diverse verschillende merken. 'Een duidelijk meer gewenste gecombineerde proef zou echter gebruik maken van het zelfde merk voor alle te bepalen liganden. ïïabermann beschrijft in 5 J. Clin. Chem. Clin. Biochem. ik, 1*9^-601 (1976) een gecombineerde HIA-procedure voor T-3 en T-fc onder toepassing van hetzelfde merk (125 J), maar hierbij is een zeer gecompliceerde volgorde aan scheidingstrappen nodig om kolamchrcmatografisch gemerkt T-3 van gemerkt T-4 tegen het einde van de proef te isoleren. Een meer ge-10 wenste gecombineerde proef moet liefst niet meer dan de gebruikelijke scheidingstrappen omvatten ter isolatie van elk gemerkt species van de anderen.

Er werd nu een gecombineerde heterogene specifieke bindings-proef gevonden, onder toepassing van hetzelfde merk. voor alle te 15 bepalen, liganden, die simultaan bij een enkel proefmonster mogelijk is onder toepassing van vaste-fase-bindingsmiddelen corresponderend met elke ligande, die differentieel kunnen worden gescheiden. Zo wordt tegen het einde van de proefreactie elke respectievelijke vaste-fase gescheiden van de anderen (en van de in de vloeistoffase over-20 gebleven gemerkte, bindingsmiddelen) waarbij het in elk afzonderlijk geval gemeten merk. een functie vormt van de aanwezigheid of hoeveelheid van de respectievelijke ligande in het proefmonster.

'· · . /Zo betreft de -uitvinding in zijn.breedste vorm een specifieke bindingsproefmethode voor de simultane bepaling van elk van een 25 reeks verschillende liganden in een vloeibaar proefmonster, waarbij: (a) het monster wordt gecombineerd met reagentia voor elke verschillende te bepalen ligande, waarbij elk reagens (l) een gemerkt bindingsmiddel en een vaste-fase-bindingsmiddel omvat, het merk hetzelfde is voor al deze gemerkte bindingsmiddelen 30 in de met het monster gecombineerde diverse reagentia, en het vaste-fase-bindingsmiddel voor elke verschillende te bepalen ligande differentieel kan worden gescheiden van de andere vaste-fase-bindingsmiddelen voor de andere te bepalen liganden, en (2) met de corresponderende te bepalen ligande een bindingsreaetie-35 systeem vormt met een vaste-fase-gebonden deel en een vrij deel 790 7 9 39 > * m

- T

van het betreffende gemerkte bindingsmiddel, "waarbij de hoeveelheid van dit merk in elk resulterend vaste-fase gebonden deel een functie is van de aanwezigheid of de hoeveelheid van het corresponderende ligande in het monster; men 5 (b) elk resulterend vaste-fase gebonden deel van de overige vaste- fase gebonden delen en van de vrije delen scheidt; en (c) de hoeveelheid merk in elk aldus afgescheiden, vaste-fase gebonden deel meet.

Het gemerkte bindingsmiddel heeft bij voorkeur de vorm van een 10 gemerkte b indingspartner tegen al de te bepalen liganden, zodat het gelijkelijk met al dit soort liganden een binding aangaat. Gebruikt men dergelijke voorkeurs-gemerkte bindingsmiddelen, dahr. zullen de door het binden van de diverse liganden aan hun respectieve vaste-fasebindingsmiddelen gevormde complexen ononderscheiden worden ge-15 merkt door binding van het gemerkte bindingsmiddel. Dit wordt als volgt illustratief weergegeven, waarbij L·^, de diverse verschillende te bepalen liganden zijn en. /B1, /Bg, .,../B de overeenkomstige, vaste-fase-bmdingsmiddelen zijn en BA het gemerkte bindingsmiddel dat in staat is alle liganden t/m L te binden: 20 Ccsrolexvormende reacties Merkreacties L1 + /B1 -5?/B1-L1--» +BAS -} /B-j-L-j-BA* L2 + /32 -> /32-L2 -* +BAH -> /Β2-Β2-ΒΑ* *·· ··· .·· ·· '·· 25 Aldus wordt volgens de voorkeursaethode niet alleen een ge combineerde proef mogelijk onder toepassing van een enkel type merk {aangeduid door het sterretje in het bovenweergegeven tabelletje) wordt s maar tevens een enkel type gemerkt bindingsmiddei/gebruikt (BA ) onverschillig het aantal verschillende te bepalen liganden.

30 Deze techniek is in het bijzonder toepasbaar op de simultane bepaling van elk van een aantal verschillende antilichamen in een enkel monster via de indirecte vaste-fase-techniek die hierboven is beschreven. Met verschillende antilichamen worden antilichamen gemeend tegen verschillende antigenen (p.v. antilichamen tegen CMV -35 antigeen en antilichamen tegen Huoella-antigeen). Dergelijke voor- 790 79 39 1 8 keurs-geccmbineerde indirecte vaste-fase-antiHchaamproeftechnieken omvatten de volgende trappen: (a) combinatie van het monster met een reeks verschillende scheidbare vaste-fasedragers elk geassocieerd met een specifiek antigeen 5 voor een verschillend te bepalen antilichaam, waarbij elk ver schillend antilichaam in het monster met de corresponderende scheidbare vaste-fasedrager wordt verbonden via een binding aan het specifieke antigeen op deze drager, waardoor een vaste-fase-drager-gebonden antilichaamcamplex ontstaat; 10 (b) combinatie van de resulterende vaste-fase-drager-gebonden anti- lichaamccmplexen met een antilichaam. met een merk. dat in staat is met elk van het, aantal verschillende te bepalen antilichamen te· binden, waarbij de vaste-fase-drager-gebonden antilichaam— complexen door het gemerkte antilichaam worden gebonden; 15 (c) afscheiding van elk van de differentieel scheidbare vaste-fase— dragers van de andere dragers en van alle gemerkte antilichamen dat niet aan een van deze dragers is...gebonden; alsmede (d) meting van de respectievelijke hoeveelheid van elk merk, geassocieerd met elk. van de geïsoleerde vaste-fase-dragers.

20 De uitvinding betreft tevens proefreagentia voor de. simultane bepaling van elk van een reeks verschillende liganden in een enkel vloeibaar proefmonster met inbegrip van reagentia voor elke verschillende te bepalen ligande, waarbij elk. reagens' (l) een gemerkt bindingsmiddel omvat en een vaste-fase-bindingsmiddel, waarbij het 25 merk hetzelfde is voor al deze gemerkte bindingsmiddelen in de diverse reagentia en heb vaste-f ase-bindingsmiddel . voor elke verschillende te bepalen ligande differentieel scheidbaar is van de overige vaste-fase-bindingsmiddelen. voor de andere te bepalen liganden, en (2) met zijn corresponderende te bepalen ligande een bindingsreactie-30 systeem vormt met een vaste-fase-gebonden deel en een vrij deel van het respectievelijke gemerkte bindingsmiddel, waarbij de hoeveelheid van het merk in elk resulterend vaste-fase-gebonden deel een functie is van de aanwezigheid of de hoeveelheid van het corresponderende ligande in het proefmonster.

35 Diverse technieken zullen duidelijk zijn voor het aantonen van 790 7 9 39 9 verschillende scheidbare vaste-fase-bindingsmiddelen volgens de uitvinding. Biv. kan een vaste-fase-bindingsmiddel een enkelvoudige vaste-fase-drager omvatten met een bindingsmiddel daarop gehecht.. Dergelijke vaste-fasedragers, die geschikt zijn voor gebruik bij de 5 uitvinding moeten nagenoeg vast zijn en een passende voim hebben, b.v. bolletjes, buisjes, staafjes of stroken. De dragerlichamen moeten zijn vervaardigd van materiaal, dat kan vorden bekleed met het bindingsmiddel dat overeenkomt met de te analyseren liganden, -waarbij het bekleden kan -worden uitgevoerd overeenkomstig elke voor dit 10 doel bekende covalente of niet-covalente methode.. Voorkeursdragers volgens de uitvinding zijn polystyreenbuizen, balletjes of stroken; deze bolletjes of stroken moeten bij voorkeur zodanig van grootte zijn, dat ze in gebruikelijke reageerbuizen voor immunoproeven (b.v. met een lengte van 75 mm en een diameter van 12 mm), passen.

15 De drager lichamen moeten van elkaar kunnen, vorden onderscheiden, cm het specifieke bindingsmiddel gehecht op elke drager te kunnen identificeren. Dit kan vorden bereikt door dragers toe te passen die van elkaar verschillen in vorm, grootte en/of kleur.

Volgens een voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding 20 fungeert de houder, b.v. een reageerbuis, vaarin het monster vordt geïncubeerd, als een van de dragerlichamen, bekleed met een bindingsmiddel. Zo is overeenkomstig deze voorkeursuitvoeringsvorm het . binnencppervlak van de houder of dat deel daarvan, dat met het monster in contact komt, op bekende vijze bekleed met een van de 25 bindingsmiddeien, dat specifiek is voor de te analyseren liganden.

In een dergelijk geval, vaarbij de methode geschikt is gemaakt voor een simultane bepaling van slechts tvee liganden, kan het tweede bindingsmiddel, specifiek voor de tweede ligande, op een polystyreenbolletje vorden „bekleed, dat vervolgens in de houder wordt 30 gebracht, vaarbij dit bolletje geen verdere identificatie- eigenschappen behoeft te bezitten. Om verdere liganden aan de proef toe te voegen kan men verdere onderscheidbare dragers voor eventuele verdere bindingsmiddeien tóepassen. Dergelijke verdere dragers kunnen een andere vorm, grootte of kleur hebben en moeten een grootte 35 hebben, zodanig dat ze het volume binnen de reageerbuis, dat in f 79079 39 r : contact staat met het vloeibare reactiemengsel, kunnen innemen.

Bij de laatste trap van de onderhavige werkwijze worden de dragerlichamen, waaraan de gemerkte complexen zijn. gehecht, van elkander gescheiden en een fysische of chemische eigenschap, b.v.

5 radioactiviteit of een enzymatische activiteit, van het merk aan elk van de dragerlichamen afzonderlijk gemeten volgens een voor dit soort metingen gebruikelijke en bekende methode. De aldus verkregen cijfers kunnen worden vergeleken met corresponderende cijfers, verkregen door bekende positieve en negatieve controlemonsters met (po-10 sitieve) of zonder (negatieve) specifieke te analyseren liganden, een identieke proefprocedure te doen ondergaan. De verhouding van de merkmeting voor. het analysemonster met het controlemonster kan dienen als een maat voor de hoeveelheid van de specifieke ligande in. het te analyseren monster.

15 De onderhavige methode kan worden toegepast voor het aantonen van elke ligande waarvoor een specifieke bindingspartner bestaat.

De ligande is gewoonlijk een. peptide, eiwit, koolhydraat, glyco-proteïne, steroxde of een ander organisch molecuul, waarvoor een specifieke bindingspartner in biologische systemen bestaat of kan 20 worden gemaakt. De ligande wordt in functionele temen gewoonlijk geselecteerd uit de groep van de antigenen en antilichamen, haptenen en antilichamen daarvoor,, hormonen, vitaminen, metabolieten en farmacologische middelen,.alsmede hun receptoren en bindende stoffen. Voorbeelden van liganden zijn immunologisch actieve polypeptiden 25 en eiwitten met molecuulgewichten tussen 1000 en i*.000.000, zoals antilichamen en antigene polypeptiden en eiwitten, alsmede haptenen met molecuulgewichten tussen 100 en 1500. Representatief voor zulke antigene polypeptiden zijn angiotensine I en II, C-peptide, oxytocine, vasopressine, neurofysine, gastrine, secretine, en glucagon. Re-30 presentatief voor antigene eiwitten zijn insuline, chorio-gonado- tropine (ïïCG), carcino-embryo-antigeen (CEA), myoglobine, hemoglobine, follikel stimulerend hormoon, menselijk groeihormoon, thyroide stimulerend hormoon (TSH), menselijk placentaal lactogeen, thyroxine bindend globuline (TBG), intrinsieke factor, transcobalamine, enzymen 35 als alkalische fosfatase en melkzuurdehydrogenase, alsmede hepatitis- 790 7 9 39 1 geassocieerde antigenen, zoals heptatis B-oppervlakantigeen (HBgAg)s heptatitis 3 e antigeen (HBeAg) en hepatitis B kemantigeen (HB Ag). Representatief voor antilichaamliganden zijn die antilichamen van de SgG, IgS, IgM en IgA-klassen, die specifiek zijn jegens de antigenen 5 of haptenen die hierin zijn beschreven. Voorbeelden van de hapteenli- ganden zijn thyroxine, liothyronine, de oestrogenen, zoals oestriol, prostaglandinen, vitaminen als biotine, vitamine B12> folzuur, vitamine E, vitamine A en ascorbinezuur, alsmede geneesmiddelen. De uitvinding is bijzonder geschikt voor de bepaling van antilichamen 10 jegens virusantigenen, zoals Rubella en CMV.

Elk van de tot dusver bekende en nog te ontdekken merken kunnen bij de specifieke bindingsproeven volgens de uitvinding worden gebruikt. Voorkeursmerken zijn de thans reeds bekende radioactieve isotopen, zoals 125 «I, en enzymen, zoals fosfatasen. Alle andere 15 parameters van de proefmethode liggen binnen de gebruikelijke kennis van de deskundigen. In het bijzonder wat betreft de toelaatbare en voorkeursmonstervolumina en verdunningen, de incubatietijden en temperaturen, de methoden voor het hechten van de diverse hardingsmiddelen op de vaste-fasedragers hetzij door covalente of non-covalente 20 binding, de methoden en de instrumenten voor het meten van het merk en de technieken voor het vergelijken van proefresultaten met stan-daardcijfers.

Het reagens of proefbiiddel volgens de uitvinding omvat alle essentiële chemische elementen nodig voor het uitvoeren van de ge-25 wenste analysemethode. Het proefmiddel is liefst aanwezig in een gebruikelijke pakketvozm, als een preparaat of mengsel indien de _____ verenigbaarheden van het reagens dit toelaten, in een proef uitrusting zoals een proefgeheel, d.w.z. een verpakte combinatie van houders met de benodigde reagentia. In zijn ruimste aspect omvat 30 het proefmiddel reagentia voor elke verschillende te analyseren ligande, waarbij elk reagens (l) een gemerkt bindingsmiddel en een differentieel afscheidbare vaste-fasebindingsmiddel als hierboven cmvat en (2) met zijn corresponderende te analyseren ligande een bindingsreactiesysteem aangaat tot een in de vaste-fase gebonden 35 deel en een vrij deel ais hierboven beschreven. Indien overeenkomstig 790 7 9 39 '· - 12 een voorkeursuitvoeringsvorm b.v. de gecombineerde, indirecte vaste-fasetechniek, bet gemerkte bindingsmiddel de vorm beeft van een gemerkte bindingspartner jegens alle te analyseren liganden, kan kennelijk met een gemerkt bindingsmiddel voor alle respectievelijke 5 reagentia worden volstaan. Zo omvat in een dergelijk geval bet reagens een enkel gemerkt bindingsmiddel en differentieel scheidbare vaste-fasebindingsmiddelen voor elk van de te bepalen liganden. latuurlijk kan in alle uitvoeringsvormen het reagens andere reagentia omvatten, die overigens als zodanig bekend zijn, en die gewenst 10 kunnen zijn van een commercieel of verbruikersstandpunt, zoals buffers, verdunningsmiddelen, standaarden enz.

Als beschreven in de onderstaande voorbeelden omvat een bijzonder gunstige immunoproefuitrusting voor een simultane bepaling van elk van een. reeks verschillende, antilichamen in een enkel 15 monster van een vloeistofmedium een verpakte combinatie van (l) een reeks van elkaar scheidbare vaste-fasedragers elk met daarop een antigeen dat specifiek is voor een ander te bepalen' antilichaam alsmede. (2) een houder van een antilictiaam verwerkt met een merk en in staat tot het binden van een van ^e 20 te bepalen antilichamen.

De volgende voorbeelden lichten de uitvinding nader toe.

Tabel omtrent de inhoud van de voorbeelden Voorbeeld I Bereiding van oplosbaar CMV-antigeen.

25 II Bereiding van oplosbaar Rubella-antigeen.

III Bereiding van vaste-fase (beklede buis) CMV antigeen.

IV Bereiding van vaste-fase (bekleed bolletje) Rubella antigeen.

V Bereiding van radio gemerkt (125 J) konijnen anti-humaan IgG.

30 VI Bepaling van CMV en Rubella-antilichaamtiters door scheidingsradioimmunoproeven.

VII Gecombineerde radioimmunoproef op CMV en Rubella-antili-chamen.

VIII Bepaling van CMV en Rubella-antilichaamtiters door schei- 35 dings-enzymimmunoproeven.

790 7 9 39 13

IX gecombineerde enzym inmunoprcef op CM7 en Rubella-antilichamen. Voorbeeld I

Bereiding van oplosbaar CMV antigeen.

Humane primaire embryo-fibroblasten werden gekweekt als mono-5 lagen in roiflessen met daarin het minimaal essentiële medium en 10$ foetaal kalf serum (Grand Island Biological Company, Hew York). De cellen werden geïnfecteerd met de CMV AD-169 stam van het ATCC en wel zodanig, dat een plak vormende eenheid (pfu) per cel optrad. Nadat dit cytopathiseh effect volledig waarneembaar was, werd elke fles uitge-10 wassen met een met fosfaat gebufferde fysiologische zoutoplossing met daarin 0,3$ natriunchloride, 0,02$ kalium chloride, 0,115$ di-natriumfosfaat en 0,02$ kaliumdiwaterstoffosfaat. Hierna werden de cellen van het glas geschrapt met glaskorreltjes, gevolgd door een pelletvorming door te centrifugeren bij 300 g gedurende 10 minuten.

15 De bovenstaande vloeistof werd verwijderd en het neergeslagen pellet

O

van de cellen her suspendeer d in 10 car glycinebuffer. met 0,85$ natrium-chloride en 0,05 M glycine; waarbij de pH op 9»0 was gebracht met natriumhydroxide. De suspensie van de cellen werd 2 minuten ultrasoon behandeld en een nacht bij k°C bewaard. De suspensie werd geklaard 20 door 30 minuten bij 7700 g te centrifugeren, waarbij het oplosbare antigeen in de bovenstaande vloeistof achterbleef. Bit oplosbare antigeen werd bij -70°C bewaard.

Voorbeeld II

Bereiding van oplosbaar Hubelia-antigeen.

25 Nieren-21-C13 cellen van jonge hamsters (Flow Laboratories,

Schotland) werden gekweekt in roiflessen met daarin Bulbeco’s gemodificeerd essentieel medium (BMEM) en 10$ foetaal kalf serum. (Grand Island 3iological Co.) en geïnfecteerd met de Rubella-virus M-33 stam van het ATCC. Na hS uren na de infectie werden de flessen dagelijks 30 gedurende een week uitgespceld. Ce Is tukken werden verwijderd door langzaam te centrifugeren. Het virus antigeen werd gepelleteerd door centrifugeren bij 5C.OOC g gedurende 1 uur door een zone van 20 gew.$ saccharose in TNE-buffer (met 20 mmol tris(hydroxymethyl)amincmethaan, ICO nmci natriumchlcride en 1 mmcl ethyleendiaminetetraasijnzuur; 35 pH 7,t). De aldus gevormde pellets werden hersuspendeerd in TNE-buffer 790 79 39

Ik en de suspensie ultrasoon behandeld tot hij helder was. De hersuspen-deerde pellets werden verder gezuiverd in een 20-60$'s saccharose-gradiënt in TEE-buffer door 2 uren bij 38000 tpa te centrifugeren.

De verkregen virusband werd opgencmen en H uren bij ^°C gedialyseerd 5 tegen een met glycine gebufferde zoutoplossing met pH 9 (zie voor beeld I). Vervolgens werd glycerol toegevoegd tot een uiteindelijke concentratie van 3%· Deze Rubella-antigeenoplossing werd bevroren bewaard, bij -70°C.

Voorbeeld III

10 Bereiding, van vaste-fase (beklede buis) CMV-antigeen.

De volgens voorbeeld I verkregen CMV oplosbare antigeenoplos-sing werd met glycinebuffer (zie voorbeeld i) verdund tot een concentratie van 100-150 mg/1 eiwit en een complementbindingstiter van 3 lA-l/8. Porties van 0,2 cm van deze oplossing werden nauwkeurig 15 en zorgvuldig gepipetteerd op de bodem van afzonderlijke 12 x 75 mm polystyreen reageerbuizen, (ültraplast, Tel-Aviv, Israel) en de reageerbuizen 16 uren bij h°C geincubeerd. Ea deze incubatie werd de overgebleven vloeistof in de reageerbuizen verwijtlerd, de reageerbuizen gedroogd in een luchtstroom, met parafilm afgesloten (American Can 20 Company) en bij U°C bewaard.

Voorbeeld IV

Bereiding van vaste-fase (beklede korrel) Rubella-antigeen.

De optimale verdunning van Bubella-antigeen voor het bekleden van polystyreehkorrels werd bepaald door een bekleding van poly- 25 styreen reageerbuizen van het type volgens voorbeeld III met een reeks Rubella-antigeenverdunningen van 1:8 tot 1:8000 onder toe-3 passing van 0,2 cm van de verdunde anti geenoplossing voor elke 3 reageerbuis. Elke reageerbuis werd vervolgens geincubeerd met 0,2 cm serum met daarin Rubella-antilichaam verdund op 1:100 in PBS met 30 daarin 1% runderserumalbumine (BSA). Vervolgens werd met 125 J- gemerkt anti-humaan IgG (zie voorbeeld V) aan. elke reageerbuis toegevoegd en daarin geincubeerd. Ea afscheiding van de vloeistof en wassen werd de radioactiviteit overgebleven in elke reageerbuis gemeten.

Op deze wijze werd gevonden dat voor het verkrijgen van de hoogste 35 bindingscapaciteit voor Rubella-antilichaam de reageerbuizen moeten 790 7 9 39 15 worden "bekleed met een Rubella-anti geenoplos sing in een verdunning van ca 1:150 tot 1:300 in glycinebuffer.

Polystyreenkorrels van 0,6 mm. diameter (Precision Plastic Ball Co., Chicago) werden met PBS gewassen en aan de lucht gedroogd cro 5 filtreer papier. De korrels werden in een bekerglas gebracht en een oplossing van Bubella-antigeen, verdund op 1:200 met glycinebuffer, toegevoegd tot alle holletjes waren bedekt. Het bekerglas met zijn inhoud. liet men l6 uren bij U°C staan, waarna de vloeistof werd af geschonken en de bolletjes overgebracht op een strook filtreer-10 papier en aan de lucht gedroogd. De met Rubella-aatigeen beklede bolletjes werden opgeslagen in afgesloten houders bij U°C.

Desgewenst kunnen de met Hubella-antigeen beklede bolletjes met methanol worden behandeld cm het virus te inactiveren zander dat de virus-antigeeneigenschappen worden gewijzigd.

15 Voorbeeld 7

Bereiding van radio gemerkt (125 1) konijnenanti-humaan IgG.

De IgG-fractie van konijnen anti-bumaan IgG serum werd verkregen door het serum te leiden door een DEAS-cellulosekolcm (DE-52 van %atmam Ltd. ), geëquilibreerd met 0,015 M kaliumfosfaatbuffer met 20 pH 3,0. De IgG-fractie die aldus werd verkregen was radioactief gemerkt met 125 J door jodering volgens de chloramine T-methode van Hutchinson en Zeigler, zie Applied Microbiology, december 197½, bis. 935-9*2.

Voorbeeld 71 25 3epaling van CMV en Hubella-antilichaamtiters door een scheidings-radi oiamunoproef.

3ij dit voorbeeld evenals bij de volgende voorbeelden werden vier representatieve menselijke sera gebruikt voor een analyse op CMV en Hubella-antilichamen. Deze vier sera, die worden aangeuid 30 als A-B verschilden van elkaar behalve wat betreft titers aan CMV en Hubella-antilichamen ais volgt:

•mf J

790 7 9 39 16

Titer aan antllichamen tegen

SernTtim onster_CMV_Rubella_ A hoog medium B medium hoog 5 C erg laag medium D medium laag

De titers aan CMV en Rubella-antilichamen werden tevoren bepaald in gescheiden voorproeven onder toepassing van de indirecte vaste-fase RIA-procedure die hieronder is beschreven,, waarbij elk 10 antigeen als bovenbeschreven op de binnenwand van polystyreen reageerbuizen was bekleed. De procedure was. als volgt: 1. Het onbekende monster of de controle (negatief) werd. 100-voudig verdund, in EBS met l! BSA.

2. 200 ƒ11 van het verdunde serummonster werd nauwkeurig en zorgvuldig 15 gepipetteerd op de bodem van een reageerbuis bekleed met het respectievelijke antigeen (CMV-antigeen of Rubella-antigeen).

3. De reageerbuis werd 2 uren bij 2T°C in een waterbad geïncubeerd (bij CMV-antigeen bleek 1 uur incuberen voldoende).

h. Na de incubatie werd de vloeistof in de reageerbuis verwijderd 20 door wegzuigen en de reageerbuis tweemaal gewassen, met ca. h crn^ PBS.

5· 200 ul van een oplossing van 125 J-antihumaan IgG (verdund met r PBS met daarin 1% PSA tot een specifieke radioactiviteit van ca. i+00-1000 tellingen per minuut (cpm)/ul) werden nauwkeurig 25 en zorgvuldig gepipetteerd op de bodem van de beklede reageerbuis.

6. De reageerbuis werd 1 uur bij 3T°C in een waterbad geïncubeerd.

T· De vloeistof in de reageerbuis werd weggezogen en de reageerbuis tweemaal gewassen met ca. 1+ cm PBS.

8. De in de reageerbuis overgebleven radioactiviteit (het gebonden 30 deel) werd gemeten met een gammateller.

Het relatieve antilichaamgehalte van elk serummonster wat betreft CMV en Rubella-antilichamen werd berekend uit de verhouding cum semmmonster_ cpm negatief controleserum.

35 De aldus verkregen verhoudingen zijn opgevoerd in tabel A.

790 7 9 39

IT

Tabel A

Serummmonster CMV anti li chaamverh. Rube Ua-ant ili chaamverh.

(m) (RIA) (serum 1:100 verdund) (serum 1:100 verdund) 5 A 6,03 2,5 B 2,86 U,25 C 1,03 2,5 D 2,23 1,2

Be 100-voudige verdunning van de serummonsters bij trap 1 was 10 enigszins arbitrair en bepaald als een resultaat van titratiekrammen verkregen bij twee reeksen proeven op CMV-antilichaam en Rubella-antilicnaam cm in elk. van beide gevallen de z.g. eindpunttitratie te bepalen, hetgeen, de hoogste verdunning is, waarbij de cpm-verhouding tussen onbekend monster en controlemonster hoger is dan 2.

15 Bij de aanbevolen 100-voudige verdunning moeten serummonsters met verhoudingen tot 1,5 als negatief worden beschouwd wat betreft het specifieke aatilichaam; monsters met verhoudingen boven 2,0 moeten als positief wat betreft het antilichaam worden beschouwd, terwijl verhoudingen tussen 1,5 en 2,0 moeten warden beschouwd als twijfel-20 achtig, zodat de proef meet worden herhaald met een lagere verdunning van het monster.

Voorbeeld 711

Gecombineerde radioimaunoproef op CMV en Rubella-antilichamen.

Simultane bepaling van de titers van CMV-antilichaam en Subella-25 antilichaam in de bovenbeschreven serummonsters A-D, werd uitgeveerd volgens de trappen ^-_jvan voorbeeld VI, met dit verschil, dat reageerbuizen bekleed met CMV oplosbaar antigeen en met een poly-styr eenkorrel bekleed met Rubella-antigeen (als beschreven in voorbeeld IT) bij elke proef werden gebruikt. Na trap 7 van voorbeeld 71 30 werd de polystyreenkorrel bekleed met Hubella-antigeen uit de reageerbuis verwijderd en overgebracht in een schone onbehandelde reageerbuis. 2e radioactiviteit behouden door de met CMV-antigeen beklede reageerbuis en door de met Hubella-antigeen beklede poly-styreenkorrel werden afzonderlijk bepaald met behulp van eeh 35 gsmma-telier.

790 7 9 39 * Jr « ι» ia

Bij twee parallele reeksen controleproeven werd nauwkeurig dezelfde procedure gevolgd, met dit verschil, dat in een reeks met CMV antigeen "beklede reageerbuizen met daarin een onbeklede poly-styreenkorrel werden gebruikt, terwijl in de volgende reeks onbe-5 klede reageerbuizen met in elk een met Rubella-anti geen beklede polystyreenkorrel werden toegepast.

De resultaten van deze simultane proeven zijn weergegeven in de tabellen B-E. Deze resultaten tonen aan, dat de CMV en Rubella-antilichaamtiters bepaald bij de simultane proeven practisch identiek 10 waren met de. overeenkomstige cijfers verkregen bij de controleproeven, waarbij elk antilichaam afzonderlijk werd bepaald (voorbeeld VI).

790 7 9 39

Tabel B - Serum A

Serum Antigeen bekleed op 125 J-aamrezlg op_ verdunningen buis korrel buis . korrel (cpm) ' (cpm) 19 1:32 - Rubella 1213 1:128 » 2610 1:512 1527 1:2018 718 1:8192 135 1:32 CM7 Rubella 8900 3517 1:128 78ΟΟ 2650 1:512 1700 1760 .

1:2018 1850 951 1:8192 850 511 1:32 CMV - 9181

1:128 7I7I

1:512 I53I j 1:2018 1979 1:3192 912 790 7 9 39

Serum- Antigeen op 125 J-aanvezig op verdunningen ^ ^ (cpm) (cpm)

Tabel C - Serum B

20

1:32 - Rubella 518U

1:128 ^213 1:512 3302 1:20½ 1955 1:8192 900 ______i 1:32 CMV Rubella 3520 bg8j 1:128 2680 Ul83 1:512 ' 1610 3167 1:20½ 902 2329 1:8192 620 921 1:32 CMV - 3613 1:128 2678 1:512 1652 ,

1:20½ 905 I

1:8192 ; 695 I

- ----- --------- ' — - “ " ' 11 790 7 9 39 * ·

Tabel D - Serum C

21 „ | * -- i -----

Serum- Antigeen op_j 125 J-aanvezig op___ verdunningen "_Ïuis korrel ïöïs korrel (cpm) (cpm) 3_;32 - Rubella ^373 1:128 3391 1:512 20hr2 l:20b8 1:8192 61l 1:32 CMV Rubella ll73 1773 1:128 . 1250 3137 1:512 370 2087 1:20½ 635 1320 1:3192 595 632 1:32 CMV - 1573 1:128 13ll 1:512 920 1:2018 706 1:3192 672 7907939

Serum- Antigeen op 125 J-aamrezig. op verdunningen “ t)Uis korrel buis korrel (cpm) (cpm)

Tabel E - Seram D

22 1:32 - Rubella 2309 1:128 1291 1:512 τ68 1:20½ 1:8192 160 U32 CMV Rubella 5176 2571 1:128 2035 1235 1:512 1185 7l2 1:2018 ^01 ^1 1:8192 ^57 328 1:32 CMV - 1795 1:128 2252 1:512 1275 1:2018 569 1:8192 517 I i__ 790 7 9 39 23

Voorbeeld VUI

Bepaling van CMV en Rufaella-antilichaamtiters door een scheidings-enzymimiaunopr oef.

De titers aan CMY en Rubella-antilichamen in de vier serum-5 monsters A - D ("boven beschreven) werden voorbepaald bij gescheiden voorafgaande proeven onder toepassing van polystyreen reageerbuizen bekleed met elk bovenbeschreven antigeen, en wel volgens de volgende indirecte vaste-fase EIA-procedure (het konijnenanti-humaan IgG) gemerkt met alkalische fosfatase (verkregen van Miles-Yeda te 10 Hehovot, Israel): 1. Het onbekende monster of het controle (negatieve) monster werd 100-voudig verdund in BBS met daarin 0,05% Tween 20 (polyethyleen-sorbitanmonolauraat van J.T. Baker te tïew Jersey).

2. 200 ;ul van het verdunde serummonster werd nauwkeurig en zorgvuldig 15 gepipetteerd op de bodem van een reageerbuis bekleed met het antigeen (CMY antigeen of Rubella-antigeen).

3. De reageerbuis werd 2 uren bij 37 °C in een waterbad gexncübeerd (bij CMY-antigeen bleek 1 uur incuberen voldoende).

U. Ha de incubatie werd de vloeistof uit de reageerbuis verwijderd 3 20 door opzuigen en de reageerbuis tweemaal gewassen met ca. k cm BBS met daarin 0,05% Tween 20.

5. 200 ^ul van een oplossing van alkalische fosfatase-anti-fcumaan

IgG) in BES met daarin 0,05$ Tween 20 werd nauwkeurig en zorgvuldig gepipetteerd op de bodem van de beklede reageerbuis.

25 6. De reageerbuis werd een uur bij 37°C in een waterbad gexncübeerd.

7. De vloeistof in de reageerbuis werd weggezogen en de reageer-

O

buis tweemaal gewassen met ca. cm BBS met daarin 0,05%

Tween 20.

8. 1 cm' substraatoplossing (hieronder beschreven) werd aan de 30 reageerbuis toegeveegd.

9· De reageerbuis werd 1 uur bij 37°C gexncübeerd, waarna de enzymatische reactie werd afgebroken door een toevoeging van 30 jal 10 -T natriumhydroxide gevolgd door goed mengen.

10. Be optische dichtheid bij ^00-^35 werd gemeten.

35 Het relatieve antilichaamgehalte van elk monster wat betreft 790 79 39 2k CMV en Rube 11a-antilichamen werd berekend volgens de verhouding O.D. semmm onster_ O.D. negatief controlemonster waarbij O.D. de optische dichtheid is bij U0O-U35 nm).

5 De aldus verkregen cijfers zijn opgevoerd in de volgende tabel:

Serummmster CMV antilichaamverh. Rubella-antilichaamverh.

(EIA) (EIA) (Serum 1:100 verdund) (serum 1:100 verdund) A 25-,2 3,73 10 B 5,1 M3 C 1,5 2,82 D 10,6 1,5

Indien het doel van deze proef uitsluitend bestaat uit een bepaling of een specifiek antilichaam. aan-of afwezig iskan in plaats 15 van het meten van de optische dichtheid in trap 10 een positieve reactie kwalitatief of semi-kwantitatief worden verkregen door het verschijnen.van een gele kleur, die met het blote oog kan worden waargenomen.

De in trap-: 8 gebruikte sub straat oplos sing was een H-nitrofenyl-20 fosfaatoplossing in 10% diëthanolaminebuffer. Een liter van deze oplossing bevat: 1 g It-nitrofenylfosfaat 3 97 cm. diethanolamine 0,2 g natriumazide en 25 1 molair zoutzuur tot pH 9«8.

Als toegelicht aan het eind van voorbeeld VI was de 100-voudige verdunning van de senimmonsters bepaald als resultaat van een afzonderlijke reeks enzym-immunoproeven voor elk. van de specifieke antilichamen, waarbij de eindpunt-titratie (gedefinieerd als de 30 hoogste verdunning waarbij de 6.D.-verhouding tussen onbekend monster en negatief monster hoger is dan 2) voor elk van de antilichamen werd bepaald. Evenals bij de RIA-proeven (voorbeeld VI) konden serummonsters met verhoudingen beneden 1,5 als negatief worden beschouwd, die met verhoudingen boven 2,0 als positief en die met verhoudingen tussen 35 1,5 en 2,0 als twijfelachtig en geschikt voor een herhaalde proef bij 790 7 9 39 25 een lagere verdunning.

Voorbeeld IX

Gecombineerde enzym-immunoproef op CMV en Rubella-antilickamen.

CMV en Rubella-antilichaamtiters werden simultaan bepaald in 5 ell van de bovenbeschreven sera A - D onder toepassing van de in directe vaste fase EIA-techniek. De procedure beschreven in de trappen 1-T van voorbeeld VIII werd gevolgd met dit verschil, dat bij trap 2 een polystyreen reageerbuis bekleed met oplosbaar CMV-antigeen en met daarin een polystyreenkorrel van 6 mm diameter 10 bekleed met Rubella-antigeen (voorbeeld IV) werd gebruikt.

Na trap 7 werd de met Rubella-antigeen beklede korrel uit de met CMV-antigeen beklede reageerbuis verwijderd en overgebracht in een schone reageerbuis. De trappen 8, 9 en 10 van voorbeeld VIII werden vervolgens afzonderlijk uitgevoerd met de met CMV-antigeen 15 beklede reageerbuis enerzijds en met 'een onbebeklede reageerbuis met daarin de met Rubella-antigeen beklede korrel anderzijds.

Twee reeksen controleproeven werden uitgevoerd onder identieke vcorwaarden, een met met CMV-antigeen beklede reageerbuizen met daarin een onbeklede polystyreenkorrel en de ander met Rubella-20 antigeen beklede polystyreenkorrels aangebracht in onbeklede reag eerbui zen.

De resultaten van al deze proeven zijn opgesömd in de tabellen F-J.

790 7939

Serum Antigeen oy__Enzymactiviteit_ ^.verdunningen -01Ι£3 borrel buis (D.D) korrel (O.D.)·

Tabel F - Serum A

2 6 1:32 - Rubella 0.235 1:128 0,250

1?512 0.10T

1:20½ 0.019 1:8192 *— -—- 1:32 CMV Rubella 1.21T 0.261 1:128 0.935 0.255

1:512 0.U87 0.12U

1:20½ 0.120 0.0T2 1:8192 0.035 0.0^9 1:32 CMV 3 1.107 1:128 0.895 1:512 0.591* 1:20½ 0.101 1:8192 0.0U7 790 7 9 39

Serum. Antigeen op Enzymactiviteit verdunningen -buis korrel buis korrel (O.D.) (O.D.)

Tabel G- - Serum B

27 1:32 - Rubella 0.293 1:128 0.283 1:512 O.209 1:20½ 0.007 1:8192 °-015 1:32 i CM7 Rubella 1.095 0.310 1:128 I 0.3½ 0.333 1:512 ! 0.095 0.232 1:20½ ; 0,050 0.085 1.Q1Q2 I 0,OUl 0.039 "_I____ 1:32 CM7 - 1.170 1:128 ’.369 1:512 0.111 1:20½ 0.070 1:3192 0.0½ 790 7 9 39

Tabel Η - Serum C

28

Serum Antigeen op _Enzymactiviteit_ verdunningen korrel buis korrel 1:32 - Rubella 0.353 1:128 0.250 1:512 0.082 1:201+8 0.023 1:8192 0.029 1:32 CMV Rubella 0.053 0.27^ 1:128 0.030 0.221+ 1*512 0.010 0.079 1:201+8 0.015 0.009 1:8192 0.003 0.039 1:32 CMV - O.Oél 1:128 ’ 0.029 1:512 0,015 1:201+8 0.015 1:8192 0.037 790 7 9 39

Serum- Antigeen op_ Enzymactiviteit verdunningen tuis korrel buis (O.D.) korrel (O.D)

Tabel J - Serum D

29 1:32 - Rubella 0,169 1:128 0,12 1:512 0,059

1:20½ 0,03T

1:8192 0,015 1:32 CM7 Rubella 1,58 0,232 1:128 0,95 0,1¾ 1:512 0,33 0,11¾ 1:20½ 0,12 0,053 1:3192 0,09 0,005 1:32 CMV 1,670 1:128 0,929 1:512 0,3¾ 1:20½ 0,119 1:8192 0,133

Uit de bovenweergegeven resultaten volgt,dat de CMV en Rubella antilichaantiters betrouwbaar kwantitatief kunnen worden bepaald en wel simultaan in een enkele proef aangesien de waarden van de optische dichtheden verkregen bij de bovenbeschreven simultane proeven praktisch identiek zijn met de corresponderende cijfers verkregen bij gescheiden controleproeven.

790 7 9 39

Claims

60NCHJSIES:
1. Specifieke bindingsproefmethode voor het simultaan bepalen van elk van een verscheidenheid aan verschillende liganden in een enkel vloeibaar proefmonster, omvattende de trappen: (a) combinatie van dit monster met reagensmiddelen voor elke verschil- 5 lende te bepalen ligande, waarbij elk reagensmiddel (l) een ge merkt bindingsmiddel omvat alsmede een vaste-fasebindingsmiddel, waarbij het merk hetzelfde is voor al dit soort gemerkte bindings-middelen aanwezig in de diverse reagensmiddelen geccmbineeidmet het monster, en het vaste-fasebindingsmiddel voor elke verschillen- 10 de te bepalen ligande differentieel scheidbaar is van de andere vaste-fasebindingsmiddelen voor de andere te bepalen liganden , en (2) met de corresponderende, te bepalen ligande 1 een bindingsreactiesysteeSj^et een vaste-fase gebonden deel ën een ~ vrij deel van het. respectievelijk gemerkte bindingsmiddel, waarbij 15 de hoeveelheid van het merk optredend in elk resulterend vaste- fase gebonden deel een functie is van de aanwezigheid of de hoeveelheid van de corresponderende ligande in het monster; (b) scheiding van elk resulterend vaste-fase gebonden deel van de overige vaste-fase gebonden delen en alle rest van de vrije delen 20 alsmede (c) meting van de hoeveelheid merk in elk aldus afgescheiden vaste-fase gebonden deel.
2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat elk resp. vaste-fase bindingsmiddeleen enkele eenheids-vaste-fasedrager 25 omvat met het bindingsmiddel daaraan geassocieerd.
3. Werkwijze volgens conclusie 2, waarbij een van de vaste-fase-dragers een houder is en een bindingsmiddel op tenminste een deel van de binnenwand daarvan is gebonden. k, Werkwijze volgens conclusie 3» met het kenmerk, dat de rest 30 van de vaste-fasedragers gevormde lichamen zijn met grootten die het mogelijk maken, dat alle in de genoemde houder kunnen worden ondergebracht, en elk van deze gevormde lichamen daarop een resp. bindingsmiddel heeft gebonden. 790 7 9 39
5. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het merk een. radioactieve isotoop is.
6. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het merk een enzym is.
5 J. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de te analyseren liganden "behoren tot de volgende klassen: antigenen of antilichamen daarvoor; haptenen of antilichamen daarvoor; hormonen, vitaminen, geneesmiddelen of receptoren of "bindingsstoffen daarvoor.
8. Specifieke bindingsproefinethode voor het simultaan "bepalen 10 van elk van een reeks verschillende liganden in een enkel vloeibaar menster cmvattendde trappen: (a) combinatie van dit monster met reagensmiddelen voor elke verschillende te "bepalen ligande, -waarbij elk reagensmiddel (l) een gemerkt bindingsmiddel cm vat, dat de te bepalen respectievelij-15 ' e ke ligande kan binden alsmede een vaste-fasebindingsmiddel dat eveneens met een dergelijke respectievelijke ligande kan binden, waarbij het merk hetzelfde is voor al deze gemerkte bindings-middelen aanwezig in de diverse reagensmiddelen die met het monster worden gecombineerd, en het vaste-fasebindingsmiddel voor 20 elke verschillende te bepalen ligande differentieel scheidbaar is van de andere vaste-fasebindingsml ddelen voor de overige te bepalen liganden, en (2) met zijn corresponderende te bepalen ligande een bindingsreactiesysteesn vormt met een vaste fase gebonden deel omvattende het respectievelijke gemerkte 25 bindingsmiddel en het respectievelijke vaste-fasebindingsmiddel beide gebonden aan de corresponderende te bepalen ligande, waarbij dit bindingsreactiesysteem tevens een vrij deel van zijn respectievelijk gemerkt bindingsmiddel bezit, waarbij de hoeveelheid van het merk optredend in elk resulterend vaste-fase ge-30 bonden deel een functie is van de aanwezigheid of de hoeveelheid van de corresponderende ligande in hét monster; (b) scheiding van elk resulterend vaste-fase gebonden deel van de overige vaste-fase gebonden delen en van alle vrije delen; alsmede (c) meting van de hoeveelheid merk in elk afgescheiden vaste-fase 35 gebonden deel. 790 7 9 39 -+ *
9· Werkwijze volgens conclusie 8, waarbij elk resp. vaste-fase-b-indingsmiddel een enkele unitaire vaste-fasedrager omvat, met daarop het bindingsmiddel geassocieerd.
10. Werkwijze volgens conclusie 9s met het kenmerk, dat een van de 5· resp. vaste-fasedragers een houder is en het bindingsmiddel op tenminste een deel van de binnenwand daarvan is aangebracht.
11. Werkwijze volgens conclusie 10, met het kenmerk, dat de rest van de resp. vaste-fasedragers gevormde voortbrengselen zijn met grootten dievhet mogelijk maken alle in de genoemde houder onder te 10 brengen, en elk van deze gevormde lichamen een ander resp. bindingsmiddel daarop gehecht bezit.
12. Werkwijze volgens conclusie 8, met het. kenmerk, dat het merk een radioactieve isotoop is.
13. Werkwijze volgens conclusie. 8, met het kenmerk., dat het merk 15 een enzym is. lU. Werkwijze volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat de te analyseren liganden worden geselecteerd uit de volgende klassen: antigenen of antilichamen daarvoor; haptenen of antilichamen daarvoor; hormonen, vitaminen of geneesmiddelen, danwel receptoren of bindings-20 stoffen daarvoor. 15. üïmmmoproefmethode voor het simultaan bepalen van elk van een reeks verschillende antigenen in een enkel monster van een vloeistoiinedium omvattende de volgende trappen: (a) combinatie van dit monster met een reeks differentieel scheidbare 25 vaste-fasedragers elk met daarop een antigeen specifiek voor een verschillend antilichaam, waarbij elk verschillend antilichaam in het monster wordt gebonden aan zijn corresponderende differentieel afscheidbare vaste-fasedrager via een specifiek antigeen geassocieerd, met deze drager, waardoor een vaste-fasedrager-30 gebonden antiliehaamcamplex ontstaat; (b) combinatie van het resulterende vaste-fasedrager-gebonden anti-lichaamccmplex met een antilichaam voorzien van een merk en in staat tot het binden van een van deze reeks verschillende te analyseren antilichamen, waarbij het vaste-fasedrager-gebonden 35 antilichaamccmplex door het gemerkte antilichaam wordt gebonden; 790 7 9 39 (c) afscheiding van elk van deze differentieel scheidbare Taste- fas e dragers alle andere dragers en Tan alle niet gebonden gemerkte antilichamen; alsmede (d) meting Tan de respectievelijke hoereelheid Tan het merk ge- 5 associeerd met elk Tan deze afgescheiden Taste-fasedragers.
16. Werkwijze Tolgens conclusie 15» waarbij een Tan de vaste-fasedragers een houder is en het specifieke antigeen is gebonden op tenminste een deel Tan de binnenwand daarvan.
17. Werkwijze Tolgens conclusie 16, waarbij de rest Tan de vaste-10 fasedragers gevormde lichamen zijn met greotten die het mogelijk maken ze in de houder onder te brengen en waarbij elk van deze gevormde lichamen is gebonden aan een specifiek antigeen.
18. Werkwijze volgens conclusie 15» met het kenmerk, dat de te bepalen ant-Πτ cbamen verschillende, humane gammaglobuline-antilichamen 15 zijn.
19. Werkwijze volgens conclusie 18, met het kenmerk, dat het gemerkte anti lichaam een gemerkte vorm is van anti-(humaan, gammaglobuline ).
20. Werkwijze volgens conclusie 19» waarbij de te bepalen anti- 20 lichamen menselijke gammaglobuline-antilichamen jegens cytcmegalovirus en rubella zijn.
21. Werkwijze volgens conclusies 15, 19 en 20, waarbij het merk een radioactieve isotoop is.
22. Werkwijze volgens conclusies 15, 19 en 20, waarbij het merk 25 een enzym is.
23. Proefmiddel voor het simultaan bepalen van elk van een reeks verschillende iiganden in een enkel proefmonster omvattende reagens-middelen voor elk verschillende te bepalen ligande, waarbij elk reagensmiddel (l) een gemerkt bindingsmiddel omvat alsmede een vaste- 30 fasebindingsmiddel, waarbij het merk hetzelfde is voor al deze gemerkte bindingsmiddelen in de diverse reagensmiddelen en de vaste-fasebindingsmiddelen voor elke verschillende te bepalen ligande differentieel scheidbaar is van de overige vaste-fasebindingsmiddeien voor de andere te bepalen Iiganden, en (2) &et zijn eorrespon-35 derende te bepalen ligande een bindingsreactiesysteem. vormt met sen 790 7 9 39 3k vaste-fase gebonden deel en een vrij deel van het respectievelijk gemerkte hindingsmiddel, waarbij de hoeveelheid van elk merk optredend in elk resulterend vaste-fase-gebonden deel·· .een functie is van de aanwezigheid of hoeveelheid van de. corresponderende ligande 5 in het proefmonster. 2k. Analysemiddel volgens conclusie 23, waarbij elk vaste-fase-bindingsmiddel een enkele unitaire vaste-fasedrager omvat met. daarop het hindingsmiddel geassocieerd.
25. Analysemiddel volgens conclusie 2h, waarbij een van de vaste- 10 fasedragers een houder is en het hindingsmiddel op tenminste een deel van de. binnenwand, daarvan is gebonden.
26. Analysemiddel, volgens conclusie 25» waarbij de rest van de vaste-fasedragers gevormde lichamen zijn met grootten, die het mogelijk maken ze onder te brengen in de houder, en elk daarvan een 15 respectievelijk hindingsmiddel gebonden bezit.
27. Analysemiddel volgens conclusie 23, waarbij het merk wordt gevormd door een radioactieve isotoop.
28. Analysemiddel volgens conclusie 23, waarbij het merk wordt gevormd door een enzym.
29. Analysemiddel volgens conclusie 23, waarbij de te analyseren liganden worden geselecteerd uit de volgende klassen: antigenen of antilichamen daarvoor; haptenen of antilichamen daarvoor'; hormonen, vitaminen of geneesmiddelen, danwel receptoren of bindingsstoffen daarvoor.
30. Immunoproefanalyseuitrusting voor de simultane bepaling van elk van een reeks verschillende antilichamen in een enkel vloeistof-monster omvattende, in verpakte combinatie: (1) een reeks differentieel scheidbare vaste-fasedragers elk met daarop geassocieerd een. antigeen dat specifiek is voor een 30 ander te bepalen antilichaam; alsmede (2) een houder van een antilichaam verwerkt met een merk en in staat tot het binden van een van een reeks verschillende te bepalen antilichamen.
31· Proefuitrusting volgens conclusie 30, waarbij een van de 35 vaste-fasedragers een houder is en het specifieke antigeen op tenminste 790 7 9 39 jf 4 een deel van de binnenwand daarvan is gebonden.
32. Proefuitrusting volgens conclusie 31, waarbij de rest van de vaste-fasedragers gevormde lichamen zijn met grootten, die het mogelijk maken, ze alle in de houder onder te brengen, en elk van 5 deze gevormde lichamen daarop het betreffende antigeen heeft ge bonden. 3¾. Pr oefui trusting volgens conclusie 30, met het kenmerk, dat de te bepalen antilichamen verschillende humane, gammaglobuline.-antilichamen zijn. 10 3 4. Pr oefui trusting volgens conclusie 33, waarbij het gemerkte antilichaam een gemerkte vorm van anti-(humaan gammaglobuline) is. 35· Prcefuitrusting volgens conclusie 3^, waarbij de te bepalen antilichamen menselijk gammaglobuline-antilichamen jegens cytomegalovirus en rubella zijn.
36. Proefuitrusting volgens conclusies30, 33 en 3^, waarbij het merk een radioactieve isotoop is.
37· Proefui trusting volgens conclusies 30, 33 en 3^, waarbij het merk een enzym is. 790 7 9 39