NL1026678C2

NL1026678C2 - Method for detecting and measuring a ligand.

Info

Publication number: NL1026678C2
Application number: NL1026678A
Authority: NL
Inventors: Rentje Frederik Witkamp; Wouter Henricus Johannes Vaes; Micha Manuele Mueller
Original assignee: Tno
Priority date: 2004-07-19
Filing date: 2004-07-19
Publication date: 2006-01-23
Also published as: WO2006009435A8; WO2006009435A3; WO2006009435A2

Description

Titel: Werkwijze voor het detecteren en meten van een ligand.Title: Method for detecting and measuring a ligand.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor de detectie van binding tussen een ligand en zijn bindingspartner. Meer in het bijzonder heeft de onderhavige uitvinding betrekking op een verbeterd competitief bindingsassay voor het detecteren en meten van een ligand.The invention relates to a method for the detection of binding between a ligand and its binding partner. More specifically, the present invention relates to an improved competitive binding assay for detecting and measuring a ligand.

5 Voor de bestudering van bindingsprocessen tussen (bio)moleculen worden in het vakgebied van de (bio)chemische analysetechnologie verschillende werkwijzen toegepast. Zo worden bijvoorbeeld competitieve bindingsassays (CBAs) toegepast om de affiniteit van een bepaald (bio)molecuul voor andere (bio)moleculen, of de concentratie van een 10 bepaalde stof in een te analyseren monster te bepalen.5 Different methods are used in the field of (bio) chemical analysis technology for studying binding processes between (bio) molecules. For example, competitive binding assays (CBAs) are used to determine the affinity of a certain (bio) molecule for other (bio) molecules, or the concentration of a certain substance in a sample to be analyzed.

Het werkingsprincipe van CBAs is gebaseerd op de competitie tussen een ongelabelde ligand (meestal de te analyseren stof) en een gelabeld analoog van dat ligand (meestal een reagens) om een beperkt aantal bindingsplaatsen op een biologisch macromolecuul (de 15 bindingspartner of "carrier", meestal een antilichaam, een receptor, een polynucleotide, of een transport eiwit). Indien het ongelabelde ligand en het gelabelde analoog affiniteit hebben voor hetzelfde deel van dit macromolecuul (hierna: de bindingspartner), dan is de concentratie van het ongelabelde ligand omgekeerd evenredig aan de hoeveelheid gelabeld 20 analoog die aan de bindingspartner is gebonden. Om de bepaling van de hoeveelheid gebonden gelabeld analoog te vergemakkelijken wordt gewoonlijk voor of na de competitiestap de bindingspartner met daaraan gebonden het gelabelde analoog en ongelabelde ligand uit de oplossing gehaald zodat alle gebonden liganden kunnen worden gescheiden van het 25 ongebonden materiaal in het te onderzoeken monster. Deze scheiding van gebonden en opgeloste fase kan bijvoorbeeld geschieden door immobilisatie van de bindingspartner, bijvoorbeeld met behulp van een geïmmobiliseerd antilichaam, en verwijdering van de reactievloeistof. Dus de 1026678 2 bindingspartner kan bijvoorbeeld gekoppeld zijn aan het oppervlak van een reactievat, e.g. aan het oppervlak van een welletje van een microtiterplaat vervaardigd uit een geschikt plastic materiaal, om aldus het wassen en verwijderen van overmaat ongebonden gelabeld analoog te 5 vergemakkelijken.The working principle of CBAs is based on the competition between an unlabeled ligand (usually the substance to be analyzed) and a labeled analogue of that ligand (usually a reagent) for a limited number of binding sites on a biological macromolecule (the binding partner or carrier), usually an antibody, a receptor, a polynucleotide, or a transport protein). If the unlabeled ligand and the labeled analogue have affinity for the same part of this macromolecule (hereinafter: the binding partner), then the concentration of the unlabeled ligand is inversely proportional to the amount of labeled analogue bound to the binding partner. To facilitate the determination of the amount of bound labeled analogue, the binding partner with the labeled analogue and unlabeled ligand bound thereto is usually taken out of the solution before or after the competition step so that all bound ligands can be separated from the unbound material in the sample to be tested . This separation of bound and dissolved phase can be effected, for example, by immobilization of the binding partner, for example with the aid of an immobilized antibody, and removal of the reaction liquid. Thus, the binding partner 1026678 may, for example, be coupled to the surface of a reaction vessel, e.g., to the surface of a well of a microtiter plate made of a suitable plastic material, so as to facilitate the washing and removal of excess unbound labeled analogue.

Een dergelijk CBA wordt een heterogeen (vaste fase) CBA genoemd. Een voorbeeld van een heterogeen CBA is het "radioreceptor assay" waarbij de bindingsplaats zich aan een membraan of weefselreceptor bevindt. Door middel van het assay wordt de concentratie van een 10 substantie (meestal een hormoon) bepaald waarbij een mengsel van het te onderzoeken monster en een bekende hoeveelheid van de te testen substantie die radioactief is gelabeld wordt blootgesteld aan een bekende hoeveelheid van geïmmobiliseerde receptoren voor die te testen substantie. Hierbij wordt de hoeveelheid van de te testen substantie in het te 15 onderzoeken monster vastgesteld uit het aandeel van receptoren dat bezet is met radioactief gelabelde moleculen van de te testen substantie, onder de aanname dat gelabelde en ongelabelde moleculen willekeurig aan de receptorbindingsplaatsen binden. Ook de meeste "enzyme-linked immunoabsorbent assays" (ELISAs) zijn vormen van heterogene CBAs.Such a CBA is called a heterogeneous (solid phase) CBA. An example of a heterogeneous CBA is the "radio receptor assay" where the binding site is on a membrane or tissue receptor. The assay determines the concentration of a substance (usually a hormone) in which a mixture of the sample to be tested and a known amount of the substance to be tested that is radiolabelled is exposed to a known amount of immobilized receptors for those substance to be tested. Here, the amount of the substance to be tested in the sample to be tested is determined from the proportion of receptors occupied with radiolabeled molecules of the substance to be tested, assuming that labeled and unlabelled molecules randomly bind to the receptor binding sites. Most "enzyme-linked immunoabsorbent assays" (ELISAs) are also forms of heterogeneous CBAs.

20 In de farmaceutische industrie en voedingsmiddelenindustrie wordt veel gebruik gemaakt van heterogene competitieve bindingsassays om nieuwe farmaceutica en nutraceutica te ontdekken. Hiertoe wordt bijvoorbeeld de farmacologische bindingscapaciteit van een receptor voor een te onderzoeken stof bepaald. De scheiding van de aan de 25 bindingspartner gebonden liganden uit de oplossing kan fysisch, zoals bijvoorbeeld met behulp van een filter, of chemisch, bijvoorbeeld met behulp van actieve kool plaatsvinden. Een analyse uitgevoerd op de gescheiden componenten moet dan uitsluitsel geven of de nieuwe stof inderdaad de bekende ligand heeft verdrongen.20 In the pharmaceutical and food industry, heterogeneous competitive binding assays are widely used to discover new pharmaceuticals and nutraceuticals. To this end, for example, the pharmacological binding capacity of a receptor for a test substance is determined. The separation of the ligands bound to the binding partner from the solution can take place physically, such as with the aid of a filter, or chemically, for example with the aid of activated carbon. An analysis carried out on the separate components must then determine whether the new substance has indeed displaced the known ligand.

1026678 31026678 3

Het probleem van heterogene CBAs is dat zij langdurig, bewerkelijk, beperkt toepasbaar en grotendeels handmatig zijn. Ondanks dat zij zeer veelvuldig worden toegepast zijn dergelijke assays niet erg geschikt voor high-troughput screening (HTS) toepassingen.The problem with heterogeneous CBAs is that they are long-term, laborious, limited in application and largely manual. Although they are used very frequently, such assays are not very suitable for high-troughput screening (HTS) applications.

5 Een voorbeeld van een homogeen CBA systeem is de enzyme- multiplied immunoassay technique (EMIT; Rubenstein et al. 1972, Biochem.An example of a homogeneous CBA system is the enzyme multiplied immunoassay technique (EMIT; Rubenstein et al. 1972, Biochem.

Biophys. Res. Commun., 47:846), die onder andere wordt toegepast voor de analyse van urine op bijvoorbeeld cocaïne. Deze analyse is gebaseerd op de competitie om bindingsplaatsen op een antilichaam tussen de cocaïne in het 10 monster en cocaïne dat gelabeld is met bijvoorbeeld het enzym glucose-6-fosfaat dehydrogenase (G6P-DH). Omdat de enzyinactiviteit bij binding van het gelabelde cocaïne aan het antilichaam afneemt, kan de cocaïneconcentratie in het monster bepaald worden door spectrofotometrische bepaling van de snelheid waarmee nicotinamide 15 adenine dinucleotide (NAD) door G6P-DH wordt gereduceerd. Hierbij is het niet noodzakelijk dat het aan het antilichaam gebonden gelabelde cocaïne wordt gescheiden van het ongebonden gelabelde cocaïne. Hoe lager de gemeten G6P-DH activiteit, hoe meer gelabelde cocaïne is gebonden aan het antilichaam en dus hoe minder ongelabeld cocaïne en aanwezig is. Bij 20 verhoging van de G6P-DH activiteit ten opzichte van een controle of ijklijn is cocaïne met zeer grote waarschijnlijkheid aanwezig in het monster.Biophys. Res. Commun., 47: 846), which is used inter alia for the analysis of urine for, for example, cocaine. This analysis is based on the competition for binding sites on an antibody between the cocaine in the sample and cocaine labeled with, for example, the glucose-6-phosphate dehydrogenase enzyme (G6P-DH). Because the enzyme activity decreases upon binding of the labeled cocaine to the antibody, the cocaine concentration in the sample can be determined by spectrophotometric determination of the rate at which nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) is reduced by G6P-DH. Hereby it is not necessary that the labeled cocaine bound to the antibody is separated from the unbound labeled cocaine. The lower the measured G6P-DH activity, the more labeled cocaine is bound to the antibody and therefore the less unlabeled cocaine is present. When the G6P-DH activity is increased relative to a control or calibration curve, cocaine is very likely to be present in the sample.

Ondanks dat een dergelijke techniek gevoelig is voor vals positieve uitslagen en de uitslag van EMIT assays om die reden meestal wordt geconfirmeerd via GC-MS-analyse, hebben dergelijke CBAs duidelijke 25 voordelen ten opzichte van directe analyse technieken, waarbij de te onderzoeken stof direct wordt gemeten.Although such a technique is sensitive to false positive results and the result of EMIT assays is usually confirmed by GC-MS analysis, such CBAs have clear advantages over direct analysis techniques, whereby the substance to be investigated is directly measured.

Het is een doel van de onderhavige uitvinding om een alternatief te verschaffen voor de huidige competitieve bindingsassays. Het is voorts een doel van de onderhavige uitvinding om een bindingsassay te verschaffen dat j 1026678 4 geautomatiseerd kan worden, dat wil zeggen dat geschikt is voor high-troughput screening (HTS) en dat voor brede toepassing inzetbaar is.It is an object of the present invention to provide an alternative to the current competitive binding assays. It is a further object of the present invention to provide a binding assay that can be automated, that is, is suitable for high-troughput screening (HTS) and can be used for wide application.

Gevonden is nu dat de toepassing van verwaarloosbare depletie extractie in een chemische analyse deze analyse breder toepasbaar maakt.It has now been found that the use of negligible depletion extraction in a chemical analysis makes this analysis more broadly applicable.

5 Zo is onder andere gevonden dat het evenwicht tussen de hoeveelheid aan de receptor gebonden ligand, de hoeveelheid ongebonden ligand aanwezig in de vloeistoffase, en de hoeveelheid ongebonden ligand die is geabsorbeerd door een extraherende fase, zoals bijvoorbeeld door een extraherend polydimethyl-siloxaan oppervlak, beïnvloed wordt door stoffen die in staat 10 zijn om met het ligand te competeren om receptor bindingsplaatsen, dergelijke stoffen worden hierin aangeduid met de term analogen. Bij het optreden van competitie om binding met de bindingspartner tussen ligand en analoog neemt de hoeveelheid ongebonden ligand toe. Bijgevolg neemt de hoeveelheid ongebonden ligand die door een extraherende fase wordt 15 geabsorbeerd toe. Deze toename in geabsorbeerd ongebonden ligand, die op conventionele wijze is te bepalen, duidt daarmee op de aanwezigheid van stoffen die om bindingsplaatsen aan de receptor competeren. Dergelijke stoffen zijn bijvoorbeeld potentiële geneesmiddelen. De absorptie zoals die een rol speelt in de onderhavige uitvinding is gebaseerd op migratie van 20 ligand van de ene fysische fase naar een andere fysische fase. Met behulp van de vinding hierin beschreven is het mogelijk om liganden te detecteren en eventueel daarvan de concentratie te bepalen.For example, it has been found that the balance between the amount of ligand bound to the receptor, the amount of unbound ligand present in the liquid phase, and the amount of unbound ligand absorbed by an extracting phase, such as for example by an extracting polydimethyl siloxane surface, is affected by substances capable of competing with the ligand for receptor binding sites, such substances are referred to herein by the term analogs. When competition for binding with the binding partner between ligand and analog occurs, the amount of unbound ligand increases. Consequently, the amount of unbound ligand that is absorbed by an extracting phase increases. This increase in absorbed unbound ligand, which can be determined in a conventional manner, thus indicates the presence of substances that compete for binding sites on the receptor. Such substances are, for example, potential medicines. The absorption as it plays a role in the present invention is based on migration of ligand from one physical phase to another physical phase. With the help of the invention described herein, it is possible to detect ligands and optionally determine their concentration.

In een eerste aspect heeft de uitvinding betrekking op een werkwijze voor het detecteren en/of meten van een ligand in een vloeistof.In a first aspect, the invention relates to a method for detecting and / or measuring a ligand in a liquid.

25 De werkwijze omvat de stappen van: a) het verschaffen van een bindingspartner van genoemd ligand in genoemde vloeistof; b) het onderwerpen van genoemde vloeistof aan condities waarbij genoemd ligand kan binden aan genoemde bindingspartner ter verschaffing van een hoeveelheid gebonden ligand en een hoeveelheid vrij ligand in genoemde 30 vloeistof; c) het onderwerpen van genoemde vloeistof aan verwaarloosbare 1026678 5 depletie extractie waarbij een deel van de hoeveelheid vrij ligand door genoemde extraherende fase wordt geëxtraheerd, en d) het detecteren en/of meten van het geëxtraheerde ligand. Bij voorkeur omvat de werkwijze voorts de stap van: e) het bepalen van de in oplossing aanwezige hoeveelheid 5 gebonden ligand en/of vrij ligand.The method comprises the steps of: a) providing a binding partner of said ligand in said fluid; b) subjecting said fluid to conditions wherein said ligand can bind to said binding partner to provide an amount of bound ligand and an amount of free ligand in said fluid; c) subjecting said liquid to negligible depletion extraction wherein a portion of the amount of free ligand is extracted through said extracting phase, and d) detecting and / or measuring the extracted ligand. Preferably, the method further comprises the step of: e) determining the amount of bound ligand and / or free ligand present in solution.

In stap c) vindt een proces van verwaarloosbare depletie extractie plaats. Hierbij wordt een verwaarloosbaar klein gedeelte, bijvoorbeeld minder dan 20%, bij voorkeur minder dan 10%, bij grotere voorkeur minder dan 2%, bij nog grotere voorkeur minder dan 1%, bij nog grotere voorkeur 10 minder dan 0,5%, bij nog grotere voorkeur minder dan 0,1%, bij nog grotere voorkeur minder dan 0,01% van genoemd vrij ligand door een extraherende fase geëxtraheerd. Bij voorkeur wordt ten minste 0,1%, bij grotere voorkeur ten minste 0,01%, bij nog grotere voorkeur ten minste 0,001%, en bij nog grotere voorkeur ten minste 0,0001% van de in oplossing aanwezige vrije 15 liganden geëxtraheerd.In step c) a process of negligible depletion extraction takes place. Hereby a negligibly small portion, for example less than 20%, preferably less than 10%, more preferably less than 2%, even more preferably less than 1%, even more preferably less than 0.5%, even more preferably less than 0.1%, even more preferably less than 0.01% of said free ligand extracted through an extracting phase. Preferably at least 0.1%, more preferably at least 0.01%, even more preferably at least 0.001%, and even more preferably at least 0.0001% of the free ligands present in solution is extracted.

Het voordeel van het extraheren van een verwaarloosbaar, maar bij voorkeur exact bekend gedeelte van de vrij in oplossing aanwezige liganden is dat deze meetmethodiek voor de vrije liganden wordt uitgevoerd aan een zeer klein gedeelte van vrij ligand waardoor de evenwichtsreacties in 20 oplossing die optreden tussen ligand en bindingspartner, minimaal worden beïnvloed. Een ander voordeel is dat de geëxtraheerde liganden reeds gescheiden zijn of eenvoudig gescheiden kunnen worden van de in oplossing verkerende liganden en separaat daarvan, in principe direct, gemeten kunnen worden.The advantage of extracting a negligible, but preferably precisely known, part of the free ligands present in solution is that this measurement method for the free ligands is performed on a very small part of free ligand, whereby the equilibrium reactions in solution occurring between ligand and binding partner are minimally affected. Another advantage is that the extracted ligands are already separated or can easily be separated from the solution ligands and can be measured separately, in principle directly.

25 In een ander aspect heeft de uitvinding betrekking op een werkwijze voor het detecteren en/of meten van een ligand in een vloeistof, waarbij (in eerste instantie) niet het ligand zelf, maar een gelabeld analoog van het te meten ligand wordt gedetecteerd. De onderhavige uitvinding betreft daarom tevens een werkwijze voor het detecteren en/of meten van 30 een ligand in een vloeistof, omvattende de stappen van: a) het verschaffen 1026678 6 van een bindingspartner van genoemd ligand en een detecteerbaar analoog van genoemd ligand in genoemde vloeistof; b) het toestaan van het optreden van competitieve binding tussen genoemd ligand en genoemd analoog aan genoemde bindingspartner ter verschaffing van een hoeveelheid gebonden 5 analoog en een hoeveelheid vrij analoog in genoemde vloeistof; c) het onderwerpen van genoemde vloeistof aan verwaarloosbare depletie extractie waarbij een deel van de hoeveelheid vrij analoog door genoemde extraherende fase wordt geëxtraheerd, en d) het detecteren en/of meten van het geëxtraheerde analoog. Bij voorkeur omvat de werkwijze voorts de stap 10 van: e) het bepalen van de in oplossing aanwezige hoeveelheid gebonden analoog en/of vrij analoog en bij nog grotere voorkeur omvat de werkwijze voorts de stap van: f) het bepalen van de in oplossing aanwezige hoeveelheid gebonden ligand en/of vrij ligand.In another aspect the invention relates to a method for detecting and / or measuring a ligand in a liquid, wherein (initially) not a ligand itself, but a labeled analogue of the ligand to be measured is detected. The present invention therefore also relates to a method for detecting and / or measuring a ligand in a liquid, comprising the steps of: a) providing a binding partner of said ligand and a detectable analog of said ligand in said liquid ; b) allowing the occurrence of competitive binding between said ligand and said analog to said binding partner to provide an amount of bound analog and an amount of free analog in said liquid; c) subjecting said liquid to negligible depletion extraction wherein a portion of the amount of free analog is extracted through said extracting phase, and d) detecting and / or measuring the extracted analog. Preferably, the method further comprises the step of: e) determining the amount of bound analog and / or free analog present in solution and, even more preferably, the method further comprises the step of: f) determining the amount present in solution amount of bound ligand and / or free ligand.

In een voorkeursuitvoeringsvorm van een werkwijze volgens de 15 uitvinding wordt de bindingspartner gekozen uit de groep bestaande uit receptoren, polynucleotiden, bindingseiwitten, cofactoren en antilichamen.In a preferred embodiment of a method according to the invention, the binding partner is selected from the group consisting of receptors, polynucleotides, binding proteins, cofactors and antibodies.

In een andere voorkeursuitvoeringsvorm van een werkwijze volgens de uitvinding is het ligand een hydrofoob ligand.In another preferred embodiment of a method according to the invention, the ligand is a hydrophobic ligand.

In een andere voorkeursuitvoeringsvorm van een werkwijze 20 volgens de uitvinding is het ligand een te onderzoeken farmaceuticum, bij grotere voorkeur een steroïde, benzodiazopine of antibioticum.In another preferred embodiment of a method according to the invention, the ligand is a pharmaceutical to be tested, more preferably a steroid, benzodiazopine or antibiotic.

In weer een andere voorkeursuitvoeringsvorm van een werkwijze volgens de uitvinding is het analoog een radioactief gelabelde vorm van het ligand.In yet another preferred embodiment of a method according to the invention, the analog is a radiolabeled form of the ligand.

25 In nog een voorkeursuitvoeringsvorm van een werkwijze volgens de uitvinding omvat genoemde extraherende fase lipofiele polymeren.In yet another preferred embodiment of a method according to the invention, said extracting phase comprises lipophilic polymers.

In nog een voorkeursuitvoeringsvorm van een werkwijze volgens de uitvinding is het ligand en/of het analoog een polynucleotide, en omvat genoemde extraherende fase een polynucleotide waarvan de 30 nucleotidenvolgorde ten minste gedeeltelijk complementair is aan de 1026678 7 nucleotidenvolgorde van ten minste een gedeelte van het ligand en/of het analoog, en is het polynucleotide dat zich in de extraherende fase bevindt in staat om het ligand en/of het analoog uit de vloeistof te extraheren onder condities van verwaarloosbare depletie. In een voorkeursuitvoeringsvorm 5 van een dergelijke werkwijze zijn in het polynucleotide van genoemde extraherende fase ten minste 5-20, bij voorkeur ten minste 8-16 en bij grotere voorkeur ten minste 10-14 in hoofdzaak opeenvolgende nucleotiden complementair aan in hoofdzaak opeenvolgende nucleotiden van genoemd ligand.In yet another preferred embodiment of a method according to the invention, the ligand and / or the analog is a polynucleotide, and said extracting phase comprises a polynucleotide whose nucleotide sequence is at least partially complementary to the 1026678 nucleotide sequence of at least a portion of the ligand and / or the analog, and the polynucleotide in the extracting phase is capable of extracting the ligand and / or the analog from the fluid under conditions of negligible depletion. In a preferred embodiment of such a method, in the polynucleotide of said extracting phase, there are at least 5-20, preferably at least 8-16 and more preferably at least 10-14 substantially consecutive nucleotides complementary to substantially consecutive nucleotides of said extracting phase. ligand.

10 In nog een voorkeursuitvoeringsvorm van een werkwijze volgens de uitvinding heeft de extraherende fase de vorm van een oppervlakte coating op de (binnen)wand van een vloeistofhouder of de vorm van een oppervlakte coating op met de vloeistof mengbare deeltjes. Bij voorkeur omvat de extraherende fase een vaste fase. Bij voorkeur omvat genoemde vaste fase 15 polysiloxanen, en bij grotere voorkeur is de vaste fase polydimethylsiloxaan.In yet another preferred embodiment of a method according to the invention, the extracting phase is in the form of a surface coating on the (inner) wall of a liquid container or in the form of a surface coating on particles miscible with the liquid. Preferably, the extracting phase comprises a solid phase. Preferably said solid phase comprises polysiloxanes, and more preferably the solid phase is polydimethylsiloxane.

De extraherende fase toegepast in een werkwijze volgens de uitvinding heeft bij voorkeur een partitiecoëfficiënt tussen 2 en 20.The extracting phase used in a method according to the invention preferably has a partition coefficient between 2 and 20.

In nog een voorkeursuitvoeringsvorm van een werkwijze volgens de uitvinding omvat de extraherende fase een scintillator voor detectie van 20 radio-isotopen.In yet another preferred embodiment of a method according to the invention, the extracting phase comprises a scintillator for detection of radioisotopes.

De onderhavige uitvinding heeft voorts betrekking op een vloeistofhouder voor het detecteren en/of meten van een ligand in een vloeistof, welke houder is voorzien van een extraherende fase die het vermogen heeft om genoemd ligand uit de vloeistofEase te extraheren en 25 welke houder verder voorzien is van detectiemiddelen, bij voorkeur een scintillator voor detectie van radio-isotopen.The present invention furthermore relates to a liquid container for detecting and / or measuring a ligand in a liquid, which container is provided with an extracting phase which has the capacity to extract said ligand from the liquid Ease and which container is further provided of detection means, preferably a scintillator for detection of radioisotopes.

Een vloeistofhouder voorzien van een extraherende fase met het vermogen om stoffen uit een vloeistof te extraheren is onder andere bekend uit WO 98/41855. Een voordeel van de houder volgens de onderhavige 1026678 8 uitvinding boven die beschreven in WO 98/41855 is dat de onderhavige houder specifieke detectiemiddelen omvat.A liquid container provided with an extracting phase with the capacity to extract substances from a liquid is known, inter alia, from WO 98/41855. An advantage of the holder according to the present invention over that described in WO 98/41855 is that the present holder comprises specific detection means.

Bij voorkeur zijn de detectiemiddelen omvat in de extraherende fase zodat zij in de onmiddellijke nabijheid van en zonodig in direct contact 5 met het geëxtraheerde ligand kunnen worden gebracht.The detection means are preferably included in the extracting phase so that they can be brought in the immediate vicinity of, and if necessary in direct contact with, the extracted ligand.

Detectiemiddelen die met voorkeur worden toegepast zijn o.a. detectiemiddelen voor detectie van fluorescent gelabelde stoffen, zoals bijvoorbeeld fluorescentie quenchers. Ook kunnen fluoroforen worden toegepast als detectiemiddelen. De toepassing van het detectiemiddel in een 10 houder volgens de uitvinding hangt uiteraard af van het te detecteren en/of te meten ligand of analoog. In geval het ligand of analoog fluorescent is gelabeld, dan is een fluorescentie-quencher als detectiemiddel geschikt. Andersom kan het ligand of analoog zijn gelabeld met een fluorescentie-quencher, in welk geval een fluorofoor toegepast als detectiemiddel in een 15 vloeistofhouder volgens de uitvinding weer geschikt is. De vakman is in staat om een geschikt detectiemiddel toe te passen afhankelijk van het te detecteren ligand of analoog. Detectiemiddelen die met voorkeur worden toegepast zijn detectiemiddelen voor detectie van radioactief gelabelde stoffen. Dergelijke detectiemiddelen zijn bij de vakman bekend en worden 20 bijvoorbeeld toegepast in zgn. "scintillation proximity assays". Bij voorkeur zijn genoemde detectiemiddelen scintillatoren. Met grote voorkeur wordt als scintillator 2,5 diphenyloxazol toegepast.Preferred detection means are, inter alia, detection means for detecting fluorescently labeled substances, such as, for example, fluorescence quenchers. Fluorophores can also be used as detection means. The use of the detection means in a holder according to the invention naturally depends on the ligand or analog to be detected and / or measured. If the ligand or analog is fluorescently labeled, then a fluorescence quencher is suitable as a detection means. Conversely, the ligand may be analogously labeled with a fluorescent quencher, in which case a fluorophore used as a detecting agent in a liquid container according to the invention is again suitable. The person skilled in the art is able to use a suitable detection means depending on the ligand or analog to be detected. Preferred detection means are detection means for detecting radiolabelled substances. Such detection means are known to those skilled in the art and are used, for example, in so-called "scintillation proximity assays". Preferably, said detection means are scintillators. More preferably, diphenyloxazole is used as the scintillator.

In een voorkeursuitvoeringsvorm van een vloeistofhouder volgens de uitvinding omvat de extraherende fase een polynucleotide waarvan de 25 nucleotidenvolgorde gedeeltelijk complementair is aan de nucleotidenvolgorde van ten minste een gedeelte van een te meten polynucleotide-ligand en dat in staat is om genoemd ligand uit genoemde vloeistof te extraheren onder condities van verwaarloosbare depletie. Het polynucleotide van de extraherende fase kan van 3-40 nucleotiden 30 omvatten. In een voorkeursuitvoeringsvorm van een vloeistofhouder zijn in 1026678 9 het polynucleotide van genoemde extraherende fase ten minste 5-20, bij voorkeur ten minste 8-16 en bij grotere voorkeur ten minste 10-14 in hoofdzaak opeenvolgende nucleotiden complementair aan in hoofdzaak opeenvolgende nucleotiden van een te meten polynucleotiden-ligand. Bij 5 voorkeur omvat het polynucleotide van de extraherende fase 5-20, bij grotere voorkeur 8-16, bij grotere voorkeur 10-14 nucleotiden.In a preferred embodiment of a liquid container according to the invention, the extracting phase comprises a polynucleotide whose nucleotide sequence is partially complementary to the nucleotide sequence of at least a portion of a polynucleotide ligand to be measured and which is capable of extracting said ligand from said liquid under conditions of negligible depletion. The polynucleotide of the extracting phase can comprise from 3 to 40 nucleotides. In a preferred embodiment of a liquid container, in 1026678 the polynucleotide of said extracting phase is at least 5-20, preferably at least 8-16 and more preferably at least 10-14 substantially consecutive nucleotides complementary to substantially consecutive nucleotides of a polynucleotide ligand to be measured. Preferably, the polynucleotide of the extracting phase comprises 5-20, more preferably 8-16, more preferably 10-14 nucleotides.

De vakman zal begrijpen dat bij dergelijke ketenlengtes ook van oligonucleotiden kan worden gesproken. Zowel DNA als RNA polynucleotides kunnen worden toegepast evenals nucleotide mimetica zoals 10 PNA. De vakman zal eveneens begrijpen dat de complementariteit van het polynucleotide van de extraherende fase niet 100% behoeft te zijn om toch een zinvolle verwaarloosbare depletie extractie te bewerkstelligen. Zo is het bijvoorbeeld mogelijk dat het extraherend polynucleotide slechts voor ongeveer 60%, ongeveer 70%, ongeveer 80%, ongeveer 90% of ongeveer 95% 15 complementair is aan een polynucleotide ligand. Met dit percentage wordt bedoeld dat zich in een meervoudigheid van direct aaneenliggende nucleotiden in een polynucleotide, één of meer nucleotiden kunnen bevinden die niet complementair zijn aan het polynucleotiden ligand, en dus niet participeren in de hybridisatie-reactie (bij 95% complementariteit is één op 20 de twintig niincleotiden niet complementair)). Bij voorkeur is de complementariteit echter 100%. De vakman zal verder begrijpen dat het extraherende polynucleotide en/of het polynucleotide ligand meer nucleotiden kan omvatten dan die welke participeren in de hybridisatie-reactie die het gevolg is van de ten minste gedeeltelijke complementariteit 25 tussen deze moleculen. Het heirboven genoemde complementariteits-percentage heeft echter alleen betrekking op de nucleotiden die in de hybridisatiereactie netrokken zijn.Those skilled in the art will understand that oligonucleotides can also be referred to at such chain lengths. Both DNA and RNA polynucleotides can be used as well as nucleotide mimetics such as PNA. Those skilled in the art will also understand that the complementarity of the polynucleotide of the extracting phase need not be 100% in order to achieve a meaningful negligible depletion extraction. For example, it is possible that the extracting polynucleotide is only about 60%, about 70%, about 80%, about 90%, or about 95% complementary to a polynucleotide ligand. This percentage means that in a plurality of directly adjacent nucleotides in a polynucleotide, there may be one or more nucleotides that are not complementary to the polynucleotides ligand, and thus do not participate in the hybridization reaction (at 95% complementarity is one in 20 the twenty ninocleotides not complementary)). However, the complementarity is preferably 100%. Those skilled in the art will further understand that the extracting polynucleotide and / or the polynucleotide ligand may comprise more nucleotides than those participating in the hybridization reaction resulting from the at least partial complementarity between these molecules. The complementarity percentage mentioned above, however, only relates to the nucleotides that have been traced in the hybridization reaction.

In een andere voorkeursuitvoeringsvorm van een vloeistofhouder volgens de uitvinding omvat de extraherende fase 30 polysiloxanen en een polysiloxaan van voorkeur is polydimethylsiloxaan.In another preferred embodiment of a liquid container according to the invention, the extracting phase comprises polysiloxanes and a preferred polysiloxane is polydimethylsiloxane.

1026678 101026678 10

De extraherende fase die wordt toegepast in een vloeistofhouder volgens de uitvinding heeft bij voorkeur een partitiecoëffieiënt van tussen 2 en 20.The extracting phase used in a liquid container according to the invention preferably has a partition coefficient of between 2 and 20.

De onderhavige uitvinding heeft voorts betrekking op de toepassing 5 van een vloeistofhouder volgens de onderhavige uitvinding in een werkwijze voor het detecteren en/of meten van een ligand in een vloeistof. Bij voorkeur wordt een vloeistofhouder volgens de uitvinding toegepast in een werkwijze voor het detecteren en/of meten van een ligand in een vloeistof volgens de onderhavige uitvinding.The present invention further relates to the use of a liquid container according to the present invention in a method for detecting and / or measuring a ligand in a liquid. A fluid container according to the invention is preferably used in a method for detecting and / or measuring a ligand in a fluid according to the present invention.

10 Een zeer geschikte toepassing van een werkwijze volgens de uitvinding is gelegen in het bepalen van de bindingscapaciteit van farmaceutische liganden. Zo kan bijvoorbeeld heel eenvoudig bepaald worden of farmaceutische stoffen een hoge plasma-eiwit binding vertonen door toepassing van een werkwijze volgens de uitvinding, bij voorkeur in 15 combinatie met een vloeistofhouder volgens de onderhavige uitvinding.A very suitable application of a method according to the invention lies in determining the binding capacity of pharmaceutical ligands. For example, it is very easy to determine whether pharmaceutical substances exhibit a high plasma protein binding by using a method according to the invention, preferably in combination with a liquid container according to the present invention.

De onderhavige uitvinding heeft voorts betrekking op een testkit voor het uitvoeren van een werkwijze volgens de uitvinding, welke testkit een vloeistofhouder volgens de uitvinding omvat.The present invention furthermore relates to a test kit for performing a method according to the invention, which test kit comprises a liquid container according to the invention.

Met de term "detecteren en/of meten van een ligand" zoals vermeld / 20 in een werkwijze volgens de onderhavige uitvinding worden in principe alle mogelijke detectie- en meetbepalingen bedoeld. Mogelijkheden van dergelijke bepalingen zijn bijvoorbeeld, maar niet uitsluitend, het bepalen van de concentratie van genoemd ligand en/of het bepalen van de bindingsactiviteit van genoemd ligand. "Detecteren" betekent hierin het 25 vinden of bepalen van de aanwezigheid van een ligand, zowel kwalitatief als kwantitatief, bij voorkeur kwalitatief. "Meten" omvat bijvoorbeeld het meten van de vrije concentratie van een ligand, het bepalen of een stof een ligand is, het testen van de aanwezigheid van bindingspartners van een ligand, de evaluatie van (bloed) plasma-eiwitbinding van een ligand. Detecteren en/of 30 meten van een ligand omvat daarom tevens de bestudering van binding 1026678 11 tussen een ligand en één of meer bindingspartners. Een dergelijk aspect van de uitvinding, waarbij binding tussen een ligand en bindingspartner wordt bestudeerd, kan o.a. worden uitgevoerd door toepassing van verschillende concentratieverhoudingen van ligand en analoog van een ligand zoals hierin 5 uiteengezet.The term "detecting and / or measuring a ligand" as stated in a method according to the present invention basically means all possible detection and measurement determinations. Possibilities of such assays include, but are not limited to, determining the concentration of said ligand and / or determining the binding activity of said ligand. "Detecting" herein means finding or determining the presence of a ligand, both qualitatively and quantitatively, preferably qualitatively. "Measuring" includes, for example, measuring the free concentration of a ligand, determining whether a substance is a ligand, testing the presence of binding partners of a ligand, evaluating (blood) plasma protein binding of a ligand. Detecting and / or measuring a ligand therefore also includes the study of binding 1026678 11 between a ligand and one or more binding partners. Such an aspect of the invention, where binding between a ligand and binding partner is being studied, can be carried out, inter alia, by using different concentration ratios of ligand and analog of a ligand as set forth herein.

Werkwijzen volgens de onderhavige uitvinding zijn geschikt om te worden toegepast als "high throughput screening" methode in de farmaceutische industrie. Tevens zijn de werkwijzen kwantitatief toe te passen in de analytische chemie en voor onderzoek naar bijvoorbeeld 10 farmacokinetiek.Methods of the present invention are suitable for use as a "high throughput screening" method in the pharmaceutical industry. The methods can also be applied quantitatively in analytical chemistry and for research into, for example, pharmacokinetics.

Het voordeel van de werkwijzen volgens de uitvinding is dat de bepalingen zodanig worden uitgevoerd dat slechts een klein deel van het vrije ligand (en indien van toepassing van het ongeconjugeerde analoog) dat aanwezig is in een monster aan de detectie en/of meetcondities wordt 15 onderworpen, waardoor meting zonder noemenswaardige verstoring van het te meten systeem mogelijk is. Zo is het bijvoorbeeld niet nodig om actieve kool aan het meetsysteem toe te voegen, of om het gebonden ligand (of indien van toepassing het geconjugeerde analoog) door middel van filtratie te verwijderen.The advantage of the methods according to the invention is that the determinations are carried out in such a way that only a small part of the free ligand (and if applicable of the unconjugated analog) present in a sample is subjected to the detection and / or measurement conditions. , allowing measurement without significant disturbance of the system to be measured. For example, it is not necessary to add activated carbon to the measurement system, or to remove the bound ligand (or, if applicable, the conjugated analogue) by filtration.

20 Een "chemische analyse" is hierin gedefinieerd als de bepaling van de samenstelling van een monster of een van de chemische (bijv. bindings-) eigenschappen van een stof.A "chemical analysis" is defined herein as the determination of the composition of a sample or one of the chemical (e.g. binding) properties of a substance.

Een "te analyseren stof' is hierin gedefinieerd als het bestanddeel van het monster waarvan de concentratie, samenstelling of de capaciteit om 25 te binden aan een bindend macromolecuul wordt bepaald in een chemische analyse.A "analyte" is defined herein as the component of the sample whose concentration, composition or capacity to bind to a binding macromolecule is determined in a chemical analysis.

Een "receptor" is hierin gedefinieerd als een molecuul of oppervlak in een cel dat een specifieke (boodschapper)molecuul herkent en bindt hetgeen resulteert in een biologische respons.A "receptor" is defined herein as a molecule or surface in a cell that recognizes and binds a specific (messenger) molecule, resulting in a biological response.

1026678 121026678 12

Een "ligand" is hierin gedefinieerd als een ion, een molecuul, of een moleculaire groep die aan een andere chemische entiteit, zoals bijvoorbeeld een antilichaam, een receptor of een transport eiwit, bindt ter vorming van een groter complex of ter effectuering van een biologisch effect.A "ligand" is defined herein as an ion, a molecule, or a molecular group that binds to another chemical entity, such as, for example, an antibody, a receptor, or a transport protein, to form a larger complex or to effect a biological effect.

5 Een "bindingspartner" is hierin gedefinieerd als een lid van een specifiek bindingspaar, d.w.z. één van twee verschillende moleculen die een gebied op het oppervlak of een holte heeft die specifiek bindt aan, en die daarom per definitie complementair is aan, een bepaalde ruimtelijke en polaire organisatie van het andere molecuul. De leden van een specifiek 10 bindingspaar kunnen zijn een ligand en receptor; leden van een immunologische bindingspaar, zoals een antigeen-antilichaam bindingspaar; leden van een niet-immunologisch bindingspaar zoals (strept)avidine en biotine; twee complementaire nucleïnezuren, zowel ribonucleïnezuren als desoxyribonucleïnezuren en hybriden daartussen; of 15 enig ander bindend molecuul zoals een lectine. Complementaire specifieke bindingsparen binden met grote affiniteit aan elkaar, zoals bij voorbeeld een ligand en zijn complementaire receptor. Een van de twee complementaire leden van een specifiek bindingspaar kan worden aangeduid met de term "bindingspartner" voor de ander.A "binding partner" is defined herein as a member of a specific binding pair, ie one of two different molecules that has an area on the surface or a cavity that specifically binds to, and therefore is by definition complementary to, a particular spatial and polar organization of the other molecule. The members of a specific binding pair can be a ligand and receptor; members of an immunological binding pair, such as an antigen-antibody binding pair; members of a non-immunological binding pair such as (strept) avidin and biotin; two complementary nucleic acids, both ribonucleic acids and deoxyribonucleic acids and hybrids between them; or any other binding molecule such as a lectin. Complementary specific binding pairs bind to each other with great affinity, such as, for example, a ligand and its complementary receptor. One of the two complementary members of a specific binding pair can be referred to by the term "binding partner" for the other.

20 Een "reagens" is hierin gedefinieerd als een stof of mengsel dat bruikbaar is in chemische analyse of synthese.A "reagent" is defined herein as a substance or mixture that is useful in chemical analysis or synthesis.

Een "competitief bindingsassay" is hierin gedefinieerd als een assay dat is gebaseerd op de competitie tussen een gelabeld en een ongelabeld ligand in de reactie met een bindingspartner (bijvoorbeeld een 25 antilichaam, een receptor, of een transport eiwit).A "competitive binding assay" is defined herein as an assay based on the competition between a labeled and an unlabeled ligand in the reaction with a binding partner (e.g., an antibody, a receptor, or a transport protein).

"Conjugatie" en "conjugeren" is hierin gedefinieerd als het proces van chemische binding en een "conjugaat" is hierin gedefinieerd als het product van die binding. Conjugatie en (competitieve) binding zijn, zoals hierin gebruikt, in wezen dezelfde processen, waarbij een te detecteren of te 30 meten ligand of een analoog daarvan bindt aan een bindingspartner."Conjugation" and "conjugate" is defined herein as the process of chemical bonding and a "conjugate" is defined herein as the product of that bonding. Conjugation and (competitive) binding, as used herein, are essentially the same processes in which a ligand to be detected or measured or an analog thereof binds to a binding partner.

1026678 13 "Verwaarloosbare depletie extractie " is een assay proces waarbij, in het algemeen met behulp van een extraherend polymeer, verwaarloosbare hoeveelheden van zich in oplossing bevindend vrij ligand door extractie in of aan een extraherende (meestal vaste) fase uit de 5 oplossing worden verwijderd, als gevolg waarvan een verwaarloosbare verschuiving van evenwicht tussen vrij ligand en gebonden ligand in een oplossing optreedt. Een voorbeeld van een verwaarloosbare depletie extractie assay is "negligible depletion solid-phase microextraction" (ND-SPME) (Vaes et al. 1997. Chem Res Toxicol 10:1067-72; Heringa et al. 2002. 10 Anal Chem 74:5993-7). In het algemeen wordt voor de extractie een vaste fase toegepast, maar ook een polymere vloeistof of vloeistof-kristallijn kan worden toegepast. Dergelijke uitvoeringsvormen van "vaste fasen", welke onderdeel zijn van de onderhavige uitvinding, bezitten in ieder geval het vermogen om door absorptie vrij ligand uit de oplossing te verwijderen.1026678 13 "Negligible depletion extraction" is an assay process in which, generally with the help of an extracting polymer, negligible amounts of free ligand in solution are removed from the solution by extraction in or on an extracting (usually solid) phase. , as a result of which a negligible shift in equilibrium between free ligand and bound ligand occurs in a solution. An example of a negligible depletion extraction assay is "negligible solid-phase micro-extraction" (ND-SPME) (Vaes et al. 1997. Chem Res Toxicol 10: 1067-72; Heringa et al. 2002. Anal Chem 74: 5993 -7). A solid phase is generally used for the extraction, but a polymeric liquid or liquid-crystalline can also be used. Such "solid phase" embodiments, which are part of the present invention, in any case have the ability to remove free ligand from the solution by absorption.

15 Waar in de onderhavige beschrijving de term "vaste fase" wordt gebruikt is dat louter om een specifiek werkingsprincipe aan te duiden. De onderhavige uitvinding is niet beperkt tot extraherende vaste fasen die liganden uit een vloeistof kunnen absorberen. In algemene zin wordt hierin dan ook gesproken van een extraherende fase. Deze extraherende fase heeft het 20 kenmerk dat het gebonden ligand daarin geabsorbeerd wordt en daardoor als vrij ligand uit de vloeistof wordt verwijderd. Een kenmerk van de verwaarloosbare depletie extractie die een onderdeel vormt van de aspecten van de onderhavige uitvinding is dat slechts een gering deel van de totale hoeveelheid vrije ligand of analoog wordt geëxtraheerd.Where the term "solid phase" is used in the present description, this is merely to indicate a specific operating principle. The present invention is not limited to extracting solid phases that can absorb ligands from a liquid. In a general sense, this also refers to an extracting phase. This extracting phase is characterized in that the bound ligand is absorbed therein and thereby removed from the liquid as free ligand. A feature of the negligible depletion extraction that forms part of the aspects of the present invention is that only a small portion of the total amount of free ligand or analog is extracted.

25 Een "vrij" ligand of analoog heeft hierin de betekenis van een vrij in oplossing aanwezig ligand of analoog, zowel in tegenstelling tot een aan de bindingspartner gebonden ligand of analoog alsook in tegenstelling tot een door de extraherende fase geëxtraheerd ligand of analoog. Een vrij ligand of analoog is hierin dus ongebonden en niet geëxtraheerd.A "free" ligand or analog herein has the meaning of a free solution ligand or analog, both in contrast to a ligand or analog bound to the binding partner as well as in contrast to a ligand or analog extracted by the extracting phase. A free ligand or analog is therefore unbound and not extracted.

1026678 141026678 14

Vaste-fase micro extractie ("solid phase microextraction" of SPME) is een extractie techniek die gebruik maakt van een met polymeer bekleedde vezel als het extractiewerktuig. Na de extractie kan de verbinding van interesse van de vezel gedesorbeerd worden en vervolgens worden 5 geanalyseerd middels daartoe geëigende technieken zoals bijvoorbeeld GC of HPLC. Eén van de eigenschappen van SPME is dat alleen de vrij opgeloste fractie van de verbinding beschikbaar is voor partitionering aan het extractiewerktuig. Een andere eigenschap van SPME is dat de werkwijze kan worden toegepast op zo'n manier dat slechts kleine hoeveelheden vanuit 10 het monster geëxtraheerd worden, hetgeen verwaarloosbare depletie extractie mogelijk maakt. Deze twee eigenschappen maken SPME werktuigen bijzonder geschikt voor meting van vrije concentraties.Solid phase micro extraction ("solid phase micro extraction" or SPME) is an extraction technique that uses a polymer coated fiber as the extraction tool. After the extraction, the compound of interest can be desorbed from the fiber and then analyzed by appropriate techniques such as for example GC or HPLC. One of the properties of SPME is that only the freely dissolved fraction of the connection is available for partitioning to the extraction tool. Another feature of SPME is that the method can be applied in such a way that only small amounts are extracted from the sample, which allows negligible depletion extraction. These two properties make SPME tools particularly suitable for measuring free concentrations.

De farmaceutische- en voedingsmiddelenindustrie is in het algemeen op zoek naar verbindingen (competitors) die een goede affiniteit 15 hebben voor een bepaald macromolecuul, en daardoor het natuurlijke of biologische ligand van dit macromolecuul kunnen verdringen. Indien een bekende hoeveelheid van een bekend ligand en een macromolecuul bijeen worden gebracht in oplossing, dan zal de hoeveelheid ligand die nog vrij in oplossing aanwezig is afhangen van de concentratie en affiniteit van de 20 aanwezige competitors (bijv. een potentieel farmacon). Binding aan macromoleculen is in het algemeen een evenwichtsproces. Het evenwicht dat zich heeft ingesteld tussen de hoeveelheid van het bekende (natuurlijke) ligand die vrij in oplossing is en de hoeveelheid van het bekende ligand die gebonden is aan het macromolecuul, kan dus worden beïnvloed door een stof 25 die eveneens aan het macromolecuul bindt. Deze laatste stof, de gezochte competitor verbinding, kan worden gevonden door gebruik te maken van een werkwijze volgens de uitvinding op de volgende wijze.The pharmaceutical and food industry is generally looking for compounds (competitors) that have a good affinity for a particular macromolecule, and therefore can displace the natural or biological ligand of this macromolecule. If a known amount of a known ligand and a macromolecule are brought together in solution, then the amount of ligand that is still freely present in solution will depend on the concentration and affinity of the competitors present (e.g. a potential pharmacon). Binding to macromolecules is generally a balancing process. The equilibrium that has been established between the amount of the known (natural) ligand that is free in solution and the amount of the known ligand that is bound to the macromolecule can therefore be influenced by a substance that also binds to the macromolecule. This latter substance, the sought competitor compound, can be found by using a method according to the invention in the following manner.

In een oplossing met een receptor en zijn ligand waarin tevens een extraherende fase als bovenomschreven aanwezig is, is de concentratie van 30 het ligand in een de extraherende fase een goede afspiegeling van de 102C6?: 15 concentratie van het ligand die is vrij in oplossing aanwezig is, en dus niet aan de bindingspartner (e.g. de receptor) is gebonden. De extractie dient dan echter wel een verwaarloosbare invloed te hebben op de concentratie van het ligand zodat het evenwicht tussen het vrije en gebonden ligand niet wordt 5 verstoord. De in de extraherende fase aanwezige concentratie van het vrije ligand kan met allerlei methoden worden bepaald, welke methoden hieronder in meer detail zullen worden beschreven.In a solution with a receptor and its ligand in which also an extracting phase as described above is present, the concentration of the ligand in the extracting phase is a good reflection of the 102C6: 15 concentration of the ligand that is freely present in solution is not bound to the binding partner (eg the receptor). However, the extraction should then have a negligible influence on the concentration of the ligand so that the balance between the free and bound ligand is not disturbed. The concentration of the free ligand present in the extracting phase can be determined by various methods, which methods will be described in more detail below.

Werkwijzen volgens de uitvinding kunnen worden toegepast om de aanwezigheid van een brede reeks van stoffen met een specifieke bindende 10 eigenschap te bepalen. Een voorwaarde is dat daarvoor één of meer specifieke bindingspartners kunnen worden toegepast. Het paar gevormd door de te bepalen stof (hierin tevens aangeduid als het ligand) en de bindingspartner, kan bijvoorbeeld gekozen worden uit de volgende combinaties, waarin ieder afzonderlijk lid van het paar het ligand of de 15 bindingspartner kan zijn, onder de voorwaarde dat het aan de bindingspartner gebonden ligand of analoog daarvan in hoofdzaak niet geëxtraheerd wordt door de extraherende fase: (a) antigeen en specifiek antilichaam; (b) hormoon en hormoon receptor; 20 (c) hapteen en antihapteen; (d) polynucleotide en complementair polynucleotide; (e) polynucleotide en polynucleotide bindingseiwit; (f) biotin en avidine of streptavidine; (g) enzym en enzym cofactor; en 25 (h) lectine en specifiek koolhydraat.Methods according to the invention can be used to determine the presence of a wide range of substances with a specific binding property. A condition is that one or more specific binding partners can be used for this. The pair formed by the substance to be determined (also referred to herein as the ligand) and the binding partner may be selected, for example, from the following combinations, wherein each individual member of the pair may be the ligand or binding partner, provided that it is ligand bound to the binding partner or analogue thereof is substantially not extracted by the extracting phase: (a) antigen and specific antibody; (b) hormone and hormone receptor; (C) hapten and anti-hapten; (d) polynucleotide and complementary polynucleotide; (e) polynucleotide and polynucleotide binding protein; (f) biotin and avidin or streptavidin; (g) enzyme and enzyme cofactor; and (h) lectin and specifically carbohydrate.

De reden dat het gebonden ligand of analoog daarvan in hoofdzaak niet geëxtraheerd wordt door de extraherende fase is het gevolg van het toegenomen molecuulgewicht van het gevormde complex, ten opzichte van de vrije vormen van ligand en analoog. Alleen het vrij in oplossing 30 aanwezige ligand en/of analoog kan worden geëxtraheerd teneinde op die 1026678 16 wijze (de hoeveelheid van) het vrij in oplossing aanwezige ligand de kunnen detecteren en/of meten.The reason that the bound ligand or analog thereof is essentially not extracted by the extracting phase is due to the increased molecular weight of the complex formed, relative to the free forms of ligand and analog. Only the free ligand present in solution 30 and / or analogously can be extracted in order to detect and / or measure (the amount of) the free ligand present in solution in that way.

Geschikte liganden die middels een werkwijze volgens de onderhavige uitvinding kunnen worden gemeten zijn laag moleculaire 5 hydrofobe moleculen. Bij voorkeur worden laag moleculaire hydrofobe stoffen zoals steroïden en benzodiazopines (zoals valium), verschillende hydrofobe antibiotica en stoffen als vitaminen, in het bijzonder vitamine D gemeten,. Andere voorbeelden van geschikte liganden zijn Quercetine, estradiol, estriol, cannabinoiden, ACE-remmers (angiotensine II 10 antagonisten)). Met laag moleculair wordt hierin bedoeld een molecuulgewicht van 100-2000 Da, bij voorkeur in een bereik van ongeveer 150 tot ongeveer 1000 Da.Suitable ligands that can be measured by a method according to the present invention are low molecular weight hydrophobic molecules. Low molecular hydrophobic substances such as steroids and benzodiazopines (such as valium), various hydrophobic antibiotics and substances such as vitamins, in particular vitamin D, are preferably measured. Other examples of suitable ligands are Quercetin, estradiol, estriol, cannabinoids, ACE inhibitors (angiotensin II antagonists)). By low molecular is meant herein a molecular weight of 100-2000 Da, preferably in a range of about 150 to about 1000 Da.

In een andere voorkeursuitvoeringsvorm worden niet alleen laag-moleculaire stoffen gemeten, maar worden bijvoorbeeld macromoleculaire 15 liganden gemeten. Een voorbeeld van een dergebjke macromoleculair ligand is een polynucleotide. Een zeer geschikt polynucleotide dat kan worden gemeten middels een werkwijze volgens de uitvinding omvat een oligonucleotide, bijvoorbeeld een 10-40 nucleotiden tellend oligonucleotide.In another preferred embodiment, not only low-molecular substances are measured, but macromolecular ligands, for example, are measured. An example of such a macromolecular ligand is a polynucleotide. A very suitable polynucleotide that can be measured by a method according to the invention comprises an oligonucleotide, for example a 10-40 nucleotide-counting oligonucleotide.

Een detecteerbaar analoog van een bgand kan bijvoorbeeld een 20 gelabelde vorm van het betreffende ligand omvatten, zoals een fluorescent gelabeld ligand, of juist een fluorescentie-quencher, en is bij voorkeur een radioactief gelabeld analoog van het ligand waarvan de binding aan de bindingspartner of carrier wordt onderzocht.A detectable analog of a bgand may, for example, comprise a labeled form of the ligand in question, such as a fluorescently labeled ligand, or just a fluorescent quencher, and is preferably a radiolabeled analogue of the ligand whose binding to the binding partner or carrier is being investigated.

Als geschikte bindingspartners voor toepassing in een werkwijze 25 volgens de uitvinding kunnen alle afzonderlijke leden van de bovenvermelde combinaties van liganden en bindingspartners, zoals receptoren, polynucleotiden, bindingseiwitten, cofactoren of antilichamen gebruikt worden. Zeer geschikte bindingspartners zijn bindingspartners die in een gebonden bgand of analoog resulteren die door hun molecuulgewicht of door 30 hun omvang niet door de extraherende fase geëxtraheerd kunnen worden, 1026678 17 terwijl het ligand wel door de extraherende fase geëxtraheerd kan worden. In het algemeen zijn macromoleculaire structuren met een Mw > 1000-2000 Da te groot om door de extraherende fase geëxtraheerd te worden. Bij voorkeur worden daarom bindingspartners toegepast die het 5 molecuulgewicht van het ligand doen toenemen tot een waarde boven 1000 Da, bij grotere voorkeur boven 2000 Da. Bij grote voorkeur worden als bindingspartners receptoren zoals de vitamine D receptor, canabinoïd-receptor, androgeen-receptoren, recombinante eiwitten, plasma of plasma eiwitten, antilichamen, oestrogeen-receptoren, BSA, angiotensine II 10 antagonisten, en SHBG toegepast. Andere geschikte bindingspartners zijn bijvoorbeeld celsystemen, e.g. cellen of weefsels of homogenaten daarvan, die een bepaald bindend macromolecuul bevatten of homogenaten van weefsels of cellen die een bepaald bindend macromolecuul bevatten, etc. In een voorkeursuitvoeringsvorm is een bindingspartner een macromolecuul 15 waaraan een bekende stof kan binden en voor welke stof een competitor wordt gezocht. De gezochte stof is in dat geval een onbekende te testen stof (i.e. het te onderzoeken ligand) die bijvoorbeeld een agonist of antagonist kan zijn.As suitable binding partners for use in a method according to the invention, all individual members of the aforementioned combinations of ligands and binding partners, such as receptors, polynucleotides, binding proteins, cofactors or antibodies, can be used. Very suitable binding partners are binding partners that result in a bound bgand or analogue that cannot be extracted by the extracting phase due to their molecular weight or by their size, while the ligand can be extracted by the extracting phase. In general, macromolecular structures with a Mw> 1000-2000 Da are too large to be extracted through the extracting phase. Preferably, binding partners are therefore used that increase the molecular weight of the ligand to a value above 1000 Da, more preferably above 2000 Da. More preferably, as binding partners, receptors such as the vitamin D receptor, canabinoid receptor, androgen receptors, recombinant proteins, plasma or plasma proteins, antibodies, estrogen receptors, BSA, angiotensin II antagonists, and SHBG are used. Other suitable binding partners are, for example, cell systems, eg cells or tissues or homogenates thereof, which contain a certain binding macromolecule or homogenates of tissues or cells which contain a certain binding macromolecule, etc. In a preferred embodiment, a binding partner is a macromolecule 15 to which a known substance can and for which substance a competitor is sought. The substance sought in that case is an unknown substance to be tested (i.e., the ligand to be investigated), which may for example be an agonist or antagonist.

De bindingspartner kan worden verschaft in iedere geschikte 20 concentratie. Bij voorkeur wordt de bindingspartner verschaft in een concentratie in het bereik van ongeveer 1 attomol/L tot ongeveer 10 mol/L, bij voorkeur van 1 attomol/L tot ongeveer 10 nanomol/L, bij nog grotere voorkeur in het bereik van ongeveer 1 attomol/L tot ongeveer 1 nanomol/L, en bij nog grotere voorkeur van ongeveer 1 attomol/L tot ongeveer 10 25 femtomol/L. Bij zeer grote voorkeur wordt een bindingspartner verschaft in een concentratie in een bereik van ongeveer 10 attomol/L tot ongeveer 1 femtomol/L. Het voordeel van een werkwijze volgens de onderhavige uitvinding is dat de bindingspartner in zeer lage hoeveelheden kan worden toegediend.The binding partner can be provided in any suitable concentration. Preferably the binding partner is provided in a concentration in the range of about 1 attomol / L to about 10 mol / L, preferably from 1 attomol / L to about 10 nanomol / L, even more preferably in the range of about 1 attomol / L to about 1 nanomol / L, and even more preferably from about 1 attomol / L to about 10 femtomol / L. Most preferably, a binding partner is provided in a concentration in the range of about 10 attomol / L to about 1 femtomol / L. The advantage of a method according to the present invention is that the binding partner can be administered in very low amounts.

1026678 181026678 18

Het detecteerbaar analoog van het te onderzoeken ligand kan, indien aanwezig, worden verschaft in iedere geschikte concentratie. Het detecteerbaar analoog van het te onderzoeken ligand kan worden verschaft in een concentratie in het bereik van ongeveer 1 attomol/L tot ongeveer 1 5 mol/L, bij voorkeur van ongeveer 1 picomol/L tot ongeveer 1 micromol/L.The detectable analog of the ligand to be tested can, if present, be provided in any suitable concentration. The detectable analog of the ligand to be tested can be provided in a concentration in the range of about 1 attomol / L to about 1 mol / L, preferably from about 1 picomol / L to about 1 micromol / L.

Als oplosmiddel voor het verschaffen van een oplossing van een bindingspartner van het ligand, kunnen in principe vele soorten oplosmiddelen worden toegepast. Van belang is dat het oplosmiddel de binding tussen bindingspartner en één van beide vormen van het ligand 10 mogelijk maakt. Bij voorkeur wordt als oplosmiddel water toegepast. Vele soorten buffers zijn als waterig oplosmiddel uitermate geschikt. De vakman is in staat om een geschikt reactiemilieu, waarbij binding tussen de bindingspartner en één van beide vormen van het ligand optreedt, te realiseren. Bij grote voorkeur worden waterige oplossingen in de vorm een 15 fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) als reactiemengsel voor een dergelijke bindingsreactie gebruikt. Ook zeer geschikt zijn TRIS/BSA buffers waarbij BSA vaak gebruikt wordt voor het verbeteren van de oplosbaarheid van het ligand of analoog. De vakman zal begrijpen dat de keuze van het oplosmiddel of medium afhangt van het te detecteren ligand.As a solvent for providing a solution of a ligand binding partner, many types of solvents can in principle be used. Importantly, the solvent allows the binding between binding partner and one of both forms of the ligand. Water is preferably used as the solvent. Many types of buffers are extremely suitable as an aqueous solvent. The person skilled in the art is able to realize a suitable reaction environment in which binding occurs between the binding partner and one of the two forms of the ligand. More preferably, aqueous solutions in the form of a phosphate buffered saline (PBS) are used as a reaction mixture for such a binding reaction. Also very suitable are TRIS / BSA buffers in which BSA is often used to improve the solubility of the ligand or analogue. Those skilled in the art will appreciate that the choice of solvent or medium depends on the ligand to be detected.

20 Een werkwijze voor het detecteren en/of meten van een ligand zal in verreweg de meeste gevallen worden uitgevoerd in een vloeistof. Een werkwijze volgens de onderhavige uitvinding is in principe niet beperkt tot de detectie en/of het meten van liganden in een vloeistof. In principe is ieder monster geschikt om te worden onderworpen aan een werkwijze volgens de 25 uitvinding. Indien het monster een vast of semi-vast monster betreft kunnen de te onderzoeken liganden daarin aan een werkwijze volgens de uitvinding worden onderworpen door het opnemen van de liganden in een vloeistof, bij voorkeur een waterige vloeistof, bij voorkeur een medium waarin binding tussen een bindingspartner en een ligand en/of analoog en 1026678 19 tevens extractie van vrij ligand (en/of vrij analoog) door de extraherende fase kan plaatsvinden.A method for detecting and / or measuring a ligand will, by far, be carried out in a liquid. A method according to the present invention is in principle not limited to the detection and / or measurement of ligands in a liquid. In principle, any sample is suitable for being subjected to a method according to the invention. If the sample is a solid or semi-solid sample, the ligands to be tested therein can be subjected to a method according to the invention by incorporating the ligands into a liquid, preferably an aqueous liquid, preferably a medium in which binding between a binding partner and a ligand and / or analog and extraction of free ligand (and / or free analog) can also take place by the extracting phase.

Een werkwijze voor het detecteren en/of meten van een ligand volgens de onderhavige uitvinding omvat de stap van het verschaffen van 5 een bindingspartner van genoemd ligand in genoemde vloeistof. De vakman zal begrijpen dat hiermee wordt voorzien dat een bindingspartner van het ligand in contact wordt gebracht met het ligand. Dit kan bijvoorbeeld geschieden door het ligand en de bindingspartner afzonderlijk toe te voegen aan een reactiemengsel waarin binding kan plaatsvinden. Ook is het 10 mogelijke om de bindingspartner aan een (vloeistof-)monster met het ligand toe te voegen en hiervan vervolgens een reactiemengsel te vormen.A method for detecting and / or measuring a ligand according to the present invention comprises the step of providing a binding partner of said ligand in said liquid. Those skilled in the art will understand that this provides for a ligand binding partner to be contacted with the ligand. This can be done, for example, by separately adding the ligand and binding partner to a reaction mixture in which binding can take place. It is also possible to add the binding partner to a (liquid) sample with the ligand and subsequently to form a reaction mixture.

Een werkwijze voor het detecteren en/of meten van een ligand volgens de onderhavige uitvinding omvat de stap van het onderwerpen van de vloeistof aan condities waarbij genoemd ligand kan binden aan genoemde 15 bindingspartner ter verschaffing van een hoeveelheid gebonden ligand en een hoeveelheid vrij ligand in de vloeistof. Met de vloeistof wordt hier uiteraard bedoeld de vloeistof die het ligand bevat, welke vloeistof de vorm van een reactiemengsel kan hebben.A method for detecting and / or measuring a ligand according to the present invention comprises the step of subjecting the fluid to conditions in which said ligand can bind to said binding partner to provide an amount of bound ligand and an amount of free ligand in the liquid. The liquid is of course here understood to mean the liquid containing the ligand, which liquid can take the form of a reaction mixture.

Met het onderwerpen van genoemd ligand aan condities waarbij 20 genoemd ligand kan binden wordt hier bedoeld dat de condities voor binding van het ligand aan de bindingspartner niet alleen moet worden gefaciliteerd, maar dat deze ook enige tijd moet worden onderhouden teneinde binding van ligand aan de bindingspartner en dientengevolge een evenwicht tussen gebonden en vrij ligand mogelijk te maken. Hierbij is dus 25 de pH, de temperatuur of een andere conditieparameter van belang en tevens de tijd gedurende welke de reactiecomponenten aan de condities voor binding worden blootgesteld. Geschikte perioden in dit verband zijn perioden variërend van enkele seconden tot enkele uren. Bij voorkeur wordt een dergelijke bindingsreactie uitgevoerd gedurende een periode van 30 ongeveer 1 tot ongeveer 24 uur. Hierbij dient in het oog te worden gehouden 1026678 20 dat de vorming van vrij ligand en gebonden ligand een evenwichtsreactie is waarbij de duur waarin het evenwicht zich instelt kan variëren van ligand tot ligand en van bindingspartner tot bindingspartner. De vakman zal bekend zijn met de mogelijkheden voor optimalisatie van zowel de 5 reactieomgeving als de reactieconditie aan de hand van de onderstaande beschrijving.By subjecting said ligand to conditions in which said ligand can bind, it is meant here that the conditions for binding the ligand to the binding partner must not only be facilitated, but must also be maintained for some time in order to bind ligand to the binding partner and, as a result, to allow a balance between bound and free ligand. The pH, the temperature or another condition parameter is therefore important here and also the time during which the reaction components are exposed to the conditions for binding. Suitable periods in this regard are periods ranging from a few seconds to a few hours. Preferably, such a binding reaction is conducted over a period of about 1 to about 24 hours. It should be borne in mind here that the formation of free ligand and bound ligand is an equilibrium reaction in which the duration in which the equilibrium is adjusted can vary from ligand to ligand and from binding partner to binding partner. The skilled person will be familiar with the possibilities for optimization of both the reaction environment and the reaction condition on the basis of the description below.

Een werkwijze voor het detecteren en/of meten van een ligand volgens de onderhavige uitvinding omvat voorts de stap van het onderwerpen van genoemde oplossing aan verwaarloosbare depletie 10 extractie waarbij een deel van de hoeveelheid vrij ligand door genoemde extraherende fase wordt geëxtraheerd. Hiertoe dient de vloeistof, d.w.z. het reactiemengsel met daarin de vrije en gebonden liganden, in contact te worden gebracht met een extraherende fase. Uiteraard is het ook mogelijk dat de vloeistof zich reeds in contact met de extraherende fase bevindt en 15 dat later een andere reactiecomponent, zoals een bindingspartner, wordt toegevoegd. Een dergelijke extraherende fase kan een extraherend oppervlak omvatten. Zo kan het oppervlak van een (holle) vezel een extraherende fase omvatten waarin extractie plaats kan vinden wanneer de vezel in contact wordt gebracht met het reactiemengsel. Ook kan het 20 oppervlak van de binnenzijde van een reactievat een extraherende fase omvatten waarin extractie plaats kan vinden. Dergelijke extraherende fases kunnen zeer geschikt in de vorm van een bekleding of deklaag worden aangebracht op een oppervlak dat in contact kan worden gebracht met het reactiemengsel waardoor aan dat oppervlak extraherende eigenschappen 25 worden verschaft. Geschikte bekledingen of deklagen omvatten bij voorkeur lipofiele polymeren zoals bijvoorbeeld polysiloxanen. Ook andere polymeren, zoals polyacrylaten, divinylbenzeen, gecarboxyleerd PVC, celluloseacetaat, mengsels van polymeren, "molecular imprinted polymeren" (MIPs), eiwitreceptoren als (strept-)avidine kunnen als extraherende fase worden 30 toegepast. Bij voorkeur worden polymeren zoals polydimethylsiloxaan 1026678 21 (PDMS) toegepast, bij grotere voorkeur met een Log Kd voor het analoog van tussen 1 en 8, bij voorkeur tussen 2 en 5.A method for detecting and / or measuring a ligand according to the present invention further comprises the step of subjecting said solution to negligible depletion extraction wherein part of the amount of free ligand is extracted by said extracting phase. To this end, the liquid, i.e. the reaction mixture containing the free and bound ligands, must be contacted with an extracting phase. It is of course also possible that the liquid is already in contact with the extracting phase and that another reaction component, such as a binding partner, is added later. Such an extracting phase can comprise an extracting surface. For example, the surface of a (hollow) fiber may comprise an extracting phase in which extraction can take place when the fiber is brought into contact with the reaction mixture. The surface of the inside of a reaction vessel can also comprise an extracting phase in which extraction can take place. Such extracting phases can very suitably be applied in the form of a coating or coating on a surface that can be brought into contact with the reaction mixture, thereby providing extracting properties to that surface. Suitable coatings or coatings preferably comprise lipophilic polymers such as, for example, polysiloxanes. Other polymers, such as polyacrylates, divinylbenzene, carboxylated PVC, cellulose acetate, mixtures of polymers, molecular imprinted polymers (MIPs), protein receptors such as (strept-) avidin can be used as an extracting phase. Preferably polymers such as polydimethylsiloxane 1026678 21 (PDMS) are used, more preferably with a Log Kd for the analog of between 1 and 8, preferably between 2 and 5.

Een zeer geschikte bekledingslaag wordt gevormd door een substraat-geïmmobiliseerd polynucleotide dat complementair is aan een 5 (deel van) een te meten of te detecteren polynucleotide ligand, of waaraan een ligand op een andere wijze kan binden. Het substraat-geïmmobiliseerde polynucleotide kan bijvoorbeeld worden geïmmobiliseerd op de binnenzijde van een reactievat (bijv. de houder volgens de uitvinding) met behulp van een (strept-)avidine-coating aangebracht op het substraat en een biotine 10 label aangebracht aan het polynucleotide.A very suitable coating layer is formed by a substrate-immobilized polynucleotide that is complementary to a (part of) a polynucleotide ligand to be measured or detected, or to which a ligand can bind in some other way. The substrate-immobilized polynucleotide can for example be immobilized on the inside of a reaction vessel (e.g. the container according to the invention) using a (strept) avidin coating applied to the substrate and a biotin label applied to the polynucleotide.

In de onderstaande paragraaf wordt het werkingsprincipe van de extractie uiteengezet aan de hand van het ligand (L). De vakman zal begrijpen dat hetzelfde geldt voor het (eventueel) aanwezige analoog (A). Door de (vaste-fase) extractie wordt een fractie van het ongebonden, vrij in 15 oplossing aanwezige ligand (L°p0 uit genoemde oplossing verwijderd doordat een fractie van het ongebonden, vrij in oplossing aanwezig ligand in een extraherende fase wordt geëxtraheerd. Volgens de te volgen methodiek wordt echter een relatief klein gedeelte van de zich vrij in oplossing bevindende liganden door de extraherende fase geëxtraheerd, zodat de 20 evenwichtsreacties tussen bindingspartner en ligand slechts in relatief geringe mate wordt beïnvloed. In een werkwijze volgens de onderhavige uitvinding wordt het reactiemengsel daarom onderworpen aan verwaarloosbare depletie extractie waarbij een extraherende fase wordt toegepast die slechts een klein gedeelte van de zich vrij in oplossing 25 bevindende liganden kan binden teneinde te voorzien in verwaarloosbare depletie van de fractie vrije liganden en/of analogen. Het is dus van belang dat de capaciteit (dat wil onder andere zeggen, de combinatie van affiniteit en hoeveelheid) van de toegepaste extraherende fase om vrij in oplossing aanwezige liganden te binden, beperkt is en zodanig is gekozen dat er een 30 beperkte extractie plaatsvindt. Om deze capaciteit (dat wil onder andere 1026678 22 zeggen, de extractie-efficiëntie) te beperken kan de hoeveelheid van de extraherende fase beperkt worden, bijvoorbeeld door de dikte van een extraherende bekledingslaag of het oppervlak van een extraherende bekledingslaag in omvang te beperken of door bijvoorbeeld de hoeveelheid 5 van een extraherende bekledingslaag die aan een binnenwand van een reactievat is aangebracht te beperken. In een voorkeursuitvoeringsvorm wordt in een werkwijze volgens de uitvinding een reactiemengsel in contact gebracht met een extraherende fase die zich aan de binnenzijde van een reactievat (vloeistofhouder) bevindt en die een extraherende polysiloxaan in 10 de vorm van een deklaag omvat waarvan de hoeveelheid beperkt is zodat slechts een klein gedeelte van de vrije liganden daardoor kan worden geëxtraheerd. De beperking in de capaciteit (dat wil onder andere zeggen, de extractie-efficiëntie) van de extraherende fase om vrije liganden te extraheren is in ieder geval dusdanig dat minder dan 20%, bij voorkeur 15 minder dan 10%, bij grotere voorkeur minder dan 1% van de totale hoeveelheid aanwezige vrije liganden door de extraherende fase kan worden geëxtraheerd. Bij voorkeur wordt meer dan 0,001% van de fractie vrije liganden door de extraherende fase geëxtraheerd. Bij voorkeur is de hoeveelheid van de extraherende fase in combinatie met de extraherende 20 capaciteit van de extraherende fase exact bekend zodat bekend is welke fractie van het totaal aantal vrije liganden in potentie kan worden geëxtraheerd. Deze fractie kan makkelijk bepaald worden in een controle experiment. De extractie van de vrije liganden (L°p0 door de extraherende fase kan in hoofdzaak door absorptie plaatsvinden, maar ook adsorptie, 25 aanhechting of binding is geschikt. De hoeveelheid extraherende fase die wordt toegepast om een vooraf bepaalde fractie (bijvoorbeeld ongeveer 5%) of bepaalde hoeveelheid van de vrije liganden (L°p1) daarvan door de extraherende fase te extraheren, is afhankelijk van de partitiecoëfficiënt (Kd) van de toegepaste extraherende fase. Bij een partitiecoëfficiënt van 10 30 zal de verhouding tussen de hoeveelheid (concentratie) door extraherende 1026678 23 fase geëxtraheerd ligand (L^030) ten opzichte van de hoeveelheid (concentratie) vrij in oplossing aanwezig ligand (L°p0 10:1 bedragen. De vakman zal op basis hiervan een hoeveelheid (concentratie) toe te passen extraherende fase kunnen definiëren. Omdat de extraherende fase in eerste 5 instantie wordt aangewend om vrije liganden (L0?*) uit de vloeistof te extraheren is de extraherende fase in hoofdzaak dusdanig dat daaraan geen gebonden (geconjugeerd) ligand (LconJ) wordt gebonden en tevens bij voorkeur geen vrije bindingspartner. Hierin kan worden voorzien door een extraherende fase te verschaffen waarin de gebonden liganden (de 10 conjugaten) (Lconf) en bij voorkeur tevens vrije bindingspartners door hun grootte niet kunnen doordringen, maar waarin vrije liganden (Z/v*) wel kunnen doordringen, bijvoorbeeld door middel van diffusie en vervolgens kunnen absorberen. In een werkwijze volgens de uitvinding waarin een analoog wordt toegepast is het analoog bij voorkeur een detecteerbare vorm 15 van het ligand, bijvoorbeeld een gelabelde vorm.In the paragraph below, the working principle of the extraction is explained on the basis of the ligand (L). Those skilled in the art will understand that the same applies to the analogue (A) present (if any). By the (solid phase) extraction, a fraction of the unbound free ligand present in solution (L0 p0) is removed from said solution by extracting a fraction of the unbound free ligand present in solution in an extracting phase. However, a relatively small proportion of the free-solution ligands to be followed is extracted by the extracting phase, so that the equilibrium reactions between binding partner and ligand are influenced only to a relatively small extent. In a method according to the present invention, the reaction mixture is therefore subjected to negligible depletion extraction using an extracting phase that can only bind a small portion of the free-standing ligands to provide negligible depletion of the fraction of free ligands and / or analogues, so it is important that the capacity (that is, among other things, the combination of affinity and amount) of the extracting phase used to bind free ligands present in solution, is limited and is chosen such that limited extraction takes place. In order to limit this capacity (i.e., among others 1026678 22, the extraction efficiency), the amount of the extracting phase can be limited, for example by limiting the thickness of an extracting coating layer or the surface of an extracting coating layer or by for example, to limit the amount of an extracting coating layer applied to an inner wall of a reaction vessel. In a preferred embodiment, in a method according to the invention, a reaction mixture is brought into contact with an extracting phase which is on the inside of a reaction vessel (liquid container) and which comprises an extracting polysiloxane in the form of a cover layer, the amount of which is limited so that only a small portion of the free ligands can thereby be extracted. The limitation in the capacity (i.e., the extraction efficiency) of the extracting phase to extract free ligands is in any case such that less than 20%, preferably less than 10%, more preferably less than 1% of the total amount of free ligands present can be extracted through the extracting phase. Preferably, more than 0.001% of the fraction of free ligands is extracted through the extracting phase. Preferably, the amount of the extracting phase in combination with the extracting capacity of the extracting phase is precisely known so that it is known which fraction of the total number of free ligands can potentially be extracted. This fraction can easily be determined in a control experiment. The extraction of the free ligands (L ° p0 through the extracting phase can mainly take place through absorption, but also adsorption, attachment or binding is suitable. The amount of extracting phase that is applied to a predetermined fraction (for example about 5%) or certain amount of its free ligands (L ° p1) thereof by extracting the extracting phase is dependent on the partition coefficient (Kd) of the extracting phase used.With a partition coefficient of 10, the ratio between the amount (concentration) will extracting 1026678 23 phase extracted ligand (L ^ 030) with respect to the amount (concentration) of free ligand present in solution (L ° p0 10: 1. The skilled person will be able to use an amount of (extracting) extractable phase based on this Because the extracting phase is used in the first instance to extract free ligands (L0? *) from the liquid, the extracting phase is essentially such that no bound (conjugated) ligand (LconJ) is bound to it and, preferably, no free binding partner. This can be provided by providing an extracting phase in which the bound ligands (the conjugates) (Lconf) and preferably also free binding partners cannot penetrate due to their size, but in which free ligands (Z / v *) can penetrate, for example by diffusion and then being able to absorb. In a method according to the invention in which an analog is used, the analog is preferably a detectable form of the ligand, for example a labeled form.

Een werkwijze voor het detecteren en/of meten van een ligand volgens de onderhavige uitvinding omvat ten slotte de stap van het detecteren en/of meten van het geëxtraheerde ligand. De bepaling daarvan kan bijvoorbeeld plaatsvinden door de vloeistof waarin zich vrij ligand 20 bevindt te scheidén van de extraherende fase en de hoeveelheid ligand in de extraherende fase te bepalen. De bepaling kan plaatsvinden door toepassing van bijvoorbeeld chromatografische, (massa)spectrometrische, fluorimetrische en radiochemische detectie technieken.A method for detecting and / or measuring a ligand according to the present invention finally comprises the step of detecting and / or measuring the extracted ligand. The determination thereof can for instance take place by separating the liquid in which free ligand 20 is present from the extracting phase and determining the amount of ligand in the extracting phase. The determination can be made by applying, for example, chromatographic, (mass) spectrometric, fluorometric and radiochemical detection techniques.

Een alternatieve werkwijze voor het detecteren en/of meten van 25 een ligand volgens de onderhavige uitvinding maakt gebruik van een detecteerbaar analoog, welke werkwijze in principe dezelfde stappen omvat als die welke hierboven zijn uiteengezet. Deze alternatieve werkwijze omvat de stap van a) het verschaffen van een bindingspartner van genoemd ligand en een detecteerbaar analoog van genoemd ligand in de vloeistof. Dit kan op 30 overeenkomstige wijze geschieden als bovenbeschreven.An alternative method for detecting and / or measuring a ligand according to the present invention uses a detectable analog, which method basically comprises the same steps as those set forth above. This alternative method comprises the step of a) providing a binding partner of said ligand and a detectable analog of said ligand in the fluid. This can be done in a similar manner as described above.

1026678 241026678 24

De alternatieve werkwijze omvat voorts de stap van b) het toestaan van het optreden van competitieve binding tussen genoemd ligand en genoemd analoog aan genoemde bindingspartner ter verschaffing van een hoeveelheid gebonden analoog en een hoeveelheid vrij analoog in genoemde 5 vloeistof. Deze stap is in principe dezelfde als de stap van het onderwerpen van de vloeistof aan condities waarbij het ligand kan binden aan de bindingspartner ter verschaffing van een hoeveelheid gebonden ligand en een hoeveelheid vrij ligand, met dat verschil dat in de aanwezigheid van analoog er competitie om bindingsplaatsen tussen ligand en analoog zullen 10 optreden.The alternative method further comprises the step of b) allowing the occurrence of competitive binding between said ligand and said analog to said binding partner to provide an amount of bound analog and an amount of free analog in said liquid. This step is basically the same as the step of subjecting the fluid to conditions where the ligand can bind to the binding partner to provide an amount of bound ligand and an amount of free ligand, with the difference that in the presence of analogue there is competition for binding sites between ligand and analog will occur.

De alternatieve werkwijze omvat voorts de stap van c) het onderwerpen van de vloeistof aan verwaarloosbare depletie extractie waarbij een deel van de hoeveelheid vrij analoog door genoemde extraherende fase wordt geëxtraheerd. Voor deze stap geldt wederom dat de 15 uitvoering daarvan grotendeels overeenkomstig bovenomschreven kan worden uitgevoerd.The alternative method further comprises the step of c) subjecting the liquid to negligible depletion extraction wherein a portion of the amount of free analog is extracted through said extracting phase. For this step, it again applies that the implementation thereof can largely be carried out in accordance with the above described.

De alternatieve werkwijze omvat tenslotte de stap van d) het detecteren en/of meten van het geëxtraheerde analoog. Deze stap verschaft een voordeel boven de eerstgenoemde variant van de werkwijze omdat 20 hierin van een detecteerbaar analoog kan worden toegepast, dat op veel eenvoudiger wijze is te detecteren en/of te meten dan het ligand in de eerste werkwijze. Dus, een werkwijze volgens de uitvinding kan de stap omvatten van het detecteren van de door de extraherende fase geëxtraheerde fractie van het analoog van het te onderzoeken ligand Deze stap heeft als 25 doel de fractie (concentratie) van het vrije analoog in oplossing (A°p0 te bepalen teneinde daaruit de fractie van het analoog dat aan de bindingspartner is gebonden (AconJ) te kunnen bepalen. Voor het analoog geldt A = A°ijl + Aconj + Auf°se, waarin A is het analoog, A°p1 is de fractie vrij analoog in oplossing, AconJ is de fractie gebonden analoog, A^ase is de fractie 30 analoog in extraherende fase.The alternative method finally comprises the step of d) detecting and / or measuring the extracted analog. This step provides an advantage over the first-mentioned variant of the method because it is possible to use herein a detectable analogue that can be detected and / or measured in a much simpler way than the ligand in the first method. Thus, a method according to the invention may comprise the step of detecting the fraction of the analog of the ligand to be investigated extracted by the extracting phase. This step aims at the fraction (concentration) of the free analog in solution (A ° determine p0 in order to determine therefrom the fraction of the analogue bound to the binding partner (AconJ.) For the analogue, A = A ° ile + Aconj + Auf ° se, where A is the analog, A ° p1 is the fraction free analog in solution, AconJ is the fraction bound analog, A ^ ase is the fraction analog in extracting phase.

1026678 251026678 25

Voor het ligand geldt L = L°i)l + Lc0,lJ + L0/**8*, waarin L is het ligand, L°p1 is de fractie vrij ligand in oplossing, Lconi is de fractie gebonden ligand en Lvfaseis de fractie ligand in extraherende fase.For the ligand, L = L ° i) 1 + Lc0, 1J + L0 / ** 8 *, where L is the ligand, L ° p1 is the free ligand fraction in solution, Lconi is the bound ligand fraction and Lv phase is the fraction ligand in extracting phase.

Door meting van de door de extraherende fase geëxtraheerde 5 fractie van het analoog (A"/**) is daarmee de hoeveelheid ligand in de oplossing (A°p0 te bepalen. De fractie van het vrije analoog in oplossing (A°p0 verhoudt zich immers tot de door de extraherende fase geëxtraheerde fractie van het analoog (Αυ^ε) als bepaald door de partitiecoëffiënt van die extraherende fase en door de hoeveelheid extraherende fase die is toegepast. 10 De hoeveelheid gebonden analoog (AC0"J) volgt daaruit.By measuring the fraction of the analogue (A "/ **) extracted by the extracting phase, it is possible to determine the amount of ligand in the solution (A ° p0. The fraction of the free analogue in solution (A ° p0 relates to after all, to the fraction of the analogue (Αυ ^ ε) extracted by the extracting phase as determined by the partition coefficient of that extracting phase and by the amount of extracting phase used. The amount of bound analogue (AC0 "J) follows from this.

De vakman zal inzien dat er een aantal mogelijkheden zijn om L te bepalen. L kan bijvoorbeeld worden bepaald door gebruik te maken van een ijklijn, dat wil zeggen, door calibratie van het assay met ten minste twee bekende concentraties van ligand L, waaruit een onbekende concentratie L 15 kan worden "afgelezen". In de onderhavige beschrijving wordt in dit geval gesproken van een stap van "het meten van (de concentratie van) een ligand". Een dergelijke meting kan dus een kwantitatieve meting omvatten.Those skilled in the art will recognize that there are a number of options for determining L. For example, L can be determined by using a calibration line, that is, by calibrating the assay with at least two known concentrations of ligand L, from which an unknown concentration of L can be "read". In the present description, in this case it is referred to a step of "measuring (the concentration of) a ligand". Such a measurement can therefore include a quantitative measurement.

Een alternatieve methode om L te bepalen houdt verband met het detecteren van L in kwalitatieve zin. Indien verdringing van Aconi in de 20 oplossing optreedt zal een verhoging van A°i}l optreden. Aangezien verdringing alleen optreedt in aanwezigheid van L, kan de waarneming van een verhoging van A°p1 worden toegepast voor de kwalitatieve detectie van L.An alternative method to determine L is related to the detection of L in a qualitative sense. If displacement of Aconi occurs in the solution, an increase of A10 will occur. Since displacement only occurs in the presence of L, the observation of an increase of A ° p1 can be applied for the qualitative detection of L.

Detectie van de door de extraherende fase geëxtraheerde fractie van het analoog (Ah'fasc) kan bijvoorbeeld plaatsvinden door het 25 reactiemengsel of de oplossing, met daarin o.a. de vrij in oplossing verkerende liganden en analogen en de gebonden liganden en analogen, van de extraherende fase te scheiden, het detecteerbaar analoog uit te extraherende fase te verwijderen, bijvoorbeeld door toepassing van een organisch oplosmiddel, en de aldus vrijgemaakte analoog te detecteren, 30 waarbij de wijze van detectie afhankelijk zal zijn van het toegepaste label.Detection of the fraction of the analogue (Ah'fasc) extracted by the extracting phase can be carried out, for example, by the reaction mixture or the solution, including, inter alia, the free-solution ligands and analogues and the bound ligands and analogues of the extracting phase to remove the detectable analogue from the extracting phase, for example by using an organic solvent, and to detect the analogue thus released, the method of detection being dependent on the label used.

1026678 261026678 26

Detectie kan plaatsvinden door toepassing van bijvoorbeeld chromatografïsche, (massa)spectrometrische, fluorimetrische en radiochemische detectietechnieken.Detection can take place by applying, for example, chromatographic, (mass) spectrometric, fluorometric and radiochemical detection techniques.

Detectie van de door de extraherende fase geëxtraheerde fractie 5 van het ligand (Lvfase) en/of analoog (Ai;f°se) kan evenwel ook plaatsvinden door het reactiemengsel of de oplossing van de extraherende fase te scheiden en het ligand en/of analoog te detecteren zonder het ligand en/of analoog uit te vaste fase te verwijderen. Hiertoe kan bijvoorbeeld een "scintillation proximity assay" (SPA) worden toegepast zoals onder andere beschreven in 10 WO 02/101084.However, detection of the fraction of the ligand (Lv phase) and / or analog (Ai; f ° se) extracted by the extracting phase can also be effected by separating the reaction mixture or the solution from the extracting phase and the ligand and / or analogue to detect without removing the ligand and / or analogue from the solid phase. For this purpose, for example, a "scintillation proximity assay" (SPA) can be used as described, inter alia, in WO 02/101084.

Het "scintillation proximity assay" is gebaseerd op het gegeven dat β stralen die worden uitgezonden door verbindingen die zijn gelabeld met zwakke radio-isotopen (zoals 3H, 125I, 33P en 35S) slechts een beperkte afstand in een waterig milieu kunnen overbruggen voordat hun energie 15 volledig verloren is gegaan. Deze emissies kunnen echter wel met hoge gevoeligheid worden gedetecteerd indien de met radio-isotopen gelabelde verbindingen in de directe nabijheid worden gebracht van een extraherende fase die voorzien is van een scintillator (zoals bijvoorbeeld 2,5 diphenyloxazol) waardoor een specifieke emissie wordt verkregen.The "scintillation proximity assay" is based on the fact that β rays emitted from compounds labeled with weak radioisotopes (such as 3H, 125I, 33P and 35S) can only bridge a limited distance in an aqueous environment before their energy 15 has been completely lost. However, these emissions can be detected with high sensitivity if the radioisotope-labeled compounds are brought in close proximity to an extracting phase which is provided with a scintillator (such as, for example, 2.5 diphenyloxazole), whereby a specific emission is obtained.

20 Radiogelabelde verbindingen die zich vrij in oplossing bevinden worden niet gedetecteerd omdat zij te ver verwijderd zijn van de scintillerende extraherende fase. SPA technologie is onder andere commercieel beschikbaar onder de naam FlashPlate® van NEN Life Science Products.Radiolabeled compounds that are free in solution are not detected because they are too far away from the scintillating extracting phase. SPA technology is commercially available under the name FlashPlate® from NEN Life Science Products.

De onderhavige uitvinding heeft verder betrekking op een 25 vloeistofhouder voor het detecteren en meten van een ligand in een vloeistof, welke houder voorzien is van een extraherende fase met het vermogen om het ligand uit de vloeistoffase te extraheren en welke houder voorts voorzien is van detectiemiddelen. Een dergelijk vloeistofhouder kan bijvoorbeeld een bodem, wanden en een opening omvatten, waarin de wanden voor ten 30 minste een deel voorzien zijn van de extraherende fase. In een 1026678 27 voorkeursuitvoeringsvorm is de extraherende fase voorzien van de detectiemiddelen, zoals bijvoorbeeld scintillatoren voor de detectie van radio-isotopen.The present invention further relates to a liquid container for detecting and measuring a ligand in a liquid, which container is provided with an extracting phase with the capacity to extract the ligand from the liquid phase and which container is furthermore provided with detection means. Such a liquid container can for instance comprise a bottom, walls and an opening, in which at least part of the walls are provided with the extracting phase. In a preferred embodiment, the extracting phase is provided with the detection means, such as, for example, scintillators for the detection of radioisotopes.

Geschikte primaire scintillatoren zijn o.a. organische verbindingen 5 met fenyl-, nafthyl-, en/of bifenyl-groepen, en oxazol en oxadiazol en aanverwante stoffen. Als (vaste) scintillator worden bij voorkeur verbindingen als 2,5 difenyloxazol (PPO), butylfenylbifenyloxadiazol (butyl-PBD), en p-terfenyl (TP). toegepast. Geschikte secondaire scintillatoren zijn o.a.difenyloxazolylbenzol (POPOP), l,4-bis(2-methylstyryl)benzol (bis-MSB), 10 2-(l-nafthyl)-5-fenyloxazol (NPO), dibifenyloxazol (BBO), difenylhexatrieen (DPH) of tetraphenylbutadieen (TPB)).Suitable primary scintillators include organic compounds with phenyl, naphthyl, and / or biphenyl groups, and oxazole and oxadiazole and related substances. As (solid) scintillator, compounds such as 2.5 diphenyloxazole (PPO), butylphenylbiphenyloxadiazole (butyl-PBD), and p-terphenyl (TP) are preferably used. applied. Suitable secondary scintillators are oadiphenyloxazolyl benzol (POPOP), 1,4-bis (2-methylstyryl) benzol (bis-MSB), 2- (1-naphthyl) -5-phenyloxazole (NPO), dibiphenyloxazole (BBO), diphenylhexatrienes ( DPH) or tetraphenylbutadiene (TPB)).

De scintillator kan op ieder bekende wijze worden toegepast en kan bijvoorbeeld zeer geschikt in een bekledingslaag worden aangebracht. Een werkwijze voor het aanbrengen van een scintillator in een bekledingslaag 15 kan bijvoorbeeld het mengen van een geschikt polymere of vaste fase met een geschikte scintillator en het aanbrengen van een laag van genoemd mengsel op een drager, zoals de wand van de onderhavige houder, omvatten, eventueel gevolgd door uitharding van de aldus aangebrachte deklaag.The scintillator can be used in any known manner and can, for example, very suitably be applied in a coating layer. A method of applying a scintillator in a coating layer 15 may, for example, include mixing a suitable polymeric or solid phase with a suitable scintillator and applying a layer of said mixture to a support, such as the wall of the present container, optionally followed by curing of the coating thus applied.

In een voorkeursuitvoeringsvorm wordt een gedeelte van de 20 binnenzijde van de houder bekleed met een lipofiele polymeer zoals bijvoorbeeld een polysiloxaan of andere lipofiele polymeer zoals boven omschreven en wordt daarin een scintillator toegepast voor detectie van zwakke radio-isotopen (zoals 3H, 125I, 33P en 35S). Bij voorkeur worden polymeren zoals polydimethylsiloxaan (PDMS) toegepast, bij grotere 25 voorkeur met een Log Kd van 2 of hoger.In a preferred embodiment, a portion of the inside of the container is coated with a lipophilic polymer such as, for example, a polysiloxane or other lipophilic polymer as described above, and a scintillator is used therein for detection of weak radioisotopes (such as 3H, 125 I, 33 P and 35S). Preferably polymers such as polydimethylsiloxane (PDMS) are used, more preferably with a Log Kd of 2 or higher.

De houder behoeft geen conventionele vloeistofhouder te zijn. De vloeistofhouder kan bijvoorbeeld tevens een holle vezel zijn of een polystyreen of glazen houder in de vorm van een microtiterplaat, zoals een 96 wells plaat. Dit maakt de onderhavige uitvinding zeer geschikt voor high 30 throughput screening assays.The container does not have to be a conventional liquid container. The liquid container can for example also be a hollow fiber or a polystyrene or glass container in the form of a microtiter plate, such as a 96-well plate. This makes the present invention very suitable for high throughput screening assays.

1026678 281026678 28

Middels een werkwijze volgens de uitvinding kunnen liganden in een vloeistof kwalitatief en kwantitatief worden gedetecteerd. Voorts kunnen door toepassing van een werkwijze volgens de uitvinding bindingsexperimenten worden uitgevoerd, bijvoorbeeld in screeningsreacties 5 waarbij het detecteren van radioactiviteit middels toepassing van een vloeistofhouder volgens de uitvinding een aanduiding voor binding en/of competitie is. Op die wijze kunnen tevens nieuwe potentiële actieve stoffen worden geïdentificeerd die aan bepaalde receptoren binden. De werkwijze kan toegepast worden als analytisch chemische bepaling. Tevens kan de 10 werkwijze toegepast worden bij de bepaling van partitiecoëfficiënten tussen een bepaalde stof en water zoals voor bepaling van plasma binding van farmaca van belang is binnen de farmacokinetiek.By means of a method according to the invention, ligands in a liquid can be qualitatively and quantitatively detected. Furthermore, by using a method according to the invention, binding experiments can be carried out, for example in screening reactions, wherein the detection of radioactivity by using a liquid container according to the invention is an indication of binding and / or competition. In this way, new potential active substances can also be identified that bind to certain receptors. The method can be applied as an analytical chemical determination. The method can also be used in the determination of partition coefficients between a certain substance and water, such as is important for the determination of plasma binding of drugs within pharmacokinetics.

De uitvinding heeft voorts betrekking op een testkit voor het detecteren en/of meten van een ligand in een vloeistof, omvattende een 15 vloeistofhouder volgens de uitvinding. De testkit kan voorts een instructie-folder omvatten waarin de toepassingsmogelijkheden van de testkit alsmede bijvoorbeeld een geschikte werkwijze voor het detecteren en/of meten van een ligand in een vloeistof is beschreven. In een voorkeursuitvoeringsvorm omvat de testkit één of meerdere geschikte bindingspartners voor een te 20 detecteren/en of te meten ligand. In een andere voorkeursuitvoeringsvorm omvat de testkit één of meerdere geschikte analogen. Uiteraard kunnen de verschillende componenten in combinatie zijn omvat in een testkit volgens de uitvinding. De bindingspartners en analogen kunnen op iedere geschikte wijze zijn verpakt. Verschillende bijkomende materialen zullen in veel 25 gevallen worden toegepast in een werkwijze die wordt uitgevoerd met behulp van een vloeistofhouder volgens de uitvinding en kunnen aanwezig zijn in een kit. Verscheidene reagentia zoals reactiebuffers, zullen in de meeste gevallen aanwezig zijn in een test medium, en ook stabilisatoren voor het testmedium en de testcomponenten. In veel gevallen zullen naast 30 deze bijkomende materialen aanvullingen zijn omvat, bijvoorbeeld 1026678 29 aanvullende eiwitten, zoals albuminen; surfactanten, in het bijzonder niet-ionische surfactanten; binding bevorderaars, bijv. polyalkyleen glycolen en dextranen; conserveermiddelen; en antimicrobiële middelen, en dergelijke. De testkit kan worden toegepast voor diagnostiek en onderzoek zoals 5 bovenbeschreven.The invention furthermore relates to a test kit for detecting and / or measuring a ligand in a liquid, comprising a liquid container according to the invention. The test kit may further comprise an instruction leaflet describing the application possibilities of the test kit as well as for example a suitable method for detecting and / or measuring a ligand in a liquid. In a preferred embodiment, the test kit comprises one or more suitable binding partners for a ligand to be detected and / or to be measured. In another preferred embodiment, the test kit comprises one or more suitable analogs. The various components can of course be included in combination in a test kit according to the invention. The binding partners and analogs can be packaged in any suitable manner. Various additional materials will in many cases be used in a method which is carried out with the aid of a liquid container according to the invention and can be present in a kit. Various reagents, such as reaction buffers, will in most cases be present in a test medium, and also stabilizers for the test medium and the test components. In many cases additions to these additional materials will be included, for example 1026678 29 additional proteins, such as albumin; surfactants, in particular non-ionic surfactants; binding promoters, e.g. polyalkylene glycols and dextrans; preservatives; and antimicrobials, and the like. The test kit can be used for diagnostics and research as described above.

VOORBEELDENEXAMPLES

Voorbeeld 1. Competitieve binding assav van estradiol in competitie met 10 estriol in aanwezigheid van een E2-antiserum.Example 1. Competitive binding assav of estradiol in competition with estriol in the presence of an E2 antiserum.

In het onderhavige voorbeeld wordt estriol als ligand en [3Η]17β-estradiol als analoog toegepast om de binding van estriol aan E2-antiserum in een buffer te bepalen.In the present example, estriol is used as a ligand and [3Η] 17β-estradiol is used as an analog to determine the binding of estriol to E2 antiserum in a buffer.

Een [3H]17p-estradiol verdunning met een gewenste concentratie 15 van ca. 40pg/10pl (overeenkomend met ca 25.000 DPM/ΙΟμΙ) wordt toegepast.A [3 H] 17β-estradiol dilution with a desired concentration of approximately 40pg / 10 µl (corresponding to approximately 25,000 DPM / μμΙΟ) is used.

Een standaardreeks, omvattende 12 standaardconcentraties (0-1600 pg/ml ligand, wordt samengesteld door een bekende hoeveelheid ligand in een bekende hoeveelheid Tris/BSA-werkbuffer (0,01 mol/1 Tris-HCl 20 [pH 7,5]; lmg/ml BSA) op te lossen. Elke standaardconcentratie heeft een dusdanige concentratie dat 200 μΐ daarvan de gewenste concentratie van de standaardreeks geeft.A standard series comprising 12 standard concentrations (0-1600 pg / ml ligand) is composed by a known amount of ligand in a known amount of Tris / BSA working buffer (0.01 mol / 1 Tris-HCl 20 [pH 7.5]; 1 mg) / ml BSA) Each standard concentration has a concentration such that 200 μΐ gives the desired concentration of the standard series.

Als antiserum is een 5.000x verdunde oplossing gebruikt van konijnenserum opgewekt tegen estradiol (rabbit anti-estradiol) De vakman 25 zal bekend zijn met de mogelijkheden om een anti-estradiol antiserum afkomstig van konijnen te maken.As an antiserum, a 5,000x diluted solution of rabbit serum raised against estradiol (rabbit anti-estradiol) has been used. Those skilled in the art will be familiar with the possibilities of making an anti-estradiol antiserum derived from rabbits.

Een glazen (injectie)vial (Packard, miniature vial 6 ml) werd voorzien van een PDMS coating. De PDMS coating heeft de functie van extraherend oppervlak.A glass (injection) vial (Packard, miniature vial 6 ml) was provided with a PDMS coating. The PDMS coating has the function of extracting surface.

1026678 301026678 30

De gecoate vials worden gevuld met 200μ1 van het desbetreffende standaardconcentratie, ΙΟμΙ van de werktracer en ΙΟΟμΙ van de antiserumwerkverdunning (5.000x). De vials worden aangevuld met Tris/BSA werkbuffer tot een totaal volume van lml per vial. Vervolgens 5 worden de vials geïncubeerd (dit kan bijvoorbeeld overnacht bij ca. 4°C of 90 minuten bij 37°C).The coated vials are filled with 200μ1 of the relevant standard concentration, ΙΟμΙ of the work tracer and ΙΟΟμΙ of the antiserum work dilution (5,000x). The vials are supplemented with Tris / BSA work buffer to a total volume of lml per vial. The vials are then incubated (this can for example be overnight at approximately 4 ° C or 90 minutes at 37 ° C).

Na incubatie wordt de inhoud van de vials verwijderd waarna de vial veelvuldig worden gespoeld met demi water. Uiteindelijk worden de lege vials gevuld met ca. 1,5 ml scintillatie vloeistof (Optiphase Hisafe II, 10 Wallac) en geteld m.b.v. een Liquid Scintillation Counter (LSC).After incubation, the contents of the vials are removed, after which the vial is frequently rinsed with demi water. Finally the empty vials are filled with approx. 1.5 ml scintillation fluid (Optiphase Hisafe II, 10 Wallac) and counted using a Liquid Scintillation Counter (LSC).

De gemeten counts, aanwezig in de coating, worden in een grafiek uitgezet tegen de logaritmische schaal van de ongelabelde competitorconcentratie waardoor de bekende “S”-curve wordt verkregen. Figuur 1 toont een S-curve van het antiserum/estradiol-estriol assay.The measured counts present in the coating are plotted against the logarithmic scale of the unlabeled competitor concentration, resulting in the known "S" curve. Figure 1 shows an S curve of the antiserum / estradiol-estriol assay.

15 Bovenstaand voorbeeld beschrijft een eenvoudige, snelle en nauwkeurige methode om bijvoorbeeld stoffen die verdacht worden van estrogeniteit, te testen op estrogeniteit.The above example describes a simple, fast and accurate method for, for example, testing substances suspected of estrogenity for estrogenity.

20 Voorbeeld 2. Analyse van de vrije oligonucleotiden concentratie in bloedplasma met behulp van streptavidine-gecoate microtiterplaten. Algemeen principe:Example 2. Analysis of the free oligonucleotide concentration in blood plasma using streptavidin-coated microtiter plates. General principle:

Een streptavidine gecoate microtiterplaat wordt gecoat met een oligonucleotide-template als extraherende fase. Deze oligonucleotide -25 template heeft, afhankelijk van het aantal nucleotiden, een bepaalde oligonucleotide ketenlengte en dient als "capture" oligo van een te onderzoeken oligonucleotide ligand. Ter immobilisatie van de extraherende fase is aan één uiteinde van de oligonucleotide-template een biotinemolecuul gekoppeld waarmee de oligonucleotide-template aan het streptavidine in de 30 well (het "putje" van de microtiterplaat) bindt. Gezien de zeer hoge 1026678 31 j biologische affiniteit tussen streptavidine en biotine zal deze binding zeer sterk zijn en relatief snel plaatsvinden (ca 30 minuten). Afhankelijk van het gewenste extractiepercentage van de verwaarloosbare depletie extractie wordt de ketenlengte van de desbetreffende oligonucleotide-template 5 gekozen. Afhankelijk van de gewenste oligonucleotide-template concentratie wordt de oligonucleotide-template verdund met gesteriliseerd demi-water.A streptavidin coated microtiter plate is coated with an oligonucleotide template as an extracting phase. This oligonucleotide -25 template has, depending on the number of nucleotides, a specific oligonucleotide chain length and serves as a "capture" oligo of an oligonucleotide ligand to be investigated. To immobilize the extracting phase, a biotin molecule is attached to one end of the oligonucleotide template, with which the oligonucleotide template binds to the streptavidin in the 30 well (the "well" of the microtiter plate). In view of the very high biological affinity between streptavidin and biotin, this binding will be very strong and will take place relatively quickly (approximately 30 minutes). Depending on the desired extraction percentage of the negligible depletion extraction, the chain length of the relevant oligonucleotide template 5 is chosen. Depending on the desired oligonucleotide template concentration, the oligonucleotide template is diluted with sterilized demineralized water.

Uitvoering:Performance:

In het onderhavige Voorbeeld wordt de plasma-binding van een 20 10 nucleotiden omvattend oligonucleotide ligand onderzocht. De nucleotidensequentie van dit ligand was 5,-CTG*C*T*A*GCCTCTGGATTTGA-3’ (waarbij * staat voor een [35S] label). Als extraherende fase wordt een gebiotinileerd oligonucleotide-template van 12 nucleotiden toegepast. De nucleotidensequentie van deze 15 12-mer oligo was 5’-AGAGGCTAGCAG-‘3 en is gedeeltelijk complementair aan het oligonucleotide ligand. Van het gebiotinyleerd oligonucleotide-template werd een stockoplossing van ImM doorverdund tot een ΙΟμΜ werkoplossing. Van deze werkoplossing werd ΙΟΟμΙ aangebracht in elke well van een 96 wells microtiterplaat waarin streptavidine reeds door de 20 fabrikant was geïmmobiliseerd en 30 minuten geïncubeerd bij 37°C. Na incubatie werden de wells gespoeld met 4 x 300μ1 wasbufïer (25mM TRIS/HC1 (pH: 7,2); 0,15M NaCl; 0,1% Tween) met behulp van een multikanaalpipet.In the present Example, the plasma binding of an oligonucleotide ligand comprising 10 nucleotides is investigated. The nucleotide sequence of this ligand was 5.CTG * C * T * A * GCCTCTGGATTTGA-3 "(where * stands for a [35S] tag). A biotinylated oligonucleotide template of 12 nucleotides is used as the extracting phase. The nucleotide sequence of this 12-mer oligo was 5'-AGAGGCTAGCAG-'3 and is partially complementary to the oligonucleotide ligand. From the biotinylated oligonucleotide template, a stock solution from ImM was diluted to a ΙΟμΜ working solution. WerkμΙ of this working solution was placed in each well of a 96-well microtiter plate in which streptavidin had already been immobilized by the manufacturer and incubated for 30 minutes at 37 ° C. After incubation, the wells were rinsed with 4 x 300 µl wash buffer (25mM TRIS / HCl (pH: 7.2); 0.15M NaCl; 0.1% Tween) using a multi-channel pipette.

Vervolgens werden de wells gevuld met 200μ1 van de 25 desbetreffende bloedplasma verdunning. De plasmaverdunningsreeks (in PBS) was: 99; 90; 75; 50; 25; 20; 15; 10; 5; 4; 3; 2,5; 2 en 1% plasma in PBS. Elke 200μ1 plasmaverdunning werd aangevuld (gespiked) met lOul oplossing van de te meten 20-mer oligonucleotide waarna het totaal 2 uur bij 37°C werd geïncubeerd. Na deze tweede incubatiestap werd de inhoud 30 van de wells uitgespoeld met ijskoud (<4°C) demi-water. Tenslotte zijn de 1026678 32 wells gevuld met ca 200μ1 scintillatievloeistof (Optiphase Hisafe II, Wallac) waarna de microtiterplaten geanalyseerd werden met behulp van een Liquid Scintillation Counter (LSC).The wells were then filled with 200 µl of the corresponding blood plasma dilution. The plasma dilution series (in PBS) was: 99; 90; 75; 50; 25; 20; 15; 10; 5; 4; 3; 2.5; 2 and 1% plasma in PBS. Every 200 µl plasma dilution was supplemented (spiked) with 10 µl solution of the 20-mer oligonucleotide to be measured, after which the total was incubated for 2 hours at 37 ° C. After this second incubation step, the contents of the wells were rinsed out with ice cold (<4 ° C) demi water. Finally, the 1026678 32 wells were filled with approximately 200 µl of scintillation fluid (Optiphase Hisafe II, Wallac), after which the microtiter plates were analyzed using a Liquid Scintillation Counter (LSC).

De gemeten counts zijn afkomstig van vrij ligand dat kan binden 5 aan de extraherende fase, terwijl de door plasma gebonden fractie van ligand bij de uitspoeling is verwijderd. De gemeten counts aanwezig in de gecoate wells, zijn in een grafiek uitgezet tegen de volumefractie plasma waardoor een afnamecurve van de vrije oligonucleotidenconcentratie wordt verkregen (zie ook figuur 1). Figuur 1 toont de afnamecurve van de vrije 10 oligonucleotidenconcentratie bij een toenemende plasma fractie.The measured counts are from free ligand that can bind to the extracting phase, while the plasma-bound fraction of ligand is removed at the leaching. The measured counts present in the coated wells are plotted against the volume fraction of plasma, whereby a decrease curve of the free oligonucleotide concentration is obtained (see also figure 1). Figure 1 shows the decrease curve of the free oligonucleotide concentration with an increasing plasma fraction.

Bovenstaand voorbeeld beschrijft een eenvoudige, snelle en nauwkeurige methode om vrije concentraties van oligonucleotiden in plasma te bepalen. Dit kan bijvoorbeeld van belang zijn wanneer een oligonucleotide therapeutisch wordt toegepast, waarbij het van belang is te weten of alle 15 actieve substantie wordt gebonden door het plasma of dat ook een vrije (actieve) fractie overblijft. De extractie-efficiëntie bedraagt voor deze 12 nucleotiden oligo ongeveer 5% wat als verwaarloosbaar kan worden beschouwd. Verlenging van de complementaire ketenlengte (verhoging van de complementariteit tussen extraherende fase en ligand) zou leiden tot een 20 te hoge en dus niet verwaarloosbare depletie extractie.The example above describes a simple, fast and accurate method to determine free concentrations of oligonucleotides in plasma. This may be important, for example, when an oligonucleotide is used therapeutically, it being important to know whether all active substance is bound by the plasma or whether a free (active) fraction is also left. The extraction efficiency for these 12 nucleotide oligo is approximately 5%, which can be considered negligible. Extending the complementary chain length (increasing the complementarity between extracting phase and ligand) would lead to a too high and therefore not negligible depletion extraction.

102667S102667S

Claims

A method for detecting and / or measuring a ligand in a liquid, comprising the steps of: a) providing a binding partner of said ligand in said liquid; B) subjecting said fluid to conditions wherein said ligand can bind to said binding partner to provide an amount of bound ligand and an amount of free ligand in said fluid; c) subjecting said liquid to negligible depletion extraction wherein part of the amount of free ligand is extracted through said extracting phase, and d) detecting and / or measuring the extracted ligand.

2. A method according to claim 1, further comprising the step of: e) determining the amount of bound ligand and / or free ligand present in solution.

A method for detecting and / or measuring a ligand in a liquid, comprising the steps of: a) providing a binding partner of said ligand and a detectable analog of said ligand in said liquid; B) allowing the occurrence of competitive binding between said ligand and said analog to said binding partner to provide an amount of bound analog and an amount of free analog in said liquid; c) subjecting said liquid to negligible depletion extraction wherein part of the amount of free analog is extracted through said extracting phase, and d) detecting and / or measuring the extracted analog. 1026678

The method of claim 3, further comprising the step of: e) determining the amount of bound analog and / or free analog present in solution.

The method of claim 4, further comprising the step of: f) determining the amount of bound ligand and / or free ligand present in solution.

The method of any one of the preceding claims, wherein said binding partner is selected from the group consisting of receptors, polynucleotides, binding proteins, cofactors, and antibodies.

The method of any one of the preceding claims, wherein said ligand is a hydrophobic ligand.

The method of any one of the preceding claims, wherein said ligand is a pharmaceutical to be tested.

9. The method of any one of the preceding claims, wherein said ligand is a steroid, benzodiazopine or antibiotic.

The method of any one of the preceding claims, wherein said analog is a radiolabeled form of said ligand.

The method of any one of the preceding claims, wherein said extracting phase comprises lipophilic polymers.

The method of any one of the preceding claims, wherein said ligand and / or said analog is a polynucleotide, and wherein said extracting phase comprises a polynucleotide whose nucleotide sequence is at least partially complementary to the nucleotide sequence of at least a portion of the ligand and / or said analog, and which polynucleotide is capable of extracting said ligand and / or said analog from said liquid under conditions of negligible depletion.

13. A method according to claim 12, wherein the polynucleotide of said extracting phase comprises 5-20, preferably 8-16, more preferably 10-14 substantially contiguous nucleotides that 1026678 are complementary to substantially contiguous nucleotides of said ligand and / or said analogue.

14. Method as claimed in any of the foregoing claims, wherein said extracting phase is in the form of a surface coating on the wall of a liquid container or on particles miscible with the liquid.

The method of any one of the preceding claims, wherein said extracting phase comprises a solid phase.

The method of claim 15, wherein said solid phase comprises polysiloxanes.

The method of claim 15, wherein said solid phase is polydimethylsiloxane.

The method of any one of the preceding claims, wherein said extracting phase has a partition coefficient between 2 and 20.

19. Method as claimed in any of the foregoing claims, wherein said extracting phase comprises a scintillator for detection of radioisotopes.

20. Liquid container for detecting and / or measuring a ligand in a liquid, which container is provided with an extracting phase which has the capacity to extract said ligand from the liquid phase and which container is provided with detection means

The liquid container of claim 20, wherein said detecting means comprises fluorophores, fluorescent quemchers, or scinillators.

The liquid container of claim 21, wherein said scinillator is 25. diphenyloxazole.

A liquid container according to any of claims 20-22, wherein said extracting phase comprises lipophilic polymers.

A fluid container according to any of claims 20-23, wherein said extracting phase comprises a polynucleotide whose 30 nucleotide sequence is at least partially complementary to the 1026678 nucleotide sequence of at least a portion of a polynucleotide ligand to be measured and which polynucleotide is capable of to extract said ligand from said liquid under conditions of negligible depletion.

The fluid container of claim 24, wherein the polynucleotide of said extracting phase comprises 5-20, preferably 8-16, more preferably 10-14 substantially contiguous nucleotides that are complementary to substantially contiguous nucleotides of said ligand and / or said analogue.

The fluid container of claims 24 or 25, wherein the polynucleotide of said extracting phase comprises 5-20 nucleotides.

A liquid container according to any one of claims 20 to 26, wherein said extracting phase comprises polysiloxanes, preferably polydimethylsiloxane.

The liquid container of any one of claims 20-27, wherein said extracting phase has a partition coefficient of between 2 and 20.

Use of a liquid container according to one of claims 20-28, in a method for detecting and / or measuring a ligand in a liquid, preferably a method according to one of claims 1-19.

The use of a method according to any one of claims 1 to 19 for determining the binding capacity of pharmaceutical ligands.

A test kit for performing a method according to any of claims 1-19, comprising a liquid container according to any of claims 20-28. 25, 1026678. , '· *' Competitive Binding Assay Antiserum vs.. Estradiol / Estriol ^ 3500 γ- Si 3000 - ♦ - * - - S- 2500 --s- <0 C 2000 - ♦ - O 150o-- ♦ - = <D 1000 - ♦ - => 500 - ♦ - * - ± --- 0 -: - 1-1-1-1 1 10 100 1000 10000 log Estriol conc. (pg / ml) FIG. 1 1026678