NL1026335C2 - Method for making a double-stranded polyribonucleotide sequence with overhanging end, as well as a method for forming a double-stranded polynucleotide construct and an application. - Google Patents
Method for making a double-stranded polyribonucleotide sequence with overhanging end, as well as a method for forming a double-stranded polynucleotide construct and an application. Download PDFInfo
- Publication number
- NL1026335C2 NL1026335C2 NL1026335A NL1026335A NL1026335C2 NL 1026335 C2 NL1026335 C2 NL 1026335C2 NL 1026335 A NL1026335 A NL 1026335A NL 1026335 A NL1026335 A NL 1026335A NL 1026335 C2 NL1026335 C2 NL 1026335C2
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- primer
- sequence
- dna sequence
- double
- primer pair
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 28
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 title claims description 27
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 title claims description 27
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 title claims description 12
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 47
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 14
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 14
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 12
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 12
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 claims description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 7
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 6
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 6
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 5
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims description 5
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 claims description 4
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 claims description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 3
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 claims description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 2
- 102000017143 RNA Polymerase I Human genes 0.000 claims 1
- 108010013845 RNA Polymerase I Proteins 0.000 claims 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 36
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 18
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 10
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 4
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108010057163 Ribonuclease III Proteins 0.000 description 1
- 102000003661 Ribonuclease III Human genes 0.000 description 1
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/30—Nucleotides
- C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
i 11
Werkwijze voor het maken van een dubbelstrengs polyribonucle-otidenvolgorde met overhangend uiteinde, alsmede een werkwijze voor het vormen van een dubbelstrengs polynucleotiden-construct en een toepassingMethod for making a double-stranded polyribonucleotide sequence with overhanging end, as well as a method for forming a double-stranded polynucleotide construct and an application
De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het maken van een dubbelstrengs polyribonucle-otidevolgorde met een overhangend uiteinde.The present invention relates to a method for making a double-stranded polyribonucleotide sequence with an overhanging end.
De laatste jaren wordt steeds meer het belang van 5 dubbelstrengs RNA ingezien, zowel voor wat betreft de rol ervan in de natuur als bij onderzoek en voor de ontwikkeling van geneeskundige behandelingen. Voor diverse toepassingen, zoals RNA-interferentie-experimenten en voor het bouwen van polynucleinezuurconstructen zijn dergelijke dubbelstrengs RNA 10 moleculen van belang. Bij DNA kunnen overlappende, en complementaire, overhangende uiteinden worden gevormd met behulp van restrictie-enzymen, welke in de natuur overvloedig en in een veelvoud van typen worden geleverd. Voor RNA bestaat die luxe niet.In recent years, the importance of double-stranded RNA has been increasingly recognized, both with regard to its role in nature and in research and for the development of medical treatments. For various applications, such as RNA interference experiments and for building polynucleic acid constructs, such double-stranded RNA molecules are of interest. In the case of DNA, overlapping and complementary, overhanging ends can be formed with the aid of restriction enzymes, which in nature are supplied in abundance and in a multitude of types. For RNA that luxury does not exist.
15 Er bestaat derhalve een sterke behoefte aan een techniek waarmee dubbelstrengs RNA met ten minste 1 overhangend uiteinde kan worden gevormd.There is therefore a strong need for a technique with which double-stranded RNA with at least 1 overhanging end can be formed.
De onderhavige uitvinding beoogt een werkwij ze te verschaffen waarmee dergelijk RNA op eenvoudige wijze en on-20 der gebruikmaking van op zich welbekende technieken kan worden gevormd.The present invention has for its object to provide a method with which such RNA can be formed in a simple manner and using techniques known per se.
Hiertoe wordt de werkwijze volgens de uitvinding gekenmerkt doordat wordt uitgegaan van twee complementaire en-kelstrengs DNA volgorden welke worden aangeduid met eerste 25 DNA volgorde en tweede DNA volgorde - waarbij van een eerste primerpaar dat een eerste primer en een tweede primer omvat de eerste primer met de eerste DNA volgorde met elkaar in contact worden gebracht en de tweede primer in contact wordt gebracht met de met de eerste DNA 30 volgorde complementaire tweede DNA volgorde, waarbij de eerste primer van het eerste primerpaar in staat is om met de eerste DNA volgorde te hybridiseren op een eerste bin-dingslocatie en de tweede primer van het eerste primerpaar 1026335 < » 2 in staat is om met de tweede DNA volgorde te hybridiseren op een tweede bindingslocatie en de tweede primer van het eerste primerpaar homoloog is met een deel van de eerste j. DNA volgorde, welk homologe deel van de eerste DNA volgorde i i 5 5' van de plaats waar de eerste primer van het eerste pri- ί ! merpaar aan de eerste DNA volgorde kan binden is gelegen;To this end, the method according to the invention is characterized in that two complementary and single-stranded DNA sequences are assumed which are designated by first DNA sequence and second DNA sequence - wherein a first primer pair comprising a first primer and a second primer comprise the first primer with the first DNA sequence is brought into contact with each other and the second primer is brought into contact with the second DNA sequence complementary to the first DNA sequence, the first primer of the first primer pair being able to hybridize to the first DNA sequence at a first binding site and the second primer of the first primer pair 1026335 <2 is capable of hybridizing with the second DNA sequence at a second binding site and the second primer of the first primer pair is homologous to a portion of the first j DNA sequence, which homologous part of the first DNA sequence ii 5 5 'from the place where the first primer of the first prime ! couple can bind to the first DNA sequence is located;
' I I'I I
- waarbij van een tweede primerpaar dat een eerste primer en een tweede primer omvat de eerste primer van het tweede primerpaar en de met de eerste DNA volgorde complementaire 10 tweede DNA volgorde met elkaar in contact worden gebracht, en de tweede primer van het tweede primerpaar in contact wordt gebracht met de eerste DNA volgorde, waarbij de eerste primer van het tweede primerpaar in staat is om met de tweede DNA volgorde te hybridiseren op een derde bin- 15 dingslocatie en de tweede primer van het tweede primerpaar in staat is om met de eerste DNA volgorde te hybridiseren op een vierde bindingslocatie en de eerste primer van het tweede primerpaar homoloog is met een deel van de eerste DNA volgorde, welk homologe deel van de eerste DNA volgorde 20 5' van de plaats waar de tweede primer van het tweede pri merpaar aan de eerste DNA volgorde kan binden is gelegen; waarbij een primer gekozen uit de eerste en tweede primers een primer is welke een primervolgorde en een aan de 5'-zijde daarvan overhangend-uiteindevolgorde omvat; en 25 waarbij de tweede primer van elk primerpaar, indien nodig, aan het 5'-uiteinde ervan is voorzien van een RNA-polymerasevolgorde, - in een eerste amplificatiereactie (I) een DNA polymerase wordt gebruikt voor het onder gebruikmaking van het eerste 30 primerpaar in aanwezigheid van geschikte nucleotideverbin-dingen uitvoeren van een amplificatiereactie; - in een tweede amplificatiereactie (I) een DNA polymerase wordt gebruikt voor het onder gebruikmaking van het tweede primerpaar in aanwezigheid van geschikte nucleotideverbin- 35 dingen uitvoeren van een amplificatiereactie; de reactieproducten van de eerste en tweede amplificatiereactie in contact worden gebracht met een RNA polymerase voor het door transcriptie vormen van een eerste en een tweede ri- 1026335 ' C ι 3 bonucleotidenvolgorde, welke ribonucleotidenvolgorden met elkaar worden gehybridiseerd onder oplevering van de dubbel-strengs polyribonucleotidenvolgorde met overhangend uiteinde.- wherein from a second primer pair comprising a first primer and a second primer the first primer of the second primer pair and the second DNA sequence complementary to the first DNA sequence are brought into contact with each other, and the second primer of the second primer pair in is contacted with the first DNA sequence, wherein the first primer of the second primer pair is able to hybridize with the second DNA sequence at a third binding site and the second primer of the second primer pair is capable of contacting the first DNA sequence to hybridize at a fourth binding site and the first primer of the second primer pair is homologous to a portion of the first DNA sequence, which homologous portion of the first DNA sequence is 5 'from the site where the second primer of the second primer pair can bind to the first DNA sequence is located; wherein a primer selected from the first and second primers is a primer which includes a primer sequence and an overhanging end sequence on its 5 'side; and wherein the second primer of each primer pair is, if necessary, provided with an RNA polymerase sequence at its 5 'end, - in a first amplification reaction (I) a DNA polymerase is used to utilize the first primer pair carry out an amplification reaction in the presence of suitable nucleotide compounds; - in a second amplification reaction (I) a DNA polymerase is used to perform an amplification reaction using the second primer pair in the presence of suitable nucleotide compounds; the reaction products of the first and second amplification reaction are contacted with an RNA polymerase to transcription form a first and a second ribonucleotide sequence, which ribonucleotide sequences are hybridized to one another to yield the double-stranded polyribonucleotide sequence with overhanging end.
; : Aangezien de overhangende nucleotidevolgorde vrij 1 15 kan worden gekozen, zowel voor wat betreft de lengte als voor , t ; ; wat betreft de nucleotidensamenstelling, verschaft de onder-' havige uitvinding een uitermate flexibele wijze voor het verschaffen van RNA moleculen van de genoemde soort. De beide amplificatiereacties zullen in separate houders worden uitge-10 voerd.; Since the overhanging nucleotide sequence can be freely selected, both in length and for, t; ; with regard to the nucleotide composition, the present invention provides an extremely flexible way of providing RNA molecules of the aforementioned kind. The two amplification reactions will be carried out in separate containers.
Teneinde de omschrijving van de uitvinding in de bijgaande conclusies niet nodeloos te compliceren, dient te worden begrepen dat de navolgende situaties integraal deel uitmaken van dè onderhavige uitvinding.In order not to unnecessarily complicate the description of the invention in the appended claims, it is to be understood that the following situations form an integral part of the present invention.
15 Het is niet uitgesloten dat de eerste en tweede volgorde niet volledig complementair zijn, en het volstaat wanneer de geamplificeerde delen toereikend complementair zijn om hybridisatie van de polyribonucleotide-reactieproducten onder de door de gebruiker gewenste omstan-20 digheden mogelijk te maken en/of in stand te houden. In de praktijk zullen de eerste en tweede DNA volgorden volledig identiek zijn, en wordt eenvoudigweg het DNA materiaal waarvan wordt uitgegaan in twee afzonderlijke houders voor het uitvoeren van de amplificatiereacties gebracht. Aan elke hou-25 der wordt een ander primerpaar toegevoegd. Hierbij kan het deel van de primers dat met de eerste DNA volgorde hybridi-seert voor de eerste en tweede houder identiek of verschillend worden gekozen. Hetzelfde geldt voor het deel van de primers die met de tweede DNA volgorde hybridiseren.It is not excluded that the first and second order are not fully complementary, and it is sufficient if the amplified portions are sufficiently complementary to allow hybridization of the polyribonucleotide reaction products under the conditions desired by the user and / or in to stand. In practice, the first and second DNA sequences will be completely identical, and simply the DNA material that is assumed is introduced into two separate containers for carrying out the amplification reactions. A different primer pair is added to each container. Here, the portion of the primers that hybridizes to the first DNA sequence can be selected identically or differently for the first and second containers. The same applies to the part of the primers that hybridize with the second DNA sequence.
30 In de praktijk zal de werkwijze volgens de uitvin ding het meest gebruikt worden voor het maken van een polyri-bonucleinezuur met twee overhangende uiteinden die al dan niet complementair met elkaar zijn. Ook maakt de uitvinding het mogelijk dat een, en slechts een, van de overhangende 35 uiteinden een lengte van nul ribonucleotiden heeft, en er dus sprake is van een dubbelstrengs RNA molecuul met slechts aan een uiteinde een overhangend uiteinde. De omschrijving van de hoofdconclusie zou nodeloos gecompliceerd worden wanneer het 1026335 * · 4 gebruik van de term "overhangend uiteinde" in de onderhavige aanvrage niet ook de mogelijkheid zou omvatten dat van 1 van de twee RNA volgorden de lengte van het overhangende uiteinde nul mag zijn, dus feitelijk niet overhangt.In practice, the method according to the invention will be used most frequently for making a polybibucleic acid with two overhanging ends that may or may not be complementary to each other. The invention also makes it possible for one and only one of the overhanging ends to have a length of zero ribonucleotides, and thus there is a double-stranded RNA molecule with an overhanging end only at one end. The description of the main claim would be unnecessarily complicated if the use of the term "overhanging end" in the present application would not also include the possibility that of one of the two RNA sequences the length of the overhanging end may be zero , so in fact not overhanging.
5 De RNA polymerasevolgorde van de tweede primer is optioneel in die zin dat deze niet nodig is wanneer de betreffende DNA volgorde deze reeds op de gewenste plaats bevat. In de praktijk zal in de meeste gevallen de tweede primer de RNA polymerasevolgorde moeten bevatten.The RNA polymerase sequence of the second primer is optional in the sense that it is not necessary if the relevant DNA sequence already contains it at the desired location. In practice, in most cases the second primer will have to contain the RNA polymerase sequence.
10 Onder de term "primervolgorde" wordt de volgorde van een primer verstaan die de eerste of tweede DNA volgorden herkent, dat wil zeggen in staat is om daarmee te hybridise-ren voor het uitvoeren van een DNA polymerisatie.The term "primer sequence" is understood to mean the sequence of a primer that recognizes the first or second DNA sequences, i.e. is capable of hybridizing thereto for carrying out a DNA polymerization.
De verschillende stappen van de werkwijze volgens de 15 uitvinding kunnen op verschillende locaties worden uitgevoerd.The different steps of the method according to the invention can be carried out at different locations.
Ofschoon in de onderhavige aanvrage wordt gesproken over polyribonucleinezuur, dient aan de term "poly" geen specifiek belang toegekend, in die zin dat het eveneens "oligo" 20 kan betekenen. Elke dubbelstrengs ribonucleinezuurproduct wordt omvat dat onder de door de gebruiker gewenste omstandigheden uitgaande van de enkelstrengs reactieproducten kan hybridiseren of gehybridiseerd blijft.Although polyribonucleic acid is used in the present application, the term "poly" should not be given any specific interest in the sense that it may also mean "oligo". Any double-stranded ribonucleic acid product is included that can hybridize or remain hybridized under the conditions desired by the user from the single-stranded reaction products.
De dubbelstrengs polyribonucleotidenvolgorde wordt 25 bij voorkeur onderworpen aan een zuiveringsstap. Dit kan zeer geschikt door uitvoeren van elektroforese over een gel. Volgens een voorkeursuitvoering wordt na het uitvoeren van de de transcriptie, bij voorkeur na de hybridisatie, een digestie-behandeling uitgevoerd voor het digesteren van DNA.The double-stranded polyribonucleotide sequence is preferably subjected to a purification step. This can be very suitable by performing electrophoresis over a gel. According to a preferred embodiment, after performing the transcription, preferably after the hybridization, a digestion treatment is performed to digest DNA.
30 Dit maakt het verwijderen van DNA eenvoudiger.This makes the removal of DNA easier.
Zoals reeds aangegeven heeft de dubbelstrengs poly-ribonucleotidevolgorde volgens de uitvinding bij voorkeur niet 1 maar 2 overhangende uiteinden. Een voorkeursuitvoeringsvorm wordt hierdoor gekenmerkt dat de overhangend-35 uiteindevolgorde van het eerste primerpaar niet complementair is met de overhangend-uiteindevolgorde van het tweede primerpaar .As already indicated, the double-stranded poly-ribonucleotide sequence according to the invention preferably has not 1 but 2 overhanging ends. A preferred embodiment is characterized in that the overhanging end order of the first primer pair is not complementary to the overhanging end order of the second primer pair.
Aldus kan worden voorkomen dat de uiteinden van 1 1026335 * · 5 dubbelstrengs RNA molecuul, dat volgens de uitvinding is gevormd, met elkaar hybridiseren en het aldus minder beschikbaar maken voor ligateren aan andere polynucleotidenmolecu-len. Verder kan, door gebruik van niet-complementaire uitein-5 den, een precieze oriëntatie van het dubbelstrengs RNA molecuul aan een ander dubbelstrengs polynucleotidenmolecuul worden verzekerd.Thus, the ends of a double-stranded RNA molecule formed according to the invention can be prevented from hybridizing to each other and thus making it less available for ligating to other polynucleotide molecules. Furthermore, by using non-complementary ends, a precise orientation of the double-stranded RNA molecule to another double-stranded polynucleotide molecule can be ensured.
De onderhavige uitvinding maakt het mogelijk om een dubbelstrengs polyribonucleotidenvolgorde te maken waarvan 10 een streng aan zowel de 3' zijde als aan de 5' zijde overhangende uiteinden bezit. Deze interessante uitvoeringsvorm wordt hierdoor gekenmerkt dat van één primerpaar beide primers van een, identieke of verschillende, overhangenduitein-devolgorde bevatten.The present invention makes it possible to make a double-stranded polyribonucleotide sequence of which 10 has a strand on both the 3 'side and the 5' side overhanging ends. This interesting embodiment is characterized in that both primers of one primer pair contain one, identical or different, overhanging sequence.
15 De onderhavige uitvinding heeft tevens betrekking op een werkwijze voor het maken van een dubbelstrengs polynucle-otiden-construct.The present invention also relates to a method for making a double-stranded polynucleotide construct.
Deze werkwijze wordt gekenmerkt dat de dubbelstrengs polyribonucleotidenvolgorde volgens de uitvinding met een 20 overhangend uiteinde wordt geligateerd aan een dubbelstrengs polynucleotidenvolgorde, welke dubbelstrengs polynucleotiden-volgorde een complementair overhangend uiteinde bezit.This method is characterized in that the double-stranded polyribonucleotide sequence according to the invention is ligated with an overhanging end to a double-stranded polynucleotide sequence, which double-stranded polynucleotide sequence has a complementary overhanging end.
Aldus kunnen naar believen RNA-RNA en RNA-DNA constructen worden gevormd. In dit verband moet worden opgemerkt 25 dat het complementaire overhangende uiteinde van de dubbelstrengs polynucleotidenvolgorde niet volledig complementair hoeft te zijn, zolang als voldoende hybridisatie mogelijk is om ligatie mogelijk te maken.Thus, RNA-RNA and RNA-DNA constructs can be formed as desired. In this connection, it should be noted that the complementary overhanging end of the double-stranded polynucleotide sequence need not be completely complementary, as long as sufficient hybridization is possible to allow ligation.
Tenslotte heeft de uitvinding betrekking op een toe-30 passing van een dubbelstrengs polyribonucleotidenvolgorde gemaakt volgens de uitvinding voor het transformeren van een cel.Finally, the invention relates to the use of a double-stranded polyribonucleotide sequence made according to the invention for transforming a cell.
De cel kan, zoals duidelijk zal zijn, een prokaryote of eukaryote cel zijn. De cel kan tevens deeluitmaken van een 35 meercellig organisme, zoals een zoogdier.The cell can, as will be appreciated, be a prokaryotic or eukaryotic cell. The cell can also be part of a multicellular organism, such as a mammal.
De onderhavige uitvinding zal thans worden toegelicht aan de hand van een uitvoeringsvoorbeeld en de tekening, waarin 1026335 4 · 6The present invention will now be elucidated with reference to an exemplary embodiment and the drawing, in which 1026335 4 · 6
Fig. 1 een schematisch toont hoe een dubbelstrengs RNA molecuul kan worden gevormd met twee 3' -overhangende uiteinden;FIG. 1 schematically shows how a double-stranded RNA molecule can be formed with two 3 'overhanging ends;
Fig. 2 in hoofdzaak overeenkomt met Fig. 1 en be-, 5 schrijft hoe een dubbelstrengs RNA molecuul kan worden ge- ; vormd met twee 5'-overhangende uiteinden.FIG. 2 substantially corresponds to FIG. 1 and 5 describes how a double-stranded RNA molecule can be made; formed with two 5 'overhanging ends.
' ' Fig. 1 toont schematisch hoe met behulp van de werk wijze een dubbelstrengs RNA molecuul 16 kan worden gevormd.FIG. 1 shows schematically how a double-stranded RNA molecule 16 can be formed by the method.
In het hier beschreven voorbeeld heeft het dubbelstrengs RNA 10 molecuul twee overhangende uiteinden, meer specifiek twee 3' overhangende uiteinden.In the example described here, the double-stranded RNA molecule has two overhanging ends, more specifically two 3 'overhanging ends.
Bij dit voorbeeld wordt uitgegaan van dubbelstrengs DNA 17 dat in twee porties wordt gesplitst (stap I). Elke portie wordt op in 'hoofdzaak dezelfde wijze behandeld, en el-15 ke portie levert een enkelstrengs RNA molecuul 15', 15'' op, welke enkelstrengs RNA moleculen 15', 15'' met elkaar worden gehybridseerd onder oplevering van het gewenste dubbelstrengs RNA molecuul 16.This example assumes double-stranded DNA 17 that is split into two portions (step I). Each portion is treated in substantially the same way, and each portion yields a single-stranded RNA molecule 15 ', 15' ', which single-stranded RNA molecules 15', 15 '' are hybridized to each other to yield the desired double-stranded RNA molecule 16.
Het dubbelstrengs DNA 17 bezit een eerste DNA volg-20 orde (of streng) 1, en een tweede DNA volgorde 2. Deze strengen worden, afhankelijk van welke portie zij uitmaken, aangeduid met een enkel of een dubbel accent. Bij dit voorbeeld zijn de eerste DNA volgorden 1' en 1'' dus identiek. Hetzelfde geldt voor de tweede DNA volgorden 2' en 2''.The double-stranded DNA 17 has a first DNA sequence (or strand) 1, and a second DNA sequence 2. These strands are designated with a single or double accent, depending on which portion they make. In this example, the first DNA sequences 1 'and 1' 'are therefore identical. The same applies to the second DNA sequences 2 'and 2' '.
25 Om enkelstrengs RNA moleculen 15 te maken wordt, in het hier beschreven uitvoeringsvoorbeeld, eerst een PCR reactie uitgevoerd (stap II; PCR 1 en PCR 2). Deze wordt bijvoorbeeld uitgevoerd onder gebruikmaking van een Mastercycler (Eppendorf, Hamburg, Duitsland). Hierbij wordt gebruik ge-30 maakt van een eerste primerpaar (met primers 3, 4) en een tweede primerpaar (met primers 8, 9). Voor een goed begrip van de term primer zoals gebruikt binnen de onderhavige aanvrage wordt het volgende opgemerkt. Voor een DNA amplificatie is een oligonucleotidenvolgorde nodig die met DNA hybridi-35 seert, en welke een DNA polymerase kan gebruiken voor ketenverlenging. Deze oligonucleotidenvolgorde kan worden aangeduid als de feitelijke primer. Voor het maken van een RNA molecuul met 3' overhangende uiteinden moet de feitelijke pri- 1026335 4 · 7 mer (weergegeven als een zwart blok van primers 3, 4, 8, 9) zijn voorzien van een extra volgorde 18 respectievelijk 19 voor de primers 3, 8, en van een volgorde voor het mogelijk i maken van transcriptie (horizontaal gestreepte rechthoek aan-' 'S gegeven met T7) . Deze laatste volgorde is voor het maken van , ; 3' overhangende uiteinden optioneel mits de DNA nucleotiden- volgorden de benodigde RNA promotorvolgorde verschaffen. Als dat niet het geval is, zijn de primers 4, 9 van de RNA promo-torvolgorden 13 voorzien.In order to make single-stranded RNA molecules, in the exemplary embodiment described here, a PCR reaction is first performed (step II; PCR 1 and PCR 2). This is carried out, for example, using a Mastercycler (Eppendorf, Hamburg, Germany). Use is made here of a first primer pair (with primers 3, 4) and a second primer pair (with primers 8, 9). For a proper understanding of the term primer as used within the present application, the following is noted. DNA amplification requires an oligonucleotide sequence that hybridizes to DNA, and which can use a DNA polymerase for chain extension. This oligonucleotide sequence can be referred to as the actual primer. For making an RNA molecule with 3 'overhanging ends, the actual primer 1026335 4 · 7 mer (represented as a black block of primers 3, 4, 8, 9) must have an additional order of 18 and 19 respectively for the primers 3, 8, and of a sequence for enabling transcription (horizontal striped rectangle given with T7). This last order is for creating,; 3 'overhanging ends optional provided that the DNA nucleotide sequences provide the required RNA promoter sequence. If that is not the case, the primers 4, 9 are provided with the RNA promoter sequences 13.
10 Om te voorkomen dat de twee G nucleotiden die in de T7 promotor (aangegeven met een horizontaal-gestreepte rechthoek) aanwezig zijn deel gaan uitmaken van de overhang, wordt er zorg voor gedragen dat zich aan de 3' zijde van RNA molecuul 15' twee C nucleotiden bevinden. Hiertoe zijn er bij PCR 15 1 in primer 3 twee G nucleotiden aanwezig. Aldus kan het 5' uiteinde van RNA molecuul 15" (dat voor T7 RNA polymerase (stap III) altijd begint met twee G's) hybridiseren met de twee C nucleotiden van RNA molecuul 15', en maken zij dus geen deel uit van de overhang. De tweede primers 4, 9 zijn 20 voorzien van een herkenningsvolgorde 13 voor T7 RNA polymerase. Vanzelfsprekend kunnen voor de porties verschillende RNA polymerasen en dus ook verschillende herkenningsvolgorden 13 worden toegepast.In order to prevent the two G nucleotides present in the T7 promoter (indicated by a horizontal-striped rectangle) from becoming part of the overhang, care is taken to ensure that on the 3 'side of RNA molecule 15' two C nucleotides. For this purpose, two G nucleotides are present in PCR 15 1 in primer 3. Thus, the 5 'end of RNA molecule 15' (which always starts with two Gs for T7 RNA polymerase (step III)) can hybridize to the two C nucleotides of RNA molecule 15 ', and thus do not form part of the overhang. The second primers 4, 9 are provided with a recognition sequence 13 for T7 RNA polymerase Of course, different RNA polymerases and therefore also different recognition sequences 13 can be used for the portions.
De volgorden 18, 19 kunnen complementair zijn, zoals 25 dat bij dubbelstrengs DNA verkregen met restrictie-enzymen gebruikelijk het geval is, maar met de werkwijze volgens de uitvinding heeft de vakman vrije keuze voor wat betreft lengte en nucleotidensamenstelling van deze volgorden 18 en 19. Zoals eerder aangegeven omvat de onderhavige uitvinding ook 30 het geval waarbij 1 (en slechts 1) van deze lengten 0 nucleotiden lang is.The sequences 18, 19 can be complementary, as is usually the case with double-stranded DNA obtained with restriction enzymes, but with the method according to the invention the person skilled in the art has free choice as to length and nucleotide composition of these sequences 18 and 19. As previously indicated, the present invention also encompasses the case where 1 (and only 1) of these lengths is 0 nucleotides in length.
Na de PCR reacties, onder gebruikmaking van een geschikte DNA polymerase zoals Pfu DNA polymerase en nucleotiden, wordt een DNA reactieproduct 14', 14" verkregen. Onder 35 gebruikmaking van T7 RNA polymerase en nucleotiden worden en-kelstrengs RNA strengen 15', 15" verkregen. De transcriptie-richting is met pijlen aangegeven.After the PCR reactions, using a suitable DNA polymerase such as Pfu DNA polymerase and nucleotides, a DNA reaction product 14 ', 14 "is obtained. Using T7 RNA polymerase and nucleotides, single-stranded RNA strands 15", 15 " obtained. The transcription direction is indicated by arrows.
Voor het vormen van het gewenste dubbelstrengs RNATo form the desired double-stranded RNA
1026335 i * 8 16 (stap IV) kan eenvoudig worden verwarmd tot een denaturerende temperatuur, van bijvoorbeeld 65°C. Afkoelen levert dan het gewenste dubbelstrengs RNA product op.1026335 * 8 16 (step IV) can easily be heated to a denaturing temperature, for example 65 ° C. Cooling then yields the desired double-stranded RNA product.
Het is in de praktijk gunstig om het aanwezige DNA 5 te verwijderen. Dit gaat gemakkelijk met een DNase, zoals DNase I. Daarenboven of in plaats daarvan kan een zuivering worden uitgevoerd door middel van gel-elektroforese.It is favorable in practice to remove the DNA present. This is easy with a DNase, such as DNase I. In addition or instead, a purification can be performed by gel electrophoresis.
Van transcriptie is bekend dat dit proces niet 100% betrouwbaar is. Het geniet dan ook de voorkeur gebruik te ma-10 ken van in het vak bekende technieken om deze betrouwbaarheid te vergroten. Hierbij kan in het bijzonder worden verwezen naar Kao et al, RNA 5, blz. 1268-1272 (1999).It is known from transcription that this process is not 100% reliable. It is therefore preferable to use techniques known in the art to increase this reliability. Reference may be made in particular to Kao et al., RNA 5, pp. 1268-1272 (1999).
In Fig. 2 is het maken van een dubbelstrengs RNA product 16 weergegeven, waarbij het resulterende RNA product 15 16 twee 5' overhangende uiteinden heeft. De werkwijze komt in wezen overeen met de werkwijze zoals beschreven voor Fig. 1. Echter, nu bevinden de overhangenduiteindevolgorden 18, 19 zich tussen de feitelijk met de DNA strengen hybridiserende primerdelen en de voor T7 RNA polymerase benodigde volgorde 20 13.In FIG. 2 shows the production of a double-stranded RNA product 16, the resulting RNA product 16 having two 5 'overhanging ends. The method essentially corresponds to the method as described for Figs. 1. However, the overhanging end sequences 18, 19 are now situated between the primer parts actually hybridizing with the DNA strands and the sequence required for T7 RNA polymerase 13.
De werkwijze kan op diverse wijzen binnen het kader van de uitvinding worden gevarieerd. Zo kan bijvoorbeeld een dubbelstrengs RNA molecuul worden gevormd waarvan 1 streng aan zowel de 3' zijde als de 5' zijde een overhangend uitein-25 de bezit. Het is voor de gewone terzake kundige duidelijk dat voor het inbouwen van de met behulp van de werkwijze volgens de uitvinding gevormde RNA moleculen in andere dubbelstrengs polynucleotidenmoleculen aanvullende behandelingen nodig kunnen zijn, zoals fosforylering en defosforylering. Een oc-30 trooipublicatie is immers slechts bedoeld voor het beschrijven van een uitvinding en niet als algemene opleiding tot vakman, om welke reden degenen die niet deze kennis en kunde van de gewone terzake kundige bezitten wordt verwezen naar handboeken (zoals Molecular Cloning van Sambrook et al., Cold 35 Spring Harbor Laboratory Press) en een relevante universi-teit.The method can be varied in various ways within the scope of the invention. For example, a double-stranded RNA molecule can be formed of which 1 strand has an overhanging end on both the 3 'side and the 5' side. It is obvious to the person skilled in the art that the incorporation of the RNA molecules formed by the method according to the invention into other double-stranded polynucleotide molecules may require additional treatments, such as phosphorylation and dephosphorylation. After all, an oc-30 publication is only intended to describe an invention and not as a general training for those skilled in the art, for which reason those who do not have this knowledge and expertise of the ordinary person skilled in the art are referred to manuals (such as Molecular Cloning from Sambrook et al. al., Cold 35 Spring Harbor Laboratory Press) and a relevant university.
De dubbelstrengs RNA moleculen volgens de onderhavige uitvinding zijn voor diverse toepassingen bruikbaar. Juist 1026335 * » 9 met de werkwijze volgens de uitvinding gemaakte dubbelstrengs RNA volgorden zijn, beter dan RNA volgorden gemaakt met andere technieken, bruikbaar voor digestie met een Dicer enzym [ I voor gebruik bij RNA interferentie-experimenten, alsmede de 1 ‘5 bereiding van op RNA interferentie gebaseerde farmaceutische I , I ’ ,; : preparaten en therapieën. Voor RNA interferentie genieten dubbelstrengs RNA nucleotidenvolgorden met een 3' overhangend uiteinde de voorkeur.The double-stranded RNA molecules of the present invention are useful for various applications. Precisely 1026335 * double stranded RNA sequences made with the method according to the invention are, better than RNA sequences made with other techniques, usable for digestion with a Dicer enzyme [I for use in RNA interference experiments, as well as the 1'5 preparation of RNA interference based pharmaceutical I, I '; : preparations and therapies. For RNA interference, double-stranded RNA nucleotide sequences with a 3 'overhanging end are preferred.
10263351026335
Claims (6)
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL1026335A NL1026335C2 (en) | 2004-06-04 | 2004-06-04 | Method for making a double-stranded polyribonucleotide sequence with overhanging end, as well as a method for forming a double-stranded polynucleotide construct and an application. |
| PCT/NL2005/000401 WO2005118807A1 (en) | 2004-06-04 | 2005-06-01 | Process for creating a double-stranded polyribonucleotide sequence with terminal overhang, as well as a process for creating a double-stranded polynucleotide construct and an application |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL1026335 | 2004-06-04 | ||
| NL1026335A NL1026335C2 (en) | 2004-06-04 | 2004-06-04 | Method for making a double-stranded polyribonucleotide sequence with overhanging end, as well as a method for forming a double-stranded polynucleotide construct and an application. |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NL1026335C2 true NL1026335C2 (en) | 2005-12-06 |
Family
ID=34955628
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NL1026335A NL1026335C2 (en) | 2004-06-04 | 2004-06-04 | Method for making a double-stranded polyribonucleotide sequence with overhanging end, as well as a method for forming a double-stranded polynucleotide construct and an application. |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| NL (1) | NL1026335C2 (en) |
| WO (1) | WO2005118807A1 (en) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4766072A (en) * | 1985-07-17 | 1988-08-23 | Promega Corporation | Vectors for in vitro production of RNA copies of either strand of a cloned DNA sequence |
| WO1990014090A1 (en) * | 1989-05-19 | 1990-11-29 | Hem Research, Inc. | SHORT THERAPEUTIC dsRNA OF DEFINED STRUCTURE |
| WO1993012229A1 (en) * | 1991-12-18 | 1993-06-24 | Cis Bio International | Method for preparing double stranded rna, and use thereof |
| WO2001073134A2 (en) * | 2000-03-28 | 2001-10-04 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services, The National Institutes Of Health | Gene profiling arrays |
| WO2003040294A2 (en) * | 2001-11-05 | 2003-05-15 | Janssen Pharmaceutica N.V. | METHOD FOR THE IN VITRO SYNTHESIS OF SHORT DOUBLE STRANDED RNAs |
| US20030099937A1 (en) * | 2001-08-15 | 2003-05-29 | Law Simon W. | Nucleic acid amplification |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AUPR621501A0 (en) * | 2001-07-06 | 2001-08-02 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Delivery of ds rna |
-
2004
- 2004-06-04 NL NL1026335A patent/NL1026335C2/en not_active IP Right Cessation
-
2005
- 2005-06-01 WO PCT/NL2005/000401 patent/WO2005118807A1/en active Application Filing
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4766072A (en) * | 1985-07-17 | 1988-08-23 | Promega Corporation | Vectors for in vitro production of RNA copies of either strand of a cloned DNA sequence |
| WO1990014090A1 (en) * | 1989-05-19 | 1990-11-29 | Hem Research, Inc. | SHORT THERAPEUTIC dsRNA OF DEFINED STRUCTURE |
| WO1993012229A1 (en) * | 1991-12-18 | 1993-06-24 | Cis Bio International | Method for preparing double stranded rna, and use thereof |
| WO2001073134A2 (en) * | 2000-03-28 | 2001-10-04 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services, The National Institutes Of Health | Gene profiling arrays |
| US20030099937A1 (en) * | 2001-08-15 | 2003-05-29 | Law Simon W. | Nucleic acid amplification |
| WO2003040294A2 (en) * | 2001-11-05 | 2003-05-15 | Janssen Pharmaceutica N.V. | METHOD FOR THE IN VITRO SYNTHESIS OF SHORT DOUBLE STRANDED RNAs |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| DEKKER N H ET AL: "Joining of long double-stranded RNA molecules through controlled overhangs.", NUCLEIC ACIDS RESEARCH. OCT 2004, vol. 32, no. 18, October 2004 (2004-10-01), pages e140-1 - e140-8, XP002315918, ISSN: 1362-4962 * |
| LIVACHE T ET AL: "DETECTION OF HIV1 DNA IN BIOLOGICAL SAMPLESS BY AN HOMOGENEOUS ASSAY: FLUORESCENCE MEASUREMENT OF DOUBLE-STRANDED RNA SYNTHESIZED FROM AMPLIFIED DNA", ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, ACADEMIC PRESS, SAN DIEGO, CA, US, vol. 217, no. 2, 1 March 1994 (1994-03-01), pages 248 - 254, XP000425612, ISSN: 0003-2697 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2005118807A1 (en) | 2005-12-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11713457B2 (en) | Methods and systems for processing polynucleotides | |
| US20220017893A1 (en) | Capture methodologies for circulating cell free dna | |
| US10253364B2 (en) | Method and systems for processing polynucleotides | |
| US20110269193A1 (en) | Method of amplifying a target nucleic acid by rolling circle amplification | |
| US20040126760A1 (en) | Novel compositions and methods for carrying out multple pcr reactions on a single sample | |
| WO2003033724A3 (en) | Nucleic acid amplification | |
| JP2018529326A5 (en) | ||
| GB2581599A (en) | Tagging nucleic acid molecules from single cells for phased sequencing | |
| JP2005506075A5 (en) | ||
| US11041192B2 (en) | Method for amplifying DNA | |
| US10155977B2 (en) | DNA amplification via scissor-like structures (DASL) | |
| Zangenberg et al. | Multiplex PCR: optimization guidelines | |
| Fu et al. | Sequencing double-stranded DNA by strand displacement | |
| NL1026335C2 (en) | Method for making a double-stranded polyribonucleotide sequence with overhanging end, as well as a method for forming a double-stranded polynucleotide construct and an application. | |
| Ehses et al. | Optimization and design of oligonucleotide setup for strand displacement amplification | |
| Ussery | DNA denaturation | |
| Iwamoto et al. | Evaluation of whole genome amplification methods using postmortem brain samples | |
| US20040029142A1 (en) | Concatenation-based nucleic acid detection compositions and methods | |
| Demidov | PNA Openers for Duplex DNA: Basic Facts, Fine Tuning and Emerging | |
| WO2024101294A1 (en) | Method for obtaining sequence for non-cyclic artificial nucleic acid | |
| EP3643790A1 (en) | Method for nucleic acid detection, primer for nucleic acid detection, and kit for nucleic acid detection | |
| EP3303615B1 (en) | Hybridisation method using improved nucleic acid probes | |
| JPWO2022246275A5 (en) | ||
| RU2021127691A (en) | SYSTEM | |
| Birch et al. | Multiplex PCR and Whole Genome Amplification |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD2B | A search report has been drawn up | ||
| VD1 | Lapsed due to non-payment of the annual fee |
Effective date: 20090101 |