NL1004619C2 - Inrichting en werkwijze voor het invriezen van levende cellen, in het bijzonder sperma. - Google Patents

Description

Titel: Inrichting en werkwijze voor het invriezen van levende cellen, in het bijzonder sperma.

De uitvinding heeft betrekking op een inrichting en werkwijze voor het invriezen van levende cellen, in het bijzonder sperma, volgens de aanhef van conclusie 1. Een dergelijke inrichtingen is uit de praktijk bekend.

5 Deze bekende inrichting voor het invriezen van levende cellen, in het bijzonder voor het invriezen van sperma, wordt gebruikt om cellen in levende toestand te kunnen bewaren voor later gebruik. Daartoe wordt een monster dat bijvoorbeeld een aantal spermacellen in een vloeibare 10 oplossing omvat, in een houder gebracht en zodanig gekoeld dat bevriezing optreedt. In deze beschrijving zullen inrichting en werkwijze beschreven worden aan de hand van spermamonsters, doch de uitvinding dient niet als daartoe beperkt te worden begrepen. Vele andere levende cellen 15 kunnen op gelijke wijze of met gelijke middelen worden behandeld, met gelijke voordelen.

Een bekende inrichting omvat een vat waarin vloeibare stikstof kan worden gebracht, voor het koelen van de inhoud van het vat. Het sperma wordt in monsters van geringe 20 omvang in een rietje of een dergelijke relatief dunne, kokervormige houder gebracht, waarna een groot aantal gevulde houders tegelijkertijd in het vat wordt gebracht en wordt gekoeld. De houders worden, wanneer volledige bevriezing van de inhoud is opgetreden, uit het vat genomen en bij 25 een bewaartemperatuur opgeslagen, geschikt voor later gebruik bij bijvoorbeeld kunstmatige inseminatie.

Het temperatuurverloop dat in het vat en in de houders optreedt wordt in hoofdzaak bepaald door de soort en de temperatuur van de houders bij inbrengen in het vat, het 30 aantal houders en de temperatuur in het vat bij inbrengen van de houders. Bovendien is uit onderzoek van aanvraagster gebleken dat de warmteontwikkeling in de houders als gevolg van de kristallisatie die daarin optreedt in belangrijke mate bijdraagt aan het verloop van de temperatuur in de 1004619 2 houders. Dit verloop blijkt van bijzonder belang te zijn voor het resultaat van het invriezen van het monster, in het bijzonder voor de overlevingskansen en de levendigheid van de cellen na doorlopen van de werkwijze en een daarop 5 volgend ontdooien. Uit voornoemd onderzoek is gebleken dat daarbij met name het temperatuurverloop in het monster tijdens het optreden van kristallisatie van groot belang is.

Bij de bekende inrichting is het niet mogelijk het verloop van de temperatuur in de afzonderlijke houders nauw-10 keurig te sturen. Bij gebruik van een dergelijke inrichting zullen relatief grote verschillen optreden in het temperatuurverloop in de verschillende houders, bijvoorbeeld als gevolg van de positie van de houders ten opzichte van elkaar en van het vat en van verschillen in de aanwezigheid van 15 kristallisatiekernen in het monster en daardoor verschillen in de fase waarin kristallisatie optreedt. Doordat bij gebruik van een bekende inrichting voor het invriezen van bijvoorbeeld één ejaculaat, waaruit een zeer groot aantal houders kan worden gevuld, deze invloeden niet weg te nemen 20 of te sturen zijn is een dergelijke inrichting economisch weinig voordelig en wordt de bruikbaarheid van elk monster nadelig beïnvloed.

De uitvinding beoogt een inrichting voor het invriezen van levende cellen, in het bijzonder sperma, waarbij de 25 genoemde nadelen van de bekende inrichting zijn vermeden, met behoud van de voordelen daarvan. Daartoe wordt een inrichting volgens de uitvinding gekenmerkt door de maatregelen volgens conclusie 1.

In deze beschrijving dient temperatuurgradiënt te 30 worden begrepen als een ruimtelijk verloop van de temperatuur (°C/cm). Daar waar een temperatuurverandering in de tijd wordt bedoeld zal deze worden aangeduid als temporele gradiënt, afkoelsnelheid, temperatuurverloop of een dergelijke, tijdgerelateerde term (°C/min).

35 Als gevolg van het of elk te koelen contactvlak, met behulp waarvan de of elke houder door aanligging daartegen kan worden gekoeld wordt het voordeel bereikt dat een goede 1004619 3 sturing van de temperatuur van de of elke houder en daarmee van het of elk monster kan worden bereikt, ongeacht het aantal te koelen houders. De stuurmiddelen voorzien daarbij in de mogelijkheid de temperatuur en het verloop daarvan 5 tijdens het gehele afkoelings c.q. invriestraject nauwkeurig te sturen. Als gevolg van de nauwkeurige sturing van de tempertauur, in het bijzonder het verloop daarvan tijdens het invriestraject, overleven meer cellen het invriezen en de daaropvolgende ontdooiing, terwijl bovendien de over-10 levende cellen een betere levendigheid hebben. Een belangrijk bijkomend voordeel daarbij is dat als gevolg van het grotere percentage overlevende, levendiger cellen minder spermacellen in een monster hoeven te worden opgenomen, met behoud van dezelfde kwaliteit van het monster voor gebruik 15 bij kunstmatige inseminatie. Dit betekent dat een grotere verdunning van een ejaculaat kan worden doorgevoerd, met als gevolg dat per ejaculaat meer houders kunnen worden gevuld. Dit betekent dat een beter economisch rendement wordt verkregen en dat bovendien, althans voor wat betreft sperma 20 meer vrouwelijke dieren uit één ejaculaat kunnen worden bevrucht, hetgeen bijvoorbeeld bedrijfstechnische voordelen heeft voor zowel de eigenaar of althans de houder van zowel het mannelijke als het vrouwelijke dier.

Bovendien is de kans op een succesvolle inseminatie 25 met een monster uit een ejaculaat met in de uitgangssituatie zeer weinig levendige cellen groter, hetgeen met name bij bijvoorbeeld mensen, bijzondere diersoorten en dergelijke van groot belang is.

Tijdens het afkoelen dient met name nabij het 30 vriespunt c.q. -traject van de oplossing ijsvorming binnen de cellen (intracellulaire ijsvorming) te worden verhinderd daar dit dodelijk is voor de betreffende cellen. De oorzaak dat dit wordt voorkomen is een efflux van water uit de cel, dat wil zeggen door het celmembraan wegstromen naar de 35 omgeving. Daardoor daalt de waterconcentratie in de cel, dat wil zeggen het aandeel water in het celvolume wordt minder, waardoor het vriespunt daalt.

1004619 4

Bij te hoge afkoelsnelheden zal de efflux van water zeer snel plaatsvinden, hetgeen op zichzelf reeds ongunstig lijkt voor de cellen. Bovendien bestaat een grote kans dat de water-efflux, relatief ten opzichte van de 5 afkoelsnelheid, daarbij niet snel genoeg plaatsvindt, dat wil zeggen dat de daling van het vriespunt daarbij minder snel verloopt dan de daling van de temperatuur. De temperatuur komt daardoor ver onder het vriespunt waardoor toch intracellulair ijs ontstaat.

10 Bij te lage afkoelsnelheden treedt juist het omgekeerde effect op. De ijskristallisatie buiten de cellen (intercellulair) en de efflux van water uit de cellen kunnen rustig verlopen, zodat deze processen nabij het thermodynamisch evenwicht zullen geraken. Dit evenwicht ligt 15 bij een zeer lage waterconcentratie in de cellen. Zowel intercellulair als intracellulair zal de dehydratie derhalve zeer snel optreden. De dehydratie en zout- en metaboliet-concentraties in de cellen worden daarbij zodanig hoog dat de cellen daardoor worden beschadigd. Bovendien raken de 20 cellen vervormd door afname van het volume, en beschadigd door de snel groeiende intercellulaire ijskristallen. Verder verblijven de cellen bij een te lage invriessnelheid te lang in de instabiele toestand. Pas bij zeer lage temperaturen, bijvoorbeeld onder -80°C zullen geen (bio)chemische reacties 25 of fysische transities meer plaatsvinden.

Door een geschikte keuze van het temperatuurprofiel tijdens het afkoeltraject, kan steeds een zodanige momentane afkoelsnelheid worden gerealiseerd dat de bovengenoemde nadelen worden vermeden. Een dergelijke sturing van het 30 temperatuurverloop is bijzonder goed mogelijk door gebruik van een inrichting volgens de uitvinding.

In een voordelige uitvoeringsvorm wordt een inrichting volgens de uitvinding gekenmerkt door de maatregelen volgens conclusie 2.

35 De middelen voor het bewegen van de houders relatief ten opzichte van het of elk contactoppervlak biedt het voordeel dat daarmee (semi)continu koeling kan worden verkregen 1004619 5 van de houders en daarin opgenomen monsters, waarbij de koeltijd bijvoorbeeld wordt bepaald door de bewegingstijd van de houders langs het of elk contactvlak. Bovendien wordt daarmee op eenvoudige en geschikte wijze verhinderd dat 5 houders in de inrichting kunnen vastraken, bijvoorbeeld doordat de houders vastvriezen.

In een voordelige nadere uitwerking wordt een inrichting volgens de uitvinding voorts gekenmerkt door de maatregelen volgens conclusie 3.

10 Het temperatuurverschil tussen het begin en het eind van de bewegingsbaan, waarbij tijdens gebruik de of elke houder in de richting van het koudste einde wordt bewogen, biedt het voordeel dat daarmee een geleidelijke afkoeling van de houders kan worden verkregen. Bovendien bieden de 15 stuurmiddelen daarbij de mogelijkheid, door sturing van de temperatuurgradiënt over het of elk contactvlak een temperatuurprofiel aan te leggen over de bewegingsbaan van de of elke houder. Te zamen met de sturing van de snelheid van de of elke houder ten opzichte van de inrichting, in het bij-20 zonder ten opzichte van het of elk contactvlak, kan daardoor voor elke houder en derhalve voor elk monster een voor de betreffende levende cellen optimaal invriesprofiel worden ingesteld. Het zal duidelijk zijn dat het daarbij de voorkeur geniet dat elk monster ter hoogte van het koudste einde 25 van de inrichting in voldoende mate is bevroren.

Tijdens het invriezen van levende cellen is uit onderzoek van aanvraagster gebleken dat het optreden van kristallisatie in een monster van grote invloed is op het resultaat van de invrieswerkwijze, in het bijzonder op de 30 overlevingskansen en de levendigheid van spermacellen. Daarbij is met name van belang dat het moment dat de kristallisatie aanvangt en het verloop van de temperatuur daarbij goed worden gestuurd.

Gebleken is dat het moment van optreden van de 35 kristallisatie van het grootste belang is. Indien de kristallisatie te laat wordt ingezet worden de cellen, 1004619 6 althans een deel daarvan, te lang opgehouden in een ongunstige, instabiele situatie, tus_°n 0°C en -5°C.

Teneinde deze nadelen te vermijder wordt een inrichting volgens de uitvinding gekenmerkt door de 5 maatregelen volgens conclusie 4.

De beweging van elke houder wordt tijdens gebruik met behulp van de stuurmiddelen zodanig gestuurd dat het optreden van kristallisatie in een monster, in een zogenaamde kristallisatiefase, althans in hoofdzaak optreedt in 10 dat gedeelte van de inrichting waar een relatief gering temperatuurverschil heerst tussen het begin en het einde van het betreffende gedeelte, een kristallisatie sector. De warmte, afgegeven door het of elk monster tijdens de kristallisatiefase zorgt daarbij voor een geringe temperatuur-15 stijging in de betreffende houder, de kristallisatie treedt relatief langzaam op waarbij op voordelige wijze kristallen worden gevormd en eventuele uitwisseling van bijvoorbeeld ionen en water tussen de cellen en de omgeving vindt relatief geleidelijk plaats, met als gevolg dat geen shock-20 effecten optreden. Mede daardoor wordt met een inrichting volgens de uitvinding een beter resultaat verkregen dan bij gebruik van de bekende inrichting. Indien kristallisatie niet wordt geïnitialiseerd dient het gehele monster sterk onderkoeld te worden. Bij het optreden van de kristallisatie 25 zal dan een zeer sterke stijging van de temperatuur optreden, met een temperatuurschok als gevolg, waarbij plotselinge kristallisatie zal optreden. Dit heeft onder meer mechanische schokken tot gevolg welke de cellen kunnen beschadigen. Voorts zal een plotselinge verandering in de 30 osmotische druk en de ionensterkte optreden en een te snel watertransport door celmembranen.

Belangrijke voordelen van het initiëren van de kristallisatie kunnen als volgt worden begrepen.

Zodra kristallisatie start zal de temperatuur in de 35 betreffende cellen of delen van het monster naar het voor de betreffende oplossing geldende vriespunt verschuiven. Zolang de kristallisatie niet althans grotendeels volledig is kan 1004619 7 de temperatuur in de houder niet, althans nagenoeg niet van buiten af worden beïnvloed, anders dan door het op gang houden van de kristallisatie. Bij de bekende werkwijzen en inrichtingen wordt steeds ook tijdens het optreden van de 5 kristallisatie de omgevingstemperatuur verder verlaagd, wordt doorgekoeld. Verrassenderwijs is gebleken dat deze omgevingstemperatuur tijdens het kristalliseren juist niet of slechts minimaal moet dalen, teneinde te grote temperatuurverschillen tussen de inhoud van de houder en de 10 omgeving te verhinderen. Als dit verschil te groot wordt kunnen grote spatiële verschillen optreden in de voortgang van de kristallisatie, bijvoorbeeld tussen een zone nabij de buitenwand van de houder en een zone in het hart van de houder. Dergelijke ongewenste verschillen zullen tevens 15 ongewenste verschillen in afkoelsnelheid veroorzaken.

Bovendien heeft een tijdens de kristallisatie doorgezette afkoeling van de omgeving tot gevolg dat wanneer de kristallisatie volledig is het temperatuurverschil tussen de houder en de omgeving onaanvaardbaar groot is, met als 20 gevolg dat de daarop volgende afkoeling te snel verloopt.

Een kristallisatiefase bij gebruik van een inrichting volgens de uitvinding biedt voorts het voordeel dat, indien gewenst, het op de kristallisatiefase voorgaande en met name het daarop volgende koeltraject tot aan een bewaar-25 temperatuur relatief snel kunnen verlopen, waardoor met een inrichting volgens de uitvinding snel een groot aantal monsters kan worden ingevroren.

In een verdere voordelige uitvoeringsvorm wordt een inrichting volgens de uitvinding gekenmerkt door de maat-30 regelen volgens conclusie 7.

De modulen kunnen alle in hoofdzaak aan elkaar gelijk zijn, waardoor deze tegen relatief lage kosten kunnen worden vervaardigd. Daardoor kan een groot aantal modulen tegen relatief geringe kosten worden toegepast. Dit biedt 35 het voordeel dat de temperatuurverschillen tussen de modulen tijdens gebruik gering kunnen zijn, waarbij de modulen relatief weinig massa behoeven te hebben en toch voldoende 1004619 8 warmte kunnen afvoeren. Zo kunnen de modulen bijvoorbeeld worden opgebouwd uit van koelmiddelen voorziene blokken, van in hoofdzaak massief aluminium of een dergelijk materiaal. Daarbij verdient het de voorkeur dat voor elke module afzon-5 derlijk stuurraiddelen zijn voorzien voor regeling van ten minste de temperatuur daarvan. Thermische koppeling van de modulen zorgt voor een geleidelijk verloop van de temperatuur langs het uit de gezamenlijke contactoppervlakken gevormde oppervlak waarlangs de houders worden bewogen.

10 Overigens kan een contactoppervlak van een inrichting volgens de uitvinding ook in hoofdzaak eendelig zijn uitgevoerd, bijvoorbeeld als een zijde van een relatief dik, massief en van koelmiddelen voorzien blok aluminium of dergelijke, waarbij een aantal koelstations is voorzien op 15 onderling relatief grote afstand. Het temperatuurverschil tussen opeenvolgende koelstations kan daarbij relatief groot zijn terwijl bovendien minder koelstations nodig zijn dan bij een modulaire en/of relatief dunne uitvoeringsvorm, hetgeen economische voordelen kan bieden.

20 In nadere uitwerking wordt een inrichting volgens de uitvinding voorts gekenmerkt door de maatregelen volgens conclusie 10 en 11.

De koelkanalen volgens de uitvinding maken een bijzonder eenvoudige en economisch voordelige koeling van 25 het of elk contactoppervlak mogelijk, waarbij door zorgvuldige positionering en dimensionering van de koelkanalen bovendien een zeer goede verdeling van de temperatuur en een goede temperatuurgradiënt over het betreffende contactvlak kan worden verkregen. Door een koelmedium toe te passen dat 30 bij het verlaten van de koelkanalen verdampt, en de ontstane damp door de in hoofdzaak gesloten behuizing langs de houders af te voeren wordt verhinderd dat lucht in de behuizing stroomt en althans vocht daaruit op de houders en/of het contactoppervlak neerslaat. Dergelijke condensatie 35 en daarop volgende bevriezing van lucht, althans vocht zal een goede doorvoer van de houders belemmeren en bovendien is 1004619 9 dit energetisch nadelig. Daarenboven kan daardoor vervuiling van het of elk contactoppervlak ontstaan.

In een voorkeursuitvoeringsvorm wordt een inrichting volgens de uitvinding voorts gekenmerkt door de maatregelen 5 volgens conclusie 15.

Zoals in het voorgaande beschreven is het van groot belang dat de kristallisatie in hoofdzaak tijdens de kristallisatiefase plaatsvindt, bij voorkeur onder strikt geregelde omstandigheden. Het aanvangen van kristallisatie 10 is in veel gevallen een toevalsproces, afhankelijk van onder meer de aanwezigheid van nucleatiekernen. De kristallisatie-initialisatiemiddelen volgens de uitvinding hebben het voordeel dat daardoor gestuurd de kristallisatie op gang wordt gebracht, op dat moment in het invriesproces dat voor de 15 betreffende cellen het meest geschikt is. De kristallisatie-initialisatiemiddelen zijn bij voorkeur uitgevoerd als middelen voor het tijdelijk en plaatselijk onderkoelen van een houder aan het begin van de kristallisatiefase.

De uitvinding heeft voorts betrekking op een werk-20 wijze voor het invriezen van levende cellen, gekenmerkt door de maatregelen volgens conclusie 16.

Verdere voordelige uitvoeringsvormen van een inrichting en werkwijze volgens de uitvinding zijn weergegeven in de volgconclusies en de beschrijving.

25 Ter verduidelijking van de uitvinding zullen uitvoe- ringsvoorbeelden van een inrichting volgens de uitvinding en een werkwijze, onder verwijzing naar de tekening, worden beschreven. Daarin toont: fig. 1 een zij-aanzicht van een inrichting volgens 30 de uitvinding; fig. 2 een bovenaanzicht van een inrichting volgens fig. 1, met gedeeltelijk weggenomen bovenafdekking; fig. 3 een vooraanzicht van een inrichting volgens fig. 1; 35 fig. 4 een schematische weergave van een tijd- temperatuurprotocol voor een inrichting volgens fig. 1-3; 1004619 10 fig. 5 een zij-aanzicht van een alternatieve, stationaire uitvoeringsvorm van een inrichting volgens de uitvinding; en fig. 6 een schematische weergave van een tijd-5 temperatuurprotocol voor een inrichting volgens fig. 5.

Een inrichting 1 volgens fig. 1-3 omvat een blok 2, vervaardigd uit warmtegeleidend materiaal, bijvoorbeeld aluminium of een aluminiumlegering. Het blok 2 heeft een ten opzichte van zijn breedte B een grote lengte L, terwijl de 10 dikte D relatief klein is. De bovenzijde 3 van het blok 2 is voorzien van een reeks evenwijdige, zich in de lengterichting uitstrekkende groeven 4, waarvan het doel en de uitvoeringsvorm nog nader zullen worfden toegelicht.

Door het blok 2 strekt zich onder het bovenvlak 3 15 een aantal koelleidingen 5 uit, in hoofdzaak dwars op de lengterichting van het blok 2, over de volle breedte B daarvan. Een aantal naast elkaar gelegen koelleidingen 5 is steeds gezamenlijk verbonden met een aanvoerleiding 6 voor een koelmedium, bijvoorbeeld vloeibare stikstof. In elke 20 aanvoerleiding is een regelklep 7 opgenomen voor het doseren van de hoeveelheid koelmedium die door de betreffende koelleidingen 5 wordt geleid. De regelklep 7 wordt gestuurd door een in het oppervlak 3 ter hoogte van de betreffende koelleidingen 5 aangebrachte thermostaat of andersoortige 25 temperatuurmeetmiddelen 8. De koelleidingen 5 die te zamen door één aanvoerleiding 6 en één regelklep worden gevoed vormen te zamen één koelstation 9, waarin de temperatuur wordt geregeld op basis van signalen van de bijbehorende temperatuurmeetmiddelen 8. In de getoonde uitvoeringsvorm is 30 een negental van dergelijke koelstations 9A-9I in de lengterichting van het blok 2 gezien achter elkaar aangebracht .

De temperatuurmeetmiddelen 8 zijn gezamenlijk instelbaar met behulp van een centrale regeleenheid 10, met 35 behulp waarvan de gewenste temperatuur in elk koelstation 9 kan worden ingesteld, zodanig dat een gewenst temperatuur- 1004619 11 profiel over het blok 2 kan worden verkregen. Dit gewenste temperatuurprofiel zal nog nader worden toegelicht.

De inrichting is voorzien van een aandrijfinrichting 12, omvattende een ketting of band 14 met zich over het 5 bovenvlak 3 van het blok 2, over de groeven 4 uitstrekkende duwstangen 15.

Tijdens gebruik ligt een aantal houders 16 in de groeven 4, zodanig dat de houders 16 met een deel van het buitenoppervlak aanliggen tegen het binnenoppervlak van de 10 groeven 4, zoals duidelijk blijkt uit fig. 3. In het getoonde uitvoeringsvoorbeeld worden de houders 16 gevormd door dunwandige rietjes, waarin een monster is opgenomen.

Elk monster omvat een aantal levende, in te vriezen cellen, in het bijzonder sperma, in een hoeveelheid oplosvloeistof. 15 De rietjes liggen in de lengterichting naast elkaar, waarbij steeds een duwstang 15 aanligt tegen het in bewegingsrichting achterliggende einde van de houders 16. Tijdens het aandrijven van de aandrijfinrichting 12 worden de houders derhalve in de lengterichting door de groeven 4 bewogen 20 tussen de beide einden van het blok 2, daarbij innig contact makend met het oppervlak 3 van het blok 2, in het bijzonder de binnenzijde van de groeven 4.

Over het bovenvlak 3 van het blok 2 is een dunne, flexibele en thermisch isolerende film 17 aangebracht, 25 bijvoorbeeld HDPE- of PTFE-film. Deze film 17 isoleert de houders 16 van de omgeving en vormt te zamen met het blok 2 voor een gesloten behuizing 18. De koelkanalen 5 monden aan bijvoorbeeld de van de aanvoerleiding 6 afgekeerde zijde of door kleine doorgangen naar de groeven 4 uit onder de film 30 17, binnen de genoemde behuizing 18. Bij het verlaten van de koelleidingen 5 verdampt de vloeibare stikstof en verdringt alle lucht uit de behuizing 18 of althans tussen de film 17 en het oppervlak 3 van het blok 2. Daardoor wordt verhinderd dat condensatie optreedt binnen de behuizing 18, welke 35 condensatie tot gevolg zou kunnen hebben dat de houders 16 niet of althans niet op regelmatige wijze door de groeven 4 kunnen worden gedrukt. Bovendien is condensatie thermisch 1004619 12 ongunstig. Het verdient daarbij de voorkeur dat het verdampende medium in de richting van de invoerzijde 19, dat wil zeggen het warmste einde van de inrichting stroomt, zodat de houders daardoor niet onbedoeld weer worden opgewarmd.

5 Bovendien zal eventuele lucht binnen de inrichting de neiging vertonen in de bewegingsrichting van de houders 16 mee te stromen. Het is daarom voordelig de stikstof in hoofdzaak in tegengestelde richting te doen stromen voor het verdringen van die lucht. Door een relatief klein deel van 10 de stikstof echter met de houders 16 mee te laten bewegen wordt ook de lucht nabij het koude einde van de inrichting verdreven.

In het tweede koelstation 9B is een zogenaamde koel-vinger 23 aangebracht als kristallisatie-initiatiemiddel.

15 Deze koelvinger 23 omvat in de getoonde uitvoeringsvorm een buisvormig deel 24, aangesloten op de koelmedium-aanvoer-leiding 6. Het buisvormige deel 24 ligt in het oppervlak 3 van het blok 2, zodanig dat de houders 16 daarmee in contact komen tijdens het passeren caarvan. Met behulp van een 20 regelklep 25 kan vloeibaar stikstof door het buisvormige deel 24 worden gejaagd, waardoor de koelvinger 23 plotseling en kortstondig koud kan worden gemaakt, dat wil zeggen kouder dan het oppervlak 3 rond de vinger 23 in het betreffende koelstation 9B. Het doel hiervan zal nog nader worden 25 toegelicht.

Aan de aanvoerzijde 19 van het blok 2, dat wil zeggen de in transportrichting achterliggende zijde, is een aanvoerinrichting 20 voorzien die voor een regelmatige verdeling van de rietjes 16 over het oppervlak 3 van het 30 blok 2 zorgt, in het bijzonder voor plaatsing van de rietjes 16 in de groeven 4. Een dergelijke aanvoerinrichting 20 kan op velerlei wijzen worden uitgevoerd.

Aan de afvoerzijde 21 van het blok 2 sluit een afvoerinrichting 22 aan, welke voor sortering en opslag van 35 de rietjes met daarin ingevroren monsters zorgt. Ook een dergelijke afvoerinrichting 22 kan op velerlei wijzen worden uitgevoerd.

1004619 13

Een inrichting volgens fig. 1-3 kan bijvoorbeeld de volgende afmetingen hebben, welke afmetingen geenszins als beperkend dienen te worden uitgelegd. Het blok kan een lengte L hebben van 1600 mm, een breedte B van 300 mm en een 5 dikte van enkele tientallen milimeters. In het oppervlak 3 kan een 100-tal gootvormige groeven 4 met een breedte van 3 mm zijn aangebracht. Tijdens gebruik kunnen bijvoorbeeld 100 rietjes naast elkaar en 11 rietjes achter elkaar op het oppervlak 3 van het blok 2 worden gelegd.

10 In fig. 4 is schematisch een temperatuurgrafiek getoond voor een inrichting volgens de fig. 1-3. In een getrokken lijn T(opp) is het temperatuurprofiel getoond dat tijdens gebruik op het oppervlak 3 wordt verkregen, in een onderbroken lijn T(hou) het temperatuurprofiel dat in een 15 over het oppervlak gevoerde houder 16 optreedt. De onderste horizontale as toont de bijbehorende koelstations 9A-9I. De houders 16 worden tijdens gebruik met een snelheid van bijvoorbeeld 1000 mm/min over het oppervlak 3 gevoerd.

In het eerste koelstation 9A wordt een temperatuur 20 Tl ingesteld die gemiddeld ongeveer +5°C bedraagt. Daartoe is in dit eerste koelstation 9A een verwarmingsspiraal 26 opgenomen, welke kan worden ingeschakeld wanneer de thermostaat 8 in het betreffende koelstation 9A een temperatuur registreert die lager is dan een minimale grens-25 temperatuur.

In het tweede koelstation 9B wordt een temperatuur T2 ingesteld die ongeveer -5°C bedraagt. Het tweede koelstation 9B ligt op een afstand van ongeveer 200 mm van de koelmiddelen van het eerste koelstation 9A, waardoor tussen 30 deze twee koelstations 9A en 9B een temperatuurgradiënt TG1 wordt verkregen van ongeveer 50°C/min. Het tweede koelstation 9B is ongeveer 350 mm lang en heeft over de volle lengte een ongeveer gelijke temperatuur. Daartoe zijn onder het gehele oppervlak 3 in het tweede koelstation 9B op 35 regelmatige, relatief kleine tussenafstanden koelhuizen 5 voorzien, in tegenstelling tot de overige koelstations 9, 1004619 14 waarin slechts onder een gedeelte van het oppervlak 3 koelhuizen 5 zijn voorzien.

Bij het binnentreden van de houders in het tweede koelstation 9B passeren deze de koelvinger 23. Wanneer het 5 achterliggende einde van elke betreffende houder 16 zich ongeveer boven de koelvinger 23 bevindt wordt de regelklep 25 kortstondig geopend en de koelvinger 23 sterk onderkoeld. In fig. 4 is deze sterke onderkoeling van het oppervlak 3 ter hoogte van het begin van het tweede koelstation 9B weer-10 gegeven door een dal Tkv in de getrokken lijn T(opp)

Daardoor wordt in de houders 16, op afstand van het midden daarvan, kristallisatie geïnitialiseerd, waarna tijdens het doorlopen van het tweede koelstation 9B volledige kristallisatie kan optreden in de houders 16. De nagenoeg constante 15 temperatuur (de minimale temperatuurgradiënt TG2) in het tweede koelstation 9B zorgt daarbij voor een kristallisatie-pauze. De temperatuur in de houders loopt in het tweede koelstation, als gevolg van dissipatie van kristallisatie-warmte, op, eventueel tot nabij 0°C.

20 Tijdens gebruik is de omgevingstemperatuur van de houders in het tweede koelstation 9B nauwkeurig ingesteld, afhankelijk van de betreffende soort cellen. Zo wordt bijvoorbeeld voor gebruik bij het invriezen van rundersperma de temperatuur in het tweede koelstation 9B ingesteld op 25 ongeveer -5°C en constant gehouden. Deze kan echter ook in het tweede koelstation 9B enigszins afnemen, dat wil zeggen dat in het betreffende tweede koelstation 9B een lage temperatuurgradiënt TG2 kan worden ingesteld.

In het op het tweede koelstation 9B aansluitende 30 deel van de inrichting wordt bij voorkeur een temperatuurgradiënt TG3 ingesteld die hoger is dan die in het voorgaande deel van de inrichting, bijvoorbeeld een temperatuurgradiënt c.q. temperatuurprofiel dat zorgt voor een af koelsnelheid van 100°C/min. Daartoe wordt in de opvolgende 35 koelstations 9C - 91 achtereenvolgens temperaturen ingesteld van T3=-15°C, T4=-25°C, T5=-40°C, T6=-55°C, T7 = -75°C, T8 = -95°C en T9 = -120°C. De afstand tussen elk der opvolgende 1004619 15 koelstations is daarbij gemiddeld bijvoorbeeld ongeveer 150 mm.

De soortelijke warmte van het gevormde ijs in de houders 16 is aanmerkelijk lager bij lagere temperaturen. Om 5 deze reden kan de afstand tussen twee in de bewegingsrichting gezien latere koelstations ten opzichte van de afstand tussen twee eerdere koelstations 9 relatief groot zijn, terwijl de temperatuurverschillen tussen latere koelstations bovendien groter kunnen zijn. Voorts is de 10 temperatuurgradiënt TG of althans de actuele afkoelsnelheid bij lagere temperaturen voor de levende cellen, in het bijzonder voor spermacellen minder kritisch voor de overlevingskansen van de cellen. De thermische geleiding van het blok 2 dient zodanig te worden gekozen, bijvoorbeeld 15 door materiaalkeuze en afmetingen, dat de warmtestroom tussen de koelstations 9 aanmerkelijk groter is dan de hoeveelheid warmte die wordt afgegeven door de houders 16 in de betreffende koelstations 9. Daardoor wordt in de koelstations 9A en 9C - 91 een voldoende lineaire temperatuur-20 gradiënt verkregen.

De afvoerinrichting 2 omvat bijvoorbeeld een aantal glijgoten 27 die aansluiten op in koelmiddelen 28 opgestelde opvangbakken 29 waarinde houders gesorteerd kunnen worden opgenomen en opgeslagen. Het sorteren van de houders kan 25 voorafgaand aan het invriezen plaatsvinden maar kan ook in de afvoerinrichting 22 worden uitgevoerd. Dit kan zowel met de hand als met behulp van mechanische sorteermiddelen worden uitgevoerd.

In de voorgaand beschreven inrichting kunnen 30 bijvoorbeeld 700 houders 16 per minuut op de band worden gebracht, hetgeen betekent dat een ejaculaat in omgeveer 3-4 minuten geheel kan zijn verwerkt.

Uitgaande van gebruik van gelijk materiaal voor het blok 2 kan worden gesteld dat een dikker blok 2 het voordeel 35 kan bieden dat daardoor minder koelstations noodzakelijk zijn, welke op een grotere onderlinge afstand kunnen liggen en een groter onderling temperatuurverschil kunnen hebben, 1004619 16 bijvoorbeeld 20°C. Dit is het gevolg van de grotere warmte-stroom door het relatief dikke blok 2. Bij een dunnere uitvoeringsvorm van het blok 2 zullen juist meerdere koel-stations 9 dichter bij elkaar moeten worden geplaatst, met 5 relatief kleine temperatuurverschillen, bijvoorbeeld 5°C. Door de inrichting modulair uit te voeren, dat wil zeggen elk koelstation 9 of eventueel een beperkt aantal koel-stations 9 in een afzonderlijke module op te nemen, waarbij de modulen gelijk en onderling thermisch en mechanisch 10 koppelbaar zijn, wordt het voordeel bereikt dat op economische wijze een dergelijke inrichting kan worden vervaardigd en opgebouwd. Een relatief dun blok 2 kan productietechnische, gebruikstechnische en economische voordelen hebben boven een relatief dik blok 2.

15 Het is uiteraard ook mogelijk bijvoorbeeld de snel heid van de houders 16 ten opzichte van het blok 2 anders te kiezen, bijvoorbeel 500 mm/min, te zamen met en korter blok 2, bijvoorbeeld 800 mm. Daarbij dient dan bijvoorbeeld een temperatuurgradiënt TG ingesteld te worden van 2°C/cm.

20 Daarmee kan met een relatief dun blok 2 worden volstaan.

In fig. 5 is een alternatieve uitvoeringsvorm getoond van een inrichting 101 volgens de uitvinding.

Gelijke delen hebben daarbij corresponderende verwijzings-cijfers. Fig. 6 toont een bijbehorend regelschema. Bij 25 gebruik van een dergelijke inrichting kunnen houders 116 tijdens gebruik stationair op een blok 102 worden geplaatst en worden afgekoeld, ten einde daarin opgenomen monsters in te vriezen onder ideale omstandigheden.

De inrichting 101 omvat een blok 102, vervaardigd 30 uit warmtegeleidend materiaal zoals metaal, bijvoorbeeld aluminum, koper of legeringen daarvan, waarin een aantal koelleidingen 105 is opgenomen. De koelleidingen 105 zijn via een aantal regelkleppen 107 aangesloten op een aanvoer-leiding 106 voor een koelmiddel, bijvoorbeeld vloeibaar 35 stikstof. In het oppervlak 103 van het blok 102 zijn thermo-staatmiddelen 108 opgenomen, aangesloten op een centrale regeleenheid 110. Met behulp van de centrale regeleenheid 1004619 17 110 kunnen de regelkleppen 107 worden aangestuurd voor het door de koelleidingen 105 voeren van een hoeveelheid koelmedium afgestemd op de op dat moment gewenste temperatuur van het oppervlak 103, afhankelijk van de gemeten 5 temperatuur. Daarmee kan een in de centrale regeleenheid 110 ingevoerd koelprotocol KP, afgestemd op de te koelen levende cellen, worden overgebracht op het blok 102 en daarmee op de daarop geplaatste houders 116.

Ook bij deze inrichting 101 worden de op het opper-10 vlak 103 geplaatste houders 116 tijdens gebruik afgedekt met behulp van een flexibele, thermisch isolerende afdekfilm 117, waarbij de koelleidingen 105 tussen het oppervlak 103 van het blok 102 en de film 117 uitmonden. Een inrichting volgens fig. 5 is met name geschikt voor gebruik bij houders 15 met een ten opzichte van hun oppervlak relatief kleine hoogte, bijvoorbeeld foliezakjes zoals gebruikelijk bij berensperma (boar sperm) (sperma van mannetjes-varkens), maar ook voor cellen in bakjes of op glaasjes. In of boven het oppervlak 103 is een koelvinger 123 aangebracht, welke 20 kortstondig kan worden onderkoeld en in contact kan worden gebracht met een gedeelte van de op het oppervlak 103 geplaatste houders 116.

In fig. 6 is schematisch een regelschema getoond voor gebruik bij een inrichting 101 volgens fig. 5, waarin 25 gelijke delen gelijke verwijzingscijfers hebben. Fig. 6 toont daarbij grafisch het verband tussen de temperatuur van het oppervlak 103 en de temperatuur in de houders 116.

Daarin is in een getrokken lijn T(opp) het temperatuurprofiel getoond dat tijdens gebruik op het oppervlak 103 30 wordt verkregen, in een onderbroken lijn T(hou) het temperatuurprofiel dat in een op het oppervlak geplaatste houder 16 optreedt. Langs de verticale as is de temperatuur uitgezet, in °C, langs de horizontale as de tijd, in min. De weergegeven waarden zijn slechts illustratief bedoeld en 35 zijn gekozen voor het invriezen van berensperma (boar sperm).

1004619 18

Voor aanvang van het invriestraject worden de houders 116 afgekoeld tot bij voorbeeld +5°C. Vervolgens worden de houders 116 op het tijdstip ti op het oppervlak 103 geplaatst, waarbij of waarna de oppervlaktemperatuur Tl 5 wordt ingesteld op -5°C. De houders 16 en elk daarin opgenomen monster worden afgekoeld (TG1), zolang tot de temperatuur in de houder ongeveer -5°C is. Vervolgens wordt de koelvinger 123 met een gedeelte van elke houder 116 in contact gebracht en onderkoeld voor het initiëren van de 10 kristallisatie in de houders. Vervolgens wordt de temperatuur van het oppervlak 103 gedurende een kristallisatiefase T2 op -5°C gehouden, (temperatuurverloop-gradiënt TG2 = 0) zolang tot volledige kristallisatie is opgetreden. Daarna wordt de temperatuur van het oppervlak 15 geleidelijk, bijvoorbeeld met een gemiddelde temperatuurs-daling TG3 van 100°C/min tot 150°C/min voor rundersperma of 50°C/min voor berensperma (boarsperm), teruggebracht tot -120°C, zodanig dat volledige bevriezing van de monsters wordt verkregen. De monsters kunnen vervolgens worden 20 opgeslagen voor later gebruik, en het oppervlak 103 kan weer op de begintemperatuur Tl van -5°C worden teruggebracht.

Een inrichting volgens de uitvinding omvat ten minste één contactvlak waarvan de temperatuur regelbaar is met behulp van koel- en/of verwarmingsmiddelen. Een contact-25 vlak dient in deze te worden begrepen als een oppervlak dat door direct of althans nagenoeg direct contact de temperatuur van houders kan beïnvloeden. Daarbij kan de temperatuur van het of elk contactvlak zelf bijvoorbeeld door contact met een koel medium, door convectie of door straling worden 30 geregeld, waarbij de of elke houder kan aan liggen tegen het contactvlak of bijvoorbeeld op zeer geringe afstand daarvan kan liggen, bijvoorbeeld gedragen door een film van koelmedium.

De uitvinding is geenszins beperkt tot de 35 inrichtingen en werkwijzen zoals als voorbeelden beschreven. Vele variaties daarop zijn mogelijk.

1004619 19

Zo kan, afhankelijk van de soort en hoeveelheid in te vriezen cellen, de gewenste nauwkeurigheid, de gewenste overlevingskans, de samenstelling van de vloeistof of andersoortige omgeving waarin de levende cellen zijn opgenomen en 5 worden ingevroren, de gewenste eindtemperatuur en dergelijke, een ander invriesprotocol worden gekozen. Bovendien kunnen andersoortige contactoppervlakken worden toegepast, bijvoorbeeld koker- of buisvormige geleidingen bij een inrichting volgens fig. 1 - 3 of koker- of busvormige 10 opneemholten bij een inrichting volgens fig. 5. Ook kunnen combinaties van dergelijke oppervlakken worden toegepast. Voorts kan een inrichting zijn opgebouwd uit een combinatie van een inrichting volgens de uitvinding voor het eerste, over het algemeen meest kritische gedeelte van het invries-15 traject, en een inrichting van de bekende soort voor een gedeelte van het invriestraject na de kristallisatiefase, dat wil zeggen dat deel van het invriestraject nadat althans nagenoeg volledige kristallisatie in de houders is opgetreden. Verder kunnen andere koelmiddelen worden 20 toegepast en kunnen andere houders worden gebruikt. Ook kunnen meerdere contactvlakken tegenover elkaar worden geplaats, waarbij de houders tussen de betreffende contactvlakken worden opgenomen of doorgevoerd. Het koelprotocol kan handmatig of (semi)automatisch worden geregeld. Deze en 25 vele vergelijkbare varianten vallen binnen het raam van de uitvinding.

1004619

Claims (18)

1. Inrichting voor het invriezen van levende cellen, in het bijzonder sperma, welke cellen in ten minste één monster zijn opgenomen in ten minste één houder, waarbij middelen zijn voorzien voor het koelen van de of elke houder, met het 5 kenmerk, dat de koelmiddelen (5, 6, 7; 105 , 106, 107) ten minste één koelbaar contactvlak (3, 103) omvatten voor het tijdens gebruik door aanligcontact koelen van de of elke houder (16, 116) en het of elk daarin opgenomen monster, waarbij stuurmiddelen (10, 110) zijn voorzien voor het 10 tijdens afkoelen sturen van de afkoelsnelheid (TG) en de omgevingstemperatuur van de of elke houder (16, 116).

2. Inrichting volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat middelen (12, 14, 15) zijn voorzien voor het relatief ten opzichte van het of elk contactvlak (3) bewegen van de of 15 elke houder (16).

3. Inrichting volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat de stuurmiddelen (10) zijn ingericht voor het tijdens gebruik over het of elk contactvlak (3) aanbrengen en in stand houden van een temperatuurverschil tussen de in 20 bewegingsrichting tegenover elkaar gelegen einden (19, 21) daarvan, zodanig dat de of elke houder (16) tijdens gebruik in de richting van het koudste einde (21) wordt bewogen.

4. Inrichting volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat de stuurmiddelen (10) zijn ingericht voor het tijdens 25 gebruik in een kristallisatiesector (9B) van de inrichting (1) instellen en ingesteld houden van een relatief klein temperatuurverschil, bij voorkeur nagenoeg 0°C, over het contactvlak (3) of het contactvlakgedeelte in de kristallisatiesector (9B), waarbij de gemiddelde temperatuur in de 30 kristallisatiesector (9B) zodanig is dat kristallisatie optreedt in de of elke houder (16) tijdens het bewegen daarvan door de kristallisatiesector (9B). 1004619 «

5. Inrichting volgens één der conclusies 2-4, met het kenmerk, dat een reeks contactvlakken (3) is voorzien, waarbij elk contactvlak (3) tijdens gebruik althans een gemiddelde temperatuur (T1-T9) heeft die gelijk of bij 5 voorkeur lager is dan die van het in de bewegingsrichting daarop voorliggende contactvlak.

6. Inrichting volgens één der conclusies 2-5, met het kenmerk, dat de stuurmiddelen (10) in of nabij elk contactvlak (3) ten minste temperatuurmeetmiddelen (8) en koel- 10 middelen (5) omvatten, waarbij de koelmiddelen (5) aanstuur-baar zijn op basis van een door de temperatuurmeetmiddelen (8) afgegeven signaal, voor het regelen van de temperatuur en bij voorkeur de temperatuurgradiënt over het betreffende oppervlak (3).

7. Inrichting volgens conclusie 5 of 6, met het kenmerk, dat de inrichting (1) een aantal modulen omvat, waarbij elke module ten minste één contactvlak (3) omvat en waarbij de modulen thermisch gekoppeld zijn.

8. Inrichting volgens één der conclusies 2-7, met het 20 kenmerk, dat het of elk contactvlak (3) is voorzien van geleidingsmiddelen (4) voor het gestuurd geleiden van de of elke houder (16) langs het of elk contactvlak (3).

9. Inrichting volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de stuurmiddelen (110) in of nabij het contactvlak (103) ten 25 minste temperatuurmeetmiddelen (108) en koelmiddelen (105) omvatten, waarbij de koelmiddelen (105) aanstuurbaar zijn op basis van een door de temperatuurmeetmiddelen (108) afgegeven signaal, voor het regelen van de temperatuur van het betreffende oppervlak (103).

10. Inrichting volgens één der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat de koelmiddelen koelkanalen (5, 105) omvatten voor het doorleiden van een koelmedium, waarbij klepmiddelen (7, 107) zijn voorzien voor het sturen van de tijdens gebruik door de koelkanalen (5, 105) stromende 35 hoeveelheid medium.

11. Inrichting volgens conclusie 10, met het kenmerk, dat de inrichting (1, 101) een in hoofdzaak gesloten behuizing 1004619 (18, 118) omvat, waarbij de of elke houder (16, 116) binnen de behuizing (18, 118) wordt gekoeld, -«'aarbij althans een aantal van de koelkanalen (5, 105) binnen de behuizing (18, 118) uitmondt, waarbij het koelmedium een medium is dat 5 tijdens of na het verlaten van de koelkanalen (5, 105) overgaat in een gasfase, één en ander zodanig dat tijdens gebruik door het gasvormige koelmedium binnen de behuizing (18, 118) ten minste condenstatie wordt tegengegaan.

12. Inrichting volgens conclusie 11, met het kenmerk, dat 10 althans een aantal van de koelkanalen (5, 105) zodanig uitmondt dat het gasvormige koelmedium tijdens gebruik door de behuizing (18, 118) beweegt, in hoofdzaak in een richting tegengesteld aan de bewegingsrichting van de of elke houder (16, 116) .

13. Inrichting volgens één der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat afdekmiddelen (17, 117) zijn voorzien voor het tijdens het koelen afdekken van de of elke houder (16, 116) aan de van het of elk contactvlak (3, 103) afgekeerde zijde, welke afdekking (17, 117) bij voorkeur flexibel en 20 thermisch isolerend is.

14. Inrichting volgens één der conclusies 2-13, met het kenmerk, dat aan de koudste zijde (21) van de inrichting middelen (22) aansluiten voor het sorteren en vanuit de inrichting afvoeren en opslaan van houders.

15. Inrichting volgens één der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat kristallisatie-initialisatiemiddelen (23) zijn voorzien.

16. Werkwijze voor het invriezen van levende cellen, in het bijzonder sperma, in het bijzonder geschikt voor 30 toepassing met een inrichting volgens één der voorgaande conclusies, omvattende de stappen: opnemen van een een aantal levende cellenomvattend monster in een houder; plaatsing van de houder in een koelinrichting, in 35 contact met een keeloppervlak; gestuurde koeling van de houders door gestuurde koeling van het koeloppervlak, waarbij; 1004619 in een eerste koeltraject de houder relatief snel wordt afgekoeld tot het begin van kristallisatie in de houder optreedt; in een tweede koeltraject de houder relatief langzaam 5 of niet verder wordt afgekoeld, waarbij bij voorkeur de omgevingstemperatuur, in het bijzonder de temperatuur van het contactvlak nagenoeg constant wordt gehouden, zolang tot kristallisatie in de houders althans in hoofdzaak volledig is opgetreden; en 10. in een derde koeltraject de houders relatief snel tot ten minste een eindtemperatuur worden afgekoeld waarbij de cellen in hoofdzaak chemisch, biochemisch en fysisch stabiel zijn; waarna de houders bij voorkeur verder worden afgekoeld 15 tot de bewaartemperatuur van de cellen.

17. Werkwijze volgens conclusie 16, met het kenmerk, dat de houder stationair (116) ten opzichte van het contactvlak (103) wordt geplaatst, waabij de temperatuur van het contactvlak (103) wordt geregeld volgens een voor de 20 betreffende soort cellen geschikt koelprotocol (KP).

18. Werkwijze volgens conclusie 17, met het kenmerk, dat de houder (16) langs het contactvlak (3) of een aantal contactvlakken wordt bewogen tussen een eerste einde (19) met een relatief hoge temperatuur en een tweede einde (21) 25 met een relatief lage temperatuur, waarbij de temperatuur-gradiënt (TG) langs het of elk contactvlak (3) nauwkeurig wordt gestuurd volgens een voor de betreffende soort cellen geschikt koelprotocol (KP). 1004619