MXPA99010284A

MXPA99010284A - Composiciones de gelificacion retardada, de liberacion sostenida

Info

Publication number: MXPA99010284A
Application number: MXPA/A/1999/010284A
Authority: MX
Inventors: Seymour Goldenberg Merrill; C Beekman Alice; Hua Gu Jian
Original assignee: Amgen Inc; C Beekman Alice; Seymour Goldenberg Merrill; Hua Gu Jian
Priority date: 1997-05-16
Filing date: 1999-11-09
Publication date: 2000-06-01

Abstract

La presente invención se refiere a formulaciones de liberación sostenida utilizando geles retardados de alginato y métodos para fabricar las mismas.

Description

COMPOSICIONES DE GELIFICACION RETARDADA, DE LIBERACIÓN SOSTENIDA Campo de la Invención La presente invención se refiere a formulaciones de liberación sostenida que utilizan geles de acción retardada de alginato y a métodos para fabricar los mismos.

Antecedentes de la Invención Con los avances en las tecnologías de la ingeniería genética y celular, la disponibilidad de las proteína recombinantes ha engendrado avances en el uso de proteínas como medicamentos para aplicaciones terapéuticas. Muchas enfermedades o condiciones tratadas con las proteínas farmacéuticas requieren niveles de proteínas sostenidos para lograr el resultado terapéutico más efectivo. Sin embargo, como con la mayoría de las substancias farmacéuticas de las proteínas, la vida media biológica generalmente corta requiere una administración frecuente. Estas inyecciones repetidas se dan a varios intervalos lo cual conduce a niveles de medicación Ref.031946 fluctuantes y a un costo monetario y físico significativo para los pacientes. Puesto que muchas condiciones responden mejor a niveles controlados de una substancia farmacéutica, existe una necesidad de una liberación controlada de un medicamento para proporcionar períodos más prolongados de liberación consistente. Tales medicamentos de liberación sostenida podrían proveer al paciente no solamente con efectos profilácticos, terapéuticos o de diagnóstico mejorados, sino también a una reducción en la frecuencia de las inyecciones así como en los costos totales. Los intentos o pruebas actuales para sostener los niveles de medicación en los seres humanos o animales entre las dosis, han incluido el uso de polímeros biodegradables como matrices para controlar la liberación del medicamento. Por ejemplo, la Patente No. 1,388,580 de la Gran Bretaña describe el uso de hidrogeles para la liberación sostenida de insulina. La Patente U.S. No. 4,789,550 describe el uso de microcápsulas de alginato recubiertas con polilisina para el suministro de proteínas por la encapsulación de- células vivas. Los intentos o pruebas de una liberación sostenida también han utilizado composiciones poliméricas aniónicas o catiónicas rodeadas por polímeros iónicos de la carga opuesta para encapsular las células capaces de producir composiciones activas biológicamente. Patente U. S. No. 4,744,933. De manera semejante, también se han descrito recubrimientos múltiples de polímeros de reticulación aniónicos o catiónicos como medios para obtener una liberación controlada. Patentes U. S. Nos. 4,690,682 y 4,789,516. Además, algunos intentos o pruebas adicionales describen el uso de alginatos solos, o alginatos recubiertos con otros polímeros biodegradables, para la liberación controlada de las composiciones de polipéptidos o precipitados catiónicos de los mismos. PCT WO 96/00081, PCT WO 95/29664 y PCT WO 96/03116. Estas pruebas o intentos, sin embargo, _ han provisto un medio insuficiente para obtener un suministro de liberación sostenida de las substancias farmacéuticas de las proteínas deseadas. En general se sabe que el uso de ciertos polímeros biodegradables, por ejemplo, co-glicoluro de polilactida, bajo condiciones in vivo, exhiben descargas iniciales elevadas de liberación del medicamento. Johnson, 0. et al., Nature Med., 2/7 : 795 (1996) . Además, se sabe en general que las proteínas utilizadas con las formas comunes de preparaciones de liberación sostenida puedan padecer la desnaturalización y perder su bioactividad durante la exposición al agente de encapsulación. Tales preparaciones utilizan solventes orgánicos los cuales pueden tener efectos perjudiciales sobre la proteína de elección. Finalmente, como se describe posteriormente, el uso de alginato solo no ha provisto la liberación de proteína controlada, deseada, necesaria para resultados terapéuticos efectivos. En general, los alginatos son polisacáridos aniónicos, que están presentes en forma natural, bien conocidos, del ácido ß-D-manurónico 1,4-enlazado y el ácido -L-gulurónico. Smidsrod, 0. et al., Trends in Biotechnology, 8:71-78 (1990); Aslani, P. et al., J. Microencapsulation, 13/5. 601-614 (1996) . Los alginatos típicamente varían desde 70% de ácido anurónico y 30% de ácido gulurónico, hasta 30% de ácido manúrico y 70% de ácido gulurónico. Smidsrod, supra. El ácido algínico es insoluble en el agua mientras que las sales formadas con iones monovalentes semejantes al sodio, potasio y amonio son solubles en agua. McDowell, R.H., "Properties of Alginates" (London, Alginate Industries Ltd., 4/a. edición 1977) . Los cationes polivalentes se sabe que reaccionan con los alginatos para formar espontáneamente geles. Los alginatos tienen una amplia variedad de aplicaciones tales como aditivos para alimentos, adhesivos, tabletas farmacéuticas, modelos para un nuevo crecimiento celular, y vendajes para heridas. Los alginatos también han sido recomendados para las técnicas de separación de las proteínas. Por ejemplo, Gray, C.J. et al., en Biotechnology and Bioengineering, 31.: 607-612 (1988) atrapó la insulina en geles de alginato de zinc/calcio para la separación de insulina de otras proteínas del suero. Las matrices de alginato también han sido bien documentadas para sistemas de suministro de fármacos, véase por ejemplo la Patente U.S. No. 4,695,463 que describe un sistema de suministro de goma de mascar a base de alginato y preparaciones farmacéuticas. Las cuentas o glóbulos de alginato también han sido utilizadas para la liberación controlada de varias proteínas tales como: el receptor del factor de la necrosis tumorígena en las cuentas o glóbulos de alginato-catión recubiertas con policationes, Wee, S.F., Proceed. Intern. Symp. Control. Reí. Bioact. Mater., 21 : 730-31 (1994); la transformación del factor de crecimiento encapsulado en las cuentas o glóbulos de alginato, Puolakkainen, P.A. et al., Gastroenterology, 107 : 1319-1326 (1994); factores angiogénicos atrapados en cuentas o glóbulos de calcio-alginato, Downs, E.C. et al., J. of Cellular Physiology, 152: 422-429 (1992); albúmina atrapada en microcápsulas de alginato-quitosán, Polk, A. et al., J. Pharmaceutical Sciences, 83/2. 178-185 (1994), o las cuentas o glóbulos de alginato de calcio-quitosán recubiertas con polímeros, Okhamafe, A. 0. et al., J. Microencapsulation, 13/5: 497-508 (1996); hemoglobulina encapsulada con cuentas o glóbulos de alginato de calcio-quitosán, Huguet, M.L. et al., J. Applied Polymer Science, 51. 1427-1432 (1994), Huguet, M. L. et al., Process Biochemistry, 31_: 745-751 (1996); e interleucina-2 encapsulada en microesferas de alginato-quitosán, Liu, L. S. et al., Proceed. Intern. Symp. Control. Reí. Bioact . Mater. 22: 542-543 (1995). Los sistemas que utilizan cuentas o glóbulos de gel de alginato, cuentas o glóbulos de alginato/calcio, para atrapar las proteínas, sufren de la falta de algún efecto de liberación sostenida debido a una liberación rápida de la proteína de las cuentas o glóbulos de alginato. Liu, L. et al., J. Control. Reí., 43: 65-74 (1997) . Para evitar tal liberación rápida, varios de los sistemas anteriores utilizan recubrimientos de polímero policatiónico (por ejemplo, polilisina, quitosán) para retardar la liberación de las cuentas o glóbulos de alginato proteína. Véase, por ejemplo, Wheatley, M.A. et al., J. Applied Polymer Science, 43: 2123-2135 (1991); Wee, S.F. et al. Supra; Liu, L.S. et al., supra; Wee, S. F. et al., Controlled Reléase Society, 22: 566-567 (1995) y Lim, et al., supra.

Los policationes, tales como la polilisina, son polielectrólitos cargados positivamente los cuales interactúan con las moléculas de alginato cargadas negativamente para formar complejos de polielectrólito que actúan como barreras de difusión sobre la superficie de la cuenta o glóbulo. Pueden ocurrir problemas con el uso de policationes porque: (1) tales formulaciones pueden ser citotóxicas debido a los policationes (Huguet, M.L. et al., supra; Zimmermann, Ulrich, Electrophoresis, _13: 269 (1992); Bergmann, P. et al., Clinical Science, 67 : 35 (1984)); (2) los policationes son propensos a la oxidación; (3) las cuentas o glóbulos con recubrimientos policatiónicos tienden a no ser desgastables y se acumulan en el cuerpo; (4) tales formulaciones se hacen por medio de procedimientos de recubrimiento laboriosos los cuales incluyen recubrimientos múltiples de la polilisina policatiónica (Padol, et al., Proceed. Intern. Symp. Control. Reí. Bioact. Mater, 2,: 216 (1986) y (5) las interacciones iónicas entre la proteína y los policationes pueden conducir a la pérdida de la actividad de la proteína o provocar la inestabilidad de la proteína. Además de los sistemas anteriores, también existen sistemas de suministro los cuales se gelifican después de la inyección, o son a base de substancias orgánicas y/o a base de substancias tixotrópicas. Los depósitos gelificados los cuales se gelifican después de la inyección en el cuerpo pueden sostener la liberación de los fármacos atrapados. Estos podrían incluir la gelificación inducida por la temperatura de los poloxámeros, (por ejemplo, Pluronics®, Patente U. S. No. 2,741,573). Estos son líquidos a temperaturas frías pero se gelifican a temperaturas elevadas tales como las temperaturas del cuerpo. Estos sistemas son difíciles de controlar debido a las variaciones en las condiciones de la temperatura ambiental, y las variaciones en las temperaturas anatómicas especialmente si se utilizan inyecciones subcutáneas. Como para los sistemas de gelificación de base orgánica, tales sistemas no son adecuados para fármacos de proteínas frágiles que son desestabilizados en la presencia de solventes orgánicos o condiciones no fisiológicas. Los geles tixotrópicos del estearato de aluminio en aceites también han sido utilizados para prolongar la actividad de la penicilina. Buckwalter, et al, J. Am. Pharm. Assoc, 137: 472 (1948); Thompson, R. E., American Journal Clinical Nutrition, 1_ : 311 (1959); Thompson, Robert E., Sustained Reléase of Parenteral Drugs, Bulletin of Parenteral Drug Assoc. , 1_4: 6-17, (1960); Chen, Y., Journal of Parenteral Science & Tech., 35: 106 (1981) . Las proteínas tienden a ser desestabilizadas en la presencia de estos tipos de sistemas que contienen aceites. Los sistemas de suministro de fármacos de liberación sostenida que involucran un retardo de tiempo controlado para la gelificación en el cuerpo no son conocidos en general en la técnica. Estos tipos de sistemas de gel retardado, se conocen, sin embargo, en el contexto del cultivo del tejido de las plantas, la inmovilización de las células, la formación de microesferas, la liberación de insecticidas y la industria de los alimentos. Por ejemplo, los alginatos han sido utilizados con complejos de calcio insolubles y d-gluconolactona como un donador de protones para la liberación de los iones de calcio en la solución para la gelificación. Véase Draget, et al, Appl. Microbiol. Biotechnol., 3_l:79-83 (1989). De manera semejante, se han utilizado sistemas similares para la formación de cuentas o glóbulos de alginato por emulsificación/gelificación interna. Las microesferas de alginato fueron producidas utilizando alginato dispersado dentro del aceite vegetal y la gelificación iniciada por la reducción del pH para liberar el calcio del complejo insoluble. Véase Poncelet, D. et al, Appl. Microbiol. Biotechnol, 43: 644-650 (1995) . Los sistemas de alginato también han sido utilizados para inmovilizar células. Burke, C. describe, en Methods of Enzimology, 135: 175-189 (1987), que el fosfato de dicalcio y la d-gluconolactona pueden ser utilizados con alginatos para la gelificación retardada de las células. La Patente U.S. No. 4,053,627 describe el uso de discos de gel de alginato para controlar la liberación de un insecticida en un medio ambiente acuoso. Estos usos mencionados anteriormente no están diseñados para depósitos gelificados en el cuerpo para la liberación sostenida de agentes activos biológicamente, especialmente proteínas. En consecuencia, existe una necesidad de desarrollar formulaciones farmacéuticas de gelificación retardada las cuales logren un mejor medio de liberación sostenida para aplicaciones clínicas. Numerosas proteínas naturales o recombinantes podrían beneficiarse de la liberación a largo plazo constante a través de formulaciones de gelificación retardada y por medio de lo cual se proporcionen resultados clínicos más efectivos. La presente invención proporciona tales avances. Las composiciones farmacéuticas de gelificación retardada de la presente invención son capaces de proporcionar la protección de proteínas, una degradación reducida y una disolución lenta con una potencia y estabilidad incrementadas de la proteína. También, las composiciones farmacéuticas de la presente invención proporcionan un medio simple, rápido y económico de una liberación de la proteína recombinante controlada para resultados profilácticos, terapéuticos o de diagnóstico efectivos .

Breve Descripción de la Invención La presente invención se refiere a formulaciones de liberación sostenida que utilizan geles retardados de alginato, y a métodos de producción de las mismas. En particular, la formación de los geles retardados de liberación sostenida incluyen geles de alginato tixotrópicos con un agente activo biológicamente. Este enfoque proporciona una ventaja de una producción eficiente y carga elevada del agente activo biológicamente dentro del gel retardado de alginato para el suministro de liberación sostenida mientras que se logra la protección de la proteína, una degradación reducida, y una potencia y estabilidad incrementada del agente que va a ser suministrado. Además, la gelificación temporizada o sincronizada proporiona más control sobre las propiedades de gelificación y la administración de las mismas.

En consecuencia, un aspecto de la presente invención proporciona una composición de gel retardado de liberación sostenida, que comprende un polímero hidrofílico; un agente activo biológicamente y al menos un ion metálico polivalente unido. La velocidad de gelificación es controlada por el nivel de calcio libre, es decir, el ion metálico polivalente liberado. El agente activo biológicamente puede estar en una forma de complejo. La formación de moléculas complejas y cualesquiera agentes de formación de complejos relacionados es bien conocida para aquellos expertos en la técnica. Además, la composición anterior puede contener además el ion metálico polivalente el cual es una mezcla de iones metálicos polivalente unidos y liberados. Debido a la naturaleza de tiempo controlado de estos geles retardados, estas mezclas pueden ser colocadas en el cuerpo en donde las mismas pueden gelificarse después de la inyección. Además, debido a la naturaleza tixotrópica de la composición en el estado de gelificación, estas mezclas pueden ser inyectadas mientras que están en el estado gelificado, por ejemplo, por la presión de la jeringa, después de lo cual las mismas pueden regelificarse en el cuerpo. Otro aspecto de la presente invención proporciona una composición de gelificación retardada de liberación sostenida, que comprende un polímero hidrofílico; un agente activo biológicamente; al menos un ion metálico polivalente unido y además comprende al menos un donador de protones capaz de liberar el ion metálico polivalente unido. La liberación de los protones a partir del donador de protones, libera los cationes del ion metálico polivalente unido. Otro aspecto proporciona métodos para producir las composiciones de gelificación retardada de liberación sostenida. Un método comprende los pasos de mezclar un agente activo biológicamente y un polímero hidrofílico con un solvente para formar una primera mezcla y mezclar la primera mezcla con al menos un ion metálico polivalente unido para formar una segunda mezcla. Un método alternativo comprende los pasos de mezclar un agente activo biológicamente y un polímero hidrofílico con un solvente para formar una primera mezcla; mezclar la primera mezcla con al menos un ion metalálico polivalente unido para formar una segunda mezcla; y mezclar con la segunda mezcla al menos un donador de protones capaz de liberar el ion metálico polivalente unido. El ion metálico polivalente unido y el donador de protones también pueden ser agregados a la primera mezcla conjuntamente, o el donador de protones puede ser agregado a la primera mezcla previo al ion metálico polivalente unido. Además, un paso para aislar la composición de gelificación retardada de liberación sostenida también es contemplado. Cuando se utilice aquí, el término ion metálico polivalente unido se refiere a un ion metálico polivalente en una forma de sal o quelato o de complejo iónico. El ion metálico polivalente unido puede incluir una mezcla de iones metálicos polivalentes unidos y no unidos. Esto podría incluir como se señaló anteriormente la liberación del ion metálico polivalente unido a no unido. Cuando se utilice aquí, el término donador de protones capaz de liberar el ion metálico polivante unido se refiere a ácidos fuertes, ácidos débiles, o materiales capaces de generar un ácido, por ejemplo, lactonas o esteres (por hidrólisis acuosa) , o un ácido escasamente soluble o un ácido de disolución lenta tal como el ácido adípico. Cuando se utilice aquí, el término solvente se refiere a los solventes de base acuosa o no acuosa capaces de dispersar o disolver los agentes activos biológicamente, polímeros hidrofílicos, iones metálicos polivalentes, donadores de protones o agentes de formación de complejos de elección. Tales solventes son bien conocidos por un experto en la técnica. Las adiciones para formar la primera mezcla y la segunda mezcla se pueden hacer por los métodos bien conocidos para una persona experta en la técnica, incluyendo pero sin estar limitado al vertido y agitación, adición de gotitas, dispersión, rociado o mezclado utilizando chorros de rocío, chorros de aire, atomización, y campos eléctricos. El término dispersión para propósitos de esta invención puede significar dispersiones líquidas, sólidas o gaseosas. Cuando se utilice aquí, el término aislamiento, se refiere al proceso para el aislamiento de la composición de gelificación retardada de liberación sostenida de la presente invención. Tales procedimientos de aislamiento y purificación son bien conocidos en la técnica. En todavía otro aspecto, la presente invención proporciona un composición de gelificación retardada de liberación retardada producida por los métodos anteriores. Los aspectos adicionales incluyen formulaciones farmacéuticas de gelificación retardada de las composiciones anteriores en un portador aceptable farmacéuticamente, o adyuvante. Además, la composición de gel retardado puede estar contenida en una jeringa. En todavía otro aspecto, la presente invención proporciona métodos de tratamiento de indicaciones con las composiciones de gelificación retardada de liberación sostenida que contienen los agentes activos biológicamente deseados.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Composiciones Los polímeros hidrofílicos que incluyen alginatos y derivados de los mismos, pueden ser obtenidos de varias fuentes comerciales, naturales o sintéticas bien conocidas en la técnica. Cuando se utilice aquí, el término polímero hidrofílico se refiere a polímeros solubles en agua o polímeros que tienen afinidad para la absorción del agua. Los polímeros hidrofílicos son bien conocidos para una persona experta en la técnica. Estas incluyen pero no están limitadas a polianiones, incluyendo polisacáridos aniónicos tales como el alginato, gelan, carboximetil amilosa, sales de ácido poliacrílico, sales de ácido polimetacrílico, copolímero de etileno anhídrico maiéico (semi éster), carboximetil celulosa, sulfato de dextrano, heparina, carboximetil dextrano, carboxi celulosa, 2, 3-dicarboxicelulosa, tricarboxicelulosa, goma arábiga carboxi, carboxi carragenano, carboxi pectina, goma de tragacanto carboxi, goma de xantano carboxi, polisulfato de pentosan, fécula de carboxi, carboximetil quitina/quitosán, curdlan, hexasulfato de inositol, sulfato de ß-ciclodextrina, ácido hialurónico, condroitin-6-sulfato, sulfato de dermatan, sulfato de heparina, fécula de carboximetilo, carragenano, poligalacturonato, goma de guar carboxi, polifosfato, ácido carbónico-polialdehido, poli-1-hidroxi-l-sulfonato-pro?eno-2, copoliestireno ácido maiéico, agarosa, mesoglicano, alcoholes de polivinilo sulfopropilados, sulfato de celulosa, sulfato de protamina, fosfo goma de guar, ácido poliglutámico, ácido poliaspártico, poliaminoácidos, derivados o combinaciones de los mismos. Un experto en la técnica apreciará otros diversos polímeros hidrofílicos que están dentro del alcance de la presente invención. De manera semejante, los iones metálicos polivalente unidos pueden ser obtenidos de varias fuentes comerciales, naturales o sintéticas las cuales son bien conocidas en la técnica. Los iones metálicos polivalentes unidos o secuestrados dentro del alcance de esta invención incluyen pero no están limitados a manganeso, estroncio, hierro, magnesio, calcio, bario, cobre, aluminio o zinc. Los iones metálicos pueden ser obtenidos de las sales solubles de un agente de formación de complejos, acetatos, fosfatos, lactatos, tartratos, citratos, sulfatos, cloruros, carbonatos, hidróxidos, o aniones de ácidos grasos, tales como los oleatos, de los mismos. Un experto en la técnica apreciará otros varios complejos/iones metálicos polivalentes unidos que están dentro del alcance de la invención. Los iones metálicos polivalentes unidos pueden incluir una mezcla de iones metálicos polivalentes unidos y no unidos. Los donadores de protones cuando se utilizan aquí, se refieren al material que puede generar ácidos. Los donadores de protones son capaces de liberar un ion metálico polivalente secuestrado o unido. Los donadores de protones son bien conocidos en la técnica, e incluyen pero no están limitados a lactonas tales como gluconolactonas, esteres, soluciones amortiguadoras y otros ácidos que se disuelven lentamente. Cuando se utilice aquí los ácidos que se disuelven lentamente, se hace referencia a los ácidos tales como los ácidos sólidos que son de solubilidad baja en el solvente. Además, los ácidos que se disuelven lentamente incluyen dispositivos o materiales recubiertos que liberan lentamente los ácidos. Los ácidos bien conocidos dentro del alcance de la técnica incluyen el ácido acético, adípico, cítrico, fumárico, glucónico, láctico, málico, fosfórico y tartárico. Una persona con experiencia en la técnica apreciará otros varios donadores de protones que están dentro del alcance de la invención.

Cuando se utilice aquí, el término amortiguador o solución amortiguadora se refiere al uso de ácidos o bases orgánicas e inorgánicas o a una combinación de los mismos, para preparar una solución amortiguadora como se conoce en la técnica. Estos también incluyen materiales anfotéricos o aminoácidos. Los ácidos orgánicos dentro del alcance de la presente invención incluyen haluro de hidrógeno (por ejemplo, ácido clorhídrico) , fosfórico, nítrico o sulfúrico. Otros ácidos inorgánicos podrían ser bien conocidos para una persona experta en la técnica y están contemplados aquí. Los ácidos orgánicos dentro del alcance de la invención incluyen los ácidos carboxílicos alifáticos y los ácidos aromáticos tales como el ácido fórmico, carbónico, acético, propiónico, butírico, valérico, capróico, acrílico, malónico, succínico, glutárico, adípico, maiéico, fumárico, glicina o fenol sulfónico. Otros ácidos orgánicos podrían ser bien conocidos por una persona experta en la técnica. Las bases orgánicas incluyen TRIS®, piridina, PIPES®, y HEPES®. Los amortiguadores de aminoácidos incluyen glicina y mezclas de ácido fosfórico/glicina. Cuando se utilicen aquí, agentes activos biológicamente se refiere a proteínas recombinantes o que están presentes en forma natural, ya sea de seres humano o de animales, útiles para aplicaciones profilácticas, terapéuticas o de diagnóstico, tales como moléculas pequeñas, oligonucleótidos, y agentes orgánicos o inorgánicos. El agente activo biológicamente puede ser natural, sintético, semisintético o derivados de los mismos. Además, los agentes activos biológicamente de la presenté invención pueden ser precipitables . Se contempla una amplia gama de agentes activos biológicamente. Estos incluyen pero no están limitados a hormonas, citocinas, factores hematopoyéticos, factores del crecimiento, factores antiobesidad, factores tróficos, factores antiinflamatorios, y enzimas (véase también la patente U. S. No. 4,695,463 para los ejemplos adicionales de agentes activos biológicamente, útiles) . Una persona con expriencia en la técnica será capaz de adaptar fácilmente un agente activo biológicamente a las composiciones de la presente invención. Tales proteínas podrían incluir pero no están limitadas a interferonas (véanse, las patentes U.S. Nos. 5,372,808, 5,541,293, 4,897,471, y 4,695,623 incorporadas para referencia aquí, incluyendo los dibujos), interleucinas (véase, la patente U.S. No. 5,075,222, incorporada aquí para referencia, incluyendo los dibujos), eritropoyetinas (véanse, las patentes U.S. Nos. 4,703,008, 5,441,868, 5,618,698, 5,547,933, y 5,621,080 incorporadas aquí para referencia, incluyendo los dibujos), factores estimulantes de colonias-granulocitos (véanse, las patentes U.S. Nos. 4,810,643, 4,999,291, 5,581,476, 5,582,823, y la Publicación PCT No. 94/17185, incorporada aquí para referencia, incluyendo los dibujos), el factor de las células del tallo (Publicaciones PCT Nos. 91/05795, 92/17505 y 95/17206, incorporadas aquí para referencia, incluyendo los dibujos), y la proteína OB (véanse, las publicaciones PCT Nos. 96/40912, 96/05309, 97/00128, 97/01010 y 97/06816, incorporadas aquí para referencia, incluyendo las Figuras) . Además, los agentes activos biológicamente también pueden incluir pero no están limitados a productos relacionados con la anti-obesidad, insulina, gastrína, prolactina, la hormona adrenocorticotrópica (ACTH), la hormona estimulante de la tiroides (TSH), la hormona luteinizante (LH) , la hormona estimulante de los folículos (FHS), la gonadotropina coriónica humana (HCG) , motilina, interferonas (alfa, beta, gamma) , interleucinas (IL-1 a IL-12), factor de necrosis del tumor (TNF), proteína de unión del factor de necrosis del tumor (TNF-bp), el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), el factor neurotrófico derivado glial (GDNF) , el factor 3 neurotrófico (NT3), los factores del crecimiento de fibroblastos (FGF), el factor de crecimiento neurotrófico (NGF) , los factores del crecimiento de los huesos tales como la osteoprotegerina (OPG) , los factores del crecimiento semejantes a la insulina (IGFs), el factor estimulante de las colonias de macrófagos (M-CSF) , el factor estimulante de la colonia de macrófagos de granulocitos (GM-CSF) , factor del crecimiento derivado de megacariocitos (MGDF) , factor de crecimiento de queratinocitos (KGF) , trombopoyetina, factor del crecimiento derivado de las plaquetas (PGDF) , factores del crecimiento estimulantes de las colonias (CSFs), proteína morfogenética de los huesos (BMP) , superóxido dismutasa (SOD) , activador de plasminógeno del tejido (TPA) , urocinasa, estreptocinasa y kalikreína. El término proteínas, como se utiliza aquí, incluye péptidos, polipéptidos, moléculas de acuerdo unánime, análogos, derivados o combinaciones de los mismos. Los derivados de los agentes activos biológicamente pueden incluir la fijación de una o más porciones químicas a la porción de proteína. La modificación química de los agentes activos biológicamente se han encontrado que proporciona ventajas adicionales bajo ciertas circunstancias, tales como el incremento de la estabilidad y el tiempo de circulación de la proteína terapéutica y la reducción de la inmunogenicidad. Un experto en la técnica será capaz de seleccionar la modificación química deseada con base en la dosificación deseada, el tiempo de circulación, la resistencia a la proteólisis, los usos terapéuticos y otras consideraciones. Los derivados tales como el polietilenglicol y las proteínas de fusión Fe son deseables.

Complejos El agente activo biológicamente puede estar en formas unidas con complejos. Esto podría incluir formas precipitadas, formas estructuradas, y la asociación con otras moléculas. Estas formas unidas con complejos del agente pueden reducir la velocidad de difusión del agente fuera del gel y por consiguiente sostener la liberación del agente. Estas formas unidas con complejos incluyen pero no están limitadas al agente activo biológicamente unido con complejos con anticuerpos, substratos, receptores, lípidos, polímeros, y agentes precipitantes. Por ejemplo los agentes, análogos o derivados activos biológicamente, pueden ser administrados unidos con complejos a una composición aglutinante. Tal composición aglutinante además de los beneficios anteriores también puede tener el efecto de prolongar el tiempo de circulación del agente, análogo o derivado o mejorar la actividad del agente activo biológicamente.

Tal composición puede ser una proteína (o de manera sinónima, un péptido) , derivado, análogo o combinación o un agente diferente de una proteína. A manera de ilustración, una proteína de unión para la proteína de OB es el receptor de la proteína OB o una porción de la misma, tal como una porción soluble de la misma. Otras proteínas de unión pueden ser averiguadas examinando la proteína OB, o la proteína de elección, en el suero, o ser seleccionada empíricamente para verificar la presencia de la aglutinación. Tal aglutinación típicamente no interferirá con la capacidad de la proteína de OB o análogo o derivado para unirse al receptor de la proteína de OB endógena y/o efectuar la transducción de la señal. Además de la proteína de OB, los complejos aglutinantes también serán aplicables a otras proteínas terapéuticas de la presente invención. Aquellas personas expertas en la técnica serán capaces de averiguar las proteínas aglutinantes apropiadas para su uso con la presente invención. De manera semejante, los agentes precipitantes utilizados para precipitar el agente activo biológicamente pueden ser obtenidos de varias fuentes comerciales, naturales o sintéticas las cuales son bien conocidas en la técnica. Los agentes precipitantes incluyen pero no están limitados a iones metálicos polivalentes o sus sales tales como acetatos, citratos, cloruros, carbonatos, hidróxidos, oxalatos, tartratos o hidróxidos de los mismos, ácidos o polímeros solubles en agua. En particular, los iones metálicos pueden incluir pero no están limitados a aluminio, bario, calcio, hierro, manganeso, magnesio, estroncio y zinc. Preferentemente el ion metálico es el zinc o las sales del mismo, semejantes a las sales del cloruro y de acetato. Las moléculas pequeñas y las sales solubles en agua también pueden ser utilizadas, tales como sulfato de amonio, acetona, etanol y glicerol. Como para los polímeros solubles en agua, estos incluyen pero no están limitados a polietilenglicol, copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, hidroxietilcelulosa, amilosa, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinil pirrolidona, poli-1, 3-dioxolano, poli-1, 3, 6-trioxano, copolímeros de etileno/anhídrido maiéico, poliaminoácidos, dextrano, poli (n-vinil pirrolidona) polietilenglicol, homopolímeros de propilenglicol, copolímeros de óxido de etileno/óxido de polipropileno, polioles polioxietilados, succináto de alcohol polivinílico, glicerina, óxidos de etileno, óxidos de propileno, poloxámeros, copolímeros alcoxilados, polianiones solubles en agua, derivados o combinaciones de los mismos. El polímero soluble en agua puede ser de cualquier peso molecular, y puede ser ramificado o no ramificado. Por ejemplo, el peso molecular preferido del polietilenglicol es de entre aproximadamente 700 Da y aproximadamente 100 kDa por la facilidad de la manipulación y la eficiencia de la precipitación. Otros tamaños y tipos de los agentes de precipitación pueden ser utilizados, dependiendo del perfil terapéutico deseado (por ejemplo, la duración de la liberación sostenida deseada, los efectos, si existe alguno, sobre la actividad biológica, la facilidad de la manipulación, el grado o falta de antigenicidad y otros efectos conocidos de un agente de precipitación deseado para una proteína terapéutica o análogo) . Un experto en la técnica apreciará otros agentes precipitantes que están dentro del alcance de la invención. Además, las composiciones de la presente invención también pueden incluir excipientes extra necesarios para estabilizar el agente activo biológicamente y/o el polímero hidrofílico. Estos pueden estar contenidos en el amortiguador y pueden incluir, pero no están limitados a, los preservativos.

Composiciones farmacéuticas Las composiciones farmacéuticas de liberación sostenida de la presente invención pueden ser administradas por preparaciones orales (por ejemplo, preparaciones líquidas que permiten la gelificación en el estómago o los intestinos) y las preparaciones no orales (por ejemplo, preparaciones intramusculares, subcutáneas, viscerales, IV (intravenosas), IP (intraperitoneales) , intraarticulares, colocación en el oído, ICV (intracerebroventricular) , IP (intraperitoneal), intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, inyectable, pulmonar, nasal, rectal, y uretino-transmucosales) . En general, están comprendidas por la presente invención las composiciones farmacéuticas de un gel retardado de liberación sostenida que comprenden cantidades efectivas de la proteína, o productos derivados, con las composiciones de liberación sostenida de la invención junto con diluyentes, preservativos, solubilizantes, emulsificadores, adyuvantes y/o portadores aceptables farmacéuticamente necesarios para la administración. (Véase la patente PCT 97/01331 incorporada aquí para referencia) . La formulación farmacéutica óptima para un agente activo biológicamente deseado, será determinada por un experto en la técnica dependiendo de la ruta de administración y la dosificación deseada. Las composiciones farmacéuticas ejemplares se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., 18/a. Ed., Easton, PA, pp. 1435-1712 (1990)). Debido a la naturaleza tixotrópica de la formulación de gelificación retardada, las jeringas pueden ser utilizadas para administrarse subcutáneamente. La composición puede ser gelificada en una jeringa para inyección posterior. Esta gelificación puede ser efectuada de una manera retardada en el tiempo. La temporización es controlada por el ajuste juicioso de la cantidad del agente gelificante, y el donador de protones si es utilizado, así como el tamaño de partícula del ion metálico polivalente y la temperatura de la mezcla. Tal preparación podría ser utilizada para re-gelificación posterior en el cuerpo después de la inyección. El término tixotrópico cuando se utilice aquí, se refiere a la viscosidad de la mezcla del gel la cual se reduce bajo presión, por ejemplo, desde el émbolo de la jeringa, en tal punto la mezcla puede fluir, por ejemplo, a través de la aguja de la jeringa, y luego reformar un gel en el sitio de la inyección. El concepto de la gelificación retardada también puede ser aplicado al relleno de una jeringa en donde una composición de gel de liberación sostenida es llenada en una jeringa y en geles de tiempo prefijado en la jeringa, por ejemplo, desde pocos minutos hasta muchas horas después del llenado. Esto evita el problema de llenar una jeringa con material que ya ha sido gelificado. Estas jeringas prellenadas pueden ser almacenadas para inyección posterior en pacientes. Los componentes que pueden ser necesarios para la administración incluyen diluyentes o amortiguadores de varios pH y fuerza o intensidad iónica (por ejemplo, Tris-HCl, acetato) ; aditivos tales como agentes tensioactivos y agentes solubilizantes (por ejemplo, Tween 80, HCO-60, Polysorbate 80), lípidos, liposomas, antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, glutationa, metabisulfito de sodio) , polisacáridos adicionales (por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginato de sodio, hialuronato de sodio, sulfato de protamina, polietilenglicol), preservativos (por ejemplo, Thimersol, alcohol bencílico, metilparabeno, propil parabeno) y substancias de' construcción (por ejemplo, lactosa, manitol) ; la incorporación del material con preparaciones particuladas de los compuestos poliméricos tales como los polímeros o copolímeros de ácido poliláctico/poliglicólico, etc., o combinados con liposomas. El ácido hialurónico también puede ser utilizado como un componente de administración y este puede tener el efecto de promover aún adicionalmente la duración sostenida en la circulación. Adicionalmente, las composiciones de liberación sostenida de la presente invención también pueden ser dispersadas con aceites (por ejemplo, aceite de sésamo, aceite de maíz, vegetal), o una mezcla de los mismos con un fosfolípido (por ejemplo, lecitina) , o triglicéridos de ácidos grasos de cadena intermedia (por ejemplo, Migiyol 812) para proporcionar una suspensión aceitosa. Las composiciones de la presente invención también pueden ser dispersadas con agentes dispersantes tales como polisacáridos solubles en agua (por ejemplo, manitol, lactosa, glucosa, féculas), ácido hialurónico, glicina, fibrina, colágeno y sales inorgánicas (por ejemplo, cloruro de sodio) . Además, también están contemplados para su uso en la administración de las composiciones de liberación sostenida de la presente invención los dispositivos mecánicos diseñados para el suministro pulmonar de productos terapéuticos, incluyendo pero sin estar limitado a nebulizadores, inhaladores de dos medidas, e inhaladores de polvos, la totalidad de los cuales son familiares para aquellos expertos en la técnica. Los componentes de administración pueden tener influencia en el estado físico, la estabilidad, la velocidad de liberación in vivo, y la velocidad de despeje in vivo de las presentes proteínas y derivados. Una persona con experiencia ordinaria en la técnica apreciará los componentes de administración apropiados y/o los dispositivos mecánicos apropiados para su uso dependiendo de la utilización terapéutica, la ruta de administración, la dosificación deseada, el tiempo de circulación, la resistencia a la proteólisis, la estabilidad de la proteína y otras consideraciones.

Métodos de Uso Terapéutico. Los usos terapéuticos dependen del agente activo biológicamente utilizado. Una persona con experiencia en la técnica será capaz fácilmente de adaptar un agenté activo biológicamente deseado para la presente invención, con sus usos terapéuticos propuestos. Los usos terapéuticos para tales agentes se describen con mayor detalle en las siguientes publicaciones incorporadas aquí para referencia, que incluyen los dibujos. Los usos terapéuticos incluyen pero no están limitados a los usos para las proteínas semejantes a las interferonas (véanse, las Patentes U.S. Nos. 5,372,808, 5,541,293, 4,897,471, y 4,695,623 incorporas aquí para referencia incluyendo los dibujos), las interleucinas (véase, la patente U.S. No. 5,075,222, incorporada aquí para referencia incluyendo los dibujos), las eritropoyetinas (véanse, las Patentes U.S. Nos. 4,703,008, 5,441,868, 5,618,689, 5,547,933, y 5,621,080 incorporadas aquí para referencia incluyendo los dibujos), los factores estimulantes de las colonias-granulocitos (véanse, las patentes U.S. Nos. 4,999,291, 5,581,476, 5,582,823, 4,810,643 y la publicación PCT No. 94/17185, incorporadas aquí para referencia incluyendo los dibujos), el factor de las células del tallo (Publicaciones PCT Nos. 91/05795, 92/17505 y 95/17206, incorporadas aquí para referencia incluyendo los dibujos), y la proteína OB (véanse, las publicaciones PCT Nos. 96/40912, 96/05309, 97/00128, 97/01010 y 97/06816 incorporadas aquí para referencia incluyendo las Figuras) . Además, los usos terapéuticos de la presente invención incluyen los usos de los agentes activos biológicamente que incluyen pero no están limitados a productos relacionados anti-obesidad, insulina, gastrina, prolactina, hormona adrenocorticotrópica (ACTH) , hormona estimulante de la tiroides (THS), hormona luteinizante (LH) , hormona estimulante de los folículos (FHS), gonadotropica coriónica humana (HCG) , motilina, interferonas (alfa, beta, gamma), interleucinas (IL-1 a IL-12), factor de necrosis del tumor (TNF), proteína de unión del factor de necrosis del tumor (TNF-bp) , el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) , el factor neurotrófico derivado glial (GDNF) , el factor 3 neurotrófico (NT3), los factores del crecimiento de fibroblastos (FGF), el factor de crecimiento neurotrófico (NGF) , los factores del crecimiento de los huesos tales como la osteoprotegerína (OPG) , los factores del crecimiento semejantes a la insulina (IGFs), el factor estimulante de las colonias de macrófagos (M-CSF) , el factor estimulante de la colonia de macrófagos de granulocitos (GM-CSF) , factor del crecimiento derivado de megacariocitos (MGDF) , factor de crecimiento de queratinocitos (KGF) , trombopoyetina, factor del crecimiento derivado de las plaquetas (PGDF), factores del crecimiento estimulantes de las colonias (CSFs), proteína morfogenética de los huesos (BMP) , superóxido dismutasa (SOD) , activador de plasminógeno del tejido (TPA) , urocinasa, estreptocinasa y kalikreína. El término proteínas, como se utiliza aquí, incluye péptidos, polipéptidos, moléculas de acuerdo unánime, análogos, derivados o combinaciones de los mismos. Además, la presente invención también puede ser utilizada para la fabricación de uno o más medicamentos para el tratamiento o mejoramiento de las condiciones que el agente activo biológicamente está propuesto para tratar.

Combinación de terapias. Las presentes composiciones y métodos pueden ser utilizados en conjunción con otras terapias, tales como una dieta alterada y ejercicios. Otros medicamentos, tales como aquellos útiles para el tratamiento de la diabetes (por ejemplo, la insulina, y posiblemente amilina), los medicamentos para reducir la presión sanguínea y el colesterol (tales como aquellos los cuales reducen los niveles de los lípidos de la sangre u otros medicamentos cardiovasculares), los medicamentos para incrementar la actividad (por ejemplo, anfetaminas) , diuréticos (para eliminación de líquidos), y supresores del apetito. Tal administración puede ser simultánea o puede ser in seriatim. Además, los presentes métodos pueden ser utilizados en conjunción con procedimientos quirúrgicos, tales como cirugías cosméticas diseñadas para alterar la apariencia total de un cuerpo (por ejemplo, cirugías de rayo láser o liposucción, diseñadas para reducir la masa corporal, o cirugías de implantes diseñadas para incrementar la apariencia de la masa del cuerpo) . Los beneficios de la salud de las cirugías cardiacas, tales como cirugías de derivación u otras cirugías diseñadas para relevar o aliviar una condición perjudicial provocada por el bloqueo de los vasos sanguíneos por los depósitos de grasa, tales como la placa arterial, pueden ser incrementados con el uso concomitante de las presentes composiciones y métodos. Los métodos para eliminar las piedras de los ríñones, tales como los métodos ultrasónicos o de rayo láser, también pueden ser utilizados ya sea previo a, durante o después del curso de los presentes métodos terapéuticos. Además, los presentes métodos pueden ser utilizados como un adyuvante para cirugías o terapias para huesos rotos, músculos dañados, u otras terapias las cuales podrían ser mejoradas por un incremento en la masa del tejido magro.

Dosificaciones Una persona con experiencia en la técnica será capaz de averiguar las dosificaciones efectivas por la administración y observación del efecto terapéutico deseado. La dosificación de la preparación de liberación sostenida es la cantidad necesaria para lograr una concentración efectiva del agente activo biológicamente in vivo, durante un período de tiempo dado. La dosificación y la frecuencia de la administración preferida de las preparaciones de liberación sostenida varía con el tipo del agente activo biológicamente, la duración deseada de la liberación, la enfermedad de blanco u objetivo, la frecuencia de la administración deseada, las especies animales de objeto y otros factores. Preferentemente, la formulación de la molécula será tal que entre aproximadamente 0.10 ug/kg/día y 100 mg/kg/día producirán el efecto terapéutico deseado. Las dosificaciones efectivas pueden ser determinadas utilizando herramientas de diagnóstico durante el transcurso del tiempo. A manera de ejemplo, la presente invención proporciona las dosificaciones de la proteína de OB. Por ejemplo, un diagnóstico para medir la cantidad de proteína OB en la sangre (o en el plasma o en el suero) puede ser utilizada primero para determinar los niveles endógenos de la proteína de OB. Tal herramienta de diagnóstico puede estar en la forma de un ensayo de anticuerpos, tal como un ensayo de emparedado de anticuerpos. La cantidad de la proteína de OB endógena es cuantificada inicialmente, y una línea base es determinada. Las dosificaciones terapéuticas son determinadas cuando la cuantificación de la proteína de OB endógena y exógena (es decir, la proteína, análogo o derivado encontrado dentro del cuerpo, ya sea autoproducido o administrado) es continua durante el curso de la terapia. Por ejemplo, una dosificación relativamente elevada puede ser necesaria inicialmente, hasta que un beneficio terapéutico sea observado, y luego se utilizan dosificaciones inferiores para mantener los beneficios terapéuticos.

Materiales y Métodos Materiales . El alginato en la forma de la sal de alginato se puede encontrar de varias fuentes, o puede ser preparado por los métodos bien conocidos en la técnica. La leptina, el GCSF y la interferona de aprobación unánime son de Amgen Inc. Otras substancias químicas son de fuentes bien conocidas en la técnica.

Preparación del Gel Retardado - Introducción.

El gel retardado es preparado combinando una mezcla de un polímero aniónico y agente activo biológicamente (por ejemplo, el alginato) con una sal catiónica polivalente (por ejemplo, CaC03) y un donador de protones (por ejemplo, un amortiguador acidificado o fuente de ácido de disolución o liberación lenta tal como la d-gluconolactona) , si es utilizado. Para todos los casos, el polímero aniónico, la proteína y cualesquiera agentes de precipitación/excipientes pueden ser preparados como una mezcla. La gelificación es iniciada por la adición de la sal catiónica polivalente y la fuente de protones, si es utilizada, a esta mezcla. La adición del protón, del ion metálico polivalente a la mezcla del agente activo biológicamente del polímero puede ser simultánea, o separadamente con el donador de protones primero o el ion metálico polivalente primero. Para la gelificación inducida por el amortiguador, la sal catiónica polivante y la fuente de protones puede ser mezclada como una suspensión acuosa antes del tiempo de la gelificación. Después que la gelificación es iniciada, las jeringas son llenadas antes de que ocurra la gelificación (típicamente 5 a 10 minutos) . Las inyecciones pueden ser efectuadas antes que los geles del material para la gelificación in situ, o después de los geles del material.

Mezcla de Alginato-proteína. Una mezcla del solvente y los agentes precipitantes/excipientes (por ejemplo, las sales de zinc, amortiguadores, etc.) es preparada. En sucesión rápida, se mezclan rápidamente una solución de la proteína (por ejemplo, leptina en Tris HCl 10 mM, pH 8) y alginato estéril (por ejemplo, una solución al 10 % tratada en autoclave) . En donde el agente activo biológicamente es preparado como una suspensión fina (por ejemplo, la zinc-leptina es formada típicamente a 10-15 mg/ml), puede ser deseable concentrar la suspensión. Sal de calcio. La sal de calcio puede ser preparada como una suspensión tratada en autoclave del polvo fino en el agua (por ejemplo, 9.1% de CaC03, en agua) .

Fuente de protones. Para los geles inducidos por el amortiguador, la suspensión de la sal de calcio puede ser combinada con el amortiguador, tales como 1 M Tris HCl, pH 7.0 o 0.5 M PIPES, pH 6.7. Para las fuentes de ácido de liberación o disolución lenta (d-gluconolactona) , un peso dado del polvo se disuelve en agua en un tiempo seleccionado brevemente antes de su uso (por ejemplo, un minuto antes del mezclado) . Una mezcla prepesada de los polvos estériles, secos, de la fuente del ácido y la sal de calcio también puede ser utilizada para simplificar el proceso.

Solvente. El solvente puede ser acuoso, no acuoso o mezclas de los mismos. Los ejemplos de solventes no acuosos son el sulfóxido de dimetilo, dimetil formamida, glicerol, polietilenglicoles, Pluronics® y etcétera.

Gelificación. La gelificación de la mezcla del polímero-fármaco puede ser iniciada agregando la sal de calcio. La temperatura de la mezcla, y la cantidad y el tamaño de partícula de la sal pueden ser utilizadas para controlar la velocidad de gelificación. Si adicionalmente se utiliza un donador de protones, la gelificación de la mezcla puede ser iniciada agregando ya sea 1) sal de calcio y suspensión del amortiguador acidificado (conjuntamente o de manera separada), 2) suspensión de sal de calcio seguido por una solución fresca/suspensión de la fuente de protones de liberación lenta o viceversa, o 3) polvos de la sal de calcio y la fuente de protones conjuntamente o de manera separada. Después de la adición de la sal de calcio, otros agentes de precipitación/excipientes (por ejemplo, sales de zinc, amortiguadores, etc.) pueden ser agregados a la mezcla. Después de un mezclado rápido y completo, la mezcla del gel puede ser extraída en una jeringa antes de que la misma se gelifique.

Carga del gel. En general, la carga de la proteína ya es conocida. Las cargas del gel desconocidas pueden ser determinadas como sigue.

Método por Estallido. Aproximadamente 0.1 - 0.2 mi (tomando el peso exacto) del gel es vaciado en un tubo de Eppendorf, luego se disuelve en 1 mi de citrato de sodio 0.01M. La mezcla es incubada a temperatura ambiente con agitación suave hasta que el gel se desintegra (generalmente 2 horas hasta toda la noche) . Después que la suspensión resultante es centrifugada a 8K rpm durante 2 minutos (Eppendorf, 5415 C) la absorbencia a 280 nm del subrenadante es tomada. Cualesquiera sólidos residuales son disueltos en 1 mi de urea 7M, la absorbencia de esta solución es registrada. A partir de estas absorbencias se pueden calcular los miligramos de la proteína por gramo del gel.

Método Acumulativo. Este método es utilizado en conjunción con los estudios de liberación in vitro. La cantidad de proteína liberada del gel incluyendo la quemada o fragmentada al final del estudio, es totalizada. Para detalles, véase la sección de los Estudios de Liberación in Vitro.

Estudios de Liberación In Vitro. El gel es formado ya sea en un tubo Eppendorf (muestras "fundidas") o en la jeringa luego se vacían en el tubo Eppendorf (muestras "vaciadas"). En general, aproximadamente 0.1-0.2 mi del gel son fundidos o extruidos (la cantidad exacta pesada) . La liberación es empezada agregando una solución amortiguadora (10 M Tris HCl, pH 8 para la leptina, pH 7.4 para GCSF) a cada tubo y lo coloca en un agitador incubador (New Brunswick Scientific) a 37 °C y 100-200 rpm. A intervalos de tiempo seleccionados, la muestra es removida del incubador. Si el gel está intacto, el sobrenadante es removido y centrifugado (Eppendorf, 8000 rpm, 2 minutos) y el sobrenadante es colectado. Cualesquiera sólidos son suspendidos en 1 mi de solución amortiguadora Tris fresca y regresados al tubo de liberación original para reasumir la liberación. Si el gel es alterado ampliamente, los contenidos del tubo son centrifugados, el sobrenadante colectado y los sólidos resuspendidos en 1 mi de la solución amortiguadora para reasumir la liberación. Los "puntos del tiempo" del sobrenadante pueden requerir una centrifugación adicional (8000 - 13,000 rpm, 8 minutos) para aclararlos para el barrido con UV. La cantidad de proteína liberada es determinada de la absorbencia del sobrenadante. Después que la muestra de liberación final es tomada, la cantidad dejada en la cuenta o glóbulo es determinada por el Método del Estallido (arriba) . El por ciento liberado en un tiempo determinado de la proteína acumulativa liberada, expresada como una fracción ya sea de la carga de proteína original (conocida del peso del gel y de cómo es formulada la misma) o la proteína total final liberada (incluyendo el estallido o framentación de urea-citrato final) .

Estudios In Vivo. Pérdida de Peso en Ratones. Ratones hembra de seis a ocho semanas de edad, del tipo C57/BLC son obtenidos de Charles River y Taconic Inc. Los mismos pesan típicamente 20 gramos. Cada grupo de la dosis consiste de cinco ratones. Las inyecciones son subcutáneas.

Estudio del PK de la Rata. Se utilizan ratas macho en este estudio y las mismas típicamente pesan 250-300 gramos. Las inyecciones son efectuadas de una manera similar a aquella descrita en los experimentos de pérdida de peso del ratón. La sangre es muestreada por colección del catéter en varios intervalos de tiempo después de la inyección y las muestras se analizaron para verificar la leptina por un ensayo de ELISA.

EJEMPOS Los siguientes ejemplos son ofrecidos para ilustrar más completamente la invención, pero no van a estar propuestos para limitar el alcance de la misma. Además, con respecto a la descripción anterior o los ejemplos posteriores, un experto en la técnica será capaz de hacer los cambios necesarios a las descripciones para la producción a gran escala.

Ejemplo 1 Esta ejemplo in vivo muestra que la leptina es un gel retardado inducido por la solución amortiguadora, es activa y exhibe una liberación sostenida en comparación con una solución de leptina. Este ejemplo también ilustra un sistema que se gelifica después de la inyección en el animal. Una suspensión de carbonato de calcio estéril se prepara a partir de los sólidos tamizados de menos de 75 mieras de tamaño de partícula. Un premezcla de ésta con Tris pH 7 se agrega a la leptina en alginato (en 10 mM Tris pH 8) de tal modo que las concentraciones finales de los ingredientes fueron: 2% alginato (filtrado estéril), 10 mg/ml leptina, 7 mM Tris pH 8, 150 mM Tris pH 7 y 24 mM CaC03 (asumiendo una disolución completa) . Tal mezcla se gelificó en el intervalo de ocho a nueve minutos. Cuando la leptina fue omitida, el tiempo de la gelificación fue ligeramente más prolongado (10-12 minutos) . Esto permitió tiempo para cargar las jeringas. La formulación de gel retardado se inyectó (mientras que todavía no está gelificada) en un grupo de ratones en los días alternativos a 100 mg/kg/día (valor de 2 días a 50 mg/kg) . Un segundo grupo se inyectó con solución de leptina (en solución amortiguadora Tris a 10 mg/ml) diariamente a 50 mg/kg y un tercer grupo recibió la solución de leptina en días alternativos a 100 mg/kg. Los ratones fueron pesados diariamente y el cambio en peso se expresó como un porcentaje de los pesos iniciales de los ratones. El programa de dosificación de días alternativos con el gel retardado proporcionó casi la misma pérdida de peso que la solución de leptina inyectada diariamente (8-9 %). Por el contrario, la solución administrada en los días alternativos mostró una pérdida de peso más pequeña (6 %) de duración más corta. Este último grupo regresó a su peso de la línea base a los 8 días, aunque los otros grupos volvieron a ganar sus pesos originales a los 10-11 días.

Ejemplo 2 Este ejemplo muestra que la producción de un gel retardado de alginato de calcio inducido por la solución amortiguadora puede prolongarse en la liberación sostenida in vitro en comparación con las formulaciones no gelificadas. La suspensión de carbonato de calcio se preparó como una suspensión de 100 mg/ml de un polvo muy fino. Una premezcla de ésta con la solución amortiguadora PIPES de pH 6.7 se agregó a una suspensión de zinc leptina en alginato (Tris amortiguado a pH 8) que se generó a partir de una solución de leptina concentrada (83 mg/ml en Tris pH 8 en el tiempo cuando el zinc fue agregado) . Un mi de tal mezcla se fundió o vació en un vaso de laboratorio de 10 mi. Las concentraciones finales de todos los ingredientes fueron: 2% de alginato (a partir de la solución al 10% tratada en autoclave de Keltone LVCR) , 15 mM Tris pH 8, 50 mg/ml de leptina, 1 mM ZnC12, 10 mM CaC03 (suponiendo la disolución completa) y 93 mM PIPES pH 6.7. En la ausencia de leptina, tal mezcla se gelificó a los 7 minutos. Después de gelificación toda la noche, se pesaron piezas de 0.2 g del gel y se colocaron en ampolletas de centelleos para la liberación, en el agitador a 37 °C. Esta liberación se comparó con la liberación desde la misma formulación sin calcio y PIPES (ningún' gel de alginato de calcio) . Cuando la formulación espesada de alginato de zinc y leptina (no gelificada) fue liberada, el punto de tiempo de 5 horas fue del 75% y existió una liberación gradual al 90% durante los siguientes ~ 3 días. Sin embargo, la zinc leptina en el gel retardado de alginato de calcio exhibió una liberación mucho más sostenida - - 35% a 5 horas, 60% en un día, luego una liberación más gradual al 70% en 5 días.

Ejemplo 3 Este ejemplo muestra que un gel inducido por d-gluconolactona que contiene leptina como un precipitado de zinc fino, sostiene la liberación de la leptina. La leptina (~14 mg/ml en Tris pH 8) se agregó a una solución de PIPES de pH de 6.7 y una solución de ZnC12 se mezcló inmediatmente en, seguido rápidamente por la solución de alginato (al 10% tratada en autoclave) de tal modo que las concentraciones finales de los ingredientes fueron 1.1 M ZnC12, 2.2% alginato, 10 mM Tris (pH 8) y 22 mM PIPES (pH 6.7). Esta mezcla se concentró por centrifugación hasta que el nivel de leptina fue de 46 mg/ml. La mezcla de gel se hace entonces por agitación en una suspensión de CaC03 (polvo fino) seguido rápidamente por una solución de d-gluconolactona. Las concentraciones finales de los componentes fueron de 2% de alginato, 20 mM PIPES, 9 mM Tris, 1 mM ZnC12, 16 mM (suponiendo una disolución completa) CaC03 y 79 mM de d-gluconolactona. La mezcla se extrae en jeringas antes de la gelificación, y la gelificación ocurrió en las jeringas después de 10 minutos. Después de almacenamiento toda la noche (3 horas a temperatura ambiente y luego a 4 °C) , los geles fueron inyectados en los ratones. La pérdida de peso se verificó en comparación con el control de la solución amortiguadora . Un valor de cinco días de la leptina se inyectó a 50 mg/kg/día, es decir, un bolo de 250 mg/kg en el gel, y se comparó con el mismo bolo de la leptina libre en solución. El bolo de la leptina libre mostró solamente una pérdida de peso modesta máxima de 4.4-4.8% a los 2 a 3 días y empezó ganando peso en el día 5. Por el contrario, a los 2 y 4 días, la leptina zinc en el gel produjo una pérdida de peso del 9%. A los cinco días, la pérdida del peso para el gel fue todavía del 5%, y permaneció arriba de la línea base (pérdida de peso mantenida) cuando el experimento finalizó a los 7 días.

Ejemplo 4 Este ejemplo muestra que si la concentración de la proteína de la mezcla de alginato-leptina-zinc es suficientemente elevada, la mezcla forma un gel en la ausencia del calcio que exhibe una liberación sostenida. La leptina (~14 mg/ml en Tris pH 8 ) se agrega a una solución amortiguadora y una solución de ZnC12 fue mezclada inmediatamente en, seguido rápidamente por la solución de alginato (al 10% tratado en autoclave) de tal modo que las concentraciones finales de los ingredientes fueron de 1.1 mM ZnC12, ya sea 1.1 o 2.2% de alginato, 10 mM de Tris (pH 8) y 22 mM PIPES pH 6.7 (si está presente) . Esta mezcla se concentra por centrifugación hasta que se alcanzó la concentración deseada de los sólidos de leptina. La formulación de ~50 mg/ml tuvo PIPES y 2.2% de alginato. La formulación de ~100 mg/ml no tuvo PIPES y 1.1% de alginato. Las concentraciones finales de los componentes para 50 mg/ml del gel de calcio del Ejemplo 3 fueron de 2% de alginato, 20 mM PIPES, 9 mM Tris, 1 mM ZnC12, 16 mM (suponiendo una disolución completa) CaC03 y 79 mM de d-gluconolactona. Para el gel de calcio de 100 mg/ml, la formulación fue similar excepto que las concentraciones finales de los componentes fueron de 1% de alginato, el PIPES fue omitido, 13 mM de CaC03 y 67 mM de d-gluconolactona. Para los geles con calcio, las muestras fueron extraídas en jeringas antes de la gelificación, y la gelificación ocurrió en las jeringas después de 10 minutos. En donde no se incluyó calcio en el gel, la mezcla de Zn-leptina-alginato fue extraída en jeringas y se permitió que se gelifique. Parece que la formulación de 50 mg/ml sin calcio no se gelificó. Después del almacenamiento toda la noche (3 horas a temperatura ambiente y luego 4 °C), los geles fueron inyectados en los ratones. La pérdida de peso se verificó en comparación con el control de la solución amortiguadora. El valor de cinco días de la leptina se inyectó a 50 mg/kg/día, es decir, un bolos de 250 mg/kg en el gel. Los geles de calcio del Ejemplo 3 produjeron una pérdida de peso del 9% dentro del intervalo de 2-4 días; a los cinco días, la pérdida de peso para el gel estuvo todavía al 5%, y permaneció arriba de la línea base (pérdida de peso mantenida) cuando el experimento finalizó a los 7 días. En comparación, la formulación de 50 mg/m sin calcio produjo una pérdida de peso del 3% durante los días 2 a 4, sin embargo, la pérdida de peso se fue a cero en el día 5. En contraste, la formulación de leptina de 100 mg/ml sin calcio fue al menos tan activa como la formulación de leptina de 100 mg/ml con calcio. La pérdida de peso máxima para el gel de 100 mg/ml, sin calcio, fue del 9% en el día 4, la pérdida de peso máxima para el gel de 100 mg/ml, con calcio, fue del 6%, también en el día 4. Ambas de las formulaciones empiezan ganando peso en el día 9.

Ejemplo 5 Este ejemplo muestra que la liberación sostenida in vitro de la leptina a partir de un gel retardado de alginato puede ser preparada sin formar primero un precipitado fino de leptina-zinc. La leptina (100 mg/ml; 10 mM Tris HCl, pH 8.8; pH ajustado desde 8.0 hasta 8.8 con 1M NaOH) y 6% de algínato (10 mM Tris HCl, pH 8.6) se enfriaron sobre un baño de hielo. La leptina (0.5 mi) se agregó al alginato al 6% (0.18 mi) y la mezcla se agitó sobre un baño de hielo durante 10-15 minutos; el pH final fue de 8.6-8-8. A esta mezcla se agrega una suspensión de 1M CaC03 (16 mcl) y la suspensión resultante se agita bien. A esta suspensión se agrega por goteo, con agitación, una solución de 0.1 M ZnC12 (100 mcl); el agua fue agregada entonces para llevar el volumen a 1 mi . La mezcla de la suspensión se mezcló completamente y se mantuvo en un baño de hielo durante 10-20 minutos. Luego una solución de 1.68M de d-gluconolactona (56 mcl) se agita completamente en esta mezcla. Una cantidad de 0.1 mi de la mezcla final (50 mg/ml de leptina, 1% de alginato) se vacía sobre la parte interna de un tubo de Eppendorf y se deja toda la noche a 4C. Después de almacenamiento toda la noche se llevó a cabo una liberación in vitro en 10 mM de histídina, pH 7.4. El gel vaciado o fundido exhibió una cantidad de estallidos o roturas pequeña y una liberación bastante constante de leptina con 50% liberado en 6 días.

Ejemplo 6 Este ejemplo muestra que una leptina que contiene un gel inducido por la d-gluconolactona como un precipitado de zinco fino, produce una liberación más sostenida de la leptina que la misma suspensión de zinc en el alginato que no es gelificado. El gel con la leptina de zinc se preparó como en el Ejemplo 3. Una suspensión de leptina zinc no gelificada en alginato se prepara de la misma manera, excepto que el CaC03 y la d-gluconolactona fueron omitidos. Los ratones fueron dosificados con inyecciones de bolos de 250 mg/kg y el experimento de pérdida de peso se hizo como se describió en el Ejemplo 3. La suspensión no gelificada produjo solamente una pérdida de 3% en peso en los días 2-4, mientras que la suspensión gelificada llevó a aproximadamente una pérdida de peso del 9% durante el mismo período. La pérdida en peso para la suspensión no gelificada regreso a la línea base en el día 5, mientras que la pérdida de peso para la suspensión gelificada permaneció arriba de la línea base a los siete días, cuando finalizó el experimento.

Ejemplo 7 Este ejemplo muestra características de liberación de orden cero en un estudio farmacocinético/farmacodinámico en ratas macho, demostrando tanto una liberación sostenida como un efecto sostenido simultáneo de la leptina (es decir, la pérdida de peso) suministrada por la composición del gel descrita en el Ejemplo 3. La concentración de la leptina fue de 47 mg/ml, y se pregelificó en la jeringa como se describió en el Ejemplo 3. Las ratas fueron provistas con una dosificación del bolo de 0 mg/kg (control), 50 mg/kg y 250 mg/kg, luego se verificaron los niveles de la sangre y la pérdida de peso durante seis días. El precipitado de leptina-zinc sin el gel también se inyectó en las ratas a una dosificación de 100 mg/kg. El grupo del gel de leptina de dosificación elevada exhibió un nivel de sangre permanente de ~2000 ng/ml en todo el período, mientras que el grupo de gel de leptina de dosificación inferior tuvo un nivel de ~l/5 que el nivel para los cuatro días. En contraste, la leptina sin el grupo del gel exhibió un nivel de la sangre de 2300 ng/ml que se hizo máximo a las 12 horas y luego se redujo en un factor de 100 durante el mismo período de tiempo. El peso de la rata (contra el control del vehículo) se redujo gradualmente durante este período para el grupo del gel de leptina de dosificación elevada. El peso del grupo del gel de la leptina de dosificación siguió el mismo curso durante casi 5 días; en este punto, el nivel de la sangre de la leptina del grupo de la dosis inferior disminuyó. La biodisponibilidad del fármaco de leptina fue evaluada comparando las áreas normalizadas de la dosis bajo la curva de la formulación del gel de leptina, la formulación del gel sin leptina y la leptina administrada intravenosamente. La biodisponibilidad de la formulación del gel de leptina fue del 80% comparado con una biodisponibilidad del 63% de la formulación de gel sin leptina.

Ejemplo 8 Este ejemplo muestra la liberación sostenida in vitro de la G-CSF a partir de los vehículos del gel retardado. Los materiales tanto "fundidos" como "extruidos" son ejemplificados. El G-CSF en agua de pH 3.4 se mezcló con alginato concentrado (10%) para formar una suspensión viscosa, turbia. Esta mezcla se gelificó con CaC03 y d-gluconolactona, a 16 mM y 79 mM, respectivamente. Antes de la gelificación, las alícuotas del material fueron ya sea fundidas o vaciadas en tubos o extraídas en jeringas. Después de 1 hora a temperatura ambiente los geles fueron almacenados a 4 °C (toda la noche) . Antes de efectuar el estudio de liberación, el gel en las jeringas se extruyeron en tubos y se permitió que endurezca durante 20 minutos. Luego se agregó una solución amortiguadora de liberación. El gel extruído exhibió una liberación de GCSF durante un período de tres días, es decir, 11% a una hora, 35% a un día, 75% a los dos días y ~90% a los tres días. El gel vaciado o fundido liberó 22% a 1 hora, 80% a un día y 94% a los dos días.

Ejemplo 9 Este ejemplo demuestra la liberación sostenida in vitro de la leptina a partir de un gel retardado de alginato preparado a partir de la sal de calcio (CaS04) sin la adición de un donador de protones. La leptina no amortiguada a pH 8 se utilizó para formar una suspensión de zinc-leptina en alginato al 2%. Las concentraciones finales de ZnCl2 y leptina fueron de 1 M y 55 mg/ml, respectivamente. El polvo fino de CaS0 se mezcló con la suspensión de zinc-leptina-alginato de tal modo que la mezcla final fue 10 mM en CaS04. Las alícuotas del material fueron vaciadas sobre las paredes de los tubos de eppendorf. La mezcla se gelificó a los 4-5 minutos. Después del almacenamiento toda la noche a temperatura ambiente, se llevó a cabo un estudio de liberación. La liberación de proteína desde el gel exhibió un estallido bajo (< 5%) a l hora. En un día se liberó 11% de la leptina. La liberación de la leptina fue gradual, 1.1% por día, para los siguientes siete días.

Ejemplo 10 Este ejemplo demuestra la liberación sostenida in vitro de la leptina a partir de un gel retardado de alginato preparado a partir de una sal de calcio en un solvente no acuoso sin la adición de un donador de protones. Un polvo liofilizado de la leptina es suspendido en alginato al 2% en sulfóxido de dimetilo seco. Un polvo fino de oleato de calcio se mezcla con la suspensión de alginato-leptina de tal modo que la mezcla final sea de 10 mM en calcio. Las alícuotas del material son vaciadas sobre las paredes de los tubos de prueba. La mezcla se gelifica durante el transcurso del tiempo. Después de almacenamiento toda la noche a temperatura ambiente, se lleva a cabo un estudio de liberación. La liberación de la proteína desde el gel es gradual y sostenida, durante los siguientes 7 días.

Ejemplo 11 Este ejemplo demuestra la liberación sostenida in vivo de la leptina a partir de un gel de alginato preparado a partir de una sal de calcio como se describió en el Ejemplo 10. Un estudio de pérdida de peso en ratones es efectuada después de una sola inyección de esta gel que contiene leptina a 250 mg/kg. La pérdida de peso es medida durante varios días.

Ejemplo 12 Este ejemplo demuestra la liberación sostenida in vitro del G-CSF a partir de un gel retardado de alginato preparado a partir de una sal de calcio en un solvente no acuoso sin la adición de un donador de protones. Un polvo liofilizado de G-CSF es suspendido en alginato al 2% en sulfóxido de dimetilo seco. Un polvo fino del oleato de calcio es mezclado con la suspensión de alginato-G-CSF de tal modo que la mezcla final es de 10 mM en calcio. Las alícuotas del material son vaciadas sobre las paredes de los tubos de prueba. La mezcla se gelifica durante el transcurso del tiempo. Después del almacenamiento toda la noche a temperatura ambiente, se lleva a cabo un estudio de liberación. La liberación de proteína es gradual y sostenida.

Ejemplo 13 Este ejemplo muestra la liberación sostenida in vitro de la interferona de aprobación unánime, como se describe en la Patente U.S. No. 4,695,623, supra, a partir de los geles retardados del alginato. El agua, el ZnCl2, la solución amortiguadora Tris y la interferona de consenso (en 10 mM Tris pH 7.5) se mezclan con la solución de alginato, luego se mezclan con CaC03, y d-gluconolactona, de tal modo que las concentraciones finales de los componentes fueron 1 mg/ml de la interferona de aprobación unánime, 10 M de ZnCl2, 1% de alginato, 20 mM de Tris, 10 mM de CaC03 y 40 mM de d-gluconolactona. La mezcla se vacía sobre un tubo de eppendorg (0.4 mi por tubo), se gelifica a temperatura ambiente y se almacena toda la noche a 4 °C. Después del almacenamiento toda la noche se llevó a cabo una liberación in vitro en 10 mM de solución amortiguadora de histidina, pH 7.4. El gel fundido o vaciado exhibió un estallido o rotura inicial pequeña. El por ciento de la liberación fue del 3% en 1 hora, 14% en un día. Por 4 días se liberó el 70%. A los 5-6 días, la velocidad de liberación se redujo a <5% por día.

Ejemplo 14 Este ejemplo muestra que los geles retardados de alginato pueden ser utilizados para la liberación sostenida de la interferona de consenso. Un gel retardado de interferona de consenso de alginato se preparó de acuerdo con el ejemplo 13 excepto que las concentraciones finales fueron como sigue: 0.2 mg/ml de la interferona de consenso, 10 mM ZnCl2, 2% de alginato, 20 mM Tris, 10 mM CaC03 y 40 mM de d-gluconolactona. Otra formulación se preparó con la misma composición, excepto que la concentración final de interferona de aprobación unánime fue de 1 mg/ml. Las mezclas fueron extraídas en jeringas y se gelificaron después de 2 horas. La formulación de 0.2 mg/ml se inyectó subcutáneamente a 1 mg/kg y la formulación de 1 mg/ml a las dosis de 1 mg/kg y 5 mg/kg en hámsters Sirios machos. La sangre se colectó por punción cardiaca y se evaluó para verificar la interferona de aprobación unánime para observar la liberación sostenida del fármaco.

Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición de gelificación retardada de liberación sostenida, caracterizada porque comprende: a) un polímero hidrofílico, b) un agente activo biológicamente, y c) al menos un ion metálico polivalente unido.

2. La composición de liberación sostenida de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque además comprende (d) al menos un donador de protones capaz de liberar el ion metálico polivalente unido.

3. La composición de liberación sostenida de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque el ion metálico polivalente unido es una mezcla del ion metálico polivalente unido y no unido.

4. La composición de liberación sostenida de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque además comprende excipientes para estabilizar el agente activo biológicamente o el polímero hidrofílico.

5. La composición de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque el ion metálico polivalente unido es una sal seleccionada del grupo que consiste de acetatos, fosfatos, lactatos, tartratos, citratos, cloruros, sulfatos, carbonatos, hidróxido o aniones de ácidos grasos de los mismos.

6. La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el ion metálico se selecciona del grupo que consiste de manganeso, estroncio, hierro, magnesio, calcio, bario, cobre, aluminio o zinc.

7. La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el ion metálico es el calcio.

8. La composición de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque el polímero hidrofílico es un polianión.

9. La composición de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque el polímero hidrofílico es un polisacárido.

10. La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque el polisacárido es un polisacárido ácido.

11. La composición de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque el polisacárido es el alginato.

12. La composición de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque el alginato contiene al menos 30 % de ácido gulurónico.

13. La composición de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque el alginato consiste de al menos 0.05% en peso.

14. La composición de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque el agente activo biológicamente comprende una proteína.

15. La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque la proteína consiste de al menos 0.001 mg/ml.

16. La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque la proteína se selecciona del grupo que consiste de factores hematopoyéticos, factores estimulantes de las colonias, factores anti-obesidad, factores del crecimiento, factores tróficos, y factores antiinflamatorios.

17. La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque la proteína se selecciona del grupo que consiste de leptina, G-CSF, SSCF, BDNF, GDNF, NT3, GM-CSF, IL-lra, IL2, TNF-bp, MGDF, OPG, interferonas, eritropoyetina, KGF, insulina y análogos y derivados de los mismos.

18. La composición de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque el agente activo biológicamente es un agente activo biológicamente en la forma de un complejo.

19. La composición de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque el agente activo biológicamente en la forma de un complejo es una proteína precipitada.

20. La composición de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque la proteína precipitada es un precipitado de zinc leptina.

21. La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el donador de protones es a partir de una fuente acida.

22. La composición de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque la fuente acida se selecciona del grupo que consiste de soluciones amortiguadoras, esteres, ácidos que se disuelven lentamente o lactonas.

23. Un método de producción de una composición de gelificación retardada de liberación sostenida, caracterizado porque comprende los pasos de: a) mezclar un agente activo biológicamente y un polímero hidrofílico en un solvente para formar una primera mezcla; y b) mezclar con la primera mezcla al menos un ion metálico polivalente unido para formar una segunda mezcla.

24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque además comprende el paso de c) mezclar con la segunda mezcla al menos un donador de protones capaz de liberar el ion metálico polivalente unido.

25. El método de conformidad con las reivindicaciones 23 o 24, caracterizado porque el ion metálico polivalente es una sal seleccionada del grupo que consiste de acetatos, fosfatos, lactatos, citratos, sulfatos, tartratos, cloruros, carbonatos, hidróxidos o aniones de ácidos grasos de los mismos.

26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el ion metálico se selecciona del grupo que consiste de manganeso, estroncio, hierro, magnesio, calcio, bario, cobre, aluminio o zinc.

27. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el ion metálico es el calcio.

28. El método de conformidad con las reivindicaciones 23 o 24, caracterizado porque el polímero hidrofílico es un polianión.

29. El método de conformidad con las reivindicaciones 23 o 24, caracterizado porque el polímero hidrofílico es un polisacárido.

30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el .polisacárido es un polisacárido ácido.

31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el polisacáridos es el alginato.

32. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el alginato contiene al menos de 30% de ácido gulurónico.

33. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el alginato consiste de al menos 0.05% en peso.

34. El método de conformidad con las reivindicaciones 23 o 24, caracterizado porque el agente activo biológicamente comprende una proteína.

35. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque la proteína consiste de al menos 0.001 mg/ml.

36. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque la proteína se selecciona del grupo que consiste de factores hematopoyéticos, factores estimulantes de las colonias, factores antiobesidad, factores del crecimiento, factores tróficos, y factores antiinflamatorios.

37. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque la proteína se selecciona del grupo que consiste de leptina, G-CSF, SCF, BDNF, GDNF, NT3, GM-CSF, IL-lra, IL2, TNF-bp, MGDF, OPG, interferonas, eritropoyetina, KGF, insulina y análogos y derivados de los mismos.

38. El método de conformidad con las reivindicaciones 23 o 24, caracterizado porque el agente activo biológicamente es un agente activo biológicamente en la forma de un complejo.

39. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el agente activo biológicamente en la forma de un complejo es una proteína precipitada.

40. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque la proteína precipitada es un precipitado de zinc leptina.

41. El método de conformidad con las reivindicaciones 23 o 24, caracterizado porque además comprende el paso de aislar la composición de liberación sostenida.

42. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el donador de protones es de una fuente acida.

43. El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque la fuente de ácido se selecciona del grupo que consiste de soluciones amortiguadoras, esteres, ácidos que se disuelven lentamente o lactonas.

44. Una composición de liberación sostenida, caracterizada porque se produce por el método de las reivindicaciones 23, 24 o 41.

45. Una formulación farmacéutica, caracterizada porque comprende la composición de liberación sostenida de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2 en un portador, diluyente o adyuvante aceptable farmacéuticamente.

46. La formulación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 45, caracterizada porque la formulación está en una jeringa.

47. Un método de tratamiento de una indicación con una composición de liberación sostenida de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2 en un portador, diluyente o adyuvante aceptable farmacéuticamente .

48. Un método de tratamiento de un desorden seleccionado del grupo que consiste de exceso de peso, diabetes, nivel de lípidos elevado en la sangre, esclerosis arterial, placa arterial, la reducción o prevención de la formación de piedras renales, masa de tejido magro insuficiente, sensibilidad insuficiente a la insulina, y ataques, con una composición de liberación sostenida de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2 en un portador, diluyente o adyuvante aceptable farmacéuticamente, en donde el agente activo biológicamente es la leptina, un análogo o derivado de la misma.

49. Un método de tratamiento de un desorden seleccionado del grupo que consiste de deficiencias celulares hematopoyétícas, infección, y neutropenia con una composición de liberación sostenida de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2 en un portador, diluyente, o adyuvante aceptable farmacéuticamente, en donde el agente activo biológicamente es el G-CSF, un análogo o derivado del mismo.

50. Un método de tratamiento de la inflamación con una composición de liberación sostenida de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, en un portador, diluyente, o adyuvante aceptable farmacéuticamente, caracterizado porque el agente activo biológicamente es la IL-lra, un análogo o derivado del mismo.