MXPA99000639A - Gen quimerico para varios genes de toleranciaherbicida, celula vegetal plantas tolerantesa diversos herbicidas - Google Patents

Abstract

La invención se refiere:1. Al gen quimérico con varios genes de tolerancia herbicida, a la célula vegetal y a la planta, tolerantes a varios herbicidas 2. La planta es tolerante a la vez a varios herbicidas, principalmente a los inhbidores de la HPPD y aquellos del EPSPS y/o a los dihalogenohidroxibenzonitrilos. 3. La utilización para desherbar las plantas con varios herbicidas.

Description

GEN QUIMÉRICO PARA VARIOS GENES DE TOLERANCIA HERBICIDA, CÉLULA VEGETAL Y PLANTA TOLERANTES A DIVERSOS HERBICIDAS DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención tiene por objeto un gen guimérico par varios genes de tolerancia herbicida, una célula vegetal y una planta tolerantes a varios herbicidas. En lo subsecuente de la descripción, los herbicidas serán designados de acuerdo al nombre común en particular .referido en "Ei Manual de Pesticidas" 10a edición por British Crop Protection Council (Consejo Británico de Protección de las Cosechas ) . Se conocen en las plantas gue han sido transformadas para ser tolerantes a ciertos herbicidas, principalmente como los dihalogenohidroxibenzonitrilos , en particular el bromoxinilo y el ioxinilo, gracias al gen que codifica para la nitrilasa que degrada estos herbicidas, o incluso aquellas tolerantes a los herbicidas inhibidores del EPSPS, principalmente el glifosato, el sulfosato o la fosametina, o incluso a REF. 29336 los inhibidores de la acetolactatosintasa (ALS) del ^ tipo de las sulfonilureas o incluso de los inhibidores de la dihidro-pteroato-sintasa tal como el asula , o incluso a los inhibidores de la glutamina-sintasa tales como el glufosinato. Se conocen ' ciertos herbicidas tales como los isoxazoles descritos principalmente en las Solicitudes de Patente Francesa 95/06800 y 95/13570 y ^p principalmente el isoxaflutol, herbicida selectivo del maíz, los dicetonitrilos tales como aquellos descritos en las Solicitudes Europeas 0,496,630, 0,496,631, en particular la 2-ciano-3-ciclopropil-l- (2-S02CH3-4-CF3-fenil ) -propan-1, 3-diona y la 2-ciano- 3-ciclopropil-l- ( 2-S02CH3-4-2 , 3-Cl2~fenil) propan-1, 3- 15 diona, las tricetonas descritas en las Solicitudes Europeas 0,625,505 y 0,625,508, en particular el sulcotrieno o incluso aquellas descritas en la Patente Norteamericana No. 5,506,195, o incluso los pirazolinatos . Además, ha sido aislado el gen que codifica para el HPPD que confiere una tolerancia a estos últimos herbicidas, se han obtenido las plantas transgénicas que los contienen, que muestran una tolerancia significativa y gue son el objeto de las Solicitudes Francesas no publicadas Nos. 95/06800, 95/13570 y 96/05.944.

No obstante, la práctica agrícola muestra que los agricultores desean disponer para el tratamiento de las plantas, y principalmente de los cultivos, de asociaciones de herbicidas en particular para responder a diferentes problemas de desyerba debidos a los límites del espectro de los herbicidas tomados aisladamente. Puede ser además interesante el disponer de un gen de marcación de selección, asociado a un gen de tolerancia a herbicidas. Existe pues una necesidad de plantas, y principalmente de cultivos gue presenten una tolerancia a varios herbicidas, de preferencia al menos a dos o tres. Se ha descubierto ahora que se podría conferir a una célula vegetal y a una planta, una tolerancia herbicida múltiple. La presente invención tiene primeramente por objetivo un gen quimérico que comprende al menos dos genes quiméricos elementales que contienen cada uno, en el sentido de la transcripción, elementos de regulación necesarios para su transcripción en las plantas o vegetales, es decir al menos una secuencia de regulación promotora, al menos una parte codificante heteróloga que comprende una secuencia codificante que codifica para una enzima que confiere a las plantas la tolerancia a un herbicida, y al menos una secuencia de regulación terminadora y de poliadenilación . Como secuencia codificante, se pueden utilizar principalmente todas aquellas conocidas para conferir la tolerancia de las plantas a ciertos inhibidores tales como: - aquella del EPSPS para la tolerancia al glifosato, al sulfosato o a la fosametina, principalmente aquellas de la proteína mutada o no, pudiéndose citar principalmente las patentes; Patente Norteamericana No. 4,535,060, Patente Europea No. 115,673, Patente Norteamericana No. 4,769,061, Patente Norteamericana No. 5,094,945; Patente Norteamericana No. 4,971,908, Patente Norteamericana No. 5,145,783, Patente Europea No. 293,358; Patente Europea No. 378,985, Patente Internacional No. WO 91/04323; Patente Intencional WO92/044, 449; Patente Internacional No. WO92/06201. En lo subsecuente este tipo de gen será designado por la secuencia o gen "EPSPS". Se pueden citar igualmente la glicosato-oxidorreductasa (ver Patente Internacional WO92/000, 377) enzima de destoxificación del glifosato . aquella del gen de la nitrilasa de Kl ebsi ell a sp, para la tolerancia a los dihalogenobenzonitrilos, descrita en la Patente Norteamericana No. 4,810,648 y en particular aquella proveniente de la Kl ebsi ell a oza ena e, que será designada en lo subsecuente por el gen o secuencia "OXY". aquella de la HPPD tal como se describe en las Solicitudes Francesas no publicadas Nos. 95/06800, 95/13570 y 96/05944 citadas anteriormente. Esta HPPD puede ser de cualquier naturaleza. Más particularmente, esta secuencia puede ser de origen bacteriano, principalmente tal como del género Pseudomonas o incluso de origen vegetal, principalmente tal como de la planta monocotiledónea o dicotiledónea, principalmente de Arabi dopsi s o de umbelíferas como por ejemplo la zanahoria ( Da ucus caro ta ) . Ésta puede ser nativa o silvestre, o eventualmente mutada, guardando siempre fundamentalmente una propiedad de tolerancia herbicida contra los inhibidores de HPPD, tales como los herbicidas de la familia de los isoxazoles o de aquella de las tricetonas o de los pirazolinatos . Pueden ser utilizadas otras secuencias: aquella de la fosfinotricina-acetil-transferasa o aquella de la glutamina-sintasa, para la tolerancia al glufosinato (ver Patente Europea No. 0,242,236) aquella de la dihidropteroato-sintasa para la tolerancia al asulam (ver Patente Europea No. 0, 369, 367) aquella del ALS para la tolerancia a las sulfonilureas aquella de la protoporfirógeno-oxidasa ("protox") para la tolerancia a los herbicidas de la familia de los éteres difenílicos tales como el acifluorfen o el oxifluorfen, o aquella de los oxadiazoles tales como el oxadiazon o el oxadiargilo, o aquella de las imidas cíclicas tales como el cloroftalim o aquella de los fenilpirazoles tal como el TNP o aquellas de 'las piridinas y los fenopilatos y análogos de carbamatos (ver Patente Internacional No. W095/34659) . De preferencia, uno de los genes quiméricos contiene una secuencia que codifica la HPPD. En este caso la otra o las otras secuencias pueden ser cualesquiera, y principalmente elegidas del grupo mencionado anteriormente. De preferencia, las otras secuencias son elegidas del grupo que comprende el gen de la nitrilasa de tolerancia a los dihalogenohidroxibenzonitrilos y un gen EPSPS. Los genes quiméricos de acuerdo a la invención pueden además contener los genes que 5 codifican para las propiedades diferentes de la tolerancia a herbicidas, tales como por ejemplo los genes de resistencia a los insectos, tales como aquellos del tipo Ba ci ll us thuri gensi s que confieren • una resistencia a diversos representantes de la familia de los coleópteros, lepidópteros, o incluso los 'genes de resistencia a los nemátodos, los genes de resistencia a las enfermedades por hongos o microbianas, o incluso los genes que confieren propiedades agronómicas tales como los genes de diversas desaturasas que intervienen en la producción de ácidos grasos. 'Se pueden citar en particular • aguel de la delta- 6-desaturasa descrito en la Solicitud Internacional No. WO93/06712. Como secuencia de la regulación promotora se puede utilizar cualquier secuencia promotora de un gen que se exprese de manera natural en las plantas, en particular un promotor de origen bacteriano, viral o vegetal tal como, por ejemplo, aguel de un gen de la pequeña subunidad de la ribulosa-biscarboxilasa (RuBisCO) o de aquel de un gen de la a-tubulina (Solicitud Europea No. 0,652,286) o incluso de un gen de virus vegetal tal como, por ejemplo, aquel del mosaico de la coliflor (CaMV 19S o 35S) , pero puede ser utilizado cualquier promotor conveniente, conocido. De preferencia se ha recurrido a una secuencia de regulación promotora que favorece la sobreexpresión de la secuencia codificante, tal como por ejemplo, aquella que comprende al menos un promotor de la histona tal como se describe en la Solicitud Europea EP 0507698. De acuerdo a la invención, se puede utilizar igualmente, en asociación con la secuencia de regulación promotora, otras secuencias de regulación, que están _ situadas entre el promotor y la secuencia codificante, tales como los activadores de la transcripción "aumentadores", como por ejemplo el activador de la traducción del virus de la roya del tabaco (TEV) descrito en la Solicitud WO87/07644, o los péptidos de tránsito, ya sea simples, o bien dobles, y en este caso eventualmente separados por una secuencia intermediaria, es decir que comprende, en el sentido de la transcripción, una secuencia que codifica para un péptido de tránsito de un gen vegetal que codifica para una enzima para localización plastidial, una parte de la secuencia de la parte madura N-terminal de un gen vegetal que codifica para una enzima para localización plastidial, luego una secuencia que codifica para un segundo péptido de tránsito de un gen vegetal que codifica para una enzima para localización plastidial, constituida de una parte de la secuencia de la parte madura N-terminal de un gen vegetal que codifica para una enzima para localización plastidial, tales como se describen en la Solicitud Europea No. 0,508,909. Como secuencia de regulación terminadora o de poliadenilación, se puede utilizar cualquier secuencia correspondiente de origen bacteriano, como por ejemplo el terminador nos de Agrobac t eri um t umefaci ens o incluso de origen vegetal, como por ejemplo un terminador' de histona tal como se describe en la Solicitud Europea No. 0,633,317. La invención tiene incluso por objetivo una célula vegetal, de plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas, principalmente de cultivos, tolerante al menos a dos herbicidas, donde al menos uno es un inhibidor de HPPD. Esta célula puede contener al menos dos genes guiméricos que comprenden cada uno una secuencia que codifica para la tolerancia a un herbicida, y donde uno comprende una secuencia que codifica para HPPD. Los dos genes quiméricos pueden ser ya sea portados por un mismo vector, o bien cada uno sobre un mismo vector diferente, o bien incluso aportados tal cuales mediante introducción en la célula mediante los medios físicos o físico-químicos, por ejemplo mediante microinyección, electroporación o bombardeo, de acuerdo a los métodos conocidos de por sí. La invención tiene incluso por objetivo una planta transformada tolerante al menos a dos herbicidas, donde uno es un inhibidor de HPPD. Esta planta puede ser obtenida ya sea mediante crecimiento de al menos dos plantas que contienen cada una un gen que codifica para la tolerancia a un herbicida, o bien mediante regeneración de una célula de acuerdo a la invención, tal co o se describe anteriormente. Las plantas pueden ser monocotiledóneas o dicotiledóneas, principalmente de los cultivos, cultivos grandes tales como por ejemplo maíz, de manera no limitante, para las dicotiledóneas el tabaco, el algodón, la colza, la soya, la remolacha azucarera, y para las monocotiledóneas el maíz y los cereales de paja, o incluso los cultivos hortenses o florales.

La invención tiene incluso por objetivo un procedimiento de obtención de plantas con tolerancia herbicida múltiple mediante transgénesis vegetal, caracterizada porque: - en una primera etapa, se inserta en varias células respectivamente uno de los genes elementales que contienen cada uno los elementos de regulación necesarios para su transcripción en las plantas,, y una secuencia codificante que codifica para una enzima que confiera a las plantas la tolerancia a un herbicida, y porque en seguida las plantas son desarrolladas para obtener las plantas con tolerancia múltiple. La invención tiene incluso por objetivo otro proceso de obtención de plantas con tolerancia herbicida múltiple mediante tfansgénesis vegetal, incluyendo una primera etapa la integración en las células vegetales de al menos dos genes de tolerancias a un herbicida, donde al menos uno es un inhibidor de HPPD, comprendiendo la segunda etapa la regeneración de la planta a partir de las células transformadas de acuerdo a la invención. La transformación puede ser obtenida mediante cualguier medio conocido, apropiado, ampliamente descrito en la literatura especializada, y principalmente en las solicitudes y patentes citadas en la presente solicitud. Una serie de métodos consiste en bombardear las células o protoplastos con partículas a las cuales se anclan las secuencias de ADN. De acuerdo a la invención, estos ADN pueden ser portados por las-mismas partículas o por diferentes bombardeos. Otra serie de métodos consiste en utilizar como medio de transferencia en la planta un gen quimérico insertado en un plásmido Ti de Agrobacteri um t umefaci ens o Ri de Agrobacteri um rhi zogenes . Pueden ser utilizados otros métodos tales como la microinyección o la electroporación. El experto en la materia hará la elección del método apropiado en función de la naturaleza de la planta, principalmente de su carácter monocotiledóneo o dicotiledóneo. Se ha observado que las plantas transformadas de acuerdo a la invención presentan una tolerancia significativa a los inhibidores de la hidroxifenil-piruvato-dioxigenasa, tales como- ciertos herbicidas recientes, tales como los isoxazoles descritos principalmente en las Solicitudes de Patente Francesa Nos. 95/06800 y 95/13570 y principalmente del 4-[4-CF3-2- (metilsulfonil) benzoil]-5-ciclopropilisoxazol, o flfe "isoxaflutol", herbicida selectivo del maíz, los dicetonitrilos tales como aquellos descritos en las Solicitudes Europeas Nos. 0,496,630, 0,496,631, en particular la 2-ciano-3-ciclopropil-l- (2-S02CH3-4-CF3- fenil) -propan-1 , 3-diona y la 2-ciano-3-ciclopropil-l- (2-S02CH3-4-2, 3-Cl2-fenil) propan-1, 3-diona, las tricetonas descritas en las Solicitudes Europeas Nos. 0,625,505 y 0,625,508, en particular la sulcotriona y los pirazinolatos . Estas mismas plantas de acuerdo a la invención presentan una tolerancia significativa a otros herbicidas, tales como por ejemplo los dihalogenobenzonitrilos , principalmente el bromoxinilo y el ioxinilo, el glifosato y sus análogos, el glufosinato. La presente invención tiene incluso por objetivo las plantas regeneradas a partir de las células transformadas. La regeneración es obtenida mediante cualquier procedimiento apropiado que dependa de la naturaleza de la especie, como por ejemplo descrito en las solicitudes anteriores. Las plantas de acuerdo a la invención pueden incluso ser obtenidas mediante crecimiento de los progenitores, cada uno de ellos portando uno de los genes de tolerancia herbicida, descritos.

La invención tiene finalmente por objetivo un procedimiento de desyerba de las plantas, principalmente de los cultivos, con la ayuda de un herbicida de este tipo, caracterizado porque se aplica este herbicida sobre las plantas transformadas de acuerdo a la invención, tanto en presiembra, en precosecha como en postcosecha del cultivo. Por herbicida, en el sentido de la presente invención, se entiende un material activo herbicida solo o asociado con un aditivo que modifica su eficacia, como por ejemplo un agente que aumenta la actividad (sinergista) o que limita la actividad (en inglés asegurador) . Por supuesto, para su aplicación práctica, los herbicidas anteriores son asociados de manera conocida per se a los' adyuvantes de las formulaciones utilizadas habitualmente en agroquímica. De acuerdo a la invención, uno de los genes de tolerancia a herbicidas presentes en las plantas, puede ser utilizado como marcador de selección, ya sea in vi tro, o bien in vi vo . Los diferentes aspectos de la invención serán mejor comprendidos con ayuda de los ejemplos experimentales siguientes.

Ejemplo 1: Aislamiento del gen de la HPPD de P. fl uorescens A32 A partir de la secuencia de aminoácidos de HPPD de Pseudomona s sp . P.J. 874 (publicada por Rüetschi U. y colaboradores 1992. Eur . J. Biochem. 205:459-466) se reduce la secuencia de diferentes oligonucleótidos para amplificar mediante PCR una parte de la secuencia codificante de la HPPD de P . fl uores cens A32 (aislada por McKellar, R.C. 1982.

J. Appl Bacteriol. 53:305-316). Un fragmento de amplificación del gen de esta HPPD ha sido utilizado para seleccionar un banco genómico parcial de P . fl uorescens A32, y de este modo aislar el gen que codifica para esta enzima. A) Preparación del ADN genómico de P. fl uorescens A32. La bacteria ' ha sido cultivada en 40 ml de medio mínimo M63 (KH2P0 13.6 g/1, (NH4)2S04 2g/l, MgS04 0.2 g/1, FeS04 0.005 g/1, pH = 7 más L-tirosina mM como única fuente de carbono) a 28°C durante 48 horas . Después del lavado, las células se recogen en 1 ml de amortiguador de lisis (tris-HCl 100 mM, pH 8.3, NaCl 1.4 M y EDTA 10 mM) y se incuban 10 minutos a 65°C. Después de un tratamiento con fenol/cloroformo (24/1) y un tratamiento con cloroformo, los ácidos nucleicos se precipitan mediante la adición de un volumen de isopropanol y después se recogen en 300 µl de agua estéril, y se tratan con la ARNasa 10 µg/ml final. El ADN es nuevamente tratado con fenol/cloroformo, con cloroformo y se vuelve a precipitar mediante la adición de 1/10 de volumen de acetato de sodio 3M, pH 5 y 2 volúmenes de etanol. El ADN es en seguida recogido en agua estéril y dosificado. B) Elección de los oligonucleótidos y síntesis . A partir de la secuencia de aminoácidos de la HPPD de Pseudomona s sp . P.J. 874, se eligen cinco oligonucleótidos, dos dirigidos en el sentido NH2-terminal de la proteína hacia el extremo COOH-terminal de la proteína, y tres dirigidos en el sentido inverso (ver Figura 1) . La elección ha sido dictada por las dos reglas siguientes: un extremo 3' del oligonucleótido estable, es decir al menos dos bases sin ambigüedad, una degeneración más débil posible: Los oligonucleótidos elegidos tienen las siguientes secuencias: Pl: 5' TA(C/T) GA(G/A)AA(C/T) CCIATGGG3' P2: 5' GA(G/A) ACIGGICCIATGGA3 ' P3: 5'AA(C/T) TGCATIA(G/A) (G/A) AA ( C/ ) TC (C/ ) TC3 ' P4: 5'AAIGCIAC (G/A) TG(C/T) TG (T/G/A) TICC3' P5: 5'GC (C/T) TT (A/G) AA(A/G) TICC (C/T) TCICC3' Estos han sido sintetizados sobre el sintetizador "Cyclone plus DNA Synthesizer" de la marca MILLPORE. Con estos cinco oligonucleótidos mediante PCR, los fragmentos de amplificación que se deben obtener teóricamente después de la secuencia SEQ ID NO. 1, tienen los siguientes tamaños: con los cebadores Pl y P3 > aproximadamente 690 pares de bases con los cebadores Pl y P4 ^ aproximadamente 720 pares de bases con los cebadores Pl y P5 ^ aproximadamente 1000 pares de bases con los cebadores P2 y P3 > aproximadamente .390 pares de bases con. los cebadores P2 y P4 > aproximadamente 420 pares de bases con los cebadores P2 y P5 ^ aproximadamente 700 pares de bases C) Amplificación de una parte codificante de la HPPD de P . fl uorescens A32. Las amplificaciones han sido realizadas sobre un aparato PCR PERKIN ELMER 9600 y con la polimerasa Tag de PERKIN ELMER, con su amortiguador en las condiciones estándares, es decir para 50 µl de reacción existen los dNTP a 200 µM , los cebadores a 20 µM, la polimerasa Taq 2.5 unidades y el ADN de P . fl uorescens A32 2.5 µg . El programa de amplificación utilizado es, 5 minutos a 95°C, después 35 ciclos de menos de 45 segundos a 95°C, 45 segundos a 49°C, 1 minuto a más de 72°C seguido de 5 minutos a 72°C En estas condiciones, todos los fragmentos de amplificación obtenidos tienen un tamaño compatible con los tamaños teóricos dados anteriormente, lo que es una buena indicación de la especificidad de las amplificaciones Los fragmentos de amplificaciones obtenidos con los juegos de cebadores P1/P4, P1/P5 y P2/P4 son ligados en pBSII SK(-) después de la digestión de este plásmido mediante Eco RV, y tratamiento con la transferasa terminal en presencia e ddTTP como se describe en HOLTON T.A. y GRAHAM M.W. 1991. N.A.R, vol. 19, No. 5, pll56 Un clon de cada uno de estos tres tipos se secuencia parcialmente; esto permite confirmar que se ha amplificado bien en los tres casos una parte de la región codificante de la HPPD de P . fl uorescens A32.. El fragmento P1/P4 es retenido como sonda para seleccionar un banco genómico parcial de P . fl uorescens A32 y aislar el gen completo de la HPPD. D) Aislamiento del gen. Mediante Southern se muestra que un fragmento de 7 Kpb después de la digestión del ADN de P . fl uorescens A32 mediante la enzima 'de restricción BamHl, se híbrida con la sonda HPPD P1/P4. Se ha hecho entonces digerir 400 µg de ADN de P . fl uorescens A32 mediante la enzima de restricción Ba Hl y purificado sobre el gen de agarosa los fragmentos de ADN gue constituyen aproximadamente 7 Kpb. Estos fragmentos son ligados en pBSII SK(-), los mismos digeridos mediante BamHl y desfosforilados mediante tratamiento con la fosfatasa alcalina. Después de la transformación en E . coli DHlOb, el banco genómico parcial es seleccionado con la sonda HPPD P1/P4. Se ha aislado un clon positivo y se le ha denominado pRPA. Su mapa o carta simplificada se da en la Figura 2. Sobre este mapa se indica la posición de la parte codificante del gen HPPD. Esta está compuesta de 1077 nucleótidos que codifican para 358 aminoácidos (ver SEQ ID NO. 1) . La HPPD de P . fl uorescens A32 presenta una buena homología de aminoácidos con agüella de Pseudomona s sp . cepas P.J. 874, existiendo en efecto 92% de identidad entre estas dos proteínas (ver Figura 3) .

Ejemplo 2: Construcción de dos genes quiméricos con una secuencia HPPD.

Para conferir la tolerancia de las plantas a los herbicidas que inhiben la HPPD, se construyen dos genes quiméricos. El primero ' consiste en poner la parte codificante del gen de la HPPD de P . fl uorescens A32 bajo el control del promotor doble histona (Solicitud de Patente Europea No. 0,507,698) seguido del aumentador traduccional del virus de la roya del tabaco (TEV) (pRTL-GUS (Carrington y Freed, 1990; J. virol. 64: 1590-1597)) con el terminador del gen de la nopalin-sintasa . La HPPD será luego localizada en el citoplasma.

El segundo será idéntico al primero, salvo que entre el activador de la traducción TEV y la parte codificante de HPPD, se intercala el péptido de tránsito optimizado (OTP) (Solicitud Europea EP. No. 0,508,909) . La HPPD será luego localizada en el cloroplasto . A) Construcción del vector pRPA-RD-153: pRPA-RD-11: Un derivado de pBS-II SK(-) (catálogo Estratagene #212206) que contiene el sitio de poliadenilacón de la nopalin-sintasa (NOS poliA) (Solicitud Europea No. 0,652,286) se clona entre los sitios Kpnl y Sal í . El sitio Kpnl se transforma en un sitio Notl mediante tratamiento con la T4 ADN-polimerasa I en presencia de 150 µM de trifosfatos de desoxinucleótido, y después ligadura con un ligador Notl (catálogo Estratagene #1029) . De este modo se obtiene un cásete de clonación NOS poliA: pRPA-RD-127: Un derivado de pRPA-BL-466 (Solicitud Europea No. 0,337,899) clonado en pRPA-RD-11 creando un cásete de expresión del gen oxy y que contiene el promotor de la pequeña subunidad de la ribulosa-bis carboxilasa : "promotor (SSU) - gen oxy - NOS poliA" Para crear ese plásmido, se ha digerido el pRPA-BL-488 con Xbal y HindII para aislar un fragmento de 1.9 kpb que contiene el promotor SSU y el gen oxy, que ha sido ligado en el plásmido pRPA-RD-11 digerido con las enzimas compatibles. pRPA-RD-132: Este es un derivado de pRPA-BL-488 (Solicitud Europea No. 0,507,698) clonado en pRPA-RD-127 con la creación de un cásete de expresión del gen oxy con el promotor doble histona: "promotor doble histona - gen oxy - NOS poliA" Para fabricar este plásmido, se digiere pRPA-BL-466 con HindIII, se trata con la enzima Klenow y después de vuelve a digerir con Ncol. El fragmento de 1.35 kpb purificado, que contiene el promotor doble histona H3A748, se liga con el plásmido pRPA-RD-127 que había sido digerido con Xbal, tratado con Klenow y redigerido con Ncol. pRDA-RD-153: Este es un derivado de pRPA-RD-132 gue contiene el activador de traducción del virus de la roya del tabaco (TEV) , pRTL-GUS (Carrington y Freed, 1990: J. Virol. 64: 1590-1597) se digiere con Ncol y EcoRI, y el fragmento de 150 pares de bases se liga en pRPA-RD-132 digerido con las mismas enzimas. Se ha creado entonces un cásete de expresión que contiene el promotor: "promotor de doble histona - TEV - oxy u - NOS poliA" B) Construcción del vector pRPA-RD-185: pUC19/GECA: Un derivado de pUC-19 (catálogo Gibco #15364-011) que contiene numerosos sitios de clonación. pUC-19 se digiere con EcoRI y se liga con el oligonucleótido ligador 1: Ligador 1: AATTGGGCCA GTCAGGCCGT TTAAACCCTA GGGGGCCCG CCCGGT CAGTCCGGCA AATTTGGGAT CCCCCGGGC TTAA El clon seleccionado contiene un sitio EcoRI seguido del poliligador que contiene los sitios siguientes: EcoRI, Apal, Avrll, Pmel, Sfi l, Sa cl , Kpnl, Sma l, BamHl, Xbal, Sal í, Ps t I, Sphl y HindIII. pRPA-RD-185: Este es un derivado de pUC19/GECA que contiene un poliligador modificado. PUC19/GECA se digiere con HindIII y se liga con el oligonucleótido ligador 2 : Ligador 2: AGCTTTTAAT TAAGGCGCGC CCTCGAGCCT GGTTCAGGG AAATTA ATTCCGCGCG GGAGCTCGGA CCAAGTCCC TCGA El clon seleccionado contiene un sitio HindI.II, sitio por m dio del poliligador que contiene ahora los siguientes sitios: EcoRI, Apa l, Avrll, P el, ~ Sfi I, Sa cl, Kpnl, Smal, Ba Hl, Xba l, Sal í, Ps t.I, Sphl, HindIII, Pa cí, As cI, Xhol y EcoNI . C) Construcción del vector pRP T: pRP O: Un derivado de pRPA-RD-153 que contiene un cásete de expresión de la HPPD, promotor doble histona - TEV - gen HPPD - terminador Nos. Para fabricar pRP O, se digiere pRPA-RD-153 mediante HindIII, se trata con Klenow, después se vuelve a digerir con Ncol para obtener el gen oxy y reemplazarlo por el gen HPPD proveniente del plásmido pRP A, mediante digestión con BstEII, tratamiento con Klenow y redigestión con Ncol. pRP R: Para obtenerlo, el plásmido pRP O ha sido digerido con PvuII y Sacl, el gen quimérico ha sido purificado y después ligado en pRPA-RD-185, el mismo digerido con PvuII y Sacl. pRP T: Este ha sido obtenido mediante ligadura del gen quimérico proveniente de pRP R después de la digestión con Sacl y HindIII en el plásmido pRPA-BL- 150 alfa2 digerido con las mismas enzimas (Solicitud Europea No. 0,508,909). El gen guiméfico del vector pRP T tiene pues la siguiente estructura: D) Construcción del vector pRP V. pRP P: Este es un derivado de pRPA-RD-7 (Solicitud Europea EP. No. 0,652,286) gue contiene el péptido de tránsito optimizado seguido del gen de la HPPD. Este ha sido obtenido mediante ligadura de la parte codificante de la HPPD salida del pRP A mediante digestión con BstEII y Ncol, tratamiento con Klenow y con el plásmido pRPA-RD-7, el mismo digerido con Sphl y Accl, y tratado con la ADNasa polimerasa T4. pRP Q: Un derivado de pRPA-RD-153 que contiene un cásete de expresión de la HPPD, promotor doble histona - TEV - OTP - gen HPPD - terminador Nos. Para construirlo el plásmido pRPA-RD-153 se digiere con Salí, se trata con Klenow y después se vuelve a digerir con Ncol para obtener el gen oxy y reemplazado por el gen HPPD salido del plásmido pRP P mediante digestión de BstEII, tratamiento con Klenow y redigestión con Ncol. pRP S: Para obtenerlo, el plásmido pRP Q ha sido digerido con PvuII 'u Sacl, para obtener el gen quimérico gue ha sido ligado en pRPA-RD-185, el mismo digerido con PvuII y Sacl. pRP V: Este ha sido obtenido mediante ligadura del gen quimérico proveniente de pRP S después de la digestión con Sacl y HindII en el plásmido pRPA-BL 150 alfa2 (Solicitud Europea EP No .0, 508 , 909) . El gen guimérico del vector pRP Q tiene pues la siguiente estructura: Ejemplo 3: Transformación del tabaco industrial PBD6.

Con el fin de determinar la eficacia de estos dos genes quiméricos, éstos han sido transferidos en el tabaco industrial PBD6 de acuerdo a los procedimiento de transformación y de regeneración ya descritos en la Solicitud Europea EP No. 0,508,909. 1) Transformación: El vector se introduce en la cepa no oncogénica de Agroba c teri um EHA 101 (Hood y colaboradores, 1987) portador del cósmido pTVK 291 (Komari y colaboradores, 1986) . La técnica de transformación está basada en el procedimiento de Horsh R. y colaboradores (1985) Science, 227, 1229- 1231.

Regeneración: La regeneración del tabaco PBD6 (proveniente de SEITA Francia) a partir de explantes foliares, se realiza sobre un medio de base Murashige y Skoog (MS) que comprende 30 g/1 de sacarosa, así como 100 µg/ml de kanamicina. Los explantes foliares son tomados de las plantas en el invernadero o in vi tro, y transformadas de acuerdo a la técnica de discos foliares (Science 1985, Vol. 227, p. 1229-1231) en tres etapas sucesivas: la primera comprende la inducción de brotes sobre un medio MS adicionado con 30 g/1 de sacarosa que contiene 0.05 mg/1 de ácido naftilacético (ANA) y 2 mg/1 de bencilaminopurina (BAP) durante 15 días. Los brotes formados en el transcurso de esta etapa son en seguida desarrollados mediante cultivo sobre un medio MS adicionado de 30 g/1 de sacarosa pero gue no contiene hormona, durante 10 días. Luego se toman los brotes desarrollados y se les cultiva sobre un medio de enraizamiento MS con proporción media en sales, vitaminas y azúcares, y gue no contiene hormona. Al cabo de aproximadamente 15 días, los brotes enraizados son pasados a tierra. Las plantas obtenidas son denominadas Col7. Al salir de la prueba in vi tro, las plántulas de tabaco transformadas han sido aclimatadas al invernadero (60% de humedad relativa; temperatura: 20°C en la noche y 23°C en el día) durante cinco semanas, y después tratadas con 4-[4-CF3-2- (metilsulfonil) benzoil]-5-ciclopropilisoxazol .

El tabaco testigo, no transformado y tratado con 4-[4-CF3-2- (metilsulfonil ) benzoil]-5-ciclopropilisoxazol a las dosis que van de 50 a 400 g/hectárea, desarrolla en aproximadamente 72 horas clorosis, que se intensifican para evolucionar hacia necrosis muy pronunciadas en una semana (que cubren aproximadamente 80% de las hojas terminales) . Después de la transformación este mismo tabaco, que sobre expresa la HPPD de P . fl uorescens , está muy bien protegido contra un tratamiento con 4-[4-CF3-2-metilsulfonil) benzoil]-5-ciclopropil i soxazol a la dosis de 400 g/hectárea. Si la enzima sobreexpresada está en el cloroplasto, es decir si la transformación ha sido hecha con el gen portador por el vector pRP V, entonces la planta está perfectamente protegida, y no presenta ningún síntoma.

Ejemplo 4: Transformación del tabaco industrial PBD6, con el gen EPSPS para la => construcción 173.

Aislamento de un ADNc que codifica para una EPSPS de maíz: Las diferentes etapas, que han conducido a la obtención del ADNc de EPSPS de maíz, que ha servido de sustrato a la introducción de dos mutaciones, se describen en seguida. Todas las operaciones descritas en seguida son dadas a manera de ejemplos, y corresponden a una elección, efectuada entre los diferentes métodos disponibles para llegar al mismo resultado. Esta elección no tiene ninguna incidencia sobre la calidad del resultado y en consecuencia, cualquier método adaptado puede ser utilizado por el experto en la materia para llegar al mismo resultado. La mayor parte de los métodos de ingeniería de fragmentos de ÁDN se describen en "Current Protocols in Molecular Biology", Volúmenes 1 y 2. Ausubel F.M. y colaboradores, publicados por Greene Publishing Associates y Willey -Interscience (1989) (en lo subsecuente, las referencias a los protocolos descritos' en esta obra serán anotados "ref. CPMB") . Las operaciones concernientes al ADN, que han sido efectuadas de acuerdo a los protocolos descritos en esta obra son, en particular, los siguientes: ligadura de fragmentos de ADN, tratamientos con la ADN-polimerasa de Klenow y la ADN-polimerasa T4, preparación de la ADN de plásmidos y de bacteriófagos ? ya sea en minipreparación o bien en maxipreparación, análisis del ADN y del ARN respectivamente, de acuerdo a la técnica de Southern y Northern. Otros métodos descritos esta obra han sido también seguidos, y solo se han descrito más adelante las modificaciones o adiciones significativas a estos protocolos. A.l Obtención de un fragmento de EPSPS de Arabi dopsi s thali ana a) dos oligonucleótidos 20-mers de las secuencias respectivas: 5' -GCTCTGCTCATGTCTGCTCC-3' 5' -GCCCGCCCTTGACAAAGAAA-3' han sido sintetizados a partir de la secuencia de un gen de EPSPS de Arabi dopsi s thali ana (Klee H.J. y colaboradores (1987) Mol. Gen. Genet. 210, 437-442) . Estos dos oligonucleótidos están respectivamente en la posición 1523 a la 1543 y 1737 a 1717 de la secuencia publicada y' en orientación convergente. b) el ADN total de Arabi dopsi s thal i ana (variedad columbia) ha sido obtenido de Clontech (catálogo de referencia: 6970-1) c) Se mezclan 50 nanogramos (ng) de ADN con 300 ng de cada uno de los oligonucleótidos, y se someten a 35 ciclos de amplificación con un aparato Perkin-Elmer 9600, en las condiciones de medio estándar para la amplificación, recomendadas por el proveedor. El fragmento de 204 pares de bases resultante, constituye el fragmento de EPSPS de Arabi dopsi s thali ana . 2 . Construcción de una biblioteca genómica de un ADNc a partir de una línea celular de maíz BMS. a) Se trituran 5 g de células filtradas en nitrógeno líquido y los ácidos nucleicos totales se extraen de acuerdo al método descrito por Shure y colaboradores, con las siguientes modificaciones: el pH del amortiguador de lisis se ajusta a pH = 9.0; después de la precipitación con isopropanol, el residuo o botón se recoge en agua y después de la disolución se ajusta con cloruro de litio 2.5 M. Después de la incubación durante 12 horas a °C, el botón de la centrifugación de 15 minutos a 30000 g a 4°C, se vuelve a solubilizar. La etapa de precipitación con LiCl es luego repetida. El botón resolubilizado constituye la fracción de ARN de los ácidos nucleicos totales. b) La fracción de ARN-poliA+ de la fracción de ARN se obtiene mediante cromatografía sobre columna oligo-dT de celulosa tal como se describe "Current Protocols in Molecular Biology". c) Síntesis del ADNc de doble hebra con extremo sintético de EcoRI: esto se realiza siguiendo el protocolo del proveedor, de los diferentes reactivos necesarios para esta síntesis bajo la forma de un equipo el "equipo de copia" ("copy kit") de la sociedad In Vitrogen. Dos oligonucleótidos de hebra simple y parcialmente complementarios de secuencias respectivas : 5' -AATTCCCGGG-3' 5' -CCCGGG-3' (este último está fosforilado) son ligados con los ADNc de doble hebra con extremos romos . Esta ligadura de los adaptadores da como resultado la creación de sitos Smal unidos a los ADNc de doble hebra y EcoRI, bajo la forma cohesiva en cada extremo de los ADNc de doble hebra. d) Creación de la biblioteca: Los ADNc que presentan en sus extremos los . sitios artificiales cohesivos EcoRI, son ligados con el ADNc del bacteriófago ?gtlO cortado con EcoRI, y desfosforilado de acuerdo al protocolo del proveedor New England Biolabs. Una alícuota de la reacción de ligadura ha sido encapsidada in vi tro con los extractos de encapsidación: Gigapack Gold de acuerdo a las instrucciones del proveedor, esta biblioteca ha sido titulada utilizando la bacteria E . coli C 600hfl . La biblioteca obtenida de este modo es amplificada y almacenada de acuerdo a las instrucciones del mismo proveedor, y constituye la biblioteca de ADNc de suspensión celular de maíz BMS. 3. Selección de la biblioteca de ADNc de suspensión celular de maíz BMS con la sonda EPSPS de Arabidopsi s thaliana : El protocolo seguido es aquel de "Current Protocols in Molecular Biology" volúmenes 1 y 2, Ausubel F.M. y colaboradores, publicado por Greene Publishing Associates y S (1989) (CPMB). En resumen, son extendidos ' aproximadamente 106 fagos recombinantes sobre una caja LB con una densidad media de 100 fagos/cm2. Las placas de lisis son replicadas por duplicado sobre la membrana Hybond N de Amersham. h) El ADN ha sido fijado sobre los filtros mediante tratamiento con UV 1600 kJ (Stratalinker de Estratagene) . Los filtros habían sido prehibridados en: 6xSSC/0.1%SDS/ 0.25 de leche descremada durante 2 horas a 65°C. La sonda EPSPS de Arabi dopsi s thal i ana ha sido marcada con 32p-dCTP mediante "cebadura aleatoria" de acuerdo a las instrucciones del proveedor (Kit Ready para Go de Pharmacia) . La actividad específica obtenida es del orden de 108 cpm por µg de fragmento. Después de la desnaturalización durante 5 minutos a 100°C, la sonda se agrega en el medio de prehibridación y la hibridación es proseguida durante 14 horas a 55°C. Los filtros son fluorografiados 48 horas a -80°C con una película Kodak XAR5 y las pantallas reforzadoras Hyperscreen RPN de Amersham. El alineamiento de los puntos positivos sobre el filtro, con las cajas de donde éstos son provenientes, permite recoger, sobre la caja, las sondas correspondientes a los fagos que presentan una respuesta de hibridación positiva con la sonda EPSPS de Arabi dopsi s thali ana . Esta etapa de escalonamiento, transferencia, hibridación, recuperación es repetida hasta que todas las manchas de las cajas de los fagos sucesivamente purificados se revelan positivos al 100% de hibridación. Una placa de lisis por fago independiente es luego recogida en el medio ? diluyente (Tris-Cl pH = 7.5; sulfato de magnesio 10 mM; cloruro de sodio 0.1 M; gelatina 0.1%), estos fagos en solución constituyen los clones positivos de EPSP de la suspensión celular de maíz BMS. 4. Preparación y análisis del ADN de los clones de EPSPS de la suspensión celular de maíz BMS. Se agregan aproximadamente 5.108 fagos a 20 ml de bacterias C600h.fl a 2 DO 600 nm/ml y se incuba en 15 minutos a 37°C. Esta suspensión es luego diluida en 200 ml de medio de crecimiento de bacterias en un matraz Erlenmeyer de 1 litro y se agita en un agitador rotatorio a 250 rpm. La lisis se constata por la clarificación del medio, correspondiente a 1 lisis de bacterias túrbidas y se produce después de aproximadamente 4 horas de agitación. Este sobrenadante es luego tratado como se describe en "Current Protocols in Molecular Biology". El ADN obtenido corresponde a los clones de EPSP de la suspensión celular de maíz BMS. Uno a dos µg de este ADN son cortados con EcoRI y se separan sobre gel de agarosa LGTA/TBE (ref. CPMB) al 0.8%. Una última verificación consiste en asegurar gue el ADN purificado presente muy bien una señal de hibridación con la sonda EPSPS de Arabi dopsi s thali ana . Después de la electroforesis, los fragmentos de ADN son transferidos sobre membrana Hybon N de Amersham de acuerdo al protocolo de Southern descrito en "Current Protocols in Molecular Biology". El filtro se híbrida con la sonda EPSPS de Arabi dopsi s thal i ana de acuerdo a las condiciones descritas en el párrafo 3 anterior. El clon que presenta una señal de hibridación con la sonda EPSPS de Arabi dopsi s thal i ana y que contiene el fragmento EcoRI más largo, tiene un tamaño estimado sobre gel de aproximadamente 1.7 kpb . 5. Obtención del clon pRPA-ML-711: Diez µg del ADN del clon fágico gue contiene el inserto de 1.7 kpb se digieren con EcoRI y se separan sobre el gel de agarosa LGTA/TBE (ref. CPMB) al 0.8%. El fragmento de gel que contiene el inserto de 1.7 kpb se extirpa del gel mediante coloración BET y el fragmento se trata con la ß-agarasa de acuerdo al protocolo^ del proveedor New Biolabs. El ADN purificado del fragmento de 1.7 kpb se liga a 12°C durante 14 horas con el ADN del plásmido pUC 19 (New England Biolabs) cortado con EcoRI de acuerdo al protocolo de ligadura descrito en "Current Protocols in Molecular Biology". Dos µl de la mezcla de ligadura anteriormente mencionada se utilizan para la transformación de una alícuota de E. coli DH10B electrocompetentes ; la transformación se hace mediante electroporación utilizando las siguientes condiciones: la mezcla de bacterias competentes y del medio de ligadura se introduce en una cubeta de electroporación de espesor de 0.2 cm (Biorad) previamente enfriada a 0°C. Las condiciones físicas de electroporación utilizando un electroporador de marca Biorad, son 2500 voltios, 25 µfaradios y 200 O. En estas condiciones, el tiempo de descarga media del condensador es del orden de 4.2 milisegundos. Las bacterias son luego recogidas en 1 ml de medio SOC (ref. CPMB) y agitadas durante 1 hora a 200 rpm sobre un agitador rotatorio en tubos Corning de 15 ml . Después de la extensión sobre el medio LB/agar supl'ementado con 100 µg/ml de carbenicilina, las minipreparaciones de los clones bacterianos gue se han estimulado después de una noche a 37°C, se realizan de acuerdo al protocolo descrito en "Current Protocols in Molecular Biology". Después de la digestión con EcoRI de ADN y la separación por electroforesis sobre gel de agarosa LGTA/TBE (ref. CPMB) al 0.8%, se conservan los clones gue presentan un inserto de 1.7 kpb. Una última verificación consiste en asegurar que el ADN purificado presente muy bien una señal de hibridación con la sonda EPSPS de Arabi dopsi s thal i ana . Después de la electroforesis, los fragmentos de ADN son transferidos sobre membrana Hybond N de Amersham de acuerdo al protocolo de Southern descrito en "Current Protocols in Molecular Biology". El filtro se híbrida con la sonda EPSPS de Arabi dopsi s thal i ana de acuerdo a las condiciones descritas en el párrafo 3 anterior. El clon plasmídico gue presenta un inserto de 1.7 kpb y que se híbrida con la sonda EPSPS de Arabi dopsi s thal i ana ha sido preparado a una .escala mayor y el ADN resultante de la lisis de las bacterias se purifica sobre gradiente de cloruro de cesio, tal como se describe en "Current Protocols in Molecular Biology". El ADN purificado ha sido parcialmente secuenciado con un equipo de Pharmacia siguiendo las instrucciones del proveedor, y utilizando como cebadores, los cebadores universales de M13 directos e inversos recomendados por el mismo proveedor. La secuencia parcial realizada cubre aproximadamente 0.5 kpb. La secuencia derivada de aminoácidos en la región de la proteína madura (aproximadamente 50 residuos de aminoácidos) presenta una identidad de 100% con la secuencia aminada correspondiente de la EPSPS madura de maíz, descrita en la Patente Norteamericana No. USP 4,971,908) . Este clon correspondiente a un fragmento EcoRI de 1.7 kpb del ADN de EPSP de la suspensión celular de maíz BMS, ha sido nombrado pRPA-ML-711. La secuencia completa de este clon ha sido realizada sobre las dos hebras utilizando el protocolo del equipo de Pharmacia y sintetizando los oligonucleótidos complementarios y la dirección opuesta, por todos los 250 pares" de bases aproximadamente. La secuencia completa de este clon de 1713 pares de bases obtenida, es presentada por la SEQ ID NO. 2. 6. Obtención del clon pRPA-ML-715: El análisis de la secuencia del clon pRPA-ML-711 y en particular la comparación de la secuencia de aminoácidos derivados con agüella de maíz, muestra una extensión de secuencia de 92 pares de bases con dirección hacia arriba (5') del codón GCG gue codifica para la Alanina NH2-terminal de la parte madura de la EPSPS de maíz (Patente Norteamericana No. USP 4,971,908) . De igual modo, se observa una extensión de 288 pares de bases con dirección hacia abajo (3') del codón AAT que codifica para la asparagina COOH-terminal de la parte madura de la EPSPS de maíz (Patente Norteamericana No. USP 4,971,908) . Estas dos partes podrían corresponder, para la extensión NH2-terminal, a una porción de la secuencia de un péptido de tránsito para la localización plastidial y para la extensión COOH-terminal para la región 3' no traducida del ADNc. Con el fin de obtener un ADNc que codifica para la parte madura del ADNc de la EPSPS de maíz, tal como se describe en la Patente Norteamericana No. USP 4,971,908, se han realizado las siguientes operaciones : a) Eliminación de la región 3' no traducida: construcción de pRPA-ML-712: El clon pRPA-ML-711 ha sido cortado con la enzima de restricción Asel y los extremos resultantes de esta escisión se han hecho romos mediante tratamiento con el fragmento de Klenow de la ADN-polimerasa I de acuerdo al protocolo descrito en CPMB. Un corte con la enzima de restricción SacII ha sido efectuado en seguida. El ADN resultante de estas operaciones ha sido separado mediante electroforesis sobre gel de agarosa LGTA/TBE (ref. CPMB) al 1%. El fragmento de gel que contiene el inserto "Asel-extremos romos/Sací I" de 0.4 kpb, ha sido extirpado del . gel y purificado de acuerdo al protocolo descrito en el párrafo 5 anterior. El ADN del clon pRPA-ML-711 ha sido cortado con la enzima de restricción HindIII situada en el poliligador del vector de clonación pUC19, y los extremos resultantes de esta escisión han sido hechos romos mediante el tratamiento con el fragmento de Klenow de la ADN-polimerasa I. Un corte o escisión mediante la enzima de restricción SacII ha sido en seguida efectuado. El ADN resultante de estas manipulaciones ha sido separado mediante electroforesis sobre gel de agarosa LGTA/TBE (ref. CPMB) al 0.7%. El fragmento de gel gue contiene el inserto HindIII-extremos romos/SacII de aproximadamente 3.7 kpb, ha sido extirpado del gel y purificado de acuerdo al protocolo descrito en el párrafo 5 anterior. Los dos insertos hah sido ligados, y 2 µl de la mezcla de ligadura han servido para transformar E. coli DH10B, tal como se describe anteriormente en el párrafo 5. Se analiza el contenido de ADN plasmídico de diferentes clones, de acuerdo al procedimiento descrito para pRPA-ML-711. Un de los clones plasmídicos retenido contiene un inserto EcoRI-HindlII de aproximadamente 1.45 kpb. La secuencia de los extremos terminales de este clon revela que el extremo 5' del inserto corresponde exactamente al extremo correspondiente de pRPA-ML-711, y que el extremo 3' terminal presenta la secuencia siguiente: "5'...AATTAAGCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT-3' " La secuencia subrayada corresponde al codón del aminoácido COOH-terminal asparagina, el siguiente codón es correspondiente al codón de detención de la traducción. Los nucleótidos con dirección hacia abajo (3') corresponden a los elementos de la secuencia del poliligador de pUCl9. Este clon que comprende la secuencia de pRPAML-711 hasta el sitio de terminación de la traducción de la EPSPS madura de maíz, y seguida de las secuencias del poliligador pUC19, hasta el sitio HindIII, ha sido nombrado pRPA-ML-712. b) Modificación del extremo 5' de pRPA-ML-712: construcción de pRPA-ML-715. El clon pRPA-ML-712 ha sido cortado con las enzimas de restricción PstI y HindIII. El ADN resultante de estas manipulaciones ha sido separado mediante electroforesis sobre gel de agarosa LGTA/TBE (ref. CPMB) 0.85. El fragmento de gel que contiene el inserto PstI/EcoRI de 1.3 kpb ha sido extirpado del gel y purificado de acuerdo al protocolo descrito en el párrafo 5 anterior. Este inserto ha sido puesto en ligadura en presencia de una cantidad equimolecular de cada uno de los dos oligonucleótidos parcialmente complementarios, de secuencia: Oligo 1: 5'GAGCCGAGCTCCATGGCCGGCGCCGAGGAGATCGTGCTGCA-3' Oligo 2: 5' -GCACGATCTCCTCGGCGCCGGCCATGGAGCTCGGCTC-3 ' así como en presencia de ADN del plásmido pUC19 digerido por las enzimas de restricción BamHl y HindIII . Dos µl de la mezcla de ligadura han servido para transformar E . col i DH10B tal como se describe anteriormente en el párrafo 5. Después del análisis del contenido de ADN plasmídico de diferentes clones de acuerdo al procedimiento descrito anteriormente en el párrafo 5, ha sido conservado uno de los clones que presentan un inserto de aproximadamente 1.3 kpb, para análisis ulteriores. La secuencia del extremo 5' terminal del clon retenido, revela que la secuencia de ADN en esta región es la siguiente: secuencia de poliligador de pUC19 de los sitios EcoRI al BamHl, seguida de la secuencia de oligonucleótidos utilizados al momento de la clonación, seguida del resto de la secuencia presente en pRPAML-712. Este clon ha sido nombrado pRPA-ML-713. Este clon presenta un codón de metionina ATG incluido en un sitio Ncol con dirección hacia arriba (5') del codón de alanina N-terminal de la EPSPS-sintasa madura. Además, los codones de alanina y glicina del extremo N-terminal han sido conservados, pero modificados sobre la tercera base variable: GCGGGT_ inicial da GCCGGC modificado. El Clon pRPA-ML-713 ha sido cortado con la enzima de restricción HindIII y los extremos de este corte o escisión se han hecho romos mediante el tratamiento con el fragmento de Klenow de la ADN-poliitierasa I. Un corte con la enzima de restricción Sacl ha sido efectuado en seguida. El ADN resultante de estas manipulaciones ha sido separado mediante electroforesis sobre gel de agarosa LGTA/TBE (ref. CPMB) al 0.8%. El fragmento de gel que contiene el inserto "HindIII extremos romos/Sací" de 1.3 kpb ha sido extirpado del gen y purificado de acuerdo al protocolo descrito en el párrafo 5 anterior. Este inserto ha sido puesto en ligadura en presencia de ADN del plásmido pUC19 digerido con la enzima de restricción Xbal y los extremos de este corte que se han hecho romos mediante tratamiento con el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I. Un corte con la enzima de restricción Sacl ha sido efectuado en seguida. Dos microlitros de la mezcla de ligadura han servido para transformar E . Coli DH10B, tal como se describe anteriormente en el párrafo 5. Después del análisis del contenido del ADN plasmídico de diferentes clones de acuerdo al procedimiento descrito anteriormente en el párrafo 5, ha sido conservado uno de los clones que presentan un inserto de aproximadamente 1.3 kpb para análisis ulteriores. La secuencia de extremos terminales del clon retenido revela que la secuencia de ADN es la siguiente: secuencia del poliligador pUCl9 de los sitios EcoRI y Sacl, seguido de la secuencia de los oligonucleótidos utilizados al momento de la clonación, suprimidos de los 4 pares de bases GATCC del oligonucleótido 1 descrito anteriormente, seguido del resto de la secuencia presente en el pRPA-ML-712 justo en el sitio HindIII, y la' secuencia del poliligador de pUC19 de Xbal hasta HindIII. Este clon ha sido nombrado pRPA-ML-715. 7) Obtención de un ADNc que codifica para una EPSPS de maíz mutada Han sido realizadas todas las etapas de mutagénesis con el eguipo de mutagénesis de U.S.E. de Pharmacia siguiendo las instrucciones del proveedor. El principio de este sistema de mutagénesis es el siguiente: el ADN plasmídico es desnaturalizado con calor y reasociado en presencia de un exceso molar por una parte del oligonucleótido de mutagénesis, y por otra parte de un oligonucleótido que permite eliminar un sitio de enzima de restricción único presente en el poliligador. Después de la etapa de reasociación, la síntesis de la hebra complementaria es realizada mediante la acción de la ADN-polimerasa T4 en presencia de la ADN-ligasa T4 y de la proteína del gen 32, en un amortiguador apropiado, proporcionado. El producto de síntesis se incuba en presencia de la enzima de restricción, donde el sitio se supone gue ha desaparecido por mutagénesis. La cepa de E . Coli que presenta, en particular, la mutación mutS, se utiliza como el huésped para la transformación de este ADN. Después del crecimiento en medio líquido, el ADN plasmídico total es preparado, incubado "en presencia de la enzima de restricción utilizada anteriormente. Después de estos tratamientos, la cepa de E . Coli DH10B se utiliza como huésped para la transformación. El ADN plasmídico de los clones aislados se prepara, y la presencia de la mutación introducida se verifica mediante secuenciamiento .

A) modificaciones de los sitios o de la secuencia sin incidencia a priori sobre el carácter de resistencia a la EPSPS de maíz, a los productos inhibidores competitivos de la actividad de la EPSP-sintasa : eliminación de un sitio Ncol interno de pRPA-ML-715. La secuencia de pRPA-ML-715 es numerada arbitrariamente colocando la primera base del codón Alanina N-terminal GCC en posición 1. Esta secuencia presenta un sitio Ncol en posición la 1217. El oligonucleótido de modificación del sitio presenta la secuencia : 5' CCACAGGATGGCGATGGCCTTCTCC-3' Después del secuenciamiento de acuerdo a las referencias dadas anteriormente, la secuencia leída después de la mutagénesis corresponde a aquella del oligonucleótido utilizado. El sitio Ncol ha sido también eliminado y la traducción en aminoácidos en esta región conserva la secuencia inicial presente sobre pRPA-ML-715. Este clon ha sido nombrado pRPA-ML-716. La secuencia de 1340 pares de bases de este clon se presenta como SEQ ID No. 3 y SEQ ID No. 4.

B) modificaciones de la secuencia que permiten el aumento del carácter de resistencia de la EPSPS de maíz a los productos inhibidores competitivos de la actividad de EPSP-sintasa. Han sido utilizados los siguientes oligonucleótidos : a) mutación Thr 102 => lie. 5' GAATGCTGGAATCGCAATGCGGCCATTGACAGC-3' b) mutación Pro 106 => Ser 5' -GAATGCTGGAACTGCAATGCGGTCCTTGACAGC-3' c) mutaciones Gly 101 = Ala y Thr 102 => lie 5' -CTTGGGGAATGCTGCCATCGCAATGCGGCCATTG-3' d) mutaciones Thr 102 => lie y Pro 106 = Ser 5' -GGGGAATGCTGGAÁTCGCAATGCGGTCCTTGACAGC-3' Después del secuenciamiento, la secuencia leída después de la mutagénesis sobre los tres fragmentos mutados, es idéntica a la secuencia del ADN progenitor pRPA-ML-716, con la excepción de la región mutagenizada que corresponde a aquella de los nucleótidos de mutagénesis utilizados. Estos clones han sido nombrados: pRPA-ML-717 para la mutación Thr 102 => lie, pRPA-ML-718 para la mutación Pro 106 => Ser, pRPA-ML-719 para las mutaciones Gly 101 = Ala y Thr 102 = lie y pRPA-ML-720 para las mutaciones Thr 102 = lie y Pro 106 = Ser. La secuencia de 1340 pares de bases de pRPA-ML-720 es presentada como SEQ ID No. 5 y SEQ ID No. 6. El inserto NcoI-HindIII de 1395 pares de bases es con base en todas las construcciones utilizadas para la transformación de plantas para la introducción de la resistencia a los herbicidas inhibidores competitivos de la EPSPS y en particular la resistencia al glifosato. Este inserto será nombrado en lo subsecuente de las descripciones "el doble mutante de EPSPS de maíz".

B. Tolerancia al glifosato de diferentes mutantes in vitro . 2.a: Extracción de la EPSP-sintasa Los diferentes genes de EPSP-sintasas se introducen bajo la forma de un cásete NcoI-HindIII en el vector plasmídico pTrc99a (Pharmacia, ref: 27-5007-01) cortado con Ncol y HindIII. Los E . coli DH10B recombinantes que sobreexpresan las diferentes EPSP -sintasas se someten a sonicación en 40 ml de amortiguador con 10 g de células centrifugadas y lavadas con este mismo amortiguador (tris-HCl 200 mM pH 7.8, mercaptoetanol 50 mM, EDTA 5 mM y PMSF 1 mM) , a los cuales se agrega 1 g polivinilpirrolidona. La suspensión se agita durante 15 minutos a 4°C, después se centrifuga 20 minutos a 27000 g y 4°C. Al sobrenadante se le agrega sulfato de amonio para llevar la solución a 40% de la saturación con sulfato de amonio. La mezcla se centrifuga 20 minutos a 27000 g y 4°C. Al nuevo sobrenadante se le r agrega sulfato de amonio para llevar la solución a 70% de la saturación con sulfato de amonio. La mezcla se centrifuga 30 minutos a 27000 g y 4°C. La EPSP-sintasa, presente en este botón proteico, se recoge en 1 ml de amortiguador (tris-HCl 20 mM, pH 7.8 y mercaptoetanol 50 mM) . Esta solución se dializa una noche contra dos litros de este amortiguador a 4°C. 2.b: Actividad Enzimática La actividad de cada enzima, así como su resistencia al glifosato se mide in vitro en 10 minutos a 37°C en la mezcla de reacción siguiente: ácido maleico 100 mM pH 5.6, fos foenolpiruvato 1 mM, shikimato-3-fosfato 3 mM (preparado de acuerdo a Knowles P.F. y Sprinson D.B. 1970. Methodos in Enzimol 17A, 351-352 a partir de Aerobact er aerogenes cepa ATCC 25597) y fluoruro de potasio 10 mM. El extracto enzimático se agrega en el último momento después de la adición del glifosato, donde la concentración varía de 0 a 20 mM. La actividad se mide mediante dosificación del fosfato liberado de acuerdo a la técnica de Tausky H.A. y Shorr E. 1953. J. Biol. Chem. 202, 675-685. En estas condiciones, la enzima silvestre (WT) es inhibida al 85% desde la concentración de 0.12 mM de glifosato. A esta concentración, la enzima mutante conocida como Ser 106 no es inhibida más que a un 50% y los otros tres mutantes lie 102, lie 102/Ser 106, Ala 101/Ile 102 no son inhibidos o son poco inhibidos. Se hace multiplicar la concentración del glifosato por diez, o bien 1.2 mM, para inhibir la enzima mutante lie 102 al 50%, los mutantes lie 102/106, Ala/lie y Ala no son siempre inhibidos. Hay que hacer notar que la actividad de los mutantes Ala/lie y Ala no es inhibida sino hasta las concentraciones de 10 mM de glifosato, y que aquella del mutante lie 102/Ser 106 no es reducida de igual modo si la concentración de glifosato es multiplicada por 2, o bien 20 mM. C. Resistencia a las plantas de tabaco transformadas . 0-1 Construcciones de los plásmidos: pRPA-RD-124: Adición de una señal de poliadenilación "nos" a pRPA-ML-720, obtenido anteriormente con la creación de un cásete de clonación que contiene el gen de EPSPS doble mutante de maíz (Thr 102 => lie y Pro 106 = Ser) . pRPA-ML-720 se digiere con Hind III, tratado con el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I de E. coli, para producir un extremo romo. Se efectúa una segunda digestión con Neo I y se purifica el fragmento EPSPS. El gen EPSPS es enseguida ligado con pRPA-RD-12 purificado (un cásete de clonación que contiene la señal de poliadenilación de la nopalin-sintasa) para dar pRPA-RD-124. Para obtener el vector pRPA-RD-12 purificado útil, se necesita que éste sea previamente digerido con Salí, tratado con la ADN-polimerasa de Klenow, y después digerido una segunda vez con Ncol. pRPA-RD-125: Adición de un péptido de tránsito optimizado (OTP) a pRPA-RD-124 con la creación de un cásete de clonación que contiene el gen de EPSPS seleccionado sobre los plásmidos. pRPA-RD-7 (solicitud de patente Europea EP 652 286) se digiere con Sph I, tratado con la ADN-polimerasa T4, y después digerido con Spe I y el fragmento OTP se purifica. Este fragmento OTP se clona en pRPA-RD-124 que ha sido previamente digerido con Ncol, tratado con la ADN-polimerasa de Klenow para quitar la parte protuberante 3', después se digiere con Spe I. Este clon es luego secuenciado para asegurar la fusión traduccional correcta entre el OTP y el gen de EPSPS. Se obtiene entonces pRPA-RD-125. pRPA-RD-159: Adición del promotor doble de histona de arabi dopsi s H4A748 (solicitud de patente Europea EP 507 698) a pRPA-RD-125 con la creación de un cásete para la expresión en las plantas para la expresión del gen "OTP-gen de EPSPS doble mutante" en los tejidos de dicotiledóneas. pRPA-RD-132 (un cásete que contiene el promotor doble H4A748 (solicitud de patente Europea EP 507 698)) se digiere con Neo I y Sac I. El fragmento purificado del promotor es enseguida clonado en lo gue ha sido digerido por Eco I y Sac I . pRPA-RD-173: Adición del gen ''promotor H4A748-OTP-gen de EPSPS doble mutante" de pRPA-RD-159 en el plásmido pRPA-BL-150A (solicitud de patente Europea 508 909) con la creación de un vector de transformación de Agrobacteri um tumefaci ens . pRPA-RD-159 se digiere con Not I y se trata con la polimerasa de Klenow. Este fragmento es enseguida clonado en pRPA-BL-150A con Sma I 1.1-Transformación . El vector de pRPA-RD-173 se introduce en la cepa de Agroba cteri um t umefaci ens EHA101 (Hood y colaboradores, 1987) portadora del cósmido pTVK291 (Komari y colaboradores, 1986) . La técnica de transformación está basada en el procedimiento de Horsh y colaboradores (1985) . 1.2-Regeneración . La regeneración del tabaco PBD6 (procedente de SEITA Francia) a partir de los explantes foliares, se realiza sobre un medio de base Murashigue y Skoog (MS) que comprende 30 gramos/litro de sacarosa así como 200 µg/ml de kanamicina. Los explantes foliares son obtenidos de las plantas cultivadas en invernadero o in vitro y transformadas de acuerdo a la técnica de discos foliares (Science, 1985, Vol 227, p. 1229-1231) en tres etapas sucesivas: la primera comprende la inducción de brotes sobre un medio adicionado con 30 gramos/litro de sacarosa que contiene 0.05 mg/litro de ácido naftilacético (ANA) y 2 mg/litro de bencilaminopurina (BAP) durante 15 días. Los brotes formados en el transcurso de esta etapa son enseguida desarrollados durante 10 días por cultivo sobre un medio MS adicionado con 30 gramos/litro de sacarosa pero que no contiene hormona. Después se recogen los brotes desarrollados y se les cultiva sobre, un medio de enraizamiento MS con proporción media de sales, vitaminas y azúcar y que no contiene hormona. Al cabo de aproximadamente 15 días, los brotes enraizados se pasan a tierra. 1.3-Resistencia al glifosato. Veinte plantas transformadas han sido regeneradas y pasadas a un invernadero para la construcción de pRPA-RD-173. Estas plantas han sido tratadas en invernadero en el estado de 5 hojas con una suspensión acuosa de RoundUp correspondiente a 0.8 kg de materia activa de glifosato por hectárea. Los resultados corresponden a la observación de los índices de fitotoxicidad constatados 3 semanas después del tratamiento. En estas condiciones, se constata gue las plantas transformadas por la construcción pRPA-RD-173 presentan una muy buena tolerancia, mientras que las plantas testigo no transformadas son completamente destruidas. Estos resultados muestran claramente el mejoramiento aportado por la utilización de un gen quimérico de acuerdo a la invención, para un mismo gen que codifica para la tolerancia al glifosato.

Ejemplo 5: Transformación de tabaco industrial PBD6 con el gen de la nitrilasa (para la construcción 238) í Este tabaco es obtenido de acuerdo a la enseñanza de la solicitud Europea n° . 0 337 899 página 6 línea 50 y subsecuentes, a partir de la construcción 238, qué es aquella descrita bajo el nombre de pRPA-BL-238.

Ejemplo 6: Cruce mediante polinización Se procede mediante polinización en invernadero al cruce respectivamente de las líneas Co 17, 173 y 238.

Co 17 con 238 para obtener las plantas de tabaco PBD6 a probar sobre la doble tolerancia al isoxaflutol y al bromoxinilo ("plantas HPPD + OXY") y Co 17 con 173 para obtener las plantas de tabaco PBD6 a probar sobre la doble tolerancia al isoxaflutol y al glifosato ("plantas HPPD + EPSPS") . Las tres líneas son homocigotas frente al gen en cuestión: en consecuencia la descendencia es hemicigota para cada uno de los dos genes introducidos mediante cruce. Las plantas cruzadas son obtenidas al cabo de seis semanas.

Ejemplo 7: Medición de la tolerancia del tabaco en el tratamiento de postcosecha con el isoxaflutol y de postcosecha con el brómoxinilo o el glifosato.

En este ensayo, cada prueba se efectúa sobre la muestra de 10 plantas, siendo conservadas 10 plantas sin tratar. Todos los tratamientos son efectuados mediante pulverización a razón de 500 litros de mezcla por hectárea.

Para el tratamiento en postcosecha, se realiza un semillero, después se resiembran las plantas en vasos de 9 cm x 9 cm. Los tratamientos de postcosecha son realizados en un estado bien desarrollado (3 a 4 hojas) . Los lotes de las plantas respectivamente silvestre y genéticamente transformadas obtenidas anteriormente, se reparten en varias partes, con: a) un lote no tratado, b) otros lotes que son tratados respectivamente con un herbicida solo, de isoxaflutol en postcosecha, a dos dosis (respectivamente 200 y 400 gramos/ha), del bromoxinilo en postcosecha, a dos dosis (respectivamente 400 y 800 gramos/ha), del glifosato' en postcosecha, a dos dosis (respectivamente 800 y 1200 gramos/ha), c) de otros lotes que son tratados respectivamente con dos herbicidas, en postcosecha, en mezcla extemporánea : del isoxaflutol y del bromoxinilo a dos dosis (respectivamente 200/400 y 400/800 gramos/ha) del isoxaflutol y del glifosato a dos dosis (respectivamente 200/800 y 400/1200. gramos/ha) .

" Los tratamientos se efectúan con las siguientes formulaciones: isoxaflutol al 75%, el bromoxinilo (producto comercial PARDNER) bajo la forma de octanoato concentrado, emulsificable a 225 gramos/litro y el glifosato (Round-UP) . En estas condiciones, 17 días después del tratamiento se observan las siguientes fitotoxicidades , expresadas en porcentaje de destrucción indicadas en la tabla siguiente, así como el número de plantas por lote y las dosis de herbicida o herbicidas, expresadas en gramo de material activo por hectárea: Tratamiento de postcosecha con el isoxaflutol y de postcosecha con el bromoxinilo o el glifosato * número de plantas Ejemplo 8 Con el objetivo de estudiar si el gen de la HPPD de Pseudomonas fl uorescens puede ser utilizado como gen marcador en el transcurso del ciclo de "transformación-regeneración" de una especie vegetal, el tabaco ha sido transformado con el gen quimérico compuesto del gen de la HPPD y del gen EPSPS doblemente mutado de resistencia al glifosato y las plantas transformadas resistentes a la vez al isoxaflutol y al glifosato, han sido obtenidas después de la selección sobre el isoxaflutol.

Material y métodos y resultados El gen quimérico pRP 2012 descrito más adelante se transfiere al tabaco industrial PBD6 de acuerdo a los procedimientos de transformación y de regeneración ya descritos en la solicitud Europea EP N° 0 508 909. El gen quimérico del vector pRP 2012 y de . la estructura A-B siguiente, en la cual: A es : y B es Promotor doble TEV OTP Región codificante de la EPSPS Terminador nos histona como aquel utilizado en el vector pRPA-RD-173 El gen quimérico pRP 2012 es introducido en el tabaco . 1) Transformación: El vector se introduce en la cepa no oncogénica de Agroba c teri um EHA 101 (Hood y colaboradores, 1987) portadora del cósmido pTVK 291 (Komari y colaboradores, 1986) . La técnica de transformación está basada en el procedimiento de Horsh y colaboradores (1985) . 2) Regeneración: La regeneración del tabaco PBD6 (proveniente de SEITA Francia) a partir de explantes foliares se realiza sobre un medio de base Murashige y Skoog (MS) que comprende 30 g/1 de sacarosa así como 350 mg/1 de cefotaxima, y 1 mg/1 de isoxaflutol. Los explantes foliares son recogidos de las plantas en invernadero o in vitro transformadas de acuerdo a la técnica de discos foliares (Science 1985, Vol. 227, p. 1229-1231) en tres etapas sucesivas: la primera comprende la inducción de los brotes sobre un medio MS adicionado con 30 g/1 de sacarosa que contiene 0.05 mg/1 de ácido naftilacético (ANA) y 2 mg/1 de bencilaminopurina (BAP) durante 15 días y 1 mg/1 de isoxaflutol. Los brotes verdes formados en el transcurso de esta etapa son enseguida desarrollados mediante cultivos sobre un medio MS adicionado con 30 g/1 de sacarosa y 1 mg/1 de isoxaflutol, pero que no contiene hormona, durante 10 días. Después se recogen los brotes desarrollados y se les cultiva sobre un medio de enraizamiento MS a proporción media en sales, vitaminas y azúcares, y 1 mg/1 de isoxaflutol y que no contiene hormona. Al cabo de aproximadamente 15 días, los brotes enraizados se pasan a tierra. Todas las plántulas obtenidas de acuerdo a este protocolo son analizadas mediante PCR con los cebadores específicos de la HPPD de P . fl uorescens . Este análisis de PCR ha permitido confirmar que todas las plántulas obtenidas de este modo tienen bien integrado el gen dé la HPPD, y gue éstas son tolerantes a la vez al isoxaflutol y al glifosato, en las condiciones descritas en el ejemplo 7. En conclusión, este ensayo confirma que el gen de la HPPD puede ser utilizado como gen marcador y que, asociado a este gen, el isoxaflutol puede ser un buen agente de selección.

Ejemplo 9: Planta con un gen HPPD y un gen bar, resistente a la vez al isoxaflutol y a la fosfinotricina 1. Construcción de un gen quimérico con una secuencia HPPD: El plásmido pRPA-RD-1004 representado en la figura 4 es obtenido mediante inserción del gen quimérico de resistencia a los isoxazoles en el plásmido pUC 19 de 2686 pares de bases, comercializado por New England Biolabs (Yannish-Perron, C. Viera, J. y Massing, J. (1985) Gene 33, 103-119) y que contiene la resistencia a la ampicilina. Los diferentes elementos del gen quimérico son, en el sentido de la traducción: el promotor h'istona H3C4 del maíz de 1020 pares de bases, descritos en la solicitud Europea EP 0 507 698, el intrón del gen de la alcohol- deshidrogenasa 1 del maíz, descrito por Sachs M y colaboradores, Genetics 113: 449-467 (1986) y constituido de 536 pares de bases, el péptido de tránsito optimizado (OTP) descrito en la solicitud de patente Europea EP 0 508 909; este OTP está constituido de 171 pares de bases del péptido de tránsito de la pequeña subunidad de la Ribulosa-1, 5-bisfosfato-carboxilasa/oxigenasa de Heli an thus annus (Waksman G. y colaboradores 1987 Nucleics acids Res. 15: 7181) seguidos por 66 pares de bases de la parte madura de la pequeña subunidad de la Ribulosa-1 , 5-bisfosfato-carboxilasa/oxigenasa de Zea mays (Lebrun y colaboradores 1987. Nucleics acids Res. 15: 4360) éstas seguidas de los 150 pares de bases del péptido de tránsito de la pequeña subunidad de la Ribulosa-1 , 5-bisfosfato-carboxilasa/oxigenasa de Zea mays (Lebrun y colaboradores 1987, Nucleics acids res. 15: 4360); formando el conjunto 387 pares de bases; la región codificante de la HPPD de Pseudomonas fl uorescens descrita anteriormente ; el terminador del gen de la nopalin-sintasa (nos) (zona de poliadenilación del gen nos aislado de pTi 37, de 250 pares de bases (Bevan M. y colaboradores Nucleics Acids Res, 11: 369-385) ; 2. Construcción de un gen quimérico de tolerancia a la fosfinotricina (gen bar) : La fosfinotricina-acetiltransferasa (PAT) codificada por el gen bar, e s una enzima que inactiva un herbicida, la fosfinotricina (PPT) . La PPT inhibe la síntesis de la glutamina y provoca una acumulación rápida del amoniaco en las células, lo gue conduce a su muerte (Tachibana y colaboradores 1986) . El plásmido utilizado para introducir la tolerancia a la fosfinotricina como agente de selección, se obtiene por inserción del gen quimérico pDM 302 en el vector pSP72 de 2462 pares de bases, comercializados por Promega Corp. (base de datos Genbank/DDBJ, número de acceso X65332) y gue contiene el gen de resistencia a la ampicilina. El plásmido pDM 302 de 4700 pares de bases ha sido descrito por Cao., J., y colaboradores, Plant Cell Report 11; 586-591 (1992) .

Los diferentes elementos de este plásmido son : el promotor del gen de actina de arroz descrito por Me Elroy D. y colaboradores, Plant Molecular Biology 15: 257-268 (1990) constituido de 840 pares de bases; el primer exón del gen de actina de arroz constituido de 80 pares de bases; el primer intrón del gen de lactina de arroz constituido de 450 pares de bases; la región codificante del gen bar de 600 pares de bases extirpado del plásmido pIJ41404 descrito por White J. y colaboradores Nuc. Acids res 18: 1862 (1990) ; el terminador del gen de la nopalin-sintasa (nos) (zona de poliadenilación del gen nos aislado de pTi37, de 250 pares de bases (Bevan M. y colaboradores, Nucleics Acids Res . 11: 369-385) . 3. Transformación: La técnica 'de bombardeo se utiliza para introducir la construcción genética. Los plásmidos son purificados sobre la columna Qiagen y coprecipitados sobre partículas de tungsteno MÍO de acuerdo al procedimiento Klein (Nature 327: 70-73, 1987) . Una mezcla de partículas metálicas y de los dos plásmidos descritos anteriormente, se bombardea enseguida sobre las células embriógenas de maíz de acuerdo al protocolo. 4. Regeneración y utilización del gen bar como agente de selección: Los callos bombardeados son seleccionados sobre el glufosinato hasta la aparición de sectores verdes. Los cambios positivos son luego convertidos en embriones somáticos después se ponen en las condiciones que favorecen la germinación. Las plantas jóvenes son transferidas al invernadero para la producción de granos. Los análisis moleculares realizados sobre estas plantas muestran que: al menos 4 callos seleccionados sobre fosfinotricina han engendrado plantas que revelan la presencia del gen del HPPD mediante PCR; al menos 5 ' callos seleccionados sobre fosfinotricina han engendrado plantas que revelan la presencia del gen del HPPD mediante manchado de Southern; - al menos 5 callos seleccionados sobre fosfinotricina han engendrado plantas gue revelan la presencia de la proteína recombinante mediante manchado de Western; el gen quimérico del HPPD y la proteína heteróloga están ausentes de los callos no transformados . Estos resultados muestran la eficacia del gen quimérico bar para la selección de los callos transformados que contienen otro gen de interés agronómico .

. Análisis de la descendencia de las plantas transformadas: Las plantas transformadas obtenidas anteriormente han emitido polen supuestamente transgénico parcialmente, que ha fecundado óvulos de maíz silvestre no transgénico. Los granos obtenidos son seleccionados sobre arena después del tratamiento con isoxaflutol. El' protocolo de selección es el siguiente : 800 ml de" arena de Fontainebleau son colocados en una caja de 15 x 20 cm de lado. Estas cajas son luego rociadas con agua y ahora hidratadas con aporte de una solución nutritiva constituida de 5 ml de Quinoligo (quinoleína) por litro de agua. Son colocados veinte granos de maíz sobre las cajas, que son luego tratados con isoxaflutol mediante pulverización a razón de 100 a 200 gramos de materia activa por hectárea (300 ó 600 µg de material activo por caja) . Las cajas son enseguida colocadas en cultivo en el invernadero.

Los resultados obtenidos se presentan en la siguiente tabla: íotipos : Isoxaflutol número de número de número de número de (g/ha) granos plantas plantas plantas sembrados germinadas muertas sobrevivientes no 0 20 20 0 20 transgénico 100 20 20 20 0 261 2B 459 100 10 10 5 5 200 10 9 4 5 261 2D2 100 10 9 6 3 200 10 10 7 3 261 2A2 100 10 5 3 2 200 10 7 7 0 Estos resultados muestran la eficacia del gen de HPPD para la selección de las plantas resistentes del maíz. Éstos muestran también que la sobreexpresión del HPPD de Pseudomonas en los tejidos de maíz les confiere la tolerancia al isoxaflutol.

Se ilustran las siguientes secuencias: SEQ ID. N° 1 Secuencia del gen de la HPPD de Pseudomonas Fl uorescens A32.

SEQ ID N° 2 Secuencia del ADNc de la EPSPS de Arabi dopsi s thaliana SEQ ID N° 3 y 4 Secuencias respectivamente del gen y de la proteína de la EPSPS del maíz mutado, parte 1340 pares de bases del clon pRPA-ML-716 SEQ ID N° 5 y SEQ ID N° 6 secuencias respectivamente del gen y de la proteína de la EPSP? del maíz mutado, parte 1340 pares de bases del clon pRPA-ML-720 Las figuras siguientes se dan a manera indicativa para ilustrar la invención.

La Figura 1 representa la secuencia proteica de la HPPD de . Pseudomona s sp . cepa P.J. 874 y la secuencia nucleotídica teórica de la parte codificante correspondiente; los cinco oligonucleótidos elegidos para hacer la amplificación de una parte de esta región codificante, están simbolizados por las cinco flechas.

La Figura 2 representa la cartografía o mapa del plásmido con el fragmento de ADN genómico de 7 kb, gue contiene el gen de la HPPD de P. l uorescens A32.

La Figura 3 da la comparación de las secuencias de aminoácidos de la HPPD de P . fl uorescen s A32 y de la HPPD de Pseudomonas sp cepa P.J. 874 (solamente se indican los aminoácidos divergentes entre las dos secuencias) así como la secuencia de consenso.

LISTADO DE SECUENCIAS S?Cj ID NO: ATGGCAGATC TATACGAAAA CCCAATGGGC CTGATGGGCT TTGAATTCAT CGAATTCGCG 60 tcGCCGAcsc CGGGTACCCT GGAGCCGATC TTCGAGATCA TGGGCTTCAC CAAAGTCGCG 120 CCAAGAACGT GCACCTGTAC CGCCAGGGCG AGATCAACCT GATCCTCAAC 180 AACGAGCCCA ACAGCATCGC CTCCTACTTT GCGGCCGAAC ACGGCCCGTC GGTGTGCGGC 240 ATGGCGTTCC GCGTGAAGGA CTCGCAAAAG GCCTACAACC GCGCCCTGGA ACTCGGCGCC 300 CAGCCGATCC ATATTGACAC CGGGCCGATG GAATTGAACC TGCCGGCGAT CAAGGGCATC 360 GGCGGCGCGC CGTTGTACCT GATCGACCGT TTCGGCGAAG GCAGCTCGAT CTACGACATC 420 - GACTTCGTGT ACCTCGAAGG TGTGGAGCGC AATCCGGTCG GTGCAGGTCT CAAAGTCATC 480 GACCACCTGA CCCACAACGT CTATCGCGGC CGCATGGTCT ACTGGGCCAA CTTCTACGAG 540 AAATTGTTCA ACTTCCGTGA AGCGCGTTAC TTCGATATCA AGGGCGAGTA CACCGGCCTG 600 ACTTCCAAGG CCA7GAG7GC GCCGGACGGC ATGATCCGCA TCCCGCTGAA CGAAGAGTCG 660 TCCAAGGGCG CGGGGCAGAT CGAAGAGTTC CTGATGCAGT TCAACGGCGA AGGCATCCAG 720 CACGTGGCGT TCCTCACCGA CGACCTGGTC AAGACCTGGG ACGCGTTGAA GAAAATCGGC 780 ATGCGCTTC? TGACCGCGCC GCCAGACACT TATTACGAAA TGCTCGAAGG CCGCCTGCCT 840 GACCACGGCG AGCCGGTGGA TCAACTGCAG GCACGCGGTA TCCTGCTGGA CGGATCTTCC 900 GTGGAAGGCG ACAAACGCCT GCTGCTGCAG ATCTTCTCGG AAACCCTGAT GGGCCCGGTG ' 960 TTC7TCGAAT TCATCCAGCG CAAGGGCGAC GATGGGTTTG GCGAGGGCAA CTTCAAGGCG 1020 CTGTTCGAGT CCATCGAACG TGACCAGGTG CGTCGTGGTG TATTGACCGC CGATTAA 1077 SEQ ID NO: 2: AATCAATTTC ACACAGGAAA CAGCTATGAC CATGATTACG AATTCGGGCC CGGGCGCGTG 60 ATCCGGCGGC GGCAGCGGCG GCGGCGGTGC AGGCGGGTGC CGAGGAGATC GTGCTGCAGC 120 CCATCAAGGA GATCTCCGGC ACCGTCAAGC TGCCGGGGTC CAAGtCGCTT TCCAACCGGA 180 TCCTCCTACT csccscccTG TCCGAGGGGA CAACAGTGGT TGATAACCTG CTGAACAGTG 240 AGGATGTCCA CTACATGCTC GGGGCCTTGA GGACTCTTGG TCTCTCTGTC GAAGCGGACA 300 AAGCTGCCAA AAGAGCTGTA GTTGTTGGCT GTGGTGGAAA GTTCCCAGTT GAGGATGCTA 360 AAGAGGAAGT GCAGCTCTTC TTGGGGAATG CTGGAACTGC AATGCGGCCA TTGACAGCAG 420 CTGTTACTGC TGCTGGTGGA AATGCAACTT ACGTGCTTGA TGGAGTACCA AGAATGAGGG 480 AGAGACCCAT TGGCGACTTG GTTGTCGGAT TGAAGCAGCT TGGTGCAGAT GTTGATTsTT 540 TCCTTGGCAC TGACTGCCCA CCTGTTCGTG TCAATGGAAT CGGAGGGCTA CCTGGTGGCA 600 AGGTCAAGCT GTCTGGCTCC ATCAGCAGTC AGTACTTGAG TGCCTTGCTG ATGGCTGCTC 660 CTTTGGCTCT TGGGGATGTG GAGATTGAAA TCATTGATAA ATTAATCTCC ATTCCGTACG 720 TCGAAATGAC ATTGAGATTG ATGGAGCGTT TTGGTGTGAA AGCAGAGCAT TCTGATAGCT 780 GC-GACAGATT CTACAT AAG GGAGGTCAAA AATACAAGTC CCCTAAAAAT GCCTATGTTG 840 AAGGTGATGC CTCAAGCGCA AGCTATTTCT TGGCTGGTGC TGCAATTACT GGAGGGACTG 900 TGACTGTGGA AGGTTGTGGC ACCACCAGTT TGCAGGGTGA TGTGAAGTTT GCTGAGGTAC 960 TGGAGATGAT GGGAGCGAAG GTTACATGGA CCGAGACTAG CGTAACTGTT ACTGGCCCAC 1020 CGCGGGAGCC ATTTGGGAGG AAACACCTCA AGGCGATTGA TGTCAACATG AACAAGATGC 1080 CTGATGTCGC CATGACTCTT GCTGTGGTTG CCCTCTTTGC CGATGGCCCG ACAGCCATCA 1140 C-AGACGTGGC TTCCTGGAGA GTAAAGGAGA CCGAGAGGAT GGTTGCGATC CGGACGGAGC 1200 TAACCAAGCT GGGAGCATCT G TGAGGAAG GGCCGGACTA CTGCATCATC ACGCCGCCGG 1260 AGAAGCTGAA CGTGACGGCG ATCGACACGT ACGACGACCA CAGGATGGCC ATGGCCTTCT 1320 CCCTTGCCGC CTGTGCCGAG GTCCCCGTCA CCATCCGGGA CCCTGGGTGC ACCCGGAAGA 1380 CCTTCCCCGA CTACTTCGAT GTGCTGAGCA CTTTCGTCAA GAATTAATAA AGCGTGCGAT 1440 ACTACCACGC AGCTTGATTG AAGTGATAGG CTTGTGCTGA GGAAATACAT TTCTTTTGTT 1500 CTGTTTTTCT CTTTCACGGG ATTAAGTTTT GAGTCTGTAA CGTTAGTTGT TTGTAGCAAG ' 1560 TTTCTATTTC GGATCTTAAG TTTGTGCACT GTAAGCCAAA TTTCATTTCA AGAGTGGTTC 1620 GTTGGAATAA TAAGAATAAT AAATTACGTT TCAGTGAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 1680 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AACCCGGGAA TTC . 1713 SEQ XD NO : 3 : CCATG GCC GGC GCC GAO GAG ATC GTG CTG CAG CCC ATC AAG GAG ATC 47 Ala Gly Ala Glu Glu lie Val Leu Gln Pro lie Lys Glu lia 1 5 10 TCC GGC ACC GTC AAG CTG CCG GGG TCC AAG TCG CTT TCC AAC CGG ATC 95 Ser Gly Thr Val Lys Leu Pro Gly Ser Lys Ser Leu Ser Asn Arg lie 15 20 25 30 CTC CTA CTC GCC GCC CTG TCC GAG GGG ACÁ ACÁ GTG GTT GAT AAC CTG 143 úeu Leu Leu Ala Ala L^su Ser Glu Gly Thr Thr Val Val Asp Asn Leu 35 40 45 CTG AAC AGT GAG GAT GTC CAC TAC ATG CTC GGG GCC TTG AGG ACT CTT 191 Leu Asn Ser Glu Asp Val His Tyr Met Leu Gly Ala Leu Arg Thr Leu 50 55 60 GGT CTC TCT GTC GAA GCG GAC AAA GCT GCC AAA AGA GCT GTA GTT GTT 239 Gly Leu Ser Val Glu Ala Asp Lys Ala Ala Lys Arg Ala Val Val Val 65 70 75 GGC TGT GGT GGA AAG TTC CCA OTT GAG GAT GCT AAA GAG GAA GTG CAG 287 Gly Cvs Gly Gly Lys Phe Pro Val Glu Asp Ala Lys Glu Glu Val Gln 80 85 90 CTC TTC TTG GGG AAT GCT GGA ACT GCA ATG CGG CCA TTG ACÁ GCA GCT 335 Leu Phe Leu Gly Asn Ala Gly Thr Ala Met Arg Pro Leu Thr Ala Ala 95 100 105 110 GTT ACT GCT GCT GGT GGA AAT GCA ACT TAC GTG CTT GAT GGA GTA CCA 383 Val Thr Ala Ala Gly Gly Asn Ala Thx Tyr Val Leu Asp Gly Val Pro 115 120 125 AGA ATG AGG GAG AGA CCC ATT GGC GAC TTG GTT GTC GGA TTG AAG CAG 431 Arg Met Arg Glu Arg Pro lie Gly Asp Leu Val Val Gly Leu Lys Gln 130 135 140 CTT GGT GCA GAT GTT GAT TGT TTC CTT GGC ACT GAC TGC CCA CCT GTT 479 Leu Gly Ala Asp Val Asp Cys Phe Leu Gly Thr Asp Cys Pro Pro Val 145 150 155 CGT GTC AAT GGA ATC GGA GGG CTA CCT GGT GGC AAG GTC AAG CTG TCT 527 Arg Val Asn Gly lie Gly Gly Leu Pro Gly Gly Lys Val Lys Leu Ser 160 165 170 GGC TCC ATC AGC AGT CAG TAC TTG AGT GCC TTG CTG ATG GCT GCT CCT 575 Gly Ser lie Ser Ser Gln Tyr Leu Ser Ala Leu Leu Met Ala Ala Pro 175 180 185 190 TTG scr CTT sss GAT GTG GAG ATT GAA ATC ATT GAT AAA TTA ATC TCC 623 Leu Ala Leu Gly Asp Val Glu lie Glu He He Asp Lys Leu He Ser 195 200 205 ATT CCG TAC GTC GAA ATG ACÁ TTG AGA TTG ATG GAG CGT TTT GGT GTG 671 He Pro Tyr Val Glu Met Thr Leu Arg Leu Met Glu Arg Phe Gly Val 210 215 220 AAA GCA GAG CAT TCT GAT AGC TGG GAC AGA TTC TAC ATT AAG GGA GGT 719 Lys Ala Glu His Ser Asp Ser Trp Asp Arg Phe Tyr He Lys Gly Gly 225 230 235 CAÁ AAA TAC AAG TCC CCT AAA AAT GCC TAT GTT GAA GGT GAT GCC TCA 767 Gln Lys Tyr Lys Ser Pro Lys Asn Ala Tyr Val Glu Gly Asp Ala Ser 240 245 250 SEQ ID NO: 3 (continuación) AGC GCA AGC TAT TTC TTG GCT GGT GCT GCA ATT ACT GGA GGG ACT GTG 815 Ser Ala Ser Tyr Phe Leu Ala Gly Ala Ala lie Thr Gly Gly Thr Val 255 260 265 270 ACT GTG GAA GGT TGT GGC ACC ACC AGT TTG CAG GGT GAT GTG AAG TTT 863 Thr Val Glu Gly Cys Gly Thr Thr Ser Leu Gln Gly Asp Val Lys Phe 275 280 285 GCT GAG GTA CTG GAG ATG ATG GGA GCG AAG GTT ACÁ TGG ACC GAG ACT 911 Ala Glu Val Leu Glu Met Met Gly Ala Lys Val Thr Trp Thr Glu Thr 290 295 300 AGC GTA ACT GTT ACT GGC CCA CCG CGG GAG CCA TTT GGG AGG AAA CAC 959 Ser Val Thr Val Thr Gly Pro Pro Arg Glu Pro Phe Gly Arg Lys His 305 310 315 CTC AAG GCG ATT GAT GTC AAC ATG AAC AAG ATG CCT GAT GTC GCC ATG 1007 Leu Lvs Ala He Aep Val Asn Met Asn Lys Met Pro Asp Val Ala Met 320 325 330 ACT CTT GCT GTG GTT GCC CTC TTT GCC GAT GGC CCG ACÁ GCC ATC AGA 1055 Thr Leu Ala Val Val Ala Leu Phe Ala Asp Gly Pro Thr Ala He Arg 335 340 345 350 GAC GTG GCT TCC TGG AGA GTA AAG GAG ACC GAG AGG ATG GTT GCG ATC 1103-Asp Val Ala Ser Tro Arg Val Lys Glu Thr Glu Arg Met Val Ala He 355 360 365 CGG ACG GAG CTA ACC AAG CTG GGA GCA TCT GTT GAG GAA GGG CCG GAC 1151 Arg Thr Glu Leu Thr Lys Leu Gly Ala Ser Val Glu Glu Gly Pro Asp 370 375 380 TAC TGC ATC ATC ACG CCG CCG GAG AAG CTG AAC GTG ACG GCG ATC GAC 1199 Tyr Cys He He Thr Pro Pro Glu Lys Leu Asn Val Thr Ala He Asp 385 390 395 ACG TAC GAC GAC CAC AGG ATG GCC ATG GCC TTC TCC CTT GCC GCC TGT 1247 Thr Tyr Asp Asp HiS Arg Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys 400 405 410 GCC GAG GTC CCC GTC ACC ATC CGG GAC CCT GGG TGC ACC CGG AAG ACC 1295 Ala Glu Val Pro Val Thr He Arg Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys Thr 415 420 425 430 TTC CCC GAC TAC TTC GAT GTG CTG AGC ACT TTC GTC AAG AAT 1337 Phe Pro Asp Tyr Phe Asp Val Leu Ser Thr Phe Val Lys Asn 435 - 440 TAA 1340 SEQ ID NO: 4: Ala Gly Ala Glu Glu l e Val Leu Gln Pro He Lys Glu He Ser Gly 1 5 10 15 Thr Val Lys Leu Pro Gly Ser Lys Ser Leu Ser Asn Arg He Leu Leu 20 25 30 Leu Ala Ala Leu Ser Glu Gly Thr Thr Val Val Asp Asn Leu Leu Asn 35 40 45 Ser Glu Asp Val His Tyr Met Leu Gly Ala Leu Arg Thr Leu Gly Leu 50 55 60 Ser Val Glu Ala Asp Lys Ala Ala Lys Arg Ala Val Val Val Gly Cys 65 70 75 80 Gly Gly Lys Phe Pro Val Glu Asp Ala Lys Glu Glu Val Gln Leu Phe 85 90 95 Leu Gly Asn Ala Gly Thr Ala Met Arg Pro Leu Thr Ala Ala Val Thr 100 105 110 • Ala Ala Gly Gly Asn Ala Thr Tyr Val Leu Aso Gly Val Pro Arg Met 115 120 125 Arg Glu Arg Pro He Gly Asp Leu Val Val Gly Leu Lys Gln Leu Gly 130 135 140 Ala Asp Val Asp Cys Phe Leu Gly Thr Asp Cys Pro Pro Val Arg Val 145 150 155 160 Asn Gly He Gly Gly Leu Pro Gly Gly Lys Val Lys Leu Ser Gly Ser 165 170 175 He Ser Ser Gln Tyr Leu Ser Ala Leu Leu Met Ala Ala Pro Leu Ala 180 185 190 Leu Gly Asp Val Glu He Glu He He Asp Lys Leu He Ser He Pro 195 200 205 Tyr Val Glu Met Thr Leu Arg Leu Met Glu Arg Phe Gly Val Lys Ala 210 215 220 Glu His Ser Asp Ser Trp Asp Arg Phe Tyr He Lys Gly Gly Gln Lys 225 230 235 240 Tyr Lys Ser Pro Lys Asn Ala Tyr Val Glu Gly Asp Ala Ser Ser Ala 245 250 255 Ser Tyr Phe Leu Ala Gly Ala Ala He Thr Gly Gly Thr Val Thr Val 260 265 270 Glu Gly Cys Gly Thr Thr Ser Leu Gln Gly Asp Val Lys Phe Ala Glu 275 280 285 Val Leu Glu Met Met Gly Ala Lys Val Thr Trp Thr Glu Thr Ser Val 290 295 300 Thr Val Thr Gly Pro Pro Arg Glu Pro Phe Gly Arg Lys His Leu Lys 305 310 315 320 Ala He Asp Val Asn Met Asn Lys Met Pro Asp Val Ala Met Thr Leu 325 330 335 Ala Val Val Ala Leu Phe Ala Asp Gly Pro Thr Ala He Arg Asp Val 340 345 350 SEQ ID NO: 4 ( continuación) Ala Ser Trp Arg Val Lys Glu Thr Glu Arg Met Val Ala He Arg Thr 355 360 365 Glu Leu Thr Lys Leu Gly Ala Ser Val Glu Glu Gly Pro Asp Tyr Cys 370 375 380 He He Thr Pro Pro Glu Lys Leu Asn Val Thr Ala He Asp Thr Tyr 385 390 395 400 Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys Ala Glu 405 _, 410 415 Val Pro Val Thr He Arg Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys Thr Phe Pro 420 425 430 Asp Tyr Phe Asp Val Leu Ser Thr Phe Val Lys Asn 435 440 SEQ ID NO: 5: CCATG GCC GC-C GCC GAG GAG ATC GTG CTG CAG CCC ATC AAG GAG ATC 47 Ala Gly Ala Glu Glu He Val Leu Gln Pro He Lys Glu He 1 5 ?o TCC GGC ACC GTC AAG CTG CCG GGG TCC AAG TCG CTT TCC AAC CGG ATC 95 Ser Gly Thr Val Lys Leu Pro Gly Ser Lys Ser Leu Ser Asn Arg He 15 20 25 30 CTC CTA CTC GCC GCC CTG TCC GAG GGG ACÁ ACÁ GTG GTT GAT AAC CTG 143 Leu Leu Leu Ala Ala Leu Ser Glu Gly Thr Thr Val Val Asp Asn Leu 35 0 45 CTG AAC AGT GAG GAT GTC CAC TAC ATG CTC GGG GCC TTG AGG ACT CTT L91 Leu Asn Ser Glu Asp Val His Tyr Met Leu Gly Ala Leu Arg Thr Leu 50 55 60 GGT CTC TCT GTC GAA GCG GAC AAA GCT GCC AAA AGA GCT GTA GTT GTT 239 Gly Leu Ser Val Glu Ala Asp Lys Ala Ala Lys Arg Ala Val Val Val 65 70 75 GGC TC-T GGT GGA AAG TTC CCA GTT GAG GAT GCT AAA GAG GAA GTG CAG 287 Gly Cys Gly Gly Lys Phe Pro Val Glu Asp Ala Lys Glu Glu Val Gln SO 85 90 CTC TTC TTG GGG AAT GCT GGA ATC GCA ATG CGG TCC TTG ACÁ GCA GCT 335 Leu Phe Leu Gly Asn Ala Gly He Ala Met Arg Ser Leu Thr Ala Ala 95 100 105 110 GTT ACT GCT GCT GGT GGA AAT GCA ACT TAC GTG CTT GAT GGA GTA CCA 383 Val Thr Ala Ala Gly Gly Asn Ala Thr Tyr Val Leu Asp Gly Val Pro 115 120 125 AOA ATG AGG GAG AGA CCC ATT GGC GAC TTG GTT GTC GGA TTG AAG CAG 431 Arg Met Arg Glu Arg Pro He Gly Asp Leu Val Val Gly Leu Lys Gln 130 135 140 CTT GGT GCA GAT GTT GAT TGT TTC CTT GGC ACT GAC TGC CCA CCT GTT 479 Leu Gly Ala Asp Val Asp Cys Phe Leu Gly Thr Asp Cys Pro Pro Val 145 150 155 CGT GTC AAT GGA ATC GGA GGG CTA CCT GGT GGC AAG GTC AAG CTG TCT 527 Arg Val Asn Gly He Gly Gly Leu Pro Gly Gly Lys Val Lys Leu Ser 160 165 170 GGC TCC ATC AGC AGT CAG TAC TTG AGT GCC TTG CTG ATG GCT GCT CCT 575 Gly Ser He Ser Ser Gln Tyr Leu Ser Ala Leu Leu Met Ala Ala Pro 175 180 185 190 TTG GCT CTT GGG GAT GTG GAG ATT GAA ATC ATT GAT AAA TTA ATC TCC 623 Leu Ala Leu Gly Asp Val Glu He Glu He He Asp Lys Leu He Ser 195 200 205 ATT CCG TAC GTC GAA ATG ACÁ TTG AGA TTG ATG GAG CGT TTT GGT GTG 671 He Pro Tyr Val Glu Met Thr Leu Arg Leu Mee Glu Arg Phe Gly Val 210 215 220 AAA GCA GAG CAT TCT GAT AGC TGG GAC AGA TTC TAC ATT AAG GGA GGT 719 Lys Ala Glu His Ser Asp Ser Trp Asp Arg Phe Tyr He Lys Gly Gly 225 230 235 CAÁ AAA TAC AAG TCC CCT AAA AAT GCC TAT GTT GAA GGT GAT GCC TCA 767 Gln Lys Tyr Lys Ser Pro Lys Asn Ala Tyr Val Glu Gly Asp Ala Ser 240 245 250 SEQ ID NO: 5 (continuación) AGC GCA AGC TAT TTC TTG GCT GGT GCT GCA ATT ACT GGA GGG ACT GTG 815 Ser Ala Ser Tyr Phe Leu Ala Gly Ala Ala He Thr Gly Gly Thr Val 255 260 265 270 ACT GTG GAA GGT TGT GGC ACC ACC AGT TTG CAG GGT GAT GTG AAG TTT 863 Thr Val Glu Gly Cys Gly Thr Thr Ser Leu Gln Gly Asp Val Lys Phe 270 275 280 285 GCT GAG GTA CTG GAG ATG ATG GGA GCG AAG GTT ACÁ TGG ACC GAG ACT 911 Ala Glu Val Leu Glu Met Met Gly Ala Lys Val Thr Trp Thr Glu Thr 290 295 300 AGC GTA ACT GTT ACT GGC CCA CCG CGG GAG CCA TTT GGG AGG AAA CAC 959 Ser Val Thr Val Thr Gly Pro Pro Arg Glu Pro Phe Gly Arg Lys His 305 310 315 CTC AAG GCG ATT GAT GTC AAC ATG AAC AAG ATG CCT GAT GTC GCC ATG 1007 Leu Lys Ala He Asp Val Asn Met Asn Lys Met Pro Asp Val Ala Met 320 325 330 ACT CTT GCT GTG GTT GCC CTC TTT GCC GAT GGC CCG ACÁ scc ATC AGA 1055 Thr Leu Ala Val Val Ala Leu Phe Ala Asp Gly Pro Thr Ala He Arg 335 340 345 350 GAC GTG GCT TCC TGG AGA GTA AAG GAG ACC GAG AGG ATG GTT GCG ATC 1103 Asp Val Ala Ser Trp Arg Val Lys Glu Thr Glu Arg Met Val Ala He 355 360 365 CGG ACG GAG CTA ACC AAG CTG GGA GCA TCT GTT GAG GAA GGG CCG GAC 1151 Arg Thr Glu Leu Thr Lys Leu Gly Ala Ser Val Glu Glu Gly Pro Asp 370 375 380 TAC TGC ATC ATC ACG CCG CCG GAG AAG CTG AAC GTG ACG GCG ATC GAC 1199 Tyr Cys He He Thr Pro Pro Giu Lys Leu Asn Val Thr Ala He Asp 385 390 395 ACG TAC GAC GAC CAC AGG ATG GCG ATG GCC TTC TCC CTT scc GCC TGT 1247 Thr Tyr Asp Asp His Arg Mee Alá Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys 400 405 410 GCC GAG GTC CCC GTC ACC ATC CGG GAC CCT GGG TGC ACC CGG AAG ACC 1295 Ala Glu Val Pro Val Thr He Arg Asp Pro Gly Cys ThX Arg Lys Thr 415 420 425 430 TTC CCC GAC TAC TTC GAT GTG CTG AGC ACT TTC GTC AAG AAT 1337 Phe Pro Asp Tyr Phe Asp Val Leu Ser Thr Phe Val Lys Asn 435 440 TAA 1340 SEQ ID NO : 6 : Ala Gly Ala Glu Glu He Val Leu Gln Pro He Lys Glu He Ser Gly 1 5 10 15 Thr Val Lys Leu Pro Gly Ser Lys Ser Leu Ser Asn Arg He Leu Leu 20 25 30 Leu Ala Ala Leu Ser Glu Gly Thr Thr Val Val Asp Asn Leu Leu Asn 35 40 45 Ser Glu Aso Val HAS Tyr Met Leu Gly Ala Leu Arg Thr Leu Gly Leu 50 55 60 Ser Val Glu Ala Asp Lys Ala Ala Lys Arg Ala Val Val Val Gly Cys 65 70 75 80 Gly Gly Lys Phe Pro Val Glu Asp Ala Lys Glu Glu Val Gln Leu Phe 85 90 95 Leu Gly Asn Ala Gly He Ala Met Arg Ser Leu Thr Ala Ala Val Thr 100 105 110 Ala Ala Gly Gly Asn Ala Thr Tyr Val Leu Asp Gly Val Pro Arg Met 115 120 125 Arg Glu Arg Pro He Gly Asp Leu Val Val Gly Leu Lys Gln Leu Gly 130 135 140 Ala Asp Val Asp Cys Phe Leu Gly Thr Asp Cys Pro Pro Val Arg Val 145 150 155 160 Asn Gly He Gly Gly Leu Pro Gly Gly Lys Val Lys Leu Ser Gly Ser 165 170 175 He Ser Ser Gln Tyr Leu Ser Ala Leu Leu Met Ala Ala Pro Leu Ala 180 185 190 Leu Gly Asp Val Glu He Glu He He Asp Lys Leu He Ser He Pro 195 200 205 Tyr Val Giu Met Thr Leu Arg Leu Met Glu Arg Phe Gly Val Lys Ala 210 215 220 Glu His Ser Asp Ser Trp Asp Arg Phe Tyr He Lys Gly Gly Gln Lys 225 230 235 240 Tyr Lys Ser Pro Lys Asn Ala Tyr Val Glu Gly Asp Ala Ser Ser Ala 245 250 255 ser Tyr Phe Leu Ala Gly Ala Ala He Thr Gly Gly Thr Val Thr Val 260 265 270 Glu Gly Cys Gly Thr Thr Ser Leu Gln Gly Asp Val Lys Phe Ala Glu 275 280 285 Val Leu Glu Met Met Gly Ala Lys Val Thr Trp Thr Glu Thr Ser Val 290 295 300 Thr Val Thr Gly Pro Pro Arg Glu Pro Phe Gly Arg Lys His Leu Lys 305 310 315 320 Ala He Asp Val Asn Met Asn Lys Met Pro Asp Val Ala Met Thr Leu 325 330 335 Ala Val Val Ala Leu Phe Ala Asp Gly Pro Thr Ala He Arg Asp Val 340 345 350 SEQ ID NO: 6 ( continuación) Ala Ser Trp Arg Val Lys Glu Thr Glu Arg Met Val Ala He Arg Thr 355 360 365 Glu Leu Thr Lys Leu Gly Ala Ser Val Glu Glu Gly Pro Asp Tyr Cys 370 375 380 lie lie Thr Pro Pro Glu Lys Leu Asn Val Thr Ala He Asp Thr Tyr 385 390 395 400 Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys Ala Glu 405 410 _ 415 Val Pro Val Thr He Arg Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys Thr Phe Pro 420 425 430 Asp Tyr Phe Asp Val Leu Ser Thr Phe Val Lys Asn 435 440 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el gue resulta claro de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:

Claims (35)

REIVINDICACIONES

1. Una construcción quimérica que comprende al menos dos genes quiméricos elementales, que comprende cada uno los elementos de regulación necesarios para su transcripción en las plantas o vegetales, y una secuencia codificante que codifica para una enzima que confiere a las plantas la tolerancia a un herbicida, caracterizada la construcción porque una de las secuencias codificantes codifica para una hidroxifenil-piruvato-dioxigenasa (HPPD) .

2. La construcción quimérica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque ésta comprende además un 'tercer gen quimérico elemental que contiene una secuencia que codifica para una enzima que confiere a las plantas una tolerancia herbicida .

3. La construcción quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque la segunda secuencia codificante es proveniente de un gen de la nitrilasa Kl ebsi ell a sp . que confiere una tolerancia a un herbicida de la familia de los dihalogenohidroxibenzonitrilos .

4. La construcción quimérica de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el herbicida es el bromoxinilo.

5. La construcción quimérica de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el herbicida es ióxinilo.

6. La construcción quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque la segunda secuencia codificante codifica para una enzima de tolerancia al glifosato.

7. La construcción quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque la segunda secuencia codificante codifica para una EPSPS gue confiere una tolerancia a un herbicida inhibidor de la EPSPS.

8. La construcción quimérica de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque la segunda secuencia codificante codifica para una EPSPS que confiere una tolerancia al glifosato.

9. La construcción quimérica de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la segunda secuencia codificante codifica para la glifosato-oxidorreductasa, enzima de detoxificación del glifosato.

10. La construcción quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 9, caracterizada porque la secuencia codificante para la HPPD es proveniente de Pseudomonas sp .

11. La construcción quimérica de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque la secuencia codificante para la HPPD es proveniente de Pseudomonas fl uorescens .

12. La construcción quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 9, caracterizada porque la secuencia codificante para la HPPD es de origen vegetal.

13. La construcción quimérica de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque la secuencia codificante para la HPPD es proveniente de Arabidopsi s thaliana .

14. La construcción quimérica de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque la secuencia codificante para la HPPD es proveniente de Daucus carota .

15. Un vector, caracterizado porque comprende una construcción quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 14.

16. El vector de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque éste está constituido por un plásmido.

17. Una célula vegetal, caracterizada porque contiene al menos dos genes quiméricos elementales, que contienen cada uno una secuencia codificante que codifica para una enzima que confiere a las plantas la tolerancia a un herbicida, donde uno es un inhibidor de la hidroxifenil-piruvato-dioxigenasa (HPPD) .

18. La célula vegetal de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque ésta contiene tres genes guiméricos elementales, que contiene cada uno los elementos de regulación y una secuencia codificante que codifica para una enzima que confiere a las plantas la tolerancia a un herbicida.

19. La célula vegetal de conformidad con cualquiera de las reivindicacione's 17 y 18, caracterizada porque ésta contiene al menos una construcción quimérica, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 14.

20. Una planta, caracterizada porque contiene una célula vegetal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a la 19.

21. El procedimiento de transformación de las plantas para hacerlas tolerantes al menos a dos herbicidas, caracterizado el procedimiento porque se inserta en una célula vegetal una construcción guimérica de conformidad con las reivindicaciones 1 a la 14, y porgue las células transformadas son sometidas a una regeneración.

22. El procedimiento de Obtención de plantas con tolerancia herbicida múltiple de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque: en una primera etapa, se insertan varias células respectivamente, uno de los genes elementales gue contienen cada uno los elementos de regulación necesarios para su transcripción en las plantas, y una secuencia codificante que codifica para una enzima que confiere a las plantas la tolerancia a un herbicida, y porque las plantas son en seguida cruzadas para obtener plantas con tolerancia múltiple.

23. El procedimiento de tratamiento herbicida de las plantas de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque se aplican al menos dos herbicidas.

24. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque se aplican tres herbicidas.

25. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a la 24, caracterizado porque uno de los herbicidas es un inhibidor de la HPPD.

26. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a la 25, caracterizado porque los herbicidas son aplicados simultáneamente .

27. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque los herbicidas son aplicados bajo la forma de una sola composición lista para el empleo.

28. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque los' herbicidas son aplicados bajo la forma de una mezcla extemporánea .

29. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a la 25, caracterizado porque los herbicidas son aplicados sucesivamente .

30. El. procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a la 29, caracterizado porque el herbicida inhibidor de la HPPD es el isoxaflutol.

31. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a la 29, caracterizado porque el herbicida inhibidor de la HPPD es la sulcotriona.

32. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a la 31, caracterizado porque el segundo herbicida pertenece a la familia de los dihidrogenohidroxibenzonitrilos .

33. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porgue el herbicida es elegido del grupo gue comprende el bromoxinil y el ioxinilo .

34. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a la 33, caracterizado porque el segundo herbicida es un inhibidor de la EPSPS.

35. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el inhibidor de la EPSPS es el glifosato o el sulfosato.