MXPA97009732A - Vacuna que comprende un conjugado de antigeno depolisacarido proteina portadora y proteina portadora libre - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a vacunas de combinación comprendiendo un antígeno de polisacárido conjugado enlazado a una proteína portadora, y en donde la proteína portadora también estápresente como un antígeno libre en la composición de la vacula, carecterizada porque la proporción de la vacuan de la presente invención se refiere a una vacuna multivalente, que es una vacuna para el mejoramiento o trartamiento de más de un estado de infermedad. La presente invención también se refiere a la producción y uso de tal vacuna en medicina.

Description

VACUNA QUE COMPRENDE UN CONJUGADO DE ANTIGENO DE POLISACARIDO - PROTEINA PORTADORA Y PROTEINA PORTADORA LIBRE La presente invención se refiere a la combinación de vacu nas que comprenden u n antígeno de polisacárido conjugado u nido a una proteína portadora, y en donde la proteína portadora también está presente como un antígeno libre en la composición de la vacuna. En particular la composición de la vacuna de la presente invención se ref iere a una vacu na multivalente, es decir, u na vacuna para el mejoramiento o tratamiento de más de un estado de enf ermedad. La presente invención también se refiere a la producción y uso de tal vacuna en la medicina. Las vacunas que utilizan polisacáridos son conocidas en la técnica. Por ejemplo, una vacuna para la prevención de infecciones de Haemophilus influenzae b (Hib) se basan en el polisacárido capsular (PRP) conjugado con una proteína portadora. Normalmente la p roteína po rtadora es un toxoide de tétanos o difteria. También se ha sugerido producir u na vacuna para la prevención de Streptococcus pneumonía, que se basa en un polisacárido capsu lar conjugado a una proteína portadora, tal como toxoide de tétanos o toxoide de difteria. Ejemplos de tales antígenos de vacu na conjugados se describen en U S 4 365 1 70 U S 4 673 574 EP 208 375 EP 477508 y EP 1 61 1 88. Es deseable administrar tales vacunas conjugadas con otros antígenos o vacunas al mismo tiempo y esto puede involucrar mú ltiples inyecciones. Los problemas asociados con inyecciones m ú ltiples incluyen un procedimiento de administración más complicado y un volumen de inyección total grande. Este es un problema particularmente agudo cuando se pretende la vacuna para infantes. En consecuencia, se ha propuesto producir vacunas de combinación . Una vacuna de combinación bien conocida proporciona protección contra infecciones de difteria, tétanos y B. Pertussis. Esta vacuna comprende un componente (ya sea B. Pertussis de célula completa muerta o pertussis "accellular", el cual típicamente consiste de hasta tres antígenos - PT, FHA y 69kDa) y difteria de toxoide y toxina de tétanos. Tales vacunas frecuentemente son referidas como DTPw (célula completa) o DTPa ("accellular") . Sería deseable adicionar vacu nas de conjugado de polisacárido a tal combinación. S in embargo , hemos encontrado que la mezcla simple de los componentes resu lta en u na reducción de títulos para el componente de polisacárido y que la persistencia de niveles protectores de tales títulos de anticuerpo se reduce. Así, se ha observado qu e la inmu nogenicidad del polisacárido PRP Hib conjugado, para el toxoide de Tétanos desintóxicado (TT) disminuye en infantes inmunizados con el conjugado TT-PRP combinado con DTPa como se comparó con infantes inmunizados con conjugado TT-PRP y DTPa concomitantemente, pero en sitios separados . En la situ ación monovalente, es deci r, cuando una vacuna comprende solo un polisacárido simple (PS) conjugado con u na p rote ína portadora, mientras mayor sea el contenido de p rote ína del conju gado , mayor será la respuesta del anticuerpo al polisacárido . Esto se piensa que es debido a que la indu cción de u na respuesta de anticuerpo específ ico de polisacárido dependiente de célula T requ iere el acoplamiento covalente de un portador de proteína al polisacárido. El portador de proteína necesita estar presente a concentraciones (es decir, proporción de PS a proteína) de manera que se induzca una buena respuesta de células TH al portador, y que esta respuesta TH pueda reconocer péptidos que expresan clones de células B específicos de PS derivados de la proteína portadora acoplada de manera covalente. Normalmente, las vacunas monovalentes de la técnica anterior tienen una proporción de polisacárido: portador de proteína de 1:3 (peso:peso). De manera sorprendente y en completo contraste con la posición en la vacuna monovalente, los presentes inventores han descubierto que cuando el componente conjugado de polisacárido es parte de una vacuna multivalente comprendiendo una forma libre de la proteína portadora, la inmunogenicidad del componente de polisacárido es mejorada al reducir el contenido de proteína del antígeno conjugado. De conformidad, la presente invención proporciona una vacuna combinada que contiene un antígeno de polisacárido conjugado a una proteína portadora, y en donde la proteína portadora también está presente como un antígeno libre caracterizado porque la proporción de polisacárido a la proteína portadora es de aproximadamente 1:0.3 a 1:2. Una proporción preferida es 1:05 a 1:1.5, típicamente en el orden de 1:1. El conjugado polisacárido puede prepararse mediante cualquier técnica de acoplamiento conocida vía un enlace tioéter. Este método de conjugación depende de la activación del polisacárido con 1-ciano-4-dimetilamino piridinio tetrafluoroborato (CDAp) para formar un cianato éster. El polisacárido activado puede acoplarse de esta manera directamente o vía un grupo espaciador a un grupo amino en la proteína portadora. De preferencia, el cianato éster se acopla con hexano diamina y el polisacárido amino-derivado se conjuga con la proteína portadora usando química de heteroligación que involucra la formación del enlace tioéter. Tales conjugados se describen en la solicitud publicada de PCT 2093/15760 Uniformed Services University. Los conjugados también pueden ser preparados mediante métodos de aminación reductores directos como se describe en US 4365170 (Jennings) y US 4673574 (Anderson). Otros métodos se describen en EP-0-161-188, EP-208375 y EP-0-477508. Un método adicional involucra el acoplamiento de un polisacárido activado de cianogenbromuro derivado con un hidrazida ácido adípico (ADH) al portador de proteína mediante condesación carbodiimida (Chu c. Et al Infect. Immunity, 1983245256). De preferencia, la proteína portadora es un antígeno derivado de un Tétanos o Difteria preferiblemente toxoide de tétanos o toxoide de difteria. El portador también puede ser derivado de Bordetella. Típicamente el antígeno es un derivado no tóxico de una toxina de Tétanos o Difteria. De preferencia, las composiciones de la invención contienen un auxiliar adecuado. Un auxiliar preferido es MPL (3-deacilado monofosforil lípido A, también conocido como 3D-MPL). El 3D-MPL es conocido a partir de GB 2 220 211 (Ribi) como una mezcla de 3 De-O-acilado monofosforil lípido A con 4, 5 o 6 cadenas aciladas y es fabricado por Ribi Immunochem, Montana. Una forma preferida de MPL se describe en la Solicitud de Patente Internacional 92/116556.

Otro auxiliar, el cual puede ser usado en la presente invención es conocido como QS21. QS21 es una fracción no tóxica purificada Hplc de una saponina de la corteza del árbol sudamericano Quillaya saponaria molina y su método de producción está descrito (como QA21) en la patente estadounidense No.5,057,540. Las combinaciones de QS21 y 3 D-MPL son conocidas por producir una formulación de vacuna sinergísticamente efectiva y se describen en la solicitud de patente internacional WO 94/00153. Frecuentemente, las vacunas de componentes Hib de la invención no requerirán ningún portador específico, y serán formuladas en un acuoso o cualquier otro amortiguado farmacéuticamente aceptable. En algunos casos puede ser que la vacuna completa de la presente invención sea presentada en una emulsión aceite en agua, u otro vehículo adecuado, tales como por ejemplo, liposomas, microesferas o partículas de antígeno encapsuladas. Las formulaciones de vacunas pueden contener antígenos adicionales. Las composición antigénicas o antígenos conocidos en la técnica puede ser usados en las composiciones de la invención, incluyendo antígenos o composiciones antigénicas derivadas de HIV-1 (tal como gp120 o gp160), virus de herpes de animal o humano, tal como gD o derivados de los mismos o Immediate Early protein tales como ICP27 a partir de HSV1 o HSV2, citomegalovirus (especialmente humano)(tal como gB o derivados de los mismos). El Varicella Zoster Virus (tal como gpl, II o III), o de un virus de hepatitis tal como virus de hepatitis B por ejemplo antígeno de superficie de Hepatitis B o un derivado del mismo, virus de hepatitis A, virus de hepatitis C y virus de hepatitis E, o de otros patógenos vi rales, tal como virus sincitial respiratorio, vi rus de papiloma hu mano o virus de influenza, o virus de polio tal como el virus de polio inactivado (I PV) o derivado de patógenos bacterianos, tal como Difteria (D) , Tétanos (T), Salmonella, Neisseria, particularmente Neisseria Meningitis A, B o C. Borrelia (por ejemplo OspA o OspB o derivados de los mismos), o Chlamydia o Bordetella po r ejemplo P.69, PT y FHA de B. Pertussi (P), o derivado de parásitos tales como plasmodium o Toxoplasma. Particularmente las vacunas preferidas de la invención incluyen , DTPa Hib; y DTPa Hib Hep B; y DTPa Hib Hep B I PV. Se apreciará que en la vacuna de combinación de la invención , el componente Hib puede formu larse con los otros antígenos justo antes de la administración . Así, u n componente Hib liof ilizado puede ser reconstitu ido antes de usarse, al mezclarlo con la formulación acuosa de otros antígenos. Las combinaciones ante riores pueden inclu i r opcionalmente un componente, el cual es protector contra H epatitis A. Los componentes adecuados para usarse en tales vacunas ya están disponibles comercialmente y los detalles pueden ser obtenidos de la Organización Mundial de la Salud. Por ejemplo, el componente IPV puede ser la vacuna de polio inactivada Salk. La vacu na de difteria, tétanos y tosferina puede comprender u n produ cto "accellu lar", tal como Infanrix DTPa (SmithKIine Beecham Biologicals) . El componente que proporciona protección contra la Hepatitis A es de preferencia el producto conocido como "H avris" (Smith KIine Beecham Biologicals) con u na vacuna atenu ada muerta derivada de la especie H M- 1 75 de HAV [ver "I nactivated Candidate Vaccines for Hepatitis A" por F.E. Andre, A Hepburn y E:D'Hondt, Proa Med. Virol. Vol 37, páginas 72-95 (1990) y la monografía del producto "Havrix" publicada por SmithKIine Beecham biologicals (1991)]. El compnente de Hepatitis B puede comprenden el antígeno "S" como en "Engerix-B". De manera ventajosa, la vacuna de Haemophilus Influenzae B o la vacuna de combinación de acuerdo a la invención es una vacuna pediátrica. La preparación de la vacuna es descrita de manera general en Vaccine Design - the subunit and Adjuvant approach, editado por Michael F Powell y Mark Newman, Plenum Press. La encapsulación dentro de liposomas es descrita, por ejemplo, por Fullerton, patente estadounidense 4,235,877. La conjugación de proteínas con macromoléculas es descrita, por ejemplo, por Likhite, patentes estadounidense 4,372,945 y por Armor et al., patente estadounidense 4,474,757. La cantidad de antígeno en cada dosis de vacuna se selecciona como una cantidad, la cual induce una respuesta inmunoprotectora sin efectos laterales adversos importantes en los vacunados típicos. Tal cantidad variará dependiendo de cuales substancias inmunógenas específicas se estén empleando. De manera general, se espera que cada dosis comprenderá 1-100ug del total de substancia inmunógena, de preferencia 2-100ug, muy preferiblemente 4-40ug. Una cantidad óptima para una vacuna particular puede ser averiguada mediante estudios estándares que involucran la observación de títulos de anticuerpos y otras respuestas en los sujetos. Siguiendo una vacunación inicial, los sujetos pueden recibir una o dos inyecciones impulsoras en aproximadamente intervalos de 4 semanas. Los siguientes ejemplos ilustrarán la invención.

Ejemplos Ejemplo 1 a) Vacuna comprendiendo DTPa - Hib PRP-TT - y HbsAg. Producción de conjugado Hib TT Materiales y Métodos Materiales El Hib PRP se extrae y pu rifica de cu ltivos de células inactivadas . El material pu rificado encuentra las especificaciones WHO y US en términos de proteína residual , ácido nucleico, endotoxina, azúcares estructurales y distribución de tamaño molecular. El toxoide de tétanos producido por Behringwerke también encuentra las especificaciones WHO. El material es pu rif icado adicionalmente mediante precipitación de pH ácido y cromatograf ía de f iltración de gel , para aislar la forma monomérica ( 1 50 kDa) de TT.

Activación y química de acoplamiento 20 mg de Hib PRP se disolvieron en 4 ml de NaCI 2 M 1 50 mcl de CDAP ( 1 -ciano-4-dimetilamino-piridin io tetraflu oroborato) se adicionó a la solución de polisacárido (de u na solución soporte de 1 00 mg/ml en acetonitrilo) . Un minuto después, 300 mcl de trietilamina 0.2 M se adicionó. La activación del polisacárido se realizó du rante 2 minutos a 0°C a u n pH 9.5- 1 0. mg o 40 mg del toxoide de tétanos (proporción inicial de PRP/Proteína de 1 /1 o Vi) a una concentración de 1 5 mg/ml se adicionó, y la reacción de acoplamiento se realizó a 25°C durante 1 hora. Entonces la reacción se calmó durante 1 hora a 25°C con 3 ml de una solución de glicina 1 M de pH 5.0, y entonces du rante la noche a 4°C. El conjugado es pu rif icado mediante cromatograf ía de filtración de gel usando una columna de filtración de gel Sephacryl H R 500 equilibrada con NaCI 0.2 M. El contenido de proteína y carbohidrato de las f racciones levigadas f ue determinado. El conjugado se combinó y se f iltró de manera estéril. La propo rción PRP/proteína y el contenido de PS libre en la preparación de conju gado fueron determinados .

Ejemplo 1 b) Formulación de vacuna de combinación de DTP Hib PRP TT HbsAg La formu lación de DTPa (comprendiendo toxoide de difteria, toxoide de tétanos , toxoide de tosf erina, pertactin y FHA) con o sin vacunas de Hepatitis B son conocidas en la técnica. Por ejemplo, tal vacuna es descrita en la solicitud de patente internacional No. WO 93/241 48. El Conjugado como se describe en el ejemplo 1 fue adicionado a la vacuna y mezclado antes de la inyección para estudios de inmu nogenicidad . En los p resentes estudios, se emprendieron los sig u ientes pasos: • Ajuste del contenido de f enoxi-etanol (bacteriostático) a 5 mg/ml • Ajuste de pH a 6.1 + 0.1 • Ajuste de la concentración de PRP hasta 1 00 mcg/ml • Adición de DTPaH BV (0.5 ml) a 0.1 ml de solución de PRP-CDAP-TT.

La composición final de la vacuna fue por una dosis: PRP'S 10 mcg D 25 Lf T 10 Lf PT 25 mcg FHA 25 mcg 69K 8 mcg HepB 10 mcg A1 (OH)3 Behring 0.35 mg A1 (OH)3 Superpos 0.15 mg A1 PO4 Superpos 0.20 mg NaCI 150 mM 2fEt-OH 3 g (?-5 mg/ml) PH 6.1 + 0.1 Vol 0.6 ml Ejemplo 2 Inmunogenicidad La ¡nmunogenicidad de las proporciones de polisacárido derivado de haemophilus Influenzae tipo B:proteína (peso:peso) (1:3, 1:2 y 1:1), usando dos químicas de acoplamiento diferentes, se compara después de una primera y segunda inoculación en ratas OFA jóvenes. Los datos obtenidos a los 28 días después de la primera inoculación de la vacuna muestra claramente un título de anticuerpo anti PS mejorado que se correlaciona con un contenido de proteína disminuido en la vacuna conjugada, cuando el antígeno conjugado es combinado con DTPa Hepatitis B, pero no cuando el conjugado se inyecta solo. Esto está en claro contraste con la situación observada cuando la vacuna conjugada es proporcionada sola, donde la proporción PS menor - TT (es decir más proteína portadora) resulta en una mejor respuesta de anticuerpo al polisacárido (ver día 42 título anti PS de los Grupos 1 a 3 yendo desde 25 hasta 18 a 5 µg/ml con una cantidad en decremento de TT, mientras que van desde .3, 4 a 8 hasta 19 µg/ml para los mismos contenidos de TT, pero cuando se da en combinación con la vacuna DTPa He B.

Ejemplo 3 Efecto de la proporción TT/PS en la compatibilidad de Hib con DTPa Grupos de 10 ratas (OFA, 5 semanas de edad, femeninas) fueron inmunizadas 2 veces en intervalos de 24 días mediante la ruta subcutánea con las diferentes vacunas TT.PRP proporcionadas en 2 dosis: 0.5? PS/rata (tabla 2) o 0.05? PS/rata (tabla 3). La vacuna Hib001 fue reconstituida con una solución salina o 1 dosis de DTPa (lot 119) para tener una concentración de : 10? PS/ml. Las vacunas líquidas fueron diluidas con solución salina o 1 dosis human de DTPa para tener : 2.5? PS/ml o : 0.25? PS/ml. Las ratas fueron inyectadas con 200 µl de cada vacuna dentro de una hora después de la dilución. Los animales se hicieron sangrar en el día 24 y el día 38, y la IgG Abs anti-PRP fue medida mediante ELIS en sueros individuales y expresados en ?/ml. El GMT fue calculado para cada grupo.

Ejemplo 4 Comparación de Inmunogen icidad de la vacuna DTPa, y DTPa Hepatitis B mezcladas con u na proporción baja o "normal" PRP :TT G rupos de 1 0 ratas (OFA, 1 semana de edad) fueron inmunizadas tres veces (SC) en intervalos de dos semanas con 0.5 µg de PS combinado 1 hora antes de la inyección con 1 /20- de u na dosis hu mana de DTPa o DTPa HepB. Los animales se hicieron sangrar 2 semanas después de la tercera dosis y los anticuerpos contra toxoide de tosferina (PT), FHA, pertactin (69k), toxoide de difteria (D), toxoide de tétanos (T) y antígeno de superficie de Hepatitis B (H BS) , se midieron mediante Elisa. Los títulos, expresados como una dilución de pu nto medio usando una referencia se mu estran en la Tabla 4. Los resultados de este experimento junto con el resu ltado del ejemplo 3 demostraron que la respuesta Hib es intensif icada en una vacuna de combinación, si la cantidad de proteína en el conjugado se reduce. Más aún , no hay interferencia importante a la respuesta inmune de cualquier otro componente de la vacuna.

TABLA 1 TABLA 2 TABLA 3 TABLA 4

Claims (1)

1. REIVI NDICACIONES Una vacuna combinada comprendiendo: (a) un antígeno de polisacárido conjugado con una proteína portadora; y (b) una proteína portadora libre; caracterizada porque la proporción de polisacárido a proteína portadora en el conjugado es desde 1 :0.3 hasta 1 :2 (p/p). Una vacuna combinada como ser reclama en la reivindicación 1 , en donde la proteína portadora es un antígeno de difteria o tétanos. Una vacuna combinada como se reclama en las reivindicaciones 1 o 2 , en donde la proporción de polisacárido : proteína portadora en el conjugado es desde 1 :05 hasta 1 : 1 .5 (p/p) . Una vacuna combinada como se reclama en la reivindicación 1 , en donde el componente de polisacárido es derivado de Haemophilus Influenzae tipo B, o Streptococcus Pneu monía o Neisseria meningitis A, o B o C. Una vacuna combinada como se reclama en la reivindicación 4, que comprende además antígenos capaces de induci r protección contra infecciones de difteria, tétanos y tosferina. Una vacuna combinada como se reclama en la reivindicación 4, o reivindicación 5 , comprendiendo además un antígeno derivado del virus de hepatitis B. U na vacuna combinada como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, comprendiendo además un antígeno derivado del vi rus de hepatitis A. U na vacuna combinada como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, comprendiendo además un antígeno capaz de induci r inmunidad contra polio. U na vacu na combinada como se reclama en cualqu iera de las reivindicaciones 4 a 7, comprendiendo además un antígeno capaz de induci r inmu nidad a Streptococcus pneumoniae y Haemophilus I nflu enzae. U na vacuna combinada de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, comprendiendo adicionalmente un auxiliar adecuado. Una vacuna como se reclama en cualquiera de las reclamaciones previas, para usarse en medicina. Un método de tratar u n humano susceptible a, o suf riendo de u na enfermedad infecciosa, comp rendiendo la administración de una cantidad efectiva de una vacu na como se reclama en las reivindicaciones 1 a 1 0.