MXPA94003278A - Metodo para preparar una proteina marcada con radionuclido metalico. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere a un metodo para preparar una proteina o un material proteinaseo, marcado con radionuclido metalico, que esta destinado a aplicacion en diagnostico o una aplicacion terapeutica, haciendo reaccionar una proteina o un material proteinaseo con un agente bifuncionales para acoplar el radionuclido a la proteina o material proteinaseo; formandose un conjugado de proteina mediante reaccion entre el agente bifuncional y los grupos amino libres o mercapto libres en la proteina o el material proteinaseo, y luego formando complejo del radionuclido con el conjugado asi formado a un complejo de radionuclido.

Description

METODO PARA PREPARAR UNA PRQTEINA MARCADA CON RADIDNUCLIDQ METALICO Inventor (es) : ALFONS M . VERBRUGBE , belga con domicilio en Herestraat 49, B-300G , Leuven , Bélgica.

Causahabiente: MALLINCKRODT MEDICAL una sociedad norteamericana organi ada y existente de acuerdo con las leyes del Estado de Missouri con domicilio en 675 McDonell Blvd, St. Louis Missouri 63134·, E.U.A.

RESUMEN / ión de refiere a un método para preparar una pro e na o un material proteinaseo, marcado con radionúclido metálico, que está destinado a aplicación en diagnóstico o una aplicación terapéutica, haciendo reaccionar una proteína o un material proteinaseo con un agente b i fune i anales para acoplar el radionúclido a la proteína o material proteinaseo; formándose un conjugado de proteína mediante reacción entre el agente bifuncional y los grupos amina libres o mercapto libres en la proteína o el material proteinaseo, y luego formando complejo del radionúclido con el conjugado así formado a un complejo de radionúclido En esta reacción, un agente pol i fune i onal fórmula general Y - R - (SX) en donde: X es un grupo alcanoílo halogenado o no halogenado que tiene de 2 a 5 átomos de carbono, o un grupo benzoílo sustituido o no sustituido; R es un radical de hidrocarbilo alifático saturado mu lt ivalente , que tiene de 2 a 20 átomos de carbono y en donde la cadena principal, si se desea, puede estar interrumpida por un átomo de nitrógeno y/o un grupo carbón i lo ; Y es por lo menos un grupo reactivo terminal, que es capaz de reaccionar con un grupo amino libre o un grupo mercapto libre en la proteína o el material proteinaseo; y n es de 2 a 6; y luego, si es necesario después de la desprotección de los grupos mercapto protegidas, hacer reaccionar el conjugado de proteína formado con el radionú lido. La invención se refiere ad i c ionalmente a la proteína o al material proteinaseo marcados así obtenidas, y a un estuche para preparar una composición radiofarmacéutica, estuche que comprende el agente pol i fun ional o el conjugado de proteína mencionados arriba, formados por reacción de una proteína o un material proteinaseo con el agente polifunc ional .

MEMORIA DESCRIPTIVA La invención se refiere a un método para preparar un proteína o un material proteinaseo marcados con radionúclido metálico, que se destina a aplicación de diagnóstico o terapéutica. Se pueden utilizar compuestos marcados con radionúclido para examen de diagnóstico, por ejemplo, en desviaciones de forma y función de órganos internos, y en la presencia y ubicación de procesos patológicos en el cuerpo. Para este propósito, está presente una composición en la cual el compuesta radioactivo es administrado al paciente, por ejemplo, en la forma de un líquido inyectable. Por medio de un aparato de detección adecuado, por ejemplo, una cámara gamma, se toman imágenes, por ejemplo, del órgano o el proceso patológico en el cual se ha incorporado el compuesto radioactivo, registrando la radiación emitida ("explorando"). Los materiales biológicos marcados con elementos radioactivos, en particular las proteínas y los materiales proteinaseos , por ejemplo, las células de la sangre, la albúmina del suero, las i nmunoglobul ina , los gl icopép ido , los anticuerpos monoclonales parecidos a antimiosina y los monoc lonales contra antígenos tumorales, los péptidos, las hormonas que contienen funciones amino, tales como somatostat ina y ACTH y otras proteínas adecuadas para este propósito, tales coma plasmina y derivados de plasmina, por ejemplo, miniplasmina y activador plasminogénico de tejido, presentan perspectivas interesantes para aplicación de dignóstico. Algunas proteínas tienen una especificidad muy grande para el órgano de destino, pueden reaccionar muy selec ivamente con las macromoléculas biológicas presentes en él; un buen ejemplo de ellos es la reacción selectiva de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo con antígenos presentes en el cuerpo. Se pueden utilizar sati factoriamente varios rad ionúcl idos de metal siempre y cuando estén unidos a macrornoléculas biológicas selectivas para un tumor, tales como el glicopéptido bleomicina, para controlar tumores, y de tal manera, formar una herramienta poderosa en radioterapia. Las macromoléculas utilizadas sirven así como vehículos para el transporte de la dosis de radiación deseada, es decir, el radionúclido metálico hasta el tumor que se va a exponer a la radiación . El mareaje directo de una proteína o de un material proteinaseo con un radionúclido metálico tiene dos desventajas. En primer lugar, el sitio biológicamente activo de la proteína necesaria para una buena especifi idad o selectividad hacia el órgano de destino, se puede bloquear fácilmente mediante esta reacción, de manera que el comportamiento normal de la macromolécula biológica no se altere. Además, la afinidad entre el radionúclido metálico y la macromolécula frecuentemente es insuficiente, como resultado de lo cual la unión formada no es suficientemente estable para que permanezca intacta bajo las condiciones f siológicas. El material administrado entonces no es ya útil ni siquiera como diagnóstico (ya no se puede seguir el comportamiento de la proteína en el cuerpo) ni como material terapéutico (la dosis de radiación ya no es transportada al sitio deseado, sino que provoca una carga de radiación indeseable en algún otro sitio). A fin de mitigar estas desventajas, se sugiere en la solicitud de patente europea No. 237150 y en la solicitud de patente del PTC W0 &7/O l tratar las sustancias proteinaseas que comprenden ligaduras disulfuro con un agente reductor de sulfuro, por ejemplo, d i t iotrei tol , antes de hacer reaccionar la sustancia proteinasea reducida, que comprende ahora grupos mercapto libres, específi amente con la especie de radionúclido, por ejemplo, con tartrato de Tc- 99m o glucoheptonato de Tc-99m. La desventaja de este método es el tratamiento reductivo de la proteína en el cual la proteína se "desdobla" rompiendo las ligaduras disulfuro a ó los grupos mercapto deseados. Puede ocurrir entonces fácilmente daño a las moléculas de la prateína. En los últimos pocos años, un gran número de publi a iones de patente ha aparecido, y en ellas se han descrito macromoléculas biológicas, usualmente proteínas o sustancias proteinaseas, que comprenden grupos quelatadores para una unión para el radionúclido deseado. Las publicaciones recientes de patentes, en este campo, son las memorias de patente norteamericana Nos. 4479930; 4511550; 4652440; 4652519 y 4676667, las solicitudes de patente europea Nos. £3,129? 173,629 y 166,256, la solicitud de patente de los Países Bajos No. 6,204,106 y la solicitud de patente del PCT WO 65/03231 y WO 66/03010. Por supuesto, el comportamiento biológico de la macromolécula original debe mantenerse tan bien como sea posible mediante esta modifica ión. Esto significa que el quelatador o el agente bifuncional con el que está unido el radionúclido metálico a la proteína, puede no ser demasiado voluminoso; ciertamente no cuando se utiliza para moléculas de proteína relativamente pequeñas. Adicionalmente, la proteína o material proteinaseo, que hab itualmente es extremadamente sensible, debe ser expuesto lo menos posible a condiciones de daño durante el acoplamiento con el quelatador o agente bifuncional, lo que puede incluir adversamente en las propiedades de la macromolécula. Las incubaciones da larga duración, los tratamientos a temperaturas elevadas, la presencia de solventes orgánicos o condiciones orgánicas de acidez que difieren del pH fisiológico, las reacciones en presencia de agentes oxidantes o reductores, todos estos tratamientos deben ser evitados tanto como sea posible. Como ya se señaló con anterior dad, el agente bifuncional seleccionado debe asegurar una. unión fuerte entre la proteína a material proteinaseo, por una parte, y el radionúclido metálico, por la otra. En el caso de que la unión no permanezca intacta bajo las condiciones radiológicas, es decir, el radionúclido quede suelto en el torrente sanguíneo y pueda ser transportado a sitios indeseables del cuerpo por otras partículas de la sangre, el material radioactivo puede provocar una carga de radiación indeseable para el tejido en esos sitios e incluso puede dañar seriamente el tejido, si está presente en cantidades terapéut camente efectivas. Además, con respecto a la vida de almacenamiento, frecuentemente deficiente, de la macromolécula marcada y/o la media vida corta del radionúclido metálico usado, frecuentemente no es posible colocar la proteína o material proteinaseo marcados, listos para ser usados, a disposición del usuario. En dichos casos, el propio usuario debe efectuar la reacción marcadora con el radionúclido en la clínica o en el laboratorio clínico, para cuyo propósito se ofrecen los diversos componentes de la reacción en lo que se a denomina un "estuche". Será obvio que las operaciones que se tienen que efectuar y que deben ser llevadas bajo condiciones asépticas, deben ser lo más simple posible (de manera que se efectúa un número mínimo de pasos de reacción y tenga un número mínimo de componentes de reacción, sin separación o purificación laboriosas), a fin de permitir que el usuario prepare la proteína o material proteinaseo marcado con el material radioactivo, con el medio auxiliar que se le suministra desde el estuche. La eficiencia o rendimiento de mareaje también juega un papel importante. Además de la pérdida de material valioso, el material de partida sin convertir debe ser eliminado del producto resultante, en el caso de mareaje incompleto, como resultado de lo cual habitualmente se puede llevar a cabo, por el usuario, una purificación laboriosa de un producto radioactivo, bajo condiciones asépticas. Los quelatadores o agentes b i fune i onales descritos en las publicaciones de patentes mencionadas arriba no son sa isfactorias con respecto a uno o más de los requerimientos mencionados hasta ahora. Por ejemplo, un quelatador comparativamente voluminoso es usado en US 4,479,930, US 4, 511,550, US 4,652,519, US 4,676,667 y EP 156,256. A fin de acoplar el quelatador con la proteína, se aplican condiciones que son dañadoras para la proteína durante la reacción de acoplamiento, en los métodos descritos en US 4,652,440, EP 177,629, O 65/03231 y WO 66/03010. La unión entre la proteína y el rad ionúcl ido metálico no es suficientemente fuerte en las proteínas marcadas de acuerdo con US 4,479,93o y WO 65/03231. En muchos casos, el método de mareaje es laborioso y es necesaria una purificación posterior de la proteína marcada: US 4,652,440, EP 63,129, EL 166,256, NL 6,204,106, W0 66/03010. Algunas veces, el mareaje también es incompleto a un grado tal que, como resultado de ello, es necesario un paso de procesamiento adicional: US 4,479,930, US 4,652,440, W0 65/03231 y W0 66/03010. Se sugiere en W0 67/04164 el uso de anhídrido S-acet i lmercapto succinico (SAMSA) como agente bifuncianal para preparar un conjugado de anticuerpo marcado con tecnecio, mediante reacción con Tc ( Hal ) ^ . sin embargo, en este método, es necesario un paso extra de reducción para formar un grupo -SH, que es capaz de reaccionar con el compuesto de tecnecio. Hace algunos años, se publicó una solicitud de patente, a saber, W0 69/07456, en la cual se utiliza 2- iminotiolano (y compuestos relacionados) , como un agente bi funcionales para acoplar radionúcl idos metálicos con proteínas. Este agente, en realidad, tiene considerables ventajas con respecto a los agentes ya conocidos, debida a que puede hacerse reaccionar muy fácilmente con la proteína, en la que el conjugado de proteína formado puede reaccionar con el rad ionúcl i do en un solo paso de reacción. Esta última reacción provee directamente el conjugado deseado de proteína marcada, sin subproductos que sean alteradores. Sin embargo, se ha descubierto que, al marcar ciertas proteínas con el método descrito en W0 &9/07l+5ó, algunas veces ocurre polimerización, incluso bajo las condiciones que son habituales para esta reacción, que son deficientes en oxígeno. Recientemente, se ha descrita un método para preparar una proteína marcada con radionúclido metálico, en donde se usan S-acet i lt ioacetato de IM-succinimidilo (SATA , apropiadamente S-acet i lmercaptoacetato de N-suc in imid lo ) y compuestos relacionados, como agentes acopladores bifuncionales: WO 91/07991. Parece que la polimeriza ión anterior del conjugado proteínico durante la preparación podría evitarse y que no era necesario un paso de reducción adicional. Al utilizar este método, el conjugado de proteína formado permite un mareaje directo con el radionúclido metálico deseado, lo que es particularmente ventajoso para una formulación de estuche. Sin embargo, se ha observado que, incluso el uso de SATA con un agente de acoplamiento no es completamente satisfactorio, en particular por lo que respecta a la estabilidad in vivo de la proteína marcada, tal como se desprende de la retención en la sangre de la proteína, determinada en un ser vivo. Aparentemente, la marca de radionúclido no está unidad firmemente de manera perfecta en la proteína modificada con SATA. Es el objetivo de la presente invención proveer un método para preparar una proteina o un material proteinaseo marcados con radionúclido metálico, que se destinan a aplicación de diagnóstico o terapéutica, haciendo reaccionar un material de proteína o proteinaseo con un agente para acoplar el radionúclido a la proteína o material proteinaseo; formándose un conjugado de proteína mediante reacción entre el agente y los grupos amino o grupos mercapto libres en la proteína o el material proteinaseo, y luego formando complejo del radionúclido con el conjugado así formado, a un complejo de radionúclido, en el cual, por una parte, se mantienen las ventajas anteriores del método descrito en WD 91/07991, pero por otra parte, la proteína marcada por radionúcl do, formada, no muestra las desventajas mencionadas con anterioridad para SATA: Se puede lograr este objetivo efectuando una reacción de acoplamiento con un agente pol i fune ional de la fórmula general Y - R - (SX) <I) en donde: X es un grupo alcanoílo halogenado o no halogenado que tiene de 2 a S átomos de carbono, o un grupo benzoílo sustituido o no sustituido; R es un radical de hidrocarbilo alifático saturado, mu.lt ivalente , que tiene de 2 a 20 átomos de carbono y en donde, si se desea, la cadena principal puede estar interrumpida por un átomo de nitrógeno y/o un grupo carboni lo; Y es por lo menos un grupo reactivo terminal, que es capaz de reaccionar con un grupo amino libre o un grupo mercapto libre presentes en la proteína o el material proteinaseo; y n es de 2 a 6; y luego, si es necesario después de la desprotección de los grupos mercapto protegidos, hacer reaccionar el conjugado de proteína formado con el rad i onúc 1 ido . Loa radionúclidos metálicos adecuados para ser usados en el método de acuerdo con la invención son Tc-99m, Re-l&é», Re-lña, G?-111, Ga-¿>7, As-72 y As-- 77. De estos radionúclidos, se pueden utilizar Tc-99m, In—111, Ga-67 y As-72 para propósitos de diagnóstico; los demás radionúclidos son particularmente útiles como composiciones terapéu icamente activas. El término anterior "radical de hidrocarbilo mul i alente" significa un grupo de hidrocarbilo que tiene por lo menos tres valencias libres, tales como un radical trivalente, etc.

La formación de derivados de la proteína o de material proteinaseo, es decir, la reacción con el agente polifuncional , se puede lleva a cabo de una manera muy simple (pH entre 6.5 y & ) y a la temperatura ambiente. La desprotección subsecuente de los grupos mercapto protegidos, es decir, la rotura de los grupos protectores X en la fórmula I, se puede efectuar fácilmente inmedi tamente después de la reacción de acoplamiento, de preferencia mediante un tratamiento simple con h idrox i lamina . En la reacción de formación de complejo, está presente el radionúclido deseado para el conjugado de proteína en la forma de una sal o, de preferencia, en la forma de un quelato unido a quelatadores comparati amente débiles, por ejemplo, un pirofosfato, un fosfato o un pol i fosfonato, un oxinato, un carboxilato, un hidroxicarbo i lato, un aminocarbox i lato , un fenolato o una mezcla de ellos; asimismo, en un medio neutro. En este último caso, el complejo es formado por medio del principio de intercambio de ligando, en donde el átomo de azufre del compuesto t o forma una unión fuerte de quelato con el radionúclido metálico. Es muy importante el uso de un grupo X protector de mercapto debido a que se evita la polimer zación del conjugado de proteína durante la preparación. Los ejemplos de grupos protectores adecuados X para el grupo mercapto son: acetilo, acetilo halogenado y benzoílo sustituida o no sustituido, en donde los grupos extractores de electrones particulares, tales como nitro, halógena y sulfo, deben considerarse como sust i tuyentes adecuados. Una proteína adecuada que se va a marcar, utilizando el método de la presente invención, es la albúmina, por ejemplo, albúmina de suero humano CASH). Se ha encontrado que la ASH marcada con Tc-99m, por medio del método de la presente invención, es decir, utilizando el agente de acoplamiento pol i fune ional de la fórmula I, es muy adecuada para ciertos exámenes de diagnóstico, espe i lmente para ventr iculograf í con rad i onúcl ido . Como será evidente de los ejemplos que se anexan, una elevada retención en el compartimento vascular de un ser humano es obtenida utilizando una albúmina rad i omarcada , preparada mediante el método de la presente invención. La presente invención también se refiere al conjugado de prateína formado a complejo con el rad ionúcl ido , como se mencionó anteriormente, y al conjugado de proteína per se, preparado como se describió anter ormente, haciendo reaccionar una proteína o un agente proteinaseo con el agente acoplador pol i fune i onal de la fórmula I. Para el método de acuerdo con la invención, se puede utilizar, en particular, un agente pol i fuñe ional de la fórmula II Y' - R (SX) (II) en donde X, n y R tienen los significados dados con anterioridad; y Y' es un grupo isocianato, un grupo formilo, un grupo de diazonio, un grupo i sot ioc ianato , un grupo epoxieti leño, un grupo tr i loro-s-tr i az i n i lo , un grupo et i len i m i no , un grupo halúgeno-carbon i lo , un grupo halógeno-su 1 f on i lo , un grupo maleimido, un grupo alqu i lcarbon i lox icarbon i lo, sulfonado o no sulfonado, un grupo alquilcarboniliminocarbonilo, sulfonado o no sulfonato, un grupo 2 , 4-din i rof enox icarbon i lo o un anillo heteroc í 1 ico de 5 o ó miembros, que contiene nitrógeno, sulfonado o no sulfonado, que está unido a R con el nitrógeno de anillo por medio de un grupo carbonilo u o icarbon i lo , y que está sustituido en la posición orto con una función oxo o una función tioxo. Los ejemplos adecuados de grupos alqu i lcarbon i lox icarbon lo y de los grupos alqu i lcarbon i loiminocarbon i lo son los radicales derivados de anhídrido succínico y succinimida, respectivamente. Tal como se señaló con anterioridad, los ejemplos de grupos X protectores adecuados son: acetilo, acetilo halogenado, tal como tr i loroacet i lo y benzoílo, ya sea sustituido o no, con un grupo nitro, alquilo de 1 a ¦+ átomos de carbono, alcoxi de 1 a 4 i amos de carbono, halógeno o sulfo. Las grupos siguientes para Y' son los preferidos: un grupo , ?-—d in i t rof enox i carbón i lo o un anillo heteroc í c 1 ico de 5 o de 6> miembros, que contiene nitrógeno, sulf onado o no sulfonado, que está unido a R con el nitrógeno de anillo, por medio de un grupo carbonilo o un grupo oxicarbonilo y que está sustituido en la posición orto con una función oxo o una función tioxo. Ha comprobado ser particularmente adecuado un agente pol i fune i onal de la fórmula general: ? II II Y" - C - R - (SCCZ3)n (IV) en donde Z es un átomo de hidrógeno o un átomo de flúor; R tiene el significado dado anteriormente; y Y" es un grupo succ i n i mi do-ox , sulfonado o no sulfonado, o un grupo 2-t ioxo-t iazol i d in-3-i lo . Un grupo succinimido-o i , también se denomina grupo N— succinimidilo. Los ejemplos adecuados de los radicales multivalente anteriores -R-CO- son: (1) - CHa - CH - CO - (V) I (2) CH - Re CH CO - (VI ) (3) N - Ra - CD - (VII) / <>¦+> - RH \ -- CH - - CH - (VIII) / - R s ? k en donde: RL es hidrógeno o alquilo de 1 a M- átomos de carbono; a es alquileno de O a 3 átomos de carbono; 3 es alquileno de 1 a 5 átomos de carbono; Ru», Rs y RA , son cada uno, individualmente, alquileno de 1 a & átomos de carbono, de cadena recta o ramificada; A y ± son hidrógeno o (CH^)-. - CO - , en donde m = 0-5; a condición de que A = H si Aj. es (CHK)m - CO -; y que At = H si A es (¾!ra - CO -. Los ejemplos específicos de los radicales mult ivalentes preferidos en (3) y C-+) son: 1& Los agentes preferidos mencionados al final son excelentemente adecuados para ser usados en la preparación de proteínas o materiales proteinaseos marcadas de acuerdo con la presente invención. Se ha descubierto que los agentes pol i fune i onales mencionados al final pueden reaccionar con las funciones amina de la proteína, select amente y sin daño para la molécula de proteina. Los ejemplos específicos de agentes tr i fune ionales incluidos en la fórmula general IV mencionada al final, bajo <i), se pueden representar por las siguientes fórmulas: en donde Z tiene el significado dado con anterioridad, y Aa es hidrógeno o un grupo sulfonato alcalino <o de amonio). La invención se refiere también a una proteína marcada con radionúclido metálico o un material proteinaseo obtenido utilizando el método que se describió anteriormente, y a una composición rad iof rmacéut i ca que comprende, además del material portador líquido farmacéuticamente aceptable, una proteína o material proteinaseo marcada con radionúclido metálico. La solución resultante de la proteína marcada o 1<? material proteinaseo marcado, se puede utilizar directamente como una composición radiof armacéut ica. De ser necesario, se puede llevar la solución hasta una forma que sea adecuada para administración intravenosa o subcutánea, por ejemplo, mediante la adición de un material portador líquido f rmacéuticamente aceptable, de preferencia una solución salina fisiológica. Por supuesto, se debe asegurar que la proteína no se dañe durante el tratamiento y que la solución deber ser estéril para administración intravenosa o subcutáne . Para llevar a cabo un examen de radiodiagnóstico, se puede administrar la composición que se describió arriba, op ionalmente después de dilución con un líquido farmacéu icamente aceptable, de preferencia una solución salina fisiológica, a un animal de sangre caliente, en una cantidad de 100 ,uCi a 30 mCi, de preferencia de 0.5 a 10 mCi por 70 kg de peso de cuerpo, después de lo cual la radiación radioactiva emitida por el ser vivo se registra. Si la composición se va a usar para un tratamiento rad ioterapéut ico, se debe seleccionar un radionúclido metálico adecuado para la reacción marcadora, tal como se indicó anteriormente. En el uso, la composición, opcionalmente después de dilución con un líquido f rmacéuticamente aceptable, es administrada al animal de sangre caliente en una cantidad efectiva para combatir o controlar tumores. Dado que la composición rad iofarmacéut ica de acuerdo con la invención puede ser preparada fácil y simplemente, dicha preparación puede ser llevada a cabo de manera particularmente fácil par el propio usuario. Por lo tanto, la invención también se refiere a lo que se denomina un "estuche", que comprende: (1) en una condición opc ionalmente seca, una composición de un conjugado de proteína que se forma mediante reacción de una proteína o un material proteinaseo con un agente pol i fune ional , tal como se describe aquí anteriormente; (2) una solución de una sal o quelato de un radionú lido metálico; y (3) las instrucciones para uso con una prescripción para hacer reaccionar los ingredientes presente en el estuche. Una proteína, en lo sucesivo debe entenderse que significa una proteína que incluye un material proteinaseo. Como se señaló anteriormente, para esta reacción formadora de complejo, el radionúclido deseado preferiblemente está presente en el conjugado de proteína en la forma de un quelato unido a quelatadores comparati amente débiles, por ejemplo, un pirofosfato, un fosfonato o pol i fosfonato , un oxinato, un carboxilato, un h idrox icarbo i lato , un aminocarbo i lato , un enolato o una mezcla de ellos; en donde la reacción puede efectuarse en un medio neutro. Los ejemplos de quelatadores apropiados para el radionúclido son 6-hidroxiquinolina o sus 2.1 derivados? ácidos dicarboxílicos, ácidos pol carbox í 1 i eos o ácidos h i dro i carbox í 1 icos , por ejemplo, ácido oxálico, ácido malónico, ácido succínico, ácido maleico, ácido ortoftálico, ácido mélico, ácido láctico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido ascórbico, ácido salicílico o derivados de estos ácidos; p i rofosf atos , fosfonatos o pol i fosf onatos , por ejemplo, d i fosfonato de metileno, difosíonato de h i drox ie i leño o difosíonato de h idrox i met i leño ; o enolatos, por ejemplo, con ß-dicetona tales como acet lacetona , f uro i lacetona , tenoi laceton , bensoi lacetona, d iben zoi lmetano , tropolano o derivados de estas dicetonas. Se deben considerar como par icularmente adecuados como quelatadores , ñ-h dro i qu i nol na , ácido cítrico, ácido tartárico, ácido ascórbico, ácido glucoheptón ico o un derivado del mismo, o acet i lacetona ; debido a que se ha encontrado que un quelato de un radionúclido con estos quelatadores en un medio adecuado, de preferencia, en una solución acuosa regulada, reacciona fácilmente a un pH fisiológico con un conjugado de proteína, tal como se definió aquí con anterioridad, formándose el complejo del radionúclido deseado mediante intercambio de ligando en un rendimiento elevado y con gran pureza. El estuche suministrado también puede contener los constituyentes mencionados bajo (1) con instrucciones para el uso, mientras que la solución del radionúclido metálico definida bajo (2), que tiene una vida de almacén limitada, puede suministrarse al usuario separadamente. En otra modalidad similar, extremadamente favorable, el estuche de acuerdo con la invención está equipado de manera que comprenda los siguientes ingredientes : (1) en una condición op ionalmente seca, una composición de un conjugado de proteína que se forma mediante reacción de una proteína con un agente pol i fun ional , tal como se definió con anterioridad; (2) un quelatador, tal como se describió aquí con anterioridad, y un agente reductor; y (3) instrucciones para usar con una prescripción para hacer reaccionar los ingredientes del estuche con tecnecio-99m en la forma de una solución de pertecnetato. La composición debe comprender un agente reductor para reducir el pertecnetato, por ejemplo, ditionita o iones estanosos. Dicho estuche está destinado para la preparación de una composición farmacéutica marcada con Tc-99m. La solución de pertecnetato simplemente puede ser obtenida por el usuario de un generador de mol ibdeno-tecnec o , que se ponga a disposición del mismo. Un estuche similar puede ser usado para la preparación de una preparación farmacéutica marcada con Re-166 o Re-lñfi, en la cual la solución de per-renato también se puede reducir con un agente reductor adecuado, por ejemplo, una ditionita o iones estanosos. Si se desea, los ingredientes definidos anteriormente bajo (1) y (2) se pueden combinar, siempre y cuando sean compatibles. Dicho estuche, en el cual los ingredientes combinados preferiblemente están 1 iof i 1 i .ados , es extremadamente adecuado para ser reaccionado por el usuario con la solución del rad ionúc 1 ido , de una manera simple. En otra modalidad también excelentemente adecuada, el estuche de acuerdo con la invención está equipado de manera que comprende: (1) en una condición opc i onalmente seca, un agente poli funcional , tal como se definió con anterioridad, así como un quelatador , tal como se describió aquí con anterioridad, y un agente reductor? y (2) instrucciones para uso con una prescripción para reaccionar los ingredientes mencionados bajo (1), que de preferencia se acomodan en una ampolleta, con una proteína que se suministra separadamente al usuario, y luego, con t cnec ia-99m en la forma de una solución de pertecnetato o con renio-166 o renio-ififi, en la forma de una solución de per-renato. Por medio de lo que se denomina un "estuche de propósitos múltiples", el usuario puede marcar cualquier proteína deseada que se ponga a su disposición con el tecnecio o renio radioactivos, en donde el conjugado de proteína requerido para ello es formado de manera intermediaria. En una modalidad relacionada con el estuche mencionado al final, el estuche de acuerdo con la invención comprende: (1) un agente poli fune ional , tal como se definió 2·-+ aquí con anterioridad; (2) una solución de una sal o quelato de un radionúclido metálico; y (3) instruc ones para uso con una prescripción para hacer reaccionar el ingrediente indicado en (1) con una proteína, y luego con el ingrediente mencionado en (2). Un agente reductor metálico, por ejemplo, Sn(II), Fe(II), Cu < I ) , Ti(III) o Sb(III), se usa preferiblemen e como agente reductor par los estuches mencionados con anterioridad; Sn(II) es excelentemente adecuado. El constituyente de los estuches mencionados arriba, mencionado bajo (1), puede ser suministrado como una solución, por ejemplo, en la forma de una solución salina fisiológica, o en alguna solución reguladora o de otra manera, pero de preferencia está presente en una condición seca, por ejemplo, en una condición liafilizada. Cuando se utiliza como un componente para un líquido de inyección, debe ser estéril, en donde, si el constituyente está presente en una condición seca, el usuaria debe utilizar una solución salina fisiológica estéril, como solvente. Si se desea, se puede estabilizar el constituyente mencionado arriba de la manera usual con estabilizadores adecuados, o puede comprender otros medios auxiliares, tales como cargas, glucosa, lactosa, manitol y similares. Se describirá ahora la invención con mayor detalle con referencia a los ejemplos específicos que siguen.

EJEMPLOS EJEMPLO I SINTESIS DE 2.3-(DI-S-ACETILMERCAPTQ)PR0PIQNAT0 DE N- SUCCINIMIDILO (SATP) Las reacciones descritas en los ejemplos I a III se presentan en el esquema de reacción anexa.

ESQUEMA DE REACCION La marca de albúmina con "¡"r^Tc después de la derivación con SATP Albúmina - (NHj).

Albumina- NH-CO-CH-S-CO-CH, CH S-CO-CH3 Desprotección- ( HjOH) Albúmina- NH-CO-CH-SH CHj-SH Albúmina- O-CH-S- CH,-S- Se prepara ácido 2,3-(di-S— acet i lmercapto > prop i ón ico , mediante reacción de ácido 2,3— dibromopropiónico y ácido mercaptoacét ico , de acuerdo con Ondetti y coinventores (solicitud de patente alemana No. 2,752,720). A una solución de 5.05 g, 22.7 mmoles de ácido 2 , 3- ( d i -S-acet i lmercapto ) prop i n ico y 2.61 g, 22.7 mmoles, de IM—h idrox i succ in i m i da en 45 mi de CHSC13 , se añaden 4.66 g de 1 , 3-d i c i c lohex i 1-carbox i d i i mida (22.7 mmoles). Se agita la mezcla a la temperatura ambiente durante Ifi horas. Se filtra la mezcla y se evapora el filtrado. Se disuelve el residuo en una cantidad mínima de d iclorometano y se vuelve a filtrar para eliminar los vestigios de 1 , 3-d i i lohex i lurea . Se concentra el filtrado para dar 5.2 g del compuesto del título, como un aceite amarillo claro. RMN con lH (DMSO): ó 2.3fi (s, 3H) , 2.46 (s, 3H), 2.63 (s, 4H), 3.46 (d, 2H), 4.69 (t, 1H).

EJEMPLO II ACOPLAMIENTO DE ALBUMINA CON SATP A 1 mi de una solución al 2% m/v de albúmina (0.3 jumóles; Mérieux) en 0.05 M de regulador fosfato pH 7.5 que contiene 1 mM de EDTA, se añaden 10 jul de una solución que contiene cantidades variables (3-30 jumóles) de SATP en DMSO. 2.7 Después de incubar durante 2 horas a la temperatura ambiente, se elimina el ligando no reaccionado mediante cromatografía sobre una columna de Sephadex; hinchando en solución salina y en elución con 0.05 M de regulador fosfato pH 7.5 que contiene, 1 mM de EDTA. Las fracciones que contienen la albúmina (nativa y formada a derivados) se combinan. Se lleva a cabo la desacet i la i ón de los grupos mercapto protegidos con S-acetilo, incubando durante 2 horas después de la adición de 0.2 mi de una mezcla de desacet i la ión (50 mM de fosfato de sodio, 25 mM de EDTA, 0.5 m de hidrox i lamina , pH 7.5). Se puede llevar a cabo una purificación adicional mediante HPLC de exclusión de tamaño para eliminar la hidroxilamina, utilizando una columna BiosilR SEC 250; elución con regulador fosfato, pH 7. El pico con un tiempo de retención similar al de la albúmina de suero nativa, se recoge y se utiliza para mareaje.

EJEMPLO III MARCAJE DE ALBUMINA MODIFICADA CON SATP CON TECNECI0-99M Se lleva a cabo el mareaje directo con "^""Tc mediante adición de 10 g de SnCl5a-2HaO disueltos en 5 µ? de HC1 0.05 N y 1 mi de eluado de un generador de Tecnecio 26 comercial que contiene 0.55 GBq de *5"5'mTc- en la forma de pertecnetato de sodio, a la fracción purificada mediante HPLC, que contenía la albúmina modificada y desacet i lada . Después de incubar durante unos cuantos minutos, se analiza la mésela de reacción que se marca y se purifica mediante SEC-HPLC anterior. Se vigila el efluente de la columna tanto para la absorbencia de UV a 260 nm como para l radioactividad. El pico con un tiempo de retención similar al de la albúmina se aisla. Se lleva a cabo el mareaje de intercambio mezclando 2 mi de la solución de albúmina desacetilada y modificada con 0.5 mi de una solución de gluconato de <5"5"T,Tc , e incubación durante 20 minutos a 37°C. Para preparar el gluconato de ""Te, se disuelven 20 mi de gluconato de sodio en 1 mi de regulador fosfato 0.5 M pH 7, y se añaden 100 pg de SnCl¡a-2HaO en 25 JJI de HC1 0.05 N, y a continuación, 1 mi de una solución de pertecnetato de ^""Tc que contiene 0.55 GBq de *5>*5,'"Tc . El análisis y la purificación se llevan a cabo como para la mezcla de reacción de mareaje directo. El producto está indicado en los siguientes ejemplos como 99mTc-DMP-HSA .

EJEMPLO VI RETENCION EN LA 5ANBRE EN UN CONEJO Se diluyen preparaciones rad omarcadas con solución salina a una concentración de 3.7 HBq/ml y se añade 12SI-albúmina a una concentra ión de 0.37 MBq/ml. Se seda un conejo macho albino (2.5-3.1 kq ) y se inyecta 0.5 mi de la solución trazadora diluida a través de una vena de la oreja. A intervalos de tiempo fijos (5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 90, 105 y 120 minutos, p.i.) se toma una muestra de sangres de 2 mi de la arteria de la oreja contralateral . Se mide la actividad de iSBSI y de "mTc, tal como se describió anteriormente, y se comparan con la actividad de una solución común y corriente de la preparación inyectada. El porcentaje de actividad inyectada en .100 g de sangre se calcula a cada intervalo de tiempo, y también la proporción entre el porcentaje de actividad del ""? inyectado que queda en el plasma y el porcentaje correspondiente de actividad de 1 5I inyectado, al mismo intervalo de tiempo. Se muestran los resultados en la figura 1. Para comparación se utiliza HSA, modificado con SATA, marcado con "*'*mTc. En la ordenada, se presenta la proporción entre el porcentaje de actividad de ,,mTc inyectado, restante en la sangre, y el porcentaje residual de iSaaI-HSA, coinyectado, al mismo intervalo de tiempo. De esta manera, las gráficas muestran una comparación directa entre la retención en la sangre de los agentes marcados con <5"5>mTc, y el compuesto de referen i A=aeI— lbúmina- De la figura 1 es evidente que ambas preparaciones de albúmina modificadas con "¡"'""'T muestran una retención rela ivamente mayor en el compartimento vascular que la preparación de """""Tc-HSA probada. La 99mTc-DMP-albúmina , especialmente, imita muy parecidamente a SSI-HSA. Inmediatamente después de la inyección, su retención en la sangre es 96% de la 1¾SI-HSA y la difusión desde el compartimento vascular es casi idéntica. La 99mTc-MA— albúmina probada comparativamente, preparada utilizando SATA conocido como agente acoplador, es retenida en la sangre en un nivel significativamente menor, inmed atamente después de la inyección, y se difunde más rápido al espacio extra-vascular. Por razones de comparación, la curva obtenida de una manera similar con una preparación convencional de ""T -HSA (Technescan HSA), se incluye en la figura.

EJEMPLO V RETENCION EN LA SANGRE EN UN SER HUMANO Se comparan ''"^"'Tc-DMP-albúmina , así como una preparación de HSA marcada con <?s',T,Tc (TechnescanRHSA) , can un intervalo de tiempo de una semana, en un voluntario masculino sano. Se diluyen las preparaciones rad iomarcadas can una solución salina a una concentración de 3.7 MBq/ml y se inyectan 0.5 mi a través de una vena del brazo. A inrtevalos fijos (ver el ejemplo IV) se toma una muestra de sangre de 2 mi desde el braza contralateral y se mide la actividad de "5,nr,Tc como se describió arriba. Los datos están relacionados con la actividad en la sangre a 5 minutos después de la inyección, lo que permite comparar la desaparición en el plasma de las preparaciones probadas. Se pidió al voluntario que orinara a 30 minutos, 60 minutos y 120 minutos después de la inyección, y el porcentaje de dosis inyectada excretado a esos intervalos de tiempo, sin corrección para la orina residual posterior al vaciamiento de vejiga. Las curvas de desaparición en la sangre, obtenidas, están mostradas en la figura 2. La actividad en la sangre a - los 5 mi después de la invención, es decir, después de mezclarse suf cientemente las sustancias inyectadas con la sangre es igual a 100%, y las actividades a los demás intervalos de tiempo están relacionadas a este valor. Con 99mTc-DMP-albúmina (albúmina derivada de SATP en una proporción 1:25), hay una pequeña disminución en la actividad en la sangre durante los primeros 30 minutos después de la inyección, pero posteriormente, el tiempo de retención es bastante constante. Por otra parte, la actividad en la sangre de ''"""Tc-HSA diminuye continuamente durante las dos horas de la investigación. Después de dos horas, sólo el 60% de la actividad inicial es retenida en la sangre. La excreción urinaria acumulativa de la actividad de "*,mTc, después de la administración de las prepara iones está mostrada en la figura 3. Dos horas después de la inyección, el porcentaje de la dosis inyectada excretado en la orina es solamente 2% en el caso de 99mTc-albúmina . Sin embargo, cuando se usa ""^""Tc-HSA , ..5% de la dosis inyectada ya es excretada durante los primeros 30 minutos, y 17% después de dos horas.

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES Un método para preparar un material marcado con radionúclido que se destina a aplicación de diagnóstico o haciendo reaccionar una proteína un material proteinaseo con un agente para acoplar el radionúclido a la proteína o material formándose una conjugado de proteína mediante reacción entre el agente y los grupos libres o grupos libres presentes en la proteína o material y luego formando a complejo el radionúclido con el conjugado así formado a un complejo de caracterizado dicho método porque se lleva a cabo la reacción de acoplamiento con un agente pol i onal de la fórmula Y R en X es un grupo alcanoílo halogenado o no halogenado que tiene de 2 a 5 átomos de o un grupo sustituido o no es un radical de hidrocarbilo alifático i valente que tiene de 2 a átomos de carbono y en donde la cadena si se puede estar interrumpida por un átomo de nitrógeno un grupo Y es lo menos un grupo reactivo que es capaz de reaccionar con un grupo libre o un grupo mercapto en la proteína o el material y n es de 2 a y si es necesario después de la desprotección de los grupos mercapto hacer reaccionar el conjugado de proteína formado con el Un método de conformidad con la reivindicación caracterizado además porque la reacción de acoplamiento se lleva a cabo con un agente pol i ional de la fórmula general R en donde n y tienen los significados en la y es un grupo un grupo un grupo de un grupo i un grupo i un grupo tr i i un grupo un grupo un grupo un grupo un grupo alqu i i icarbon i lo sulfonado o no un grupo alqu i lcarbon i 1 i lo sulfonado o no un grupo o un anillo heterocíclico de 5 o que contiene nitrógeno sulfonado o no que está unido a R con el nitrógeno de anillo medio de un grupo carbonilo u y que sustituido en la posición con una función o una función Un método de conformidad con la reivind además porque la reacción de acoplamiento se lleva a cabo con un agente pol i un ional de la fórmula general 0 ü II C en donde Z es un átomo de hidrógeno o un átomo de R tiene el significado dado en la y es un grupo succ i sulfonado o no o un grupo iazol id lo El método de conformidad con la re caracterizado además porque el radical i valente se selecciona del grupo de CH I R CH CH CO I en es hidrógeno o alquilo de 1 a átomos de es alquileno de O a 3 Átomos de es alquileno de 1 a 5 átomos de y son cada alquileno de 1 a átomos de de cadena recta o y A y son hidrógeno o CO en donde m a condición de que A H si es CO y que H si A es CQ Una proteína o un material proteinaseo marcados con radionúclido caracterizados porque son obtenidos utilizando el método de conformidad con cualquiera de las reivindica iones 1 a Un conjugado de preparado haciendo reaccionar una proteína o un agente proteinaseo con un agente acoplador pol i tal como se describió en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 Una composición que además de un material vehículo líquido farmacéuticamente una proteína o material proteinaseo marcado con radionúclido caracterizada dicha composición porque comprende una proteína o un material proteinaseo marcado con un radionúclido metálico obtenido utilizando el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a Un método para efectuar un examen de radiodiaqnós caracterizado porque se administra una composición de conformidad con la reivindicación si se después de dilución con un líquido farmacéuticamente a un ser vivo de sangre en una cantidad de 100 a 30 de preferencia de mCi a 10 por 70 de peso del y la radiación radioactiva emitida por el ser se Un método de conformidad con la reivindicación en particular para ventriculograf í con porque se administra una composición que tiene como ingrediente activo albúmina marcada con tecne obtenida utilizando el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a Un método para someter un ser vivo de sangre caliente a un tratamiento caracterizado porque se administra la composición de conformidad con la reivindicación se desea después de dilución con un líquido rmacéuticamente a dicho en una cantidad efectiva para combatir o controlar Un estuche para preparar una composición porque en condición opc i onalmente una composición de un conjugado de proteína que se forma mediante reacción de una proteína o un material proteinaseo con un agente pol i de la fórmula en donde los símbolos tienen los significados dados en la reivindicación un a solución de una sal o quelato de un radionúclido y las instruc para uso con una prescripción para hacer reaccionar los ingredientes presente en el Un estuche para preparar una composición ica caracte porque en una condición ionalmente una composición de un conjugado de proteína que se forma mediante reacción de una proteína o un material proteinaseo con un agente pol i de la fórmula en donde los símbolos tienen los significados dados en la reivindicación un quelatador y un agente reductor combinándose ionalmente los ingredientes y y instrucciones de uso con una prescripción para hacer reaccionar los ingredientes del estuche con en la forma de una solución de pertecnetato o con o en la forma de Un estuche preparar de una composición porque en una condición un agente i de la fórmula general en donde las símbolos tienen el significado dado en la así como un quelatador y un agente y de uso con una prescripción para hacer reaccionar los ingredientes en con una prateína o un material proteinaseo y después de la con en la forma de una solución de pertecnetato o con o en la forma de una solución de Un estuche preparar una composición caracterizado porque en una condición opcionalmente un agente pol i ional de la fórmula general en donde los símbolos tienen los significados dados en la rei una solución de una sal o quelato de un radionúclido y instrucciones para uso con una prescripción para hacer reaccionar el ingrediente mencionado en con una proteína o un material proteinaseo después de con los ingredientes mencionados en Un estuche de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a caracterizado además porque comprende un agente pol i ional de la fórmula general II o un conjugado de formado mediante reacción de una proteina o un material con el agente en donde n y R tienen los significados dados en la rei e tiene el significado dado en la Un estuche de conformidad con cualquiera de las reivindica 11 a caracterizado además porque comprende un agente pol i de la fórmula general IV o un conjugado formado mediante reacción de una proteína o un material con el agente i ional en donde y n tienen los significados dados en la reivindicación e y Z tienen los significados dados en la reivindicac En testimonio de lo cual firmo lo anterior en esta ciudad de a los 3 días del mes de Mayo de ODT MEDICAL insufficientOCRQuality