MXPA06012576A - Tratamientos para cancer pancreatico. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona metodos para reducir la supervivencia, expansion y metastasis de tumores. En particular, la invencion proporciona metodos para reducir la supervivencia, expansion y metastasis de tumores pancreaticos. La invencion tambien proporciona agentes para el uso en los metodos, particularmente agentes que reducen el nivel o actividad del factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF) y metodos para identificar tales agentes.

Description

TRATAMIENTOS PARA CÁNCER PANCREÁTICO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona métodos para reducir la supervivencia, expansión y metástasis de tumores. En particular, la invención proporciona métodos para reducir la supervivencia, expansión y metástasis de tumores pancreáticos. La invención también proporciona agentes para el uso en los métodos, particularmente agentes que reducen el nivel o actividad del factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF, por sus siglas en inglés) y métodos para identificar estos agentes . ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El cáncer afecta las vidas de millones de personas en una base global. Los tratamientos, tales como quimioterapia producen resultados benéficos en algunas malignidades, sin embargo, algunos cánceres, que incluyen cánceres de pulmón, pancreático, próstata y colon, demuestran una respuesta pobre a tales tratamientos. Además, aun los cánceres inicialmente sensibles a la quimioterapia pueden regresar después de la remisión, con una propagación metastática extendida lo que conduce a la muerte del paciente. Además, los agentes de la quimioterapia, por ejemplo, agentes antineoplásicos, tienen toxicidades significativas, y se asocian con efectos secundarios que incluyen, por ejemplo, supresión de la médula REF.: 177197 ósea, disfunción renal, estomatitis, enteritis y pérdida de cabello. Por lo tanto, hay una necesidad de terapias efectivas y seguras para el tratamiento de cáncer, prevención de metástasis, etc. El factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF) es un factor de crecimiento con efectos demostrados en diferentes contextos fisiológicos y patológicos, que incluyen procesos mitogénicos y quimiotácticos, y la producción de componentes de matriz extracelular. CTGF ha sido implicado en un número de trastornos y condiciones, que incluyen, pero no se limitan a, trastornos que involucran angiogénesis , fibrosis y otras condiciones con aspectos proliferativos . El CTGF se ha identificado previamente como un factor crítico asociado con la formación y crecimiento de tumores y se sobre-expresa en una variedad de tipos de tumores (Ver, por ejemplo, Publicación Internacional No. W096/38172; enger et al., (1999) Oncogene 18:1073-1080; Xie et al. (2001) Cáncer Res 61:8917-8923; Igarashi et al., (1998) J Cutan Pathol 25 :143-148 ; Kasaragod et al., (2001) Ped Dev Pathol 4:37-45; Shakunaga et al., (2000) Cáncer 89:1466-1473; Vorwerk et al., (2000) Br J Cáncer 83:756-760 ; Pan et al., (2002) Neurol Res 24(7): 677-683). CTGF también se conoce que tiene actividad pro-angiogénica in vivo, un proceso importante asociado con la supervivencia tumoral . (Ver, por ejemplo, Brigstock (2002) Angiogenesis 5:153-165; Shi o et al., (1999) J Biochem 126:137-145; Babic et al., (1999) Mol Cell Biol 19:2958-2966; Ivkovic et al., (2003) Development 130:2779-2791; y Shimo et al., (2001) Oncology 61:315-322). Sin embargo, la correlación entre la expresión de CTGF y el pronóstico en pacientes con cáncer ha sugerido un papel específico contextual para las proteínas. Por ejemplo, la expresión de CTGF se asoció con una mayor supervivencia en el paciente de carcinomas de células escamosas, pero disminuyó la supervivencia en adenocarcinomas esofágicos. (Koliopanos et al., (2002) World J Surg 26:420-427) . De manera similar, CTGF ha sido implicado en el aumento de apoptosis de, por ejemplo, células de cáncer de mama y el aumento en la supervivencia de, por ejemplo, células de rabdomiosarcoma. (Ver, por ejemplo, Hishikawa et al. (1999) J Biol Chem 274:37461-37466; Croci et al., (2004) Cáncer Res 64:1730-1736). Por lo tanto, hay una necesidad para un entendimiento mejorado de los efectos relacionados con CTGF asociados con el cáncer y de las metodologías que sirven como blanco apropiadamente para el CTGF dentro del contexto de la enfermedad. En resumen, hay una necesidad en la técnica de tratamientos efectivos para el cáncer, y, específicamente, hay una necesidad de métodos para el tratamiento selectivo que dirige efectivamente los aspectos relacionados o inducidos con CTGF del cáncer. La presente invención satisface estas necesidades proporcionando métodos para reducir la supervivencia, expansión y metástasis de tumores, y, en particular, proporcionando métodos para reducir la supervivencia, expansión y metástasis de tumores pancreáticos.

La invención también proporciona agentes para el uso en los métodos, particularmente reactivos que reducen el nivel o actividad de CTGF y métodos para identificar estos agentes. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención proporciona, en un aspecto, un método para identificar un agente que inhibe el crecimiento celular independiente del anclaje, el método comprende (a) cultivar células MÍA PaCa-2, en donde las células se han identificado para expresar el factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF) , con un agente bajo condiciones apropiadas, en ausencia del agente, para el crecimiento de células independientes del anclaje; (b) medir la cantidad de crecimiento celular que se presenta en presencia del agente; y (c) comparar la cantidad de crecimiento celular que se presenta en presencia del agente con la cantidad de crecimiento celular que se presenta en ausencia del agente, en donde una disminución en la cantidad del crecimiento celular en presencia del agente con relación a la cantidad de crecimiento celular que se presenta en ausencia del agente es indicativa de un agente que inhibe el crecimiento celular independiente del anclaje. En algunas modalidades, el CTGF es CTGF humano. En algunas modalidades, las células MÍA PaCa-2 producen aproximadamente 0.3 a 2.2 µg de CTGF/105 células/48 horas. En diferentes modalidades, la medición de la cantidad del crecimiento celular comprende contar el grupo de células . En algunas modalidades, cultivar comprende dispersar las células en un medio de soporte semi-sólido apropiado para el crecimiento celular independiente del anclaje; en una modalidad específica, el medio de soporte semi-sólido comprende aproximadamente agar al 0.35%. La invención abarca varios métodos para usar un agente identificado por cualquiera de los métodos descritos anteriormente. En una modalidad, la invención contempla el uso de un agente, identificado por cualquiera de los métodos descritos anteriormente para identificar un agente que inhibe el crecimiento celular independiente del anclaje, para la manufactura de un medicamento para reducir la expansión de un tumor pancreático en un paciente. En otra modalidad, la invención proporciona el uso de un agente, identificado por los métodos descritos anteriormente para identificar un agente que inhibe el crecimiento celular independiente del anclaje, para la manufactura de un medicamento para reducir la supervivencia de células tumorales pancreáticas en un paciente. También se contempla en la presente el uso de un agente, identificado por los métodos descritos anteriormente para identificar un agente que inhibe el crecimiento celular independiente del anclaje, para la manufactura de un medicamento para reducir la metástasis de un tumor en un paciente. En un aspecto, la invención proporciona el uso de un agente que inhibe la actividad de CTGF para la manufactura de un medicamento para reducir la metástasis de un tumor en un paciente. Si un agente inhibe la actividad de CTGF puede determinarse por cualquiera de un número de métodos bien conocidos por lo experimentados en la técnica, por ejemplo, mediante el uso de la prueba de crecimiento celular independiente del anclaje descrita anteriormente. En los aspectos adicionales, la invención abarca el uso de un agente que inhibe la actividad de CTGF para la manufactura de un medicamento para reducir la expansión de un tumor pancreático en un paciente, y el uso de un agente que inhibe la actividad de CTGF para la manufactura de un medicamento para reducir la supervivencia de células tumorales pancreáticas en un paciente. Se contempla, para cualquiera de los usos descritos anteriormente de un agente identificado por los métodos descritos anteriormente para identificar un agente que inhibe el crecimiento celular independiente del anclaje o para cualquiera de los usos descritos anteriormente de un agente que inhibe la actividad de CTGF, que, en diferentes modalidades de la presente invención, el tumor es un tumor pancreático. Además se contempla, para cualquiera de los usos descritos anteriormente de un agente identificado por los métodos descritos anteriormente para identificar un agente que inhibe el crecimiento celular independiente del anclaje o para cualquiera de los usos descritos anteriormente de un agente que inhibe la actividad de CTGF, el tumor es, en diferentes aspectos, un adenocarcinoma o, en algunos aspectos, un adenocarcinoma del conducto. En algunas modalidades de cualquiera de los usos descritos anteriormente de un agente identificado por los métodos descritos anteriormente, para identificar un agente que inhibe el crecimiento celular independiente del anclaje o para cualquiera de los usos descritos anteriormente de un agente que inhibe la actividad de CTGF, se contempla que el agente es un oligonucleótido que une específicamente a un polinucleótido que codifica el CTGF, un anticuerpo que une específicamente a CTGF, una molécula pequeña, o un aptámero, respectivamente . Para las modalidades en las que el agente es un anticuerpo que une específicamente a CTGF, también se contemplan las modalidades adicionales en las que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o un fragmento activo del mismo, o en las que el anticuerpo es CLN-1 o derivados del mismo . La invención proporciona además, para cualquiera de los usos descritos anteriormente de un agente identificado por los métodos descritos anteriormente para identificar un agente que inhibe el crecimiento celular independiente del anclaje o para cualquiera de los usos descritos anteriormente de un agente que inhibe la actividad de CTGF para la manufactura de un medicamento, tal medicamento puede, en algunas modalidades, comprender además un agente quimioterapéutico citotóxico. Además, se contempla que, para cada uno de los métodos de uso descritos anteriormente, el paciente es, en las modalidades preferidas, un mamífero, y es, en la mayoría de las modalidades preferidas, un humano. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra los niveles de expresión de CTGF en diferentes líneas celulares clónales de MÍA PaCa-2 transformadas establemente con una construcción de expresión de CTGF. Las líneas celulares que representan la producción de CTGF "bajo" (CBl y CB2 ) , "medio" (CE8 y CD2 ) y "alto" (CA9 y CB4) se usaron en los ejemplos proporcionados en la presente.

Las Figuras 2A-2B muestran las características de crecimiento de células MÍA PaCa-2 transformadas establemente con construcciones de expresión que codifican CTGF. La Figura 2A muestra que el nivel de CTGF producido por células MÍA PaCa-2 no afecta el crecimiento celular cuando se cultivan en una superficie bidimensional. La Figura 2B, sin embargo, muestra que el nivel de CTGF producido afecta el crecimiento celular y la formación de colonia cuando las células se cultivan en un medio de agar suave. Las Figuras 3A-3B muestran la dependencia del crecimiento independiente del anclaje sobre CTGF. La Figura 3A muestra las imágenes de células que no expresan (vector) o niveles medios (med) de CTGF. Los paneles superiores muestran que CTGF aumenta el número y la aparición de colonias de agar suave; los paneles inferiores muestran que el tratamiento con un anticuerpo que une CTGF reduce sustancialmente el número y el tamaño de las colonias. La Figura 3B muestra una diferencia cuantitativa en el número de colonias debido al nivel de expresión de CTGF y el tratamiento con anticuerpo. Las Figuras 4A y 4B muestran los cambios en el volumen y la mortalidad del tumor, respectivamente, en ratones que portan tumores derivados de las células de expresión de CTGF medio y alto. Las Figuras 5A-5B muestran que la supervivencia celular en tumores in si tu se correlaciona con el nivel de CTGF. La Figura 5A muestra un aumento en la proliferación de células y la Figura 5B muestra una disminución en las células apoptóticas en tumores derivados de células que expresan CTGF con relación a las células de control de vector. Las Figuras 6A, 6B y 6C muestran la correspondencia entre el nivel de expresión de CTGF in vi tro y los niveles de CTGF en plasma y orina en animales que tienen tumores para las células que expresan CTGF bajo, medio y alto y tumores derivados de las mismas. Las Figuras 7A y 7B muestran que los terapéuticos que sirven como blanco para CTGF reducen efectivamente la supervivencia y expansión de tumores derivados de células MÍA PaCa-2 que expresan altos niveles de CTGF y células Panc-1, respectivamente . Las Figuras 8A-8B muestran que la supervivencia celular en tumores in si tu es dependiente de CTGF. La Figura 8A muestra que un terapéutico que sirve como blanco para CTGF no altera significativamente la capacidad proliferativa de las células, y la Figura 8B muestra que un agente que sirve como blanco para CTGF aumenta significativamente la apoptosis. La Figura 9 muestra la supervivencia, expansión y metástasis de tumores derivados de la implantación ortotópica de células PANC-1 en el páncreas de ratones y la capacidad de un agente que sirve como blanco para CTGF para reducir la supervivencia y la metástasis de los tumores . DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Antes de que se describan las presentes composiciones y métodos, se entiende que la invención no se limita a las metodologías, protocolos, líneas celulares, pruebas y reactivos particulares descritos, ya que estos pueden variar. También se entenderá que la terminología usada en la presente se pretende que describe las modalidades particulares de la presente invención, y no es de ninguna manera para limitar el alcance de la presente invención como se establece en las reivindicaciones anexas. Debe observarse que, como se usa en la presente y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un", "una" y "el, la" incluyen las referencias en plural, a menos que el contexto dictamine claramente lo contrario. De esta manera, por ejemplo, una referencia a "un fragmento" incluye una pluralidad de tales fragmentos; una referencia a un "anticuerpo" es una referencia a uno o más anticuerpos y a equivalentes de los mismos conocidos por los experimentados en la técnica, etcétera. A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen los mismos significados como se entiende comúnmente por un experimentado en la técnica, al que se refiere la invención. Aunque cualquiera de los métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente pueden usarse en la práctica o prueba de la presente invención, se describen ahora los métodos, dispositivos y materiales preferidos. Todas las publicaciones citadas en la presente se incorporan por referencia en su totalidad con el propósito de describir y exponer las metodologías, reactivos y herramientas reportados en las publicaciones que pueden usarse en conjunto con la invención. Nada en la presente se construirá como una admisión de que la invención no tiene el derecho de preceder tal descripción en virtud de la invención anterior. La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, los métodos de la química, bioquímica, biología molecular, biología celular, genética, inmunología y farmacología convencionales , dentro del experimentado en la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la literatura. La presente invención proporciona métodos y compuestos para tratar el cáncer en un paciente, en particular, cáncer pancreático, inhibiendo la expresión y/o actividad de CTGF. En particular, la invención proporciona métodos para reducir la metástasis tumoral y para reducir la supervivencia y expansión de tumores inhibiendo la expresión y/o actividad de CTGF. En algunas modalidades, la invención proporciona métodos para reducir la metástasis de tumores pancreáticos, supervivencia de tumores pancreáticos y expansión de tumores pancreáticos . En otra modalidad, los métodos reducen o inhiben la metástasis de tumores óseos. En una modalidad, la invención proporciona un método para reducir o inhibir la expansión de tumores en un paciente, el método comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de un agente que inhibe la expresión y/o actividad de CTGF. La expansión tumoral puede incluir diferentes aspectos de la biología del tumor, que incluyen, pero no se limitan a, modulación de la periferia entre el tumor y el estroma circundante; señalización y restablecimiento de las células vecinas, no transformadas; etc. En una modalidad particular, la invención proporciona un método para inhibir la expansión de tumores pancreáticos en un paciente, el método comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de un agente que inhibe la expresión y/o actividad de CTGF. En diferentes modalidades, el paciente es un mamífero, particularmente un humano. En diferentes aspectos, el agente es un anticuerpo, una molécula pequeña o una molécula a base de oligonucleótido, tales como aptámeros y antisentido. En otra modalidad, la invención proporciona un método para reducir o inhibir la supervivencia de tumores en un paciente, particularmente la supervivencia de células tumorales, el método comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de un agente que inhibe la expresión y/o actividad de CTGF. La supervivencia de células tumorales puede incluir diferentes aspectos de la biología del tumor, que incluyen, pero no se limitan a, modular el potencial apoptótico; etc. En una modalidad particular, la invención proporciona un método para inhibir la supervivencia de tumores pancreáticos, particularmente la supervivencia de células de tumores pancreáticos, en un paciente, el método comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de un agente que inhibe la expresión y/o actividad de CTGF. En diferentes modalidades, el paciente es un mamífero, particularmente un humano. En diferentes aspectos, el agente es un anticuerpo, una molécula pequeña o una molécula a base de oligonucleótido, tales como aptámeros y antisentido. En otra modalidad, la invención proporciona un método para reducir o prevenir la metástasis tumoral en un paciente, el método comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de un agente que inhibe la expresión o actividad de CTGF. La metástasis puede involucrar e incluir procesos en el sitio del tumor primario que facilitan la invasión tumoral de los tejidos, órganos vecinos, etc., o la invasión de los sistemas linfático y/o circulatorio. La metástasis también puede involucrar e incluir procesos en el sitio de un tumor secundario que facilita la unión e invasión por el tumor metastatizado. Tales procesos pueden ser debido a la célula cancerígena, por ejemplo, sobre-expresión de CTGF dentro de la célula cancerígena, etc.; o debido al tejido endógeno en el sitio de metástasis, por ejemplo, sobre-expresión de CTGF por el tejido estromal y/o respuesta del hueso, hígado, etc., a CTGF. En un aspecto particular, la invención proporciona un método para inhibir o prevenir la metástasis de un tumor pancreático en un paciente, el método comprende administrar a un paciente una cantidad efectiva de un agente que inhibe la expresión o actividad de CTGF. En diferentes modalidades, el paciente es un mamífero, particularmente un humano. En diferentes aspectos, el agente es un anticuerpo, una molécula pequeña o una molécula a base de oligonucleótido, tales como aptámeros y antisentido. También se proporcionan los métodos para reducir o prevenir la mortalidad asociada con el cáncer, en particular el cáncer pancreático, los métodos comprenden administrar a un paciente que tiene cáncer o está en riesgo de tener cáncer, una cantidad efectiva de un agente que inhibe la expresión y/o actividad de CTGF. En diferentes aspectos, el paciente es un mamífero, particularmente un humano. En diferentes modalidades, el agente es un anticuerpo, una molécula pequeña o una molécula a base de oligonucleótido, tales como aptámeros y antisentido. La presente invención establece por primera vez una relación causal directa entre el CTGF y la supervivencia y expansión de tumores, particularmente tumores pancreáticos. El tumor pancreático, como se usa en la presente, incluye cualquier tumor localizado en, o derivado de células del páncreas. Además, la presente invención demuestra la correlación explícita entre la expresión de CTGF y la supervivencia de células tumorales, la expansión del tumor, el grado de metástasis, etc. La presente invención demuestra además que los agentes o compuestos que sirven como blanco para CTGF, por lo que inhiben potencialmente la expresión y/o actividad de CTGF, reducen efectivamente la expansión del tumor, aumentar la apoptosis de las células tumorales, reducen la metástasis de tumores y mejoran la capacidad de sobrevivir del paciente: En particular, la invención demuestra que los agentes o compuestos que sirven como blanco para CTGF reducen efectivamente la expansión de tumor pancreático, aumentan la apoptosis de células de tumor pancreático y reducen la metástasis de tumores pancreáticos. Factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF) El CTGF es una heparina de 36 kD, rica en cisteína, que une la glucoproteína secretada aislada originalmente de los medios de cultivo de las células endoteliales de la vena umbilical de humano. (Bradham et al., (1991) J Cell Biol 114:1285-1294; Grotendorst and Bradham, USPN 5,408,040). El CTGF pertenece a la familia de proteínas CCN (CTGF, Cyr61, Nov) , que incluye el producto del gen casi inmediato, inducido por el suero Cyr61, el oncogen putativo Nov, y las proteínas secretadas inducidas por Wnt (WISP)-l, -2 y -3. (Ver, por ejemplo, O'Brian et al., (1990) Mol Cell Biol 10:3569-3577; Joliot et al., (1992) Mol Cell Biol 12:10-21; Ryseck et al., (1991) Cell Growth and Diff 2:225-233; Simmons et al. (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:1178-1182; Pérmica et al., (1998) Proc Nati Acad Sci USA, 95:14717-14722; y Zhang et al., (1998) Mol Cell Biol 18:6131-6141). Las proteínas CCN se caracterizan por la conservación de 38 residuos de cisteína que constituyen aproximadamente 10% del contenido de aminoácidos totales y dan origen a una estructura modular con dominios N y C terminales. La estructura modular del CTGF incluye las porciones conservadas para las proteínas de unión del factor de crecimiento similar a insulina (IGF-BP) y el factor de von Willebrand (VWC) en el dominio N terminal y la trombospondina (TSPl) y una porción de nudo de cisteína en el dominio C terminal . Aunque la presente invención demuestra el papel directo de CTGF en la supervivencia, expansión y metástasis tumoral y demuestra que los agentes que sirven como blanco para CTGF son benéficos en el tratamiento de cáncer, la invención contempla específicamente un papel similar para otros miembros de la familia de CCN, en particular Cyr61. La expresión de CTGF se induce por diferentes factores, que incluyen los miembros de la familia de TGF-ß, por ejemplo, TGF-ßl, activina, etc.; trombina, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, por sus siglas en inglés) , endotelina y angiotensina II (Franklin (1997) Int J Biochem Cell Biol 29:79-89; Wunderlich (2000) Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 238:910-915; Dentón and Abraham (2001) Curr Opin Rheumatol 13:505-511; y Riewald (2001) Blood 97:3109-3116; Xu et al., (2004) J Biol Chem 279:23098-23103). Tales factores se han asociado con la tumorigénesis previamente. Por lo tanto, en un aspecto de la presente invención se refiere al tratamiento de cánceres cuyo pronóstico negativo se correlaciona con estos factores, por ejemplo, TGF-ß.

CTGF se ha asociado con diferentes neoplasmas, pero su papel específico no se ha elucidado claramente. El CTGF se describió originalmente como un factor mitogénico y se enlazó con la proliferación de células tumorales, por lo que afectaba la formación y el crecimiento del tumor. La expresión de CTGF parece que se presenta en células dentro y en la vecindad del tumor, lo que condujo a algunos investigadores a sugerir que el CTGF puede facilitar la reorganización de la matriz extracelular y promover la neovascularización del tumor. (Ver, por ejemplo, Shi o et al., (2001) Oncogene 61 (4) : 315-22; Pan et al., (2002) Neurol Res 24 (7) : 677-83 ; Kondo et al., (2002) Carcinogenesis 23 (5) : 769-76) . El CTGF ha sido implicado en el aumento de apoptosis, por ejemplo, en células de cáncer de mama y en el aumento de la supervivencia, por ejemplo, en células de rabdomiosarcoma. (Ver, por ejemplo, Hishikawa et al., (1999) J Biol Chem 274:37461-37466; Croci et al., (2004) Cáncer Res 64:1730-1736). Por lo tanto, el papel del CTGF en el cáncer puede ser específico del contexto, dependiendo del tipo y origen del tumor primario. El CTGF se expresa específicamente en linfoblastos malignos en leucemia linfoblástica aguda (ALL) y la expresión de CTGF se correlaciona altamente con la etapa del tumor en cáncer y glioma de mama. (Ver, por ejemplo, Xie et al., (2001) Cáncer Res 61:8917-8923; y Xie et al., (2004) Clin Cáncer Res 10:2072-2081). La expresión de CTGF también se ha asociado con el cáncer pancreático invasor y en cáncer de mama que metastatiza el hueso. (Ver, por ejemplo, Iacobuzio-Donahue et al., (2002) Am J Pathol 160:91-99; Kang et al., (2003) Cáncer Cell 3:537-549). En el cáncer de mama metastático, el CTGF se sobre-expresa en las células metastáticas que inducen la osteolisis, en donde la interacción mediada por las células del tumor y/o la degradación de esta matriz ósea libera los factores de crecimiento que activan los osteoclastos lo que conduce a la resorción ósea. Los cánceres metastáticos adicionales que exhiben fenotipos osteolíticos prominentes o que metastatizan al hueso son próstata, carcinoma hepatocelular, colorrectal, pancreático, ovario, carcinoma de células renales, mielanoma múltiple, linfoma y leucemia. La presente invención, por primera vez, demuestra una relación causal directa entre el CTGF y la supervivencia de células tumorales, expansión del tumor y metástasis de tumores. Por ejemplo, la presente invención demuestra que los tumores derivados de células MÍA PaCa-2 transfectadas con la construcción de expresión de CTGF muestran una supervivencia mejorada de células tumorales, un aumento en el tamaño e invasión del tumor y una mayor propensión de tumores primarios a metastatizarse; y que los animales que portan estos tumores muestran una mayor mortalidad. La presente invención demuestra además que la expansión del tumor, metástasis y la mortalidad del paciente se correlaciona con los niveles de expresión de CTGF, es decir, los ratones implantados con células que expresan altos niveles de CTGF exhiben un mayor nivel de expansión y mortalidad tumoral que los ratones implantados con células que expresan menores niveles de CTGF, por ejemplo, células que expresan CTGF medio. Además, la presente invención demuestra que la administración in vivo de un agente que inhibe la expresión o actividad de CTGF disminuye o previene la expansión tumoral . En particular, los ratones que portan tumores derivados de las células que expresan niveles medios y altos de CTGF muestran una expansión tumoral reducida y una mortalidad reducida debido al tratamiento con un anticuerpo anti-CTGF. Esto demuestra que la expresión de CTGF se enlaza causalmente a la supervivencia y expansión tumoral y se asocian con la mortalidad del huésped, y que los terapéuticos que sirven como blanco para CTGF pueden ser efectivos para retardar la expansión tumoral y reducir la mortalidad en pacientes con cáncer. Aunque no se limita por ningún mecanismo particular, la presente invención contempla el papel de CTGF en la regulación de la actividad de NFKB, un factor de transcripción asociado con las rutas de proliferación celular y supervivencia celular en diferentes trastornos, incluyendo cáncer pancreático. (Ver, por ejemplo, Algul (2002) Int J Gastrointest Cáncer 31:71-78). La regulación de NFKB involucra probablemente otros componentes de la señalización, que incluyen, pero no se limitan a, inhibición de I?B y modulación de glucógeno sintasa cinasa (GSK)-3ß. (Ver, por ejemplo, Hoeflich et al., (2000) Nature 406:86-90). En un aspecto, la presente invención contempla una ruta de señalización que involucra la activación de GSK-3ß y NFKB por un mecanismo dependiente de CTGF y proporciona agentes que modulan la expresión y/o actividad de CTGF para modular adicionalmente la actividad de GSK-3ß y NFKB en dirección 3 ' . De esta manera,- en un aspecto, los presentes métodos y compuestos se aplican al tratamiento de una amplia variedad de cánceres, que incluyen, pero no se limitan a, adenocarcinomas, particularmente carcinomas del conducto como se presentan frecuentemente en el cáncer de mama y pancreático; tumores neuroepiteliales, por ejemplo, gliomas; carcinoides gastrointestinales, en particular carcinoides ileales; leucemia linfoblástica aguda, rabdiomiosarcona y melanoma; y en cánceres con una propensión para la metástasis al hueso, particularmente en donde el tumor secundario produce efectos sobre el hueso, incluyendo formación de lesión osteolítica y osteoblástica. En aspectos particulares, se proporciona el uso de los presentes métodos y compuestos para tratar el cáncer pancreático. Prue¿>a de selección En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para la identificación de agentes o compuestos para reducir la supervivencia y expansión tumoral, particularmente tumores del páncreas. Los métodos para identificar los compuestos o agentes usan diferentes procedimientos descritos en los ejemplos en la presente; por ejemplo, un animal que porta un tumor derivado de una célula que expresa CTGF se trata con un compuesto o agente y se miden la expansión y metástasis tumoral. Un agente que retarda o previene la expansión y la supervivencia tumoral y/o previene o reduce la metástasis tumoral sería seleccionado para el uso en los presentes métodos . En una modalidad, la presente invención proporciona una prueba de selección para identificar un agente que modula el crecimiento celular independiente del anclaje (AIG) , que es una característica demostrada de las células tumorigénicas . El método comprende cultivar una célula que expresa CTGF con un agente bajo condiciones apropiadas, en ausencia del agente, para el crecimiento independiente del anclaje de la célula; medir la cantidad de crecimiento celular que se presenta en presencia del agente y comparar la cantidad del crecimiento celular que se presenta en presencia del agente con la cantidad de crecimiento celular que se presenta en ausencia del agente, en donde un cambio en la cantidad del crecimiento celular en presencia del agente con relación a la cantidad del crecimiento celular que se presenta en ausencia del agente es indicativo de un agente que modula AIG. En algunas modalidades, las células usadas en la prueba expresan CTGF de manera endógena, mientras que en otras modalidades, las células se han modificado recombinantemente para expresar CTGF. Cualquier célula que expresa CTGF puede usarse en la prueba. En algunas modalidades descritas en la presente, la célula es una célula PANC-1. Las células PANC-1 son, células de carcinoma epitelioides del conducto obtenidas originalmente de un cáncer pancreático primario. (Lieber et al., (1975) Int J Cáncer 15:741-747). En otras modalidades descritas en la presente, la célula es una célula MÍA PaCa-2 modificada recombinantemente para expresar CTGF. Las células MÍA PaCa-2 se obtuvieron originalmente de un cáncer pancreático primario de humano. (Yunis et al., (1975) Int J Cáncer 19:128-135). Cuando las células se han modificado para expresar CTGF, el CTGF puede ser cualquier proteína de CTGF que se presenta naturalmente, por ejemplo, CTGF humano, FISP-12 de ratón, etc.; o cualquier proteína de CTGF sintética que mantiene la actividad requerida, es decir, modulación de AIG de un CTGF que se presenta naturalmente. En una modalidad particular, el CTGF es CTGF de humano. Las células expresan típicamente cantidades suficientes de CTGF para producir una actividad medible, por ejemplo, supervivencia, expansión de colonia, etc., en un periodo dado. Por ejemplo, cuando aproximadamente 105 células que producen CTGF endógeno o transfectadas establemente con una construcción de expresión de CTGF se colocan en un medio de crecimiento apropiado y se cultivan durante 48 horas, por lo menos 0.3 µg de CTGF, y más específicamente alrededor de 0.3 a 2.2 µg de CTGF, se producirán y secretarán en el medio. En las modalidades particulares de la prueba de selección, las células que expresan CTGF pueden dispersarse en un medio de soporte semi-sólido apropiado para AIG. En una modalidad, el medio de soporte semi-sólido comprende agar, por ejemplo, Agar Noble. El agar puede estar a cualquier concentración apropiada para soportar el AIG; en una modalidad particular, el agar está a una concentración de aproximadamente 0.35%. El crecimiento celular puede medirse por cualquier método conocido por un experimentado en la técnica. En una modalidad, el crecimiento celular comprende contar los grupos de células en un área definida del medio de soporte semi-sólido. En otra modalidad, el crecimiento celular comprende medir el tamaño del grupo promedio. Compuestos y agentes Los diferentes compuestos y agentes pueden usarse en los presentes métodos. Los compuestos y agentes modulan la actividad de CTGF, tal actividad incluye, pero no se limita a, expresión de CTGF por una célula y alteraciones en el fenotipo celular debido a CTGF. Las alteraciones en el fenotipo celular pueden incluir modificación de la superficie celular o macromoléculas intracelulares, tales como proteínas, por ejemplo, por fosforilación o des-fosforilación; cambios en la expresión génica como se detectan, por ejemplo, por micro-arreglo o análisis de PCR cuantitativo; y/o cambios en la expresión y/o secreción de proteínas, por ejemplo, aumento en la producción de colágeno por una célula. Las alteraciones en el fenotipo celular también pueden incluir, pero no se limitan a, cambios totales en la forma celular, adhesión de una célula a otra célula y/o a la matriz extracelular y motilidad celular como se mida, por ejemplo, en una prueba de cámara Boyden. En particular, los compuestos y agentes para el uso en los presentes métodos modulan el crecimiento independiente del anclaje de una célula como se mida, por ejemplo, en la prueba como se describió anteriormente o proporcionada en los ejemplos en la presente. En algunas modalidades, el agente es un anticuerpo que une específicamente a CTGF. En una modalidad preferida, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal . En otra modalidad preferida, el anticuerpo es un anticuerpo de humano o humanizado. Los anticuerpos que unen a CTGF se describen en la patente U.S. No. 5,408,040; Publicación internacional No. WO 99/07407; Publicación internacional No. WO 99/33878 y Publicación internacional No. WO 00/35936, cada una de estas referencias se incorpora en la presente en su totalidad. En las modalidades particulares, el agente comprende CLN-1, que se describe en la Publicación internacional No. WO 2004/108764, incorporada por referencia en la presente en su totalidad. Cualquier anticuerpo puede usarse en su totalidad, o puede modificarse, de modo que se mantenga una porción del anticuerpo que retiene una actividad apropiada contra CTGF, por ejemplo, actividad de unión de epítopo. Por ejemplo, un anticuerpo derivado de CLN-1 puede comprender una cadena ligera de CLN-1, una cadena pesada de CLN-1 o dominios variables de la cadena pesada y ligera. En una modalidad particular, el agente es un anticuerpo producido por la línea celular ATCC acceso no. PTA-6006. Los anticuerpos o fragmentos de los mismos, pueden administrarse por diferentes medios conocidos por los experimentados en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos a menudo se inyectan intravenosa, intraperitoneal o subcutáneamente. Las formulaciones de anticuerpos también pueden inyectarse intra-articularmente, intraocularmente, intradérmicamente, intratecalmente, etc. En otras modalidades, el agente es una molécula pequeña. Se han descrito los inhibidores de la molécula pequeña de la expresión y/o actividad de CTGF; por ejemplo, la Publicación internacional WO 96/38172 identifica los moduladores de cAMP tales como la toxina del cólera y 8Br-cAMP como inhibidores de la expresión de CTGF. Por lo tanto, los compuestos conocidos para aumentar el nivel de cAMP en las células, por ejemplo, análogos de prostaglandina y/o prostaciclina tales como Iloprost; inhibidores de fosfodiesterasa IV, etc., pueden usarse para modular la expresión de CTGF. (Ver, por ejemplo, la publicación internacional No. WO 00/02450; Ricupero et al., (1999) Am J Physiol 277 :L1165-1171; también, ver Ertl et al., (1992) Am Rev Respir Dis 145:A19 y Kohyama et al., (2002) Am J Respir Cell Mol Biol 26:694-701). También, los inhibidores de las cinasas activadas de mitógeno de serina/treonina, particularmente p38, cinasa dependiente de ciclina, por ejemplo CDK2 y glucógeno sintasa cinasa (GSK)-3 se han implicado también en la disminución de la expresión y/o señalización de CTGF. (Ver, por ejemplo, Matsuoka et al., (2002) Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 283 :L103-L112 ; Yosimichi et al., (2001) Eur J Biochem 268:6058-6065; Publicación internacional No. WO 01/38532; y Publicación internacional No. WO 03/092584). Estos agentes pueden usarse para reducir la expresión/actividad de CTGF y por lo tanto mejoran o previenen los procesos patológicos inducidos por CTGF.. Estos compuestos pueden formularse y administrarse de acuerdo con los procedimientos establecidos dentro de la técnica. (Ver, por ejemplo, Gennaro, Ed. (2000) Remington' s Pharmaceutical Sciences, 20th edition Mack Publishing Co., Easton PA; y Hardman, Limbird and Gilman, Eds . (2001) The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th Edition, McGraw Hill Co. New York NY.) . En diferentes modalidades, el agente es un antisentido u aptámero oligo- o polinucleótido. Las tecnologías antisentido, que incluyen ácidos ribonucleicos de interferencia pequeña (siARNs) , micro-ARNs (miARNs) , ribozimas y secuencia antisentido dirigidas para modular la expresión de CTGF también pueden usarse para inhibir la expansión y progresión y la metástasis del tumor y disminuir las tasas de mortalidad asociadas (Ver, por ejemplo, Zeng (2003) Proc Nati Acad Sci USA 100:9779-9784; and Kurreck (2003) Eur J Biochem 270:1628-1644) . Las construcciones antisentido que sirven como blanco para la expresión de CTGF se han descrito y usado para reducir la expresión de CTGF en diferentes tipos celulares. (Ver, por ejemplo, Solicitud internacional No. WO 96/38172; Publicación internacional No. WO 00/27868; Publicación internacional No. WO 00/35936; Publicación internacional No. WO 03/053340; Kothapalli et al., (1997) Cell Growth Differ 8(1): 61-68; Shimo et al., (1998) J Biochem (Tokyo) 124 (1) : 130-140; y Uchio et al., (2004) Wound Repair Regen 12:60-66). Tales construcciones antisentido pueden usarse para reducir la expresión de CTGF y de esta manera mejorar o prevenir los efectos modulados por CTGF, por ejemplo, la expansión y/o metástasis tumoral, etc. Tales construcciones pueden diseñarse usando los vectores apropiados y los reguladores de expresión para la expresión celular o específica de tejido y la expresión constitutiva o inducible. Estas construcciones genéticas pueden formularse y administrarse de acuerdo con los procedimientos establecidos en la técnica. Los aptámeros que modulan la actividad de CTGF pueden ser oligonucleótidos de ARN o ADN o las proteínas identificadas, por ejemplo, usando la prueba de selección proporcionada en la presente. Los aptámeros en general identificados por medio de un proceso llamado SELEX (evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial) , un proceso de selección iterativo para la selección y amplificación de un aptámero que tiene actividad y selectividad apropiada. (Ver, por ejemplo, Ellington and Szostak (1990) Nature 346: 818-822; Klug and Famulok (1994) Mol Biol Rep 20:97-107; y Brody and Gold (2000) J Biotechnol 74:5-13). Las bibliotecas de aptámeros, compuestas por lo regular de, por ejemplo, oligonucleótidos de ADN o ARN en forma de hebra que contienen una región central de secuencias aleatorias flanqueadas por regiones constantes para la transcripción subsecuente, transcripción inversa y amplificación de ADN, están fácilmente disponibles o preparadas (Ver, por ejemplo, Fiegon et al., (1996) Chem Biol 3:611-617) . En algunos aspectos, el compuesto o agente se administra a un paciente para reducir o prevenir la capacidad de supervivencia de las células del tumor, la expansión del tumor y la metástasis del tumor. En algunas modalidades, el compuesto o agente sirve como blanco específica y selectivamente para CTGF, por ejemplo, inhibiendo la expresión y/o actividad de CTGF sin un efecto significativo sobre los otros factores. En otras modalidades, el compuesto o agente sirve como blanco específica y selectivamente para los miembros de la familia de CCN, por ejemplo, inhibiendo la expresión y/o actividad de los miembros de la familia de CCN sin un efecto significativo sobre los otros factores. En los aspectos particulares, los miembros de la familia de CCN se seleccionan del grupo que consiste de CTGF y Cyr61. El compuesto o agente puede administrarse solo o en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales. Por ejemplo, un compuesto o agente que sirve como blanco para CTGF puede sensibilizar el tumor a la acción de un segundo agente terapéutico y usarse para limitar o reducir la capacidad de supervivencia de las células del tumor, es decir, proporcionar un efecto citostático; o puede reducir la masa del tumor, es decir, proporcionar un efecto citotóxico selectivo; mientras que puede usarse un quimioterapéutico o radiación tradicional para reducir la masa del tumor, es decir, proporcionar un efecto citotóxico no específico. El uso de los presentes métodos en este contexto permitiría el uso de dosis más pequeñas de quimioterapéutico o radiación para lograr el resultado final deseado, reduciendo de esta manera los efectos secundarios adversos asociados comúnmente con las terapias de cáncer no específicas tradicionales. Además, el compuesto o agente puede combinarse con un segundo agente terapéutico, por ejemplo, un agente anti-angiogénico tal como Avastin; una tirosina anti-receptora y/o agente de serina/treonina cinasa tal como Tarceva, etc. Estas y otras modalidades de la presente invención se presentarán fácilmente para los experimentados en la técnica desde el punto de vista de la presente descripción. EJEMPLOS La invención se entenderá adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos, que se pretenden para ser exclusivamente ejemplares de la invención. Estos ejemplos se proporcionan exclusivamente para ilustrar la invención reivindicada. La presente invención no se limita en alcance por las modalidades ejemplificadas, que se destinan únicamente como ilustraciones de los aspectos simples de la invención. Cualquiera de los métodos que son funcionalmente equivalentes está dentro del alcance de la invención. Las diferentes modificaciones de la invención además de las descritas en la presente llegarán a ser evidentes para los experimentados en la técnica a partir de la descripción anterior y las figuras anexas. Estas modificaciones se pretende que caigan dentro del alcance de las reivindicaciones anexas . Ejemplo 1: Generació de lineas celulares que expresan diferentes niveles de CTGF Células MÍA PaCa-2 (American Type Culture Collection (ATCC) , Manassas VA) se dice que son insensibles a los efectos inhibidores de crecimiento de TGF-ßl. (Ver, por ejemplo, Freeman et al. (1995) J Cell Physiol 165:155-163). Para determinar si las células MÍA PaCa-2 proporcionarían un huésped apropiado para la expresión de CTGF exógeno, se determinó la expresión constitutiva e inducible de TGFß de CTGF midiendo los niveles de CTGF en los sobrenadantes del cultivo celular usando una prueba de ELISA que mide el fragmento N terminal dividido y el CTGF total . (Ver la publicación internacional No. WO 03/024308, incorporada en la presente en su totalidad) . Ya que no se detectó la expresión de CTGF en los cultivos no tratados o tratados con TGF-ß2, las células MÍA PaCa-2 se usaron para generar células que expresan varios niveles de CTGF. Las células MÍA PaCa-2 se transfectaron con pSCMV-Puro-CTGF, una construcción adenoviral que codifica el CTGF de longitud total y el gen de resistencia a antibióticos de puromicina, usando el reactivo de lipofectamina 2000 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad CA) de acuerdo con los procedimientos suministrados por el fabricante. Los clones individuales se seleccionaron con base en su resistencia a la puromicina, y la expresión de CTGF y los niveles de proteína se determinaron por la prueba cuantitativa de RT-PCR y ELISA, respectivamente. Una serie de clones se aislaron y se caracterizaron, y se identificaron los clones representativos que exhibieron niveles bajos (clones CBl y CB2), medios (clones CE8 y CD2) y altos (clones CA9 y CB4) de la expresión de CTGF y la producción de proteína. Sobre placas de 105 células, los clones de expresión de CTGF bajo, medio y alto mostraron diferencias claras en la expresión de CTGF determinada por RT-PCR cuantitativa, con niveles secretados de CTGF que oscilan desde un bajo de aproximadamente 0.3 hasta un alto de aproximadamente 2.2 µg de CTGF/48 horas. (Figura 1). Las células MÍA PaCa-2 transfectadas con el vector que codifica el gen de resistencia a puromicina, pero no con CTGF, sirvieron como control (vector) . Como se observa en la línea celular parental de MÍA PaCa-2, las células transfectadas con el vector de control no expresaron niveles detectables de transcripción de CTGF o proteína. Ejemplo 2: El CTGF mejora el crecimiento independiente del anclaje Las tasas de crecimiento celular in vi tro de control del vector y los clones que expresan CTGF bajo, medio y alto se midieron para determinar si los niveles mayores de expresión de CTGF alteran la capacidad de las células tumorales de sobrevivir y/o proliferar. Las líneas celulares clónales se cultivaron en las placas de cultivo estándares durante hasta 12 días, con células cosechadas y contadas después de 3 , 6, 9 y 12 días. No se observó diferencia en la tasa o nivel de la acumulación celular entre las células de control del vector y las células que expresan diferentes niveles de CTGF (Figura 2A) . AIG es una característica común de las células cancerígenas . Aunque el CTGF fue incapaz aparentemente de inducir el AIG independientemente, se requirió para la inducción de AIG por TGF-ß. (Ver, por ejemplo, Frazier et al., (1996) J Invest Dermatol 107:404-411; y Kothapalli et al., (1997) Cell Growth Differ 8:61-68). Las células MÍA PaCa-2 se dice que tienen una eficiencia de formación de colonia en agar suave de aproximadamente 19%. (Yunis et al., (1977) Int J Cáncer 19:128-135). Para determinar el efecto de la expresión de CTGF en AIG en células MÍA PaCa-2, los clones que expresan los diferentes niveles de CTGF (CA9, CBl, CB4 y CD2) o que contienen sólo el vector (VA2, VA6, VBl y VB4) se analizaron para su capacidad de crecer en agar suave. En experimentos duplicados, aproximadamente 1.2xl03 células de cada clon se distribuyeron en 2.0 mi de Agar Noble al 0.35% que contiene 10% de suero fetal de bovino (FBS) y 10% de suero de carnero recién nacido (NCS) . Cada mezcla celular acoplada se superpuso en 1.5 mi de Agar Noble al 0.7% en placas de 6 pozos, y se adicionó una capa superior de 1.5 mi de agar Noble al 0.7% a cada pozo para prevenir la evaporación. Las placas se incubaron durante 11 días en un incubador humidificado a 37°C, 5.0% de C02. Se enumeró el número de colonias contando una rejilla de 1.5 cm por 1.5 cm bajo un microscopio. Los conteos totales de la colonia se extrapolaron a la placa completa con base en la relación del área superficial de cada pozo al área superficial de la rejilla. Las morfologías de la colonia se fotografiaron a una amplitud 20x. Aunque las células MÍA PaCa-2 transformadas sólo con el vector demostraron AIG, el número de colonias formadas aumentó con el aumento en la expresión de CTGF. (Figura 2B) . Los paneles superiores en la Figura 3A muestran una morfología de colonia de clones que expresan CTGF y clones de vector nulo, respectivamente. La mayoría de las colonias formadas en los clones de expresión de CTGF y las colonias que surgen de los clones de expresión de CTGF fueron, en general, más grandes que las colonias que surgen de los clones del vector nulo. Estos resultados demuestran que el CTGF mejora el crecimiento independiente del anclaje de las células MÍA PaCa-2 y los niveles mayores de expresión de CTGF resultan en un mayor tamaño de la colonia. Ejemplo 3: Agentes que inhiben el CTGF reducen el crecimiento independiente del anclaje Conforme el CTGF mejora el AIG (ver el ejemplo anterior) , los agentes que reducen la actividad y/o la disponibilidad de CTGF se probaron en la prueba de AIG para determinar si pueden reducir la formación de colonia. La capacidad de los anticuerpos que sirven específicamente como blanco para CTGF, en general, tales como los descritos en la patente U.S. 5,408,040, para inhibir AIG en células MÍA PaCa-2 se probaron usando la prueba de agar suave como se describió anteriormente con las siguientes modificaciones. Un anticuerpo monoclonal de humano, CLN-1 (ver la Publicación internacional WO 2004/108764) , que une específicamente CTGF o un IgG humano de control se adicionó a una concentración final de 100 µg/ml a agar suave que contiene células CD2 del clon que expresa CTGF o células VA6 del clon del vector nulo. Las placas se re-alimentaron en el día 5 con 1.5 mi de capa superior que contiene 100 µg/ml de CLN-1 o IgG de humano. Las placas se incubaron durante 11 días y las valoraciones se llevaron a cabo como se describió anteriormente. Como se muestra visualmente en los paneles inferiores de la Figura 3A, el tratamiento con CLN-1 inhibió significativamente la formación de colonia por las células que expresan CTGF. La cuantificación del resultado muestra que la formación de colonia de anticuerpo reducido por las células que expresan CTGF aproximadamente 85%, pero produjo sólo una inhibición débil en la formación de colonia por los clones del vector. (Figura 3B) . IgG de control no tuvo efecto sobre la formación de colonia basal por control del vector o las células que expresan CTGF. Los resultados demuestran que los terapéuticos que sirven como blanco para la actividad y/o disponibilidad de CTGF son efectivos en la reducción o inhibición del crecimiento independiente del anclaje en células cancerígenas pancreáticas MÍA PaCa-2 y potencialmente en general en células cancerígenas . Ejemplo 4: CTGF mejora la expansión tumoral y aumenta la mortalidad del huésped Ratones hembra de 8 a 10 semanas de edad SCID (inmunodeficientes combinados graves; Simonsen Laboratoies, Inc., Gilroy CA) o desnudos atímicos (nu/nu; Harían, Indianapolis IN) se inyectaron subcutáneamente con aproximadamente 107 células de los clones MÍA PaCa-2 que expresan CTGF de control, bajo, medio o alto. Los ratones inyectados se monitorearon para la expansión del tumor, con el tamaño y volumen del tumor (calculado como longitud x ancho x altura) medido en intervalos semanales. Se promediaron las mediciones para los animales que recibieron la inyección del mismo tipo de clon. Los tumores se cortaron y se fijaron en parafina. Se tiñeron secciones secuenciales de 4 µm de parafina con anticuerpo de conejo (1:50; Zymed Laboratories, Inc., South San Francisco CA) dirigido contra el antígeno nuclear Ki-67, que sólo está presente en las células proliferantes (Gerdes et al., (1984) J Immunol 133:1710-1715), para cuantificar las células proliferativas . La detección se realizó usando anticuerpos secundarios biotinilados en combinación con estreptavidina acoplada a peroxidasa de rábano picante (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove PA) y un sustrato de diaminonobenzidina (Invitrogen) . Las secciones separadas se tiñeron por el marcador de extremo agrietado dUTP de desoxinucleotidil transferasa biotina terminal (TÚNEL) , que identifica las células apoptóticas, usando el sistema TÚNEL fluorométrico DEADEND (Promega, Madison WI) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En forma breve, las secciones se desparafinaron y se rehidrataron, se permeabilizaron en proteinasa K y se trataron con el amortiguador de incubación de desoxinucleotidil transferasa terminal a 37°C durante 60 minutos en la oscuridad. Las secciones se tiñeron con el contador con 4 '-6-Diamidino-2-fenilindol (DAPI, Sigma) . El porcentaje de proliferación (Ki-67-positivo) y las células tumorales apoptóticas (TÚNEL positivo) se determinó en cuatro áreas seleccionadas aleatorias de secciones tumorales usando un microscopio Eclipse E800 de Nikon a una amplitud de 400x. Por lo menos 400 células por campo de alta energía se contaron para determinar el porcentaje de células positivas. Se calcularon los valores medios y las desviaciones estándar.

Los ratones inyectados con clones que expresan CTGF exhibieron una tumorigénesis mejorada proporcional al nivel de expresión de CTGF, como se ejemplifica por un aumento en el volumen del tumor con el tiempo en los animales inyectados con las células de expresión de control, medio y alto. (Figura 4A) . Los ratones implantados con las células MÍA PaCa-2 no mostraron esencialmente expansión tumoral. (Figura 4A) .

Además, aumentó la expresión de CTGF en los implantes celulares correlacionados con el aumento en la mortalidad en los animales inyectados; la Figura 4B muestra una gráfica de supervivencia acumulativa de Kaplan-Meier a través del tiempo que dura en el seguimiento o el tiempo de muerte. Los tumores que expresan CTGF también mostraron números aumentados de células proliferantes activamente (Figura 5A) y números reducidos de células apoptóticas activamente (Figura 5B) dentro del tumor. Aunque CTGF se describió originalmente como un factor mitogénico (ver, por ejemplo, Bradham et al., (1991) J Cell Biol 114:1285-1294), el aumento en la proliferación celular puede inducirse directa o indirectamente por CTGF. Estos resultados demuestran que CTGF está involucrado directamente en la expansión del tumor y por lo tanto, es un blanco para los agentes terapéuticos que puede reducir o inhibir la expansión del tumor in vivo . En particular, los agentes que bloquean o neutralizan la función de CTGF pueden proporcionar un beneficio terapéutico en los pacientes que portan tumores . Ejemplo 5: Niveles de plasma y orina de CTGF Ya que CTGF es un factor secretado, el aumento en la producción de CTGF por una masa de tumor expandido conduciría a un aumento en CTGF en el estroma circundante y, potencialmente, a través de toda la circulación del huésped. Para determinar si los huéspedes que portan tumores tuvieron mayores niveles de circulación de CTGF, se colectaron las muestras de orina y plasma de los ratones después de la inyección de clones MÍA PaCa-2 y la expansión de la masa del tumor detectable. Las muestras de plasma también se obtuvieron por sangrado terminal . Los niveles de CTGF se midieron usando la prueba de ELISA descrita en el Ejemplo 1. (Ver la Publicación internacional No. WO 03/024308) . Los niveles de expresión de CTGF también se volvieron a valorar en los sobrenadantes de cultivo de los clones de control o los que expresan niveles bajo, medio o lato de CTGF. El nivel de CTGF presenta en el plasma (Figura 6B) y orina (Figura 6C) de los huéspedes que portan tumores imitó la expresión de CTGF observada in vi tro en los sobrenadantes de cultivo de los clones MÍA PaCa-2 respectivos (Figura 6A) . De esta manera, los ratones implantados con clones de expresión de de alto exhibieron los niveles más altos de circulación y CTGF excretado, y los animales implantados con células que expresan CTGF bajo exhibieron los niveles más bajos detectables de circulación y de CTGF excretado. Los niveles de CTGF circulación y urinario en los animales inyectados con las células de control fueron indetectables . Los datos demuestran una correlación directa entre los niveles de expresión de CTGF en el tumor y los niveles de CTGF encontrados en los fluidos corporales, lo que sugiere que los tumores secretan CTGF directamente en su ambiente.

Dado que el grado de expresión de CTGF en las células tumorales puede correlacionarse directamente con el aumento de la expansión y la supervivencia del tumor y el nivel de CTGF producido por un tumor es proporcional al nivel de CTGF en los fluidos corporales, tales como sangre y orina, la medición de CTGF en, por ejemplo, el plasma o la orina de pacientes con cáncer puede ser indicativo de la etapa del tumor o correlacionarse con el peso del tumor, lo que sería un diagnóstico valioso y un biomarcador de pronóstico para la valoración de la enfermedad. Ejemplo 6: Agentes que inhiben el CTGF reducen la expansión del tumor Implantación subcutánea de MÍA PaCa-2 que expresan CTGF En dos estudios separados, los ratones se implantaron subcutáneamente con los clones MÍA PaCa-2 que expresan CTGF medio o alto y el tamaño y el volumen del tumor se determinaron en cada grupo de animales a intervalos semanales . Cuando los tumores alcanzaron un volumen de aproximadamente 250 mm3, los animales se estratificaron para recibir 20 mg de CLN-1 por kg de peso corporal o solución salina amortiguada con fosfato (vehículo de anticuerpo) dos veces por semana. La medición del tamaño y el volumen del tumor se continuó para cada grupo de animales a intervalos semanales . La administración del anticuerpo a ratones desnudos implantados con clones que expresan CTGF alto resultaron en una expansión del tumor más lenta, particularmente evidente después de aproximadamente dos semanas de terapia. (Figura 7A) . De manera similar, la administración del anticuerpo a los animales implantados con clones que expresan CTGF medio resultó en una expansión del tumor reducida comparado con los animales que recibieron el control del vehículo. Los datos muestran que la administración de un agente que sirve como blanco para CTGF, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal específico de CTGF, conduce a la reducción en la expansión del tumor poco después del inicio de la administración terapéutica, por ejemplo, después de una a dos semanas de tratamiento. Los agentes terapéuticos que sirven como blanco para CTGF ejercen beneficios en diferentes etapas de la progresión del tumor. Por ejemplo, las células que expresan CTGF alto se inyectaron subcutáneamente en los ratones para generar tumores de xenoinjerto como se describió anteriormente. En un cohorte, a los ratones se administraron 20 mg/kg de CLN-1 dos veces por semana comenzando aproximadamente dos días después de la inyección de las células. En una segunda cohorte, los tumores se dejaron expandir hasta un volumen de aproximadamente 250 mm3, tiempo en el cual la cohorte se estratificó y se dejó sin tratar o se trató con 20 mg/kg de anticuerpo dos veces por semana. La medición del tamaño y el volumen del tumor se continuó para cada grupo de animales en intervalos semanales.

En ambas cohortes, la administración del anticuerpo redujo la expansión del tumor. En un estudio similar, las células que expresan CTGF alto se inyectaron subcutáneamente en los ratones para generar tumores de xenoinjerto como se describió anteriormente, con una cohorte de ratones dejados sin tratar y una cohorte administrada con 20 mg/kg de terapia de anticuerpo dos veces por semana comenzando aproximadamente dos días después de la implantación del tumor. Consistente con los resultados mostrados anteriormente, la administración del anticuerpo inhibió la expansión y la progresión del tumor, de modo que por 8 semanas después de la implantación, los ratones tratados con el control de vehículo tuvieron volúmenes de tumor promedio aproximadamente dos veces que la cohorte tratada con el anticuerpo. Sin embargo, la terminación de la terapia del anticuerpo a 8 semanas resultó en la reanudación de la expansión del tumor. Los datos muestran que la administración de los agentes terapéuticos que sirven como blanco de CTGF reduce o previene la expansión del tumor a diferentes etapas de la progresión del tumor. De esta manera, los agentes que bloquean CTGF pueden proporcionar un beneficio terapéutico en los pacientes con cáncer que presentan con tumores de etapa temprana clínicamente establecidos. Los resultados demuestran que los agentes que sirven como blanco para CTGF pueden proporcionar beneficio para los pacientes con cáncer a diferentes etapas de la enfermedad, retardando la expansión de los tumores de etapa temprana y tardía. Esta terapia puede ser particularmente ventajosa en combinación con un segundo método terapéutico que ejerce un efecto citotóxico, por ejemplo, quimioterapia tradicional o terapia de radiación. El terapéutico dirigido a CTGF prevendría efectivamente la expansión del tumor, mientras la terapia citotóxica destruiría la masa del tumor existente. Implantación subcutánea de PANC-1 Ratones desnudos (Harían) se implantaron subcutáneamente con células PANC-1 en un procedimiento análogo al descrito en el Ejemplo 6.1. Los ratones inyectados con PANC-1 que expresan CTGF de manera endógena, exhibieron un aumento en el volumen del tumor durante el tiempo. (Figura 7B) . Como se observó con los tumores derivados de las células MÍA PaCa-2 que expresan CTGF, la administración del anticuerpo CLN-1 a los animales implantados con PANC-1 resultó en la expansión del tumor disminuida. (Figura 7B) . Nuevamente, los datos muestran que la administración de los agentes terapéuticos que sirven como blanco para CTGF reducen o previenen la expansión del tumor. El análisis de los tumores para proliferar y las células apoptóticas, usando los métodos descritos anteriormente, mostró que los agentes que sirven como blanco para CTGF no afectan significativamente el número de células proliferantes en el tumor (Figura 8A) , pero no restablecen la actividad apoptótica de las células dentro del tumor (Figura 8B) . Estos resultados sugieren que el CTGF es importante para la supervivencia de las células proliferantes, aumentando de esta manera la masa celular manteniendo la viabilidad de las células proliferantes y reduciendo la apoptosis celular. Los resultados demuestran además que la administración de un agente que sirve como blanco de CTGF proporciona un beneficio terapéutico. Implantación ortotópica de PANC-1 Los tumores se iniciaron por inyección subcutánea de aproximadamente 106 células de PANC-1 en el flanco de los ratones desnudos (Harían) . Después de 2-6 semanas, los tumores primarios formados de las células que se resecaron asépticamente, se enjuagaron inmediatamente en piezas de 2 mm3 y se implantaron en el páncreas de ratones desnudos nativos por medio de un colgajo quirúrgico. Los ratones se sometieron al azar para recibir solución salina amortiguada con fosfato (control de vehículo; n = 4) ó 20 mg/kg de CLN-1 administrado por inyección intraperitoneal , con la dosificación iniciada 2 semanas después de la implantación del fragmento del tumor y se dosificó dos veces por semana posteriormente. El tratamiento se continuó durante un total de 6 semanas, tiempo en el cual los ratones de control habían desarrollado masas de tumores abdominales grandes y todos los ratones se sacrificaron. Los volúmenes del tumor primario se calcularon usando la ecuación: VOLUMEN = (L x H x W) x p/4, en donde L, H y W son la longitud, altura y ancho del tumor. Comparado con los animales que portan el tumor que reciben únicamente el control del vehículo, los animales administrados con el anticuerpo específico de CTGF produjeron tumores aproximadamente 83% más pequeños, presumiblemente debido a la tasa reducida de la capacidad de supervivencia del tumor. (Figura 9). El resultado muestra que los anticuerpos específicos para CTGF reducen la expansión de tumores pancreáticos ortotópicos in vivo . Los datos adicionales usando un anticuerpo anti-CTGF que une el CTGF de ratón derivado del huésped, pero no de CTGF de humano derivado de PANC-1, sugieren que el CTGF derivado del tumor y que rodea el tejido normal puede estar involucrado en la expansión del tumor. De esta manera, similar a los resultados presentados anteriormente, el presente experimento demuestra que los agentes que sirven como blanco para CTGF pueden proporcionar un beneficio terapéutico en el tratamiento de pacientes con cáncer pancreático reduciendo o previniendo la expansión y/o progresión del tumor. Ejemplo 7: Los agentes que inhiben CTGF reducen la metástasis tumoral Los animales experimentales que se trataron como se describió en los Ejemplos 6.2 se evaluaron visualmente en la autopsia para cualquier evidencia de metástasis tumoral a los nodos linfáticos axilar e inguinal. La Tabla 1 muestra la metástasis del nodo linfático en los animales tratados con CLN-1 con relación a los animales tratados con el control de vehículo. Como se muestra en la Tabla, 5 de los 6 tumores metastatizados a los nodos linfáticos en los animales de control, mientras que únicamente 1 de los 5 tumores se metastatizaron en los animales tratados con el anticuerpo. Tabla 1 Los animales experimentales que se trataron como se describió en los Ejemplos 6.3 se evaluaron visualmente en la autopsia para cualquier evidencia de metástasis tumoral al nodo linfático proximal y distal y otros sitios dentro del peritoneo. El volumen del tumor primario y los sitios de metástasis se analizaron adicionalmente y los detalles para cada animal se proporcionan en la Figura 9. En la figura, los símbolos representan el volumen del tumor, y las letras junto al símbolo indican los sitios de metástasis como sigue: M = mesentérico, G = gástrico, P = peritoneal y A = ascitis. Los resultados demuestran que los terapéuticos que sirven de blanco para CTGF no sólo reducen la expansión del tumor y la capacidad de supervivencia, sino que reducen significativamente la metástasis del tumor primario a los sitios secundarios. Por lo tanto, los agentes que sirven de blanco para CTGF pueden proporcionar un beneficio terapéutico en el tratamiento de pacientes con cáncer, particularmente cáncer pancreático, reduciendo la expansión del tumor y reduciendo o previniendo la metástasis de los tumores existentes. Ejemplo 8: Agentes que inhiben el CTGF afectan la formación de micro-vasos tumorales Los tumores derivados de los animales experimentales descritos en el Ejemplo 6.3 { supra) se fijaron y se congelaron en el compuesto OCT antes de ser seccionados y teñidos con un anticuerpo monoclonal CD31 anti-ratón de rata y se tiñeron con el contador con hematoxilina. Se analizaron un total de tres manchas calientes angiogénicas por portaobjetos y se registraron para el número de vasos sanguíneos, y se cuantificaron para la densidad del micro-vaso usando un programa de análisis de imagen Image Pro Plus versión 4.5.1 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) . La densidad del micro-vaso se calculó como la relación de las áreas teñidas positivamente al área total de la imagen o campo. Como se comparó con los animales que portan tumores que recibieron el control del vehículo, el número y la densidad de los vasos sanguíneos tumorales se redujo a 45% y 61%, respectivamente, en los animales que recibieron CLN-1. Los resultados indican que los agentes que sirven como blanco para CTGF reducen el número y la densidad de los vasos sanguíneos que se forman en los tumores primarios, particularmente los tumores pancreáticos. Una reducción en la vascularización puede ser un mecanismo mediante el cual el CTGF limita la expansión del tumor, y proporciona el suporte adicional para el uso de los agentes que sirven como blanco para CTGF para el tratamiento de diferentes cánceres, en particular los cánceres altamente vascularizados . La presente invención demuestra que los agentes terapéuticos que sirven como blanco de CTGF son efectivos en para prevenir o reducir la expansión del tumor y disminuyen el número y la densidad de los micro-vasos dentro de los tumores. La invención demuestra además que los agentes terapéuticos que sirven de blanco para CTGF son adicionalmente efectivos para reducir y/o prevenir la metástasis del tumor primario al sistema linfático y/u otros órganos. En conjunto, los datos indican que los agentes que sirven de blanco para CTGF pueden proporcionar un beneficio terapéutico en la enfermedad pancreática y otra neoplásica inhibiendo la capacidad de los tumores de expandir, sobrevivir y metastatizar a otros sitios dentro del cuerpo. Las diferentes modificaciones de la invención, además de las mostradas y descritas en la presente, llegarán a ser evidentes para los experimentados en la técnica a partir de la descripción anterior. Tales modificaciones se pretende que caigan dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Todas las referencias citadas en la presente se incorporan por referencia en su totalidad. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (24)

1. REIVINDICACIONES
2. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un método para identificar un agente que inhibe el crecimiento celular independiente del anclaje, caracterizado porque comprende: (a) cultivar células MÍA PaCa-2, en donde las células se han identificado para expresar el factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF) , con un agente bajo condiciones apropiadas, en ausencia del agente, para el crecimiento de células independientes del anclaje; (b) medir la cantidad de crecimiento celular que se presenta en presencia del agente; y (c) comparar la cantidad de crecimiento celular que se presenta en presencia del agente con la cantidad de crecimiento celular que se presenta en ausencia del agente, en donde una disminución en la cantidad del crecimiento celular en presencia del agente con relación a la cantidad de crecimiento celular que se presenta en ausencia del agente es indicativa de un agente que inhibe el crecimiento celular independiente del anclaje. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el CTGF es CTGF de humano.
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque las células MÍA PaCa-2 producen aproximadamente 0.3 a 2.2 µg de CTGF/lO5 células/48 horas.
4. 4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la medición del crecimiento celular comprende contar los grupos de células .
5. 5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque cultivar comprende dispersar las células en un medio de soporte semi-sólido apropiado para el crecimiento celular independiente del anclaje.
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el medio de soporte semi-sólido comprende aproximadamente agar al 0.35%.
7. 7. Uso de un agente identificado mediante el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la manufactura de un medicamento para reducir la expansión de un tumor pancreático en un paciente.
8. 8. Uso de un agente identificado mediante el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la manufactura de un medicamento para reducir la supervivencia de las células de un tumor pancreático en un paciente.
9. 9. Uso de un agente identificado mediante el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la manufactura de un medicamento para reducir la metástasis de un tumor en un paciente.
10. 10. Uso de un agente que inhibe la actividad de CTGF para la manufactura de un medicamento para reducir la metástasis de un tumor en un paciente.
11. 11. Uso de un agente que inhibe la actividad de CTGF para la manufactura de un medicamento para reducir la expansión de un tumor pancreático en un paciente.
12. 12. Uso de un agente que inhibe la actividad de CTGF para la manufactura de un medicamento para reducir la supervivencia de células tumorales pancreáticas en un paciente.
13. 13. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 ó 10, en donde el tumor se localiza en el páncreas .
14. 14. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13, en donde el tumor es un adenocarcinoma.
15. 15. El uso de conformidad con la reivindicación 14, en donde el adenocarcinoma es un adenocarcinoma de conducto.
16. 16. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 15, en donde el agente es un oligonucleótido que se une específicamente a un CTGF que codifica un polinucleótido.
17. 17. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 15, en donde el agente es un anticuerpo que une específicamente a CTGF.
18. 18. El uso de conformidad con la reivindicación 17, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o un fragmento activo del mismo.
19. 19. El uso de conformidad con la reivindicación 18, en donde el anticuerpo es CNL-1 o cualquier derivado del mismo.
20. 20. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 15, en donde el agente es una molécula pequeña .
21. 21. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 15, en donde el agente es un aptámero .
22. 22. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 21, en donde el medicamento comprende además un agente quimioterapéutico citotóxico.
23. 23. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 22, en donde el paciente es un mamífero.
24. 24. El uso de conformidad con la reivindicación 23, en donde el mamífero es un humano.