MXPA06009005A - Interferencia mediada por acido ribonucleico para el control de enfermedad en animales terrestres y de acuacultura. - Google Patents

Abstract

La invencion esta dirigida a composiciones (por ejemplo alimentos, suplementos alimenticios y productos terapeuticos) y metodos para inhibir un patogeno animal utilizando tecnologia de interferencia de ARN.

Description

INTERFERENCIA MEDIADA POR ACIDO RIBONUCLEICO PARA EL CONTROL DE ENFERMEDAD EN ANIMALES TERRESTRES Y DE ACUACULTURA ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La invención se refiere en general al campo de prevención de enfermedad en poblaciones agrícolas y acuícolas. La prevención de enfermedad en agricultura y acuacultura, es un punto central mayor para aumentar al máximo la salud de los animales y la viabilidad comercial de producción de estos animales. Los farmacéuticos y vacunas tienen un lugar en este esfuerzo, pero se necesita un método menos costoso y menos invasivo para curar o prevenir los síntomas de enfermedades específicas para reducir al mínimo la molestia de los animales, así como para aumentar al máximo los beneficios en su crecimiento. Un ejemplo es el cultivo de camarón. Durante las pasadas décadas, el cultivo de camarón (Penaeus sp.) ha evolucionado desde un nivel de cultivo de subsistencia, a una industria importante que provee trabajo directamente e indirectamente a millones de personas alrededor del globo. Conforme el cultivo de camarón evoluciona, es mantenido en equilibrio con muchos retos. Entre ellos, las enfermedades virales son un asunto importante para quienes cultivan el camarón. Durante los últimos años, enfermedades tales como la mancha blanca, causada por el virus del síndrome de la mancha blanca (WSSV), han causado epizootias severas en las regiones de cultivo del camarón de Asia, Centroamérica y Sudamérica, resultando en pérdidas colosales (Krishna et al., 1997, World Aquaculture 12: 14-19; Jory et al., 1999, Aquacult. Mag. 25: 83-91 ). El WSSV contiene un genoma de ADN de doble cadena circular de aproximadamente 300 kb de longitud, e infecta a todas las especies comercialmente importantes de camarón del grupo Penaeidea y muchos otros crustáceos que incluyen cangrejos y ástacos (Flegel, 1997, World J. Micro. Biotech. 13: 433-442; van Hulten et al., 2001 , Virology 286: 7-22; Yang et al., 2001 , J. Virol. 75: 11811-11820). Desde el registro inicial del WSSV en Asia meridional durante 1992 a 1993 (Inouye er al., 1994, Fish Patrol. 9: 149-158), se han estudiado en detalle muchos genes codificados por el WSSV, tales como los genes de la cápside (van Hulten et al., 2000, J. Gen. Virol. 81 : 2525-2529; van Hulten et al., 2000, Virology 266: 227-236; Zhang et al., 2001 , Virus Res. 79: 137-144; Chen et al., 2002, Virology 293: 44-53; Marks ef al., 2003, J. Gen. Virol. 84: 1517-1523); un gen de ribonucleótido reductasa (Tsai et al., 2000, Virology 277: 92-99); y los genes de timidina cinasas (Tsai ef al., 2000b, Virology 277: 100-110). Además, se ha desarrollado también un método de detección altamente sensible basado en PCR en tiempo real, para la detección y cuantificación del WSSV (Dhar et al., 2001 , J. Clin. Microbiol. 39: 2835-2845). Sin embargo, los esfuerzos hacia el desarrollo de terapéuticas para la mancha blanca han sido muy limitados. Sólo recientemente, se ha reportado que la adición de beta-1, 3-glucano como un aditivo a la dieta del camarón a un nivel de 10 g por kg por 20 días mejora la inmunidad del camarón, y la supervivencia subsiguiente contra la infección por el WSSV (Chang et al., 2003, Fish Shellfish Immunol. 15: 297-310). Mediante el uso de la presentación de fagos, Yi et al. (2003, J. Gen. Virol. 84: 2545-255) han identificado un pequeño péptido de 10 elementos (2E6) que tiene alto carácter específico por el WSSV, y bloquearon la infección por el WSSV en el ástaco. Se mostró que la inyección de proteínas recombinantes de la cápside del WSSV (VP 26 y VP 28), inducen resistencia en el camarón (P. japonicus; Namikoshia et al., 2004, Aquaculture 229: 25-35). El camarón, al igual que otros crustáceos, no tiene inmunidad adaptativa. Más bien, depende de la respuesta inmune innata. Aunque muchos genes inmunes implicados en la inmunidad a bacterias y hongos en invertebrados han estado bien caracterizados, se conocen hasta la fecha muy pocos genes inmunes implicados en la patogénesis viral en el camarón o algún otro invertebrado. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de aislar y caracterizar los genes inmunes en el camarón, y de desarrollar terapéuticas para combatir la enfermedad viral en el camarón. En años recientes, se ha usado un fenómeno denominado interferencia mediada por ARN (ARNi) para suprimir la expresión de un gen objetivo (genes celulares y virales como gen objetivo; Xia ef al., 2002, Nat. Biotechnol. 20: 1006-1010; McCown et al., 2003, Virology 313: 514-524; Wilson et al., 2003, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 100: 2783-2788), sin que cause cambios globales en la expresión génica en células. El ARNi es un fenómeno en el cual un ARN de doble cadena (ARNds) suprime la expresión de un gen objetivo mejorando la degradación específica del ARN mensajero objetivo complementario (Hannon, 2002, Nature 418: 244-251). El mecanismo del ARNi implica el reconocimiento del ARNds por la enzima ribonucleasa III, y su digestión en ARN de interferencia corto (ARNsi) de 21 a 23 nucleótidos. El ARNsi es incorporado entonces en un complejo de direccionamiento de ARNi conocido como complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), y digiere al ARN mensajero objetivo que sea homólogo al ARNsi. Esto resulta en degradación rápida del ARN mensajero objetivo, y disminución en la síntesis de proteínas (Hannon, 2002, Nature 418: 244-251 ). Se ha mostrado recientemente que puede lograrse interferencia mediada por ARN a través de la ingestión de ARNds en Caenorhabdltis elegans (Kamath et ai, 2002, Genome Biol. 2:0002.0001-0002.0010). El propósito de esta invención, es usar el fenómeno de ARNi para desarrollar terapéuticas para el control de enfermedades virales y bacterianas en especies de camarón, acuícolas y terrestres. Se provee oralmente ARN de doble cadena a animales a través de las dietas, y se mide su eficacia en la prevención de la enfermedad. Se han desarrollado métodos para el control del síndrome de la mancha blanca en el camarón. Se usan cinco genes dei WSSV como genes objetivo, que incluyen un gen expresado tempranamente codificado por el WSSV (ribonucleótido reductasa) un inhibidor de proteasa, un gen de ADN polimerasa, un gen de la nucleocápside (VP26) y un gen de la cápside (VP28). Un ADN del WSSV de 21 a 23 nucleótidos de longitud que representa a estos genes es sintetizado químicamente, y clonado en un vector de alimentación (L4440). El plásmido recombinante se usa para transformar la cepa HT?15DE3 de Escherichia coli (que posee expresión de T7 polimerasa inducible por IPTG, y carece de ribonucleasa Ni específica de doble cadena; Kamath ef al., 2002, Genome Biol. 2:0002.0001-0002.0010). Los clones recombinantes que poseen genes específicos del WSSV son secuenciados para confirmar la identidad. La célula bacteriana entera o células fracturadas se mezclan con la dieta y se proveen al camarón. El camarón es desafiado oralmente con inyecciones vivas del WSSV, y se evalúa la mortalidad. La expresión del ARN mensajero de los cinco genes objetivo del WSSV se mide también en los animales tratados y control usando RT-PCR en tiempo real (Dhar et al., 2003, Arch. Virol. 1148: 2381-2396; Dhar ef al., 2001 , J. Clin. Microbiol. 39: 2835-2845), para determinar la diferencia en expresión en dos grupos de tratamiento. Existen también desafíos de enfermedad significativos en otras especies acuícolas, así como animales terrestres. En vacas, ovejas y cabras, organismos de crecimiento lento tales como las micobacterias, causan daño extensivo y destrucción de hatos. La enfermedad de Johne (causada por Mycobacterium paratuberculosis johnii) es un ejemplo de este tipo de enfermedad. Otras bacterias de crecimiento lento que podrían tratarse con este procedimiento, son los micopiasmas. Enfermedades de bovinos tales como Neospora caninum, brucelosis, tuberculosis, leucosis bovina y diarrea, podrían controlarse usando la presente invención. Podrían consignarse enfermedades de animales por protozoarios causadas por protozoarios tales como Cryptosporidia y Giardia. Podrían consignarse también enfermedades virales tales como la diarrea bovina y el coronavirus. Un problema crónico en el manejo de pollos, es la persistencia de salmonélidos. Además, existen muchas enfermedades virales que causan daño extensivo, tales como la bronquitis infecciosa, enfermedad de Newcastle exótica y la influenza aviar (que causa la destrucción de millones de aves). Existen sistemas alternativos que podrían proveer ventajas de costo para cualquier producto de ARNi producido en estos sistemas contra sistemas bacterianos. Dichos sistemas podrían ser sistemas de algas (por ejemplo, Synechocystis o Chiorella), hongos (por ejemplo, Aspergillus niger, Neurospora crassa), plantas (por ejemplo, tabaco, alfalfa, papa, Arabidopsis) e insectos (por ejemplo, T. ni y Spodoptera frugiperda). Las herramientas moleculares necesarias para producir construcciones de ARNds en sistemas bacterianos, podrían adaptarse fácilmente a estos organismos y, por lo menos para los propósitos de esta invención, podrían proveer ventajas en costos de producción de la biomasa que serían incorporados en un alimento. Para los propósitos de esta invención, el punto central se sitúa en sistemas de plantas. Sin embargo, están bien desarrolladas herramientas de expresión en otros sistemas, según se evidencia por las siguientes citas que se incluyen en la presente como referencia para las herramientas en sistemas de hongos (el-Enshasy et al., 2001 , Appl. Biochem. Biotechnol. 90: 57-66; Wiebe et al., 2001 , Biotechnol. Bioeng. 76: 164-174; Liu et al., 2003, Lett. Appl. Microbiol. 36: 358-361 ), algas (Mayfield et al., 1990, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87: 2087-2091 ; patente de E.U.A. No. 5,270,175; patente de E.U.A. No. 5,977,437; publicación del PCT WO 00/73455; Toyomizu et al., 2001 , J. Appl. Phycol. 13: 209-214; publicación de patente de E.U.A. 2002/0164706; patente de E.U.A. No. 6,379,968; Shapira et al., 2002, Plant Physiol. 129: 7-12; Ton ef al., 2002, FASEB J. 16: A542; Mayfield et al., 2003, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 100: 438-442), levaduras (Guthrie et al., 1991 , en: Abelson J, Simón M (eds.) Methods Enzymol. Academic Press, San Diego, CA; Masón et al., 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89: 11745-11749; Wery ef al., 1997, Gene 184: 89-97; Martínez et al., 1998, Antonie Van Leeuwenhoek 73: 147-153; Cereghino et al., 1999, Curr. Opin. Biotechnol. 10: 422-427; Fischer et al., 1999, Biotechnol. Appl. Biochem. 30 (parte 2): 117-120; Cereghino et al., 2000, FEMS Microbiol. Rev. 24: 45-66; Cregg et al., 2000, Mol. Biotechnol. 16: 23-52) e insectos (Schmaljohn et al., 1990, J. Virol. 64: 3162-3170; Saliki et al., 1992, J. Gen. Virol. 73: 369-374; Jarvis ef al., 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9: 528-533; AItmann et al., 1999, Glycoconj. J. 16: 109-123; Cha et al., 1999, Biotechnol. Bioeng. 65: 316-324). En los sistemas de plantas, el uso de virus de las plantas como el vehículo para la transferencia de materia genético, está bien desarrollado. El virus del mosaico del tabaco (TMV) y el virus del mosaico de la alfalfa (AMV) son dos de estos sistemas, siendo el TMV el que se usa más ampliamente. El plásmido Ti basado en la región de ADN T de Agrobacterium tumefaciens, se ha usado para la expresión de ADN heterólogo en muchas plantas diferentes tales como el tomate, papa, lupino y lechuga (Kapusta ef al., 1999, FASEB J. 13: 1796-1799; Walmsley ef al., 2000, Curr. Opin.

Biotechnol. 11 : 126-129; Khandelwal et al., 2003, Plant Sci. 165: 77-84).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Es un objetivo de la invención, producir pequeñas moléculas de ARN de interferencia que tengan 21 a 23 nucleótidos de longitud, que sean específicas hacia un patógeno de animales, tales como bacterias, hongos, algas o levaduras. El ARN podría suministrarse como ARNsi o ARNds que es procesado entonces en el ARNsi. El ARNsi o ARNds precursor sería producido en la célula y suministrado al animal como la célula entera o como células fracturadas formuladas en la dieta. Estas dietas serán provistas al animal para efectuar el suministro oral de ARNsi terapéutico específico para el patógeno objetivo, para mejorar la enfermedad o los síntomas de la enfermedad. Secuencias de nucleótidos más largas de hasta alrededor de 1000 bases de longitud que sean complementarias al ARN objetivo, podrían producirse en la célula bacteriana y suministrarse como células enteras o células fracturadas mezcladas con la dieta. Es un objetivo de la invención, proteger a un animal de la infección por el patógeno a través de la degradación específica de ARN mensajero objetivo complementario codificado por el patógeno que explote los fenómenos de ARNi.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los objetivos de la invención pueden describirse por medio de las siguientes modalidades. . En una modalidad de la invención, se produce un ARNsi que es específico para un patógeno en acuacultura. En otra modalidad, se produce ARNsi específico para un patógeno viral en acuacultura. En otra modalidad, se produce ARNsi específico para patógenos virales del camarón. En otra modalidad, se produce ARNsi específico para el virus del síndrome de la mancha blanca, virus de la cabeza amarilla, virus del síndrome de Taura y virus hipodérmico y hematopoyético infeccioso. En otra modalidad, el ARNsi es específico para patógenos virales de peces. En otra modalidad, el ARNsi es específico para el virus de la anemia infecciosa del salmón, virus de la necrosis pancreática infecciosa, virus de la viremia de primavera de la carpa, reovirus de la carpa forrajera, virus del bagre del lecho de los ríos, virus de herpes del bagre del lecho de los ríos, birnavirus marino, virus de la necrosis nerviosa del mero Malbaricus, virus de la necrosis nerviosa del mero Dragón, rotavirus de la lobina listada, eperlano, turbo y salmón del Atlántico, virus de la septicemia hemorrágica viral de la trucha arco iris, rabdovirus de la trucha arco iris, virus de la necrosis hematopoyética infecciosa y virus de la enfermedad del sueño de la trucha arco iris. Es un objetivo de la invención, proveer un método para proteger a un animal de la infección viral, que comprende la producción de un ARN específico del patógeno viral en una bacteria o levadura hospedera, procesar la biomasa que contiene al ARN específico en un alimento o complemento alimenticio sin más purificación, y proveer dicho alimento al animal para suministrar el ARN específico del patógeno viral en una cantidad suficiente para inhibir los efectos patogénicos del virus sobre el organismo. En una modalidad de la invención, se provee un método para proteger a un animal de la infección viral. El método comprende los pasos de: producir un ARN específico del virus del síndrome de la mancha blanca (WSSV) es una bacteria hospedera, procesar la biomasa que contiene a las bacterias que se usaron para producir el ARN específico del WSSV en un alimento o complemento alimenticio sin más purificación, y proveer entonces dicho alimento al animal para suministrar las bacterias que contienen al ARN específico del WSSV en una cantidad suficiente para prevenir la acción del virus sobre el camarón. Esta invención provee una protección rápida a una enfermedad viral tal como la mancha blanca. Este procedimiento puede aplicarse también a otros tipos de enfermedades en el camarón causadas por otros virus, bacterias y hongos, así como para enfermedades en otras especies acuícolas que incluyen peces y moluscos que sufren de enfermedades causadas por hongos, bacterias y virus. En especies de invertebrados acuáticos tales como el camarón, con "un sistema inmune primitivo", la invención provee un método para el tratamiento de enfermedades agudas y crónicas por medio del suministro de una molécula de ARNi preformada. En una modalidad de la invención, se provee un método para proteger a un animal de la infección bacteriana. El método comprende los pasos de producir un ARN específico de una bacteria patógena en una bacteria hospedera, procesar la biomasa que contiene a las bacterias que se usaron para producir el ARN específico de la bacteria patógena en un alimento o complemento alimenticio sin más purificación, y proveer la biomasa procesada al animal para suministrar las bacterias que contienen al ARN específico de la bacteria patógena, en una cantidad de hasta 1 % del contenido total de alimento. En especies de vertebrados acuáticos tales como los peces, con sistemas inmunes bien desarrollados, la invención provee un primer método de respuesta para retardar el inicio de una amenaza de infección aguda, y eliminar la infección crónica. En otras modalidades de la invención, otros tipos de sistemas de expresión tales como levaduras, algas y hongos, se usan para la producción del ARN específico del patógeno. Los métodos usados para la protección del animal son similares a las modalidades descritas anteriormente.

Definiciones Para entender completamente la invención, se proveen las siguientes definiciones que aclaran términos de la técnica que son diversamente entendidos o comúnmente el sujeto de investigación intensa, que podrían cambiar el alcance de la invención si no se definen bien en la presente. Para esta invención, se usan los siguientes términos como se definen en la presente. "Silenciamiento génico", un mecanismo regulador génico novedoso que limita el nivel de transcritos suprimiendo la transcripción (conocido como silenciamiento génico de la transcripción), o activando un proceso de degradación de ARN específico de la secuencia (silenciamiento génico post-transcripción). "Interferencia mediada por ARN" o "ARNi", un mecanismo de silenciamiento génico que limita el nivel de transcripción por medio de un proceso de degradación de ARN específico de la secuencia. "ARN de interferencia pequeño" o "ARNsi", es una molécula de ARN de doble cadena que tiene menos de 1000 bases. "ARN antisentido", ARN de cadena sencilla o cadena de ARN anticodificación que sirve como molde para la síntesis de ARN mensajero. "ARN sentido", sirve como molde para la producción de la proteína, o es la misma secuencia que el ARN mensajero usado como el molde para la síntesis de proteínas.

EJEMPLOS La invención se describe ahora con relación a los siguientes ejemplos. Estos ejemplos se proveen sólo con el propósito de ilustración, y la invención no se limita a estos ejemplos, sino más bien abarca todas las variaciones que son evidentes como resultado de la enseñanza provista en la presente.

EJEMPLO 1 Construcción de plásmido recombinante que contiene oligonucleótidos formados de entre 21 y 23 nucleótidos homólogos a los genes del virus del síndrome de la mancha blanca (WSSV) Secuencias de ARNi fueron diseñadas por Ambion, Inc. (Austin, Texas), usando su algoritmo patentado de diseño de ARNsi. Se diseñaron secuencias de ARNi para cinco genes del virus del síndrome de la mancha blanca (WSSV), que incluyen los genes que codifican para una proteína de la nucleocápside VP26, una proteína de la cápside VP28, una enzima ribonucleóiido reductasa, una enzima ADN polimerasa y una proteína que contiene el motivo de identificación del inhibidor de proteasa de Kunitz. Se diseñaron cinco moléculas de ARNsi del WSSV con base en la secuencia genómica del WSSV disponible en la base de datos del GenBank, número de acceso AF369029. Además, se diseñó también ARNsi para un gen no estructural y un gen de la cápside para el virus de la necrosis hipodérmica y hematopoyética infecciosa (base de datos del GenBank, número de acceso AF273215); un gen de glucoproteína del virus de la cabeza amarilla (base de datos del GenBank, número de acceso AF540644); una ARN polimerasa dependiente de ARN, un gen de proteína de la cápside, VP1 del virus del síndrome de Taura (base de datos del GenBank, número de acceso AF277675). El diseño del ARNsi para el gen VP28 del WSSV (AF369029), puede hacerse de varias formas diferentes. Según diseño por Ambion, un diseño del ARNsi se basa en una cadena de ARNsi sentido (5A3') GGUUGGAUCA GGCUACUUCT T (SEQ ID NO:_) y una cadena de ARNsi antisentido (5'?3') GAAGUAGCCU GAUCCAACCT C (SEQ ID NO:_). El diseño del molde para esto usa vectores de expresión de ARNsi pSilencer(TM) (2.0, 2.1 , 3.0 y 3.1 de Ambion). El molde de oligonucleótidos de la cadena superior es 5 -GATCCGGTTG GATCAGGCTA CTTCTTCAAG AGAGAAGTAG CCTGATCCAA CCTCTTTTTT GGAAA-3' (SEQ ID NO:__), mientras que el molde de oligonucleótidos de la cadena inferior es 5'-AGCTTTTCCA AAAAAGAGGT TGGATCAGGC TACTTCTCTC TTGAAGAAGT AGCCTGATCC AACC G-3' (SEQ ID NO:_). Un segundo diseño del ARNsi de VP28 tiene una cadena de ARNsi sentido (5'-»3') GGCUACUUCA AGAUGACUGT T (SEQ ID NO:_) y una cadena de ARNsi antisentido (5'?3') CAGUCAUCUU GAAGUAGCCT G (SEQ ID NO: ). Para los vectores pSilencer, el molde de oligonucleótidos de la cadena superior es d'-GATCCGGCTA CTTCAAGATG ACTGTTCAAG AGACAGTCA TCTTGAAGTA GCCTG?T I I I TGGAAA-3' (SEQ ID NO: ), mientras que el molde de oligonucleótidos de la cadena inferior es 5'-AGCTTTTCCA AAAAACAGGC TACTTCAAGA TGACTGTCT CTTGAACAGT CATCTTGAAG TAGCC G-3' (SEQ ID NO:_). Un tercer diseño posible del ARNsi de VP28 tiene una cadena de ARNsi sentido (5'?3') GGUGUGGAAC AACACAUCAT T (SEQ ID NO:__), y una cadena de ARNsi antisentido (5'?3') UGAUGUGUUG UUCCACACCT T (SEQ ID NO: ). Esto requieren un diseño de molde para vectores de expresión de ARNsi pSilencer(TM) que tengan un molde de oligonucleótidos de la cadena superior 5 -GATCCGGTGT GGAACAACAC ATCATTCAAG AGA TGATGT GTTGTTCCAC ACCTTTTTTG GAAA-3' (SEQ ID NO:_) y un molde de oligonucleótidos de la cadena inferior 5'-AGCTTTTCCA AAAAAGGTGT GGAACAACAC ATCATCTCTT GAA TGATGT GTTGTTCCAC ACC G-3' (SEQ ID NO:_). El diseño del ARNsi para el gen VP26 del WSSV (AF369029), puede hacerse de varias formas diferentes. Según diseño por Ambion, un diseño de ARNsi se basa en una cadena de ARNsi sentido (5'?-3') GGGCAAAGGU AAUGUCAAUT T (SEQ ID NO._) y una cadena de ARNsi antisentido (5'?3') AUUGACAUUA CCUUUGCCCT T (SEQ ID NO:__). El diseño del molde para vectores de expresión de ARNsi pSilencer(TM) (2.0, 2.1 , 3.0 y 3.1 ), tiene un molde de oligonucleótidos de la cadena superior (5'?3') 5'-GATCCGGGCA AAGGTAATGT CAAT TTCAA GAGAATTGAC ATTACCTTTG CCCT I I I I I G GAAA-3' (SEQ ID NO:_) y un molde de oligonucleótidos de la cadena inferior (5A3') 5'-AGCTTTTCCA AAAAA GGGC AAAGGTAATG TCAATTCTCT TGAAATTGAC ATTACCTTTG CCC G-3' (SEQ ID NO:_). Un segundo diseño posible del ARNsi para VP26, tiene una cadena de ARNsi sentido (5'?3') GGUCCUACAA UACUCCUCUT T (SEQ ID NO: ) y una cadena de ARNsi antisentido (5'?3') AGAGGAGUA UUGUAGGACC TC (SEQ ID NO: ). Esto tiene un diseño de molde para vectores de expresión de ARNsi pSilencer(TM) (2.0, 2.1 , 3.0 y 3.1 ), con un molde de oligonucleótidos de la cadena superior 5'-GATCCGGTCC TACAATACTC CTCTTTCAAG AGA AGAGGA GTATTGTAGG ACCTCTTTTT TGGAAA-3' (SEQ ID NO: ) y un molde de oligonucleótidos de la cadena inferior d'-AGCTTTTCCA AAAAAGAGGT CCTACAATAC TCCTCTTCTC TTGAAAGAGG AGTATTGTAG GACC G-3" (SEQ ID NO:_). Un tercer diseño posible del ARNsi para VP26, tiene una cadena de ARNsi sentido (5'- 3') GGAAACAUUA AGGGAAAUAT T (SEQ ID NO:_) y una cadena de ARNsi antisentido (5'?3') UAUUUCCCUU AAUGUUUCCT G (SEQ ID NO: ). El diseño del molde para vectores de ARNsi pSilencer(TM) tiene un molde de oligonucleótidos de la cadena superior d'-GATCCGAAAC ATTAAGGGAA ATATTCAAGA GATATTTCCC TTAATGTTTC CTG M M M GGAAA-3' (SEQ ID NO: ) y un molde de oligonucleótidos de la cadena inferior 5'-AGCTTTTCCA AAAAA GAAA CATTAAGGGA AATATCTCTT GAATATTTCC CTTAATGTTT CC G-3' (SEQ ID NO:_).

Otro gen Proln del WSSV (AF369029), tiene un diseño de ARNsi con una cadena de ARNsi sentido (5?3') GGGAAGAAUU CUACAAGAAT T (SEQ ID NO._) y una cadena de ARNsi antisentido (5'?3') UUCUUGUAGA AUUCUUCCCT G (SEQ ID NO: ). El diseño del molde para vectores de ARNsi pSilencer(TM) tiene un molde de oligonucleótidos de la cadena superior (5'?3') 5'-GATCCGGGAA GAATTCTACA AGAATTCAAG AGATTCTTGT AGAATTCTTCC CTGTTTTTTG GAAA-3' (SEQ ID NO:__) y un molde de oligonucleótidos de la cadena inferior (5'->3') 5'-AGC I I l TCCA AAAAACAGGG AAGAATTCTA CAAGAATCTC TTGAATTCTT GTAGAATTCT TCCC G-3' (SEQ ID NO:_). Un segundo diseño de ARNsi para Proln tiene una cadena de ARNsi sentido (5'?3') GGGACCCUUU CAUGAAACAT T (SEQ ID NO:_J y una cadena de ARNsi antisentido (d'?3') UGUUUCAUGA AAGGGUCCCT T (SEQ ID NO: ). El diseño del molde para vectores de ARNsi pSilencer(TM) tiene un molde de oligonucleótidos de la cadena superior d'-GATCCGGGAC CCTTTCATGA AACATTCAAG AGATGTTTCA TGAAAGGGTC CC TTTTTTG GAAA-3' (SEQ ID NO: ) y un molde de oligonucleótidos de la cadena inferior d'-AGCTTTTCCA AAAAA GGGAC CCTTTCATGA AACATCTCTT GAATGTTTC ATGAAAGGGT CCC G-3' (SEQ ID NO:_). Un tercer diseño de ARNsi para Proln tiene una cadena de ARNsi sentido (d'?3') GGCAUACAGA UGCCCUUUAT T (SEQ ID NO:_) y una cadena de ARNsi antisentido (d'- 3') UAAAGGGCAU CUGUAUGCCT T (SEQ ID NO: ). El molde para vectores de ARNsi pSilencer(TM) tiene un molde de oligonucleótidos de la cadena superior (5A»3') 5'-GATCC GGCAT ACAGATGCCC TTTATTCAAG AGATAAAGGG CATCTGTATG CCTTTTTTGG AAA-3' (SEQ ID NO: ) y un molde de oligonucleótidos de la cadena inferior (d'?3') d'-AGCTTTTCC AAAAAA GGCA TACAGATGCC CTTTATCTCT TGAATAAAGG GCATCTGTAT GCC G-3' (SEQ ID NO:_). Otro gen potencial para interferencia mediada por ARN, es el gen Rr092 del virus de la mancha blanca (AF369029). Un diseño posible del ARNsi para Rr092 tiene una cadena de ARNsi sentido (d'?-3') GGAAGAUUCA UCUGUUCGAT T (SEQ ID NO:_) y una cadena de ARNsi antisentido (d"?3') UCGAACAGAU GAAUCUUCCT G (SEQ ID NO:_). El diseño del molde para vectores de ARNsi pSilencer(TM) tiene un molde de oligonucleótidos de la cadena superior (d'?3') 5'-GATCC GAAGA TTCATCTGTT CGATTCAAGA GATCGAACAG ATGAATCTTC CTG TTTTTGG AAA-3' (SEQ ID NO: ) y un molde de oligonucleótidos de la cadena inferior d'-AGCTTTTCCA AAAAA CAGG AAGATTCATC TGTTCGATCT CTTGAATCGA ACAGATGAAT CTTCC G-3' (SEQ ID NO:_). Un segundo diseño potencial de ARNsi para Rr092 tiene una cadena de ARNsi sentido (d'->3') GGACAUGAUU AUGCGUGUGT T (SEQ ID NO: ) y una cadena de ARNsi antisentido (d'?3') CACACGCAUA AUCAUGUCCT G (SEQ ID NO:_). El diseño del molde para vectores de ARNsi pSilencer(TM) tiene un molde de oligonucleótidos de la cadena superior d'-GATCCGGACA TGATTATGCG TGTGTTCAAG AGACACACGC ATAATCATGT CCTGT Iii I I GGAAA-3' (SEQ ID NO:_) y un molde de oligonucleótidos de la cadena inferior d'-AGCTTTTCCA AAAAACAGGA CATGATTATG CGTGTGTCTC TTGAACACAC GCATAATCAT GTCC G-3' (SEQ ID N0:_). Un tercer diseño potencial de ARNsi para Rr092 tiene una d cadena de ARNsi sentido (5'?3*) GGAUACCAUC AAUAGAAAGT T (SEQ ID NO:_) y una cadena de ARNsi antisentido (d'?3') CUUUCUAUUG AUGGUAUCCT T (SEQ ID NO: ). El diseño del molde para vectores de ARNsi pSilencer(TM) tiene un molde de oligonucleótidos de la cadena superior d'-GATCCGGATA CCATCAATAG AAAGTTCAAG AGACTTTCTA 0 TTGATGGTAT CC I I I I I I GG AAA-3" (SEQ ID NO:_) y un molde de oligonucleótidos de la cadena inferior d'-AGCTTTTCCA AAAAAGGATA CCATCAATAG AAAG TCTCT TGAACTTTCT ATTGATGGTA TCC G-3' (SEQ ID NO:_). Otro gen del WSSV que podría ser regulado por ARNi, es el gen d de ADNPol (AF369029). Un diseño potencial de ARNsi para ADNPol tiene una cadena de ARNsi sentido (d'?3') GGAAGUGGUC AUCUACGACT T (SEQ ID NO:_) y una cadena de ARNsi antisentido (d'?3') GUCGUAGAUG ACCACUUCCT T (SEQ ID NO: ). El diseño del molde para vectores de ARNsi pSilencer(TM) tiene un molde de oligonucleótidos de la cadena 0 superior (d"?3') d'-GATCCGGAAG TGGTCATCTA CGACTTCAAG AGAGTCGTAG ATGACCACTT CCTTTTTTGG AAA-3' (SEQ ID NO:_) y un molde de oligonucleótidos de la cadena inferior (d'?3') d'-AGCTTTTCCA AAAAAGGAAG TGGTCATCTA CGACTCTCTT GAAGTCGTAG ATGACCACTT CC G-3' (SEQ ID NO:_). Un segundo diseño de ARNsi para ADNPol tiene una cadena de ARNsi sentido (d'?3') GGAAGAACAU GAAACUGUCT T (SEQ ID NO:_) y una cadena de ARNsi antisentido (5'?3') GACAGUUUCA UGUUCUUCCT T d (SEQ ID NO: ). El diseño del molde para vectores de ARNsi pSilencer(TM) tiene un molde de oligonucleótidos de la cadena superior d'-GATCCGGAAG AACATGAAAC TGTC TTCAA GAGAGACAGT TTCATGTTCT TCCTTTTTTG GAAA-3' (SEQ ID NO: ) y un molde de oligonucleótidos de la cadena inferior d'-AGCTTTTCCA AAAAAGGAAG AACATGAAAC TGTCTCTCTT 0 GAAGACAGTT TCATGTTCTT CC G-3' (SEQ ID NO:__). Un tercer diseño de ARNsi para DNAPol tiene una cadena de ARNsi sentido (5'->3') GGAGCAUUGU CAUUUAAUAT T (SEQ ID NO:_) y una cadena de ARNsi antisentido (d'?3') UAUUAAAUGA CAAUGCUCCT C (SEQ ID NO: ). El diseño del molde para vectores de ARNsi pSilencer(TM) d tiene un molde de oligonucleótidos de la cadena superior d'-GATCCGGAGC ATTGTCATTT AATA TTCAAG AGATATTAAA TGACAATGCT CCTCTTTTTT GGAAA-3' (SEQ ID NO: ) y un molde de oligonucleótidos de la cadena inferior d'-AGCTTTTCCA AAAAA GAGGA GCATTGTCAT TTAATATCTC TTGAATATTA AATGACAATG CTCC G-3' (SEQ ID NO:_). 0 Se diseñan y sintetizan a la medida oligonucleótidos de 21 a 23 elementos específicos para los cinco genes del WSSV siguientes: una ribonucleótido reductasa, un inhibidor de proteasa, un gen de ADN polimerasa, un gen de la nucleocápside (VP26) y un gen de la cápside (VP28). La síntesis de oligonucleótidos sentido y antisentido que representan estos genes se basa en la secuencia publicada del genoma del WSSV, número de acceso del GenBank AF369029 (van Hulten et al., 2001 , Virology 286: 7-22). Se unen secuencias de oligonucleótidos sentido y antisentido para d generar ADN de doble cadena, y se clonan en un vector de plásmido tal como L4440 (Kamath et al., 2002, Genome Biol. 2:0002.0001-0002. 0010) o uno de los plásmidos disponibles comercialmente (por ejemplo, pSIREN-DNR de Clonetech o SILENCER de Ambion). El plásmido recombinante se usa para transformar la cepa HT115DE3 de Escherichia coli (que posee expresión de T7 0 polimerasa inducible por IPTG, y que carece de ribonucleasa III específica de doble cadena; Kamath et al., 2002, Genome Biol. 2:0002.0001-0002.0010). Los clones recombinantes que poseen genes específicos del WSSV son secuenciados para confirmar la identidad de los clones. Pueden obtenerse clones alternativos con base en diferentes cepas del WSSV, tales como los d descritos por Yang y colaboradores (Yang eí al., 2001 , J. Virol. 7d: 11811- 1 1820).

EJEMPLO 2 inducción bacteriana para la expresión de ARNds del WSSV y 0 formulación de alimento La cepa HT115DE3 de Escherichia coli que posee el gen del WSSV ¡nducible por IPTG, se desarrolla en medio de LB que contiene ampicilina, y se induce entonces con IPTG para la expresión de ARN específico del WSSV. La inducción por IPTG se optimiza empíricamente para lograr inducción máxima de la expresión de ARNds. Células que contienen a la biomasa de bacterias que expresan el gen o los genes del WSSV, se mezclan con el alimento de los camarones en un formato microunido en perlas formadas de alginato y almidón en una forma polimérica. Están disponibles formas microunidas alternativas, tales como polilactida (Bootland eí al., 2002, en: Harrington K (ed.) 4th Intl. Symp. Aquatic Animal Health, New Orleans, p 228), carragenina, alginato (Sultana ef al., 2000, Int. J. Food Microbiol. 62: 47-55; publicación de patente de E.U.A. No. 2002/0137723; publicación del PCT WO 03/103692) y quitosán (publicación de patente de E.U.A. No. 2001/0056807). Se añaden atrayentes para hacer que las perlas sean más aceptables para la especie objetivo (en el caso del camarón, la harina de krill sería un buen atrayente).

EJEMPLO 3 Método para la protección del camarón de la infección por el WSSV Se provee a los camarones una dieta control o una dieta que contiene biomasa de bacterias que contiene ARNds específico del WSSV (ejemplo 2). Se desafía a los animales con el WSSV, y se mide su supervivencia en respuesta a la infección viral. La carga del WSSV en las muestras control y de tratamiento se mide por medio de PCR en tiempo real, siguiendo el protocolo publicado (Dhar ef al., 2001 , J. Clin. Microbiol. 39: 2835-2845). La expresión del ARN mensajero de los cinco genes objetivo del WSSV se mide en los animales tratados y control usando RT-PCR en tiempo real, para determinar la diferencia en expresión en dos grupos de tratamiento, siguiendo un método publicado (Dhar et al., 2003, Arch. Virol. 1148: 2381-2396).

EJEMPLO 4 Construcción de plásmido recombinante que contiene oligonucleótidos de entre 21 y 23 nucleótidos homólogo a los genes del virus de la necrosis hematopoyética infecciosa (IPNV) Secuencias de ARNi fueron diseñadas por Ambion, Inc. (Austin, Texas), usando su algoritmo patentado de diseño de ARNsi. Se diseñó también ARNsi para un gen no estructural y un gen de la cápside para el virus de la necrosis hipodérmica y hematopoyética infecciosa (base de datos del GenBank, número de acceso AF273216). Se diseñan y sintetizan a la medida oligonucleótidos de 21 a 23 elementos específicos para los dos genes del IPNV siguientes: proteínas de la cápside VP2 y VP3. La síntesis de oligonucleótidos sentido y antisentido que representan estos genes se basa en la secuencia publicada del genoma del IPNV, número de acceso del GenBank AY283780. Se unen secuencias de oligonucleótidos sentido y antisentido para generar ADN de doble cadena, y se clonan en un vector de plásmido L4440 (Kamath et al., 2002, Genome Biol. 2:0002.0001-0002. 0010). El plásmido recombinante se usa para transformar la cepa HTn5DE3 de Escherichia coli (que posee expresión de T7 polimerasa inducible por IPTG, y que carece de ribonucleasa ili específica de doble cadena; Kamath et al., 2002, Genome Biol. 2:0002.0001-0002.0010). Los clones recombinantes que poseen genes específicos del IPNV son secuenciados para confirmar la identidad de los clones.

EJEMPLO 5 Inducción bacteriana para la expresión de ARNds del IPNV y formulación de alimento La cepa HTn5DE3 de Escherichia coli que posee el gen o los genes del IPNV inducibles por IPTG, se desarrolla en medio de LB que contiene ampicilina, y se induce entonces con IPTG para la expresión de ARN específico del IPNV. La inducción por IPTG se optimizará empíricamente para lograr inducción máxima de la expresión de ARNds. Células que contienen a la biomasa de bacterias que expresan el gen o los genes del IPNV, se mezclan con el alimento de los camarones en un formato microunido en perlas formadas de alginato y almidón en una forma polimérica. Están disponibles formas microunidas alternativas, tales como polilactida (Bootland eí al., 2002, en: Harrington K (ed.) 4th Intl. Symp. Aquatic Animal Health, New Orleans, p 228), carragenina, alginato y quitosán. Se añaden atrayentes para hacer que las perlas sean más aceptables para la especie objetivo (en el caso de peces, la harina de pescado es un buen atrayente).

EJEMPLO 6 Método para la protección de salmónidos de la infección por el IPNV Se provee a truchas arco iris una dieta control o una dieta que contiene biomasa de bacterias que contiene ARNds específico del IPNV (ejemplo d). Se desafía a los animales con el IPNV, y se mide su supervivencia en respuesta a la infección viral. La carga del IPNV en las muestras control y de tratamiento se mide por medio de PCR en tiempo real, siguiendo un protocolo similar al que se usó para el WSSV en el camarón (Dhar ef al., 2001 , J. Clin. Microbiol. 39: 283d-284d). La expresión del ARN mensajero de los dos genes objetivo del IPNV se mide en los animales tratados y control usando RT-PCR en tiempo real, para determinar la diferencia en expresión en dos grupos de tratamiento, siguiendo un protocolo similar al de la medición de la expresión génica celular en el camarón (Dhar ef al., 2003, Arch. Virol. 1148: 2381-2396).

EJEMPLO 7 Construcción de plásmido recombinante que contiene oligonucleótidos de entre 21 y 23 nucleótidos homólogo a los genes del ISAV Se diseñan y sintetizan a la medida oligonucleótidos de 21 a 23 elementos específicos para los dos genes del ISAV siguientes: hemaglutinina (HA) y glucoproteína P3. La síntesis de oligonucleótidos sentido y antisentido que representan estos genes se basa en la secuencia publicada del genoma del ISAV, números de acceso del GenBank AF309075 (Krossoy et al., 2001 , J. Gen. Virol. 82: 1757-1765) y AJ513303 (Snow eí al., 2003, Virus Res. 92: 99-105). Se unen secuencias de oligonucleótidos sentido y antisentido para generar ADN de doble cadena, y se clonan en un vector de plásmido L4440 (Kamath et al., 2002, Genome Biol. 2:0002.0001-0002.0010). El plásmido recombinante se usa para transformar la cepa HTn5DE3 de Escherichia coli (que posee expresión de T7 polimerasa inducible por IPTG, y que carece de ribonucleasa III específica de doble cadena; Kamath et al., 2002, Genome Biol. 2:0002.0001-0002.0010). Los clones recombinantes que poseen estos genes específicos del ISAV son secuenciados para confirmar la identidad de los clones.

EJEMPLO 8 Inducción bacteriana para la expresión de ARNds del ISAV y formulación de alimento d La cepa HTn5DE3 de Escherichia coli que posee los genes del ISAV inducibles por IPTG (ejemplo 7), se desarrolla en medio de LB que contiene ampicilina, y se induce con IPTG para la expresión de ARN específico del ISAV. La inducción por IPTG se optimiza empíricamente para lograr inducción máxima de la expresión de ARNds. La biomasa de bacterias 0 que expresa genes de HA y/o glucoproteína P3, se mezcla con el alimento de los salmónidos en un formato microunido en perlas formadas de alginato y almidón en una forma polimérica. Están disponibles formas microunidas alternativas, tales como polilactida (Bootland ef al., 2002, en: Harrington K (ed.) 4th Intl. Symp. Aquatic Animal Health, New Orleans, p 228), carragenina, d alginato y quitosán. Se añaden atrayentes para hacer que las perlas sean más aceptables para la especie objetivo (en el caso del salmón, AQUASAVOR(RTM) es un buen atrayente).

EJEMPLO 9 0 Método para la protección de salmónidos de la infección por el ISAV Salmónidos, tales como el salmón y la trucha arco iris, son alimentados con una dieta control o una dieta que contiene biomasa de bacterias que contiene ARNds específico del ISAV (ejemplo 8). Se desafía a los animales con el ISAV, y se mide su supervivencia en respuesta a la infección viral. La carga del ISAV es las muestras de tratamiento y control se mide por medio de PCR en tiempo real, siguiendo un método similar al usado d para el WSSV (Dhar et al., 2001 , J. Clin. Microbiol. 39: 283d-284d). La expresión del ARN mensajero de los dos genes objetivo del ISAV (HA y glucoproteína P3), se mide en los animales control y tratados usando RT-PCR en tiempo real para determinar la diferencia en expresión en dos grupos de tratamiento siguiendo un método similar al usado para el WSSV (Dhar ef al., 0 2003, Arch. Viral. 1148: 2381-2396).

EJEMPLO 10 Construcción de plásmido recombinante que contiene oligonucleótidos de entre 21 y 23 nucleótidos complementario a los genes de la viremia de d primavera de la carpa La viremia de primavera de la carpa, causada por el virus de la viremia de primavera de la carpa (SVCV), es una de las enfermedades virales importantes de la carpa común. La enfermedad está ampliamente extendida 0 en los cultivos de carpa de Europa y Asia (Ahne et al., 2002, Dis. Aquat. Organ. 62: 261-272). Las carpas infectadas con el SVCV muestran destrucción de tejidos en riñon, bazo e hígado que lleva a hemorragia, pérdida del balance de agua y sales y deterioro de la respuesta inmune (Ahne eí al., 2002, Dis. Aquat. Organ. 62: 261-272). El genoma del SVCV contiene una molécula individual de ARN de cadena sencilla de sentido negativo lineal, que codifica para nucleoproteína (N), fosfoproteína (P), proteína de matriz (M), glucoproteína (G) y ARN polimerasa dependiente de ARN (L), con una d secuencia guía y rezagada cortas en dirección 3Ad' (Hoffman ef al., 2002, Virus Res. 84: 89-100). Se diseñan y sintetizan a la medida oligonucleótidos de 21 a 23 elementos específicos para estos cinco genes del SVCV (N, P, M, G y L), con base en la secuencia publicada del genoma del SVCV, número de acceso del 0 GenBank AJ318079 (Hoffman et al., 2002, Virus Res. 84: 89-100). Se unen secuencias de oligonucleótidos sentido y antisentido para generar ADN de doble cadena, y se clonan en un vector de plásmido L4440 (Kamath ef al., 2002, Genome Biol. 2:0002.0001-0002.0010). Se transforma usando el plásmido la cepa HTH5DE3 de Escherichia coli (que posee expresión de T7 d polimerasa inducible por IPTG, y que carece de ribonucleasa III específica de doble cadena) (Kamath ef al., 2002, Genome Biol. 2:0002.0001-0002.0010). Los clones recombinantes que poseen genes específicos del SVCV son secuenciados para confirmar la identidad de los clones.

EJEMPLO 11 Inducción bacteriana para la expresión de ARNds de la viremia de primavera de la carpa y formulación de alimento La cepa HTn5DE3 de Escherichia coli que posee genes del SVCV inducibles por IPTG se desarrolla en medio de LB que contiene ampicilina, y se induce con IPTG para la expresión de ARN específico del SVCV. Se optimiza empíricamente la inducción por IPTG para obtener inducción máxima de la expresión de ARNds. Células bacterianas que expresan el gen del SVCV se mezclan con el alimento de las carpas en un formato microunido en perlas formadas de alginato y almidón en una forma polimérica, y se añaden atrayentes para hacer que las perlas sean aceptables para las carpas.

EJEMPL0 12 Inducción de hongos para la expresión de ARNds de la viremia de primavera de la carpa y formulación de alimento Se obtiene un mutante de deleción o se usa una cepa que carezca de la actividad de ribonucleasa de doble cadena (dsRNase). El hongo usado puede elegirse de hongos imperfectos (levaduras, tales como Sacharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe (Raponi et al., 2003, Nucí. Acids Res. 31 : 4481-4489) o Phaffia rhodozyma) u hongos filamentosos (por ejemplo, Neurospora crassa; Buxton et al., 1990, Biotechnol. Adv. 8: 388-389). Se sabe ya que las cepas de P. rhodozyma tienen ARNds presente que se asocia con una infección viral (Castillo ef al., 1994, Curr. Genet. 26: 364-368). Para los propósitos de este ejemplo, se construirá un mutante de S. cerevisiae deficiente en ribonucleasa de doble cadena usando técnicas moleculares estándar para bloquear la expresión de la ribonucleasa de doble cadena identificada con el genoma publicado de levaduras. Este será transformado entonces con un vector tal como pESC-URA (Stratagene). La función principal que necesita estar presente en el vector de transformación, es la presencia de dos promotores fuertes que puedan co-expresar moléculas de ARN que sean complementarias entre sí. El vector pESC-URA será modificado para contener dos piezas de ADN que sean específicas para ARNds de la viremia de primavera de la carpa, usando métodos similares a los descritos en los ejemplos 1 y 2. Se hará que la levadura sea competente, y se transformará entonces a la misma como se describe en el manual del usuario de Stratagene, que es una técnica estándar de biología molecular (Ausubel et al., 1997, en: Short Protocols in Molecular Biology, 3a. ed. John Wiley & Sons, Inc., New York). Se usará selección auxotrófica, y las cepas que crezcan en uraciio contendrán al vector. Los mutantes de levadura serán amplificados en un medio de galactosa para dirigir los dos promotores (GaM y Gal10) que se proveen en los vectores pESC para inserción de las dos secuencias. La levadura puede usarse entonces como una fuente de ARNds específico del SVCV. La levadura puede proveerse como biomasa directamente añadida al alimento, o microencapsulada y mezclada en el alimento para prevenir la infección.

EJEMPLO 13 Método para la protección de salmónidos de la infección por el virus de la viremia de primavera de la carpa Se alimenta a las carpas con dieta control o dieta que contenga bacterias (ejemplo 11) u hongos (ejemplo 12) que exprese ARNds que represente los genes N, P, M, G y L del SVCV. Se desafía a los animales usando agua contaminada con el SVCV, puesto que se piensa que ia transmisión aerotransportada es la fuente primaria de infección para el SVCV (Ahne et al., 2002, Dis. Aquat. Organ. 62: 261-272). Después del desafío con el SVCV, los animales se mantienen a una temperatura de 10 a 17°C, debido a que ocurre alta mortalidad a esa temperatura. Se registra la supervivencia en respuesta al desafío con el SVCV, y se mide la carga del SVCV en las muestras de tratamiento y control por medio de RT-PCR en tiempo real.

EJEMPLO 14 Construcción de plásmido recombinante que contiene 21 a 23 nucleótidos del gen de Streptococcus iniae S. iniae es una bacteria patógena importante de peces, que infecta a salmónidos, tilapines, bagres del lecho de los ríos y peces cebra, entre muchos otros peces de todo el mundo (Zlotkin ef al., 1998, Appl. Environ. Microbiol. 64: 4066-4067; Shoemaker et al., 2001 , Am. J. Vet. Res. 62: 174-177; Neely et al., 2002, Infect. Immun. 70: 3904-3914). Además de d peces, se ha reportado también que S. iniae infecta a humanos en Norteamérica y Asia (Weinstein ef al., 1997, N. Engl. J. Med. 337: 689-694; Lau ef al., 2003, J. Clin. Microbiol. 41 : 1004-1009). En cultivos acuícolas, se usan habitualmente antibióticos para el control de la infección por S. iniae. Debido a los intereses crecientes respecto al uso generalizado de antibióticos 0 en animales acuáticos y terrestres producidos en cultivo, existe una necesidad urgente de desarrollar medios alternativos para el control de las enfermedades bacterianas. Hacia este fin, la presente invención provee una solución en el control de S. iniae, así como otras infecciones bacterianas en peces. Se diseñan y sintetizan a la medida oligonucleótidos de 21 a 23 d elementos específicos para genes de citolisina y lactato oxidasa de S. iniae, con base en la secuencia de S. iniae publicada (Gibello et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 4346-4350; Fuller eí al., 2002, Infecí. Immun. 70: 5730- 5739). La citolisina es un homólogo funcional de la estreptolisina producida por el estreptococo del grupo A, y se requiere expresión de citolisina para la 0 necrosis local del tejido (Fuller ef al., 2002, Infect. Immun. 70: 6730-6739). Los genes de lactato oxidasa, por otra parte, están implicados en el metabolismo de ácido I-láctico en S. iniae. Se unen oligonucleótidos sentido y antisentido que representen genes de citolisina y lactato oxidasa para generar ADN de doble cadena, y se clonan en un vector de plásmido L4440 antes de la transformación de la cepa HTn5DE3 de Escherichia coli (que posee expresión de T7 polimerasa inducible por IPTG, y que carece de ribonucleasa III específica de doble cadena; Kamath et al., 2002, Genome Bioi. 2:0002.0001-0002.0010). Los clones recombinantes que poseen genes de S. iniae son secuenciados para confirmar la identidad de los clones.

EJEMPLO 15 Inducción bacteriana para la expresión de ARNds de Streptococcus iniae y formulación de alimento La cepa HT115DE3 de Escherichia coli que posee genes de S. iniae inducibles por IPTG se desarrolla en medio de LB que contiene ampicilina, y se induce con IPTG para la expresión de ARN específico de S. iniae. Se optimiza empíricamente la expresión de ARNds, haciendo variar la concentración de IPTG en el medio de las bacterias. Células bacterianas que expresan el gen de S. iniae se mezclan con la dieta de los peces en un formato microunido en perlas formadas de alginato y almidón en una forma polimérica, y se añaden atrayentes para hacer que las perlas sean aceptables para los peces.

EJEMPLO 16 Método para la protección de peces de la infección por Streptococcus iniae Se alimenta a lobinas listadas con dieta control o dieta que contiene bacterias que expresan ARNds de S. iniae. Se desafía a las lobinas listadas con S. iniae. La supervivencia en respuesta al desafío con S. iniae, se registra entonces en los peces control y tratados.

EJEMPLO 17 Construcción de plásmido recombinante que contiene 21 a 23 nucleótidos del parvovirus porcino (PPV), un patógeno de cerdos Se diseñan y sintetizan a la medida oligonucleótidos de 21 a 23 elementos específicos para el gen de la proteína de la cápside VP1 del PPV. La síntesis de oligonucleótidos sentido y antisentido que representan estos genes se basa en la secuencia publicada del genoma del parvovirus porcino, número de acceso del GenBank NC001718 (Bergeron et al., 1993, Virology 197: 86-98). Los epítopes antigénicos principales del PPV están en el gen de la cápside VP2, que se elige para este diseño (Kamstrup ef al., 1998, Virus Res. 53: 163-173). Se unen secuencias de oligonucleótidos sentido y antisentido para generar ADN de doble cadena, y se clonan en un vector de plásmido L4440 (Kamath et al., 2002, Genome Biol. 2:0002.0001-0002.0010).

El plásmido recombinante se usa para transformar la cepa HTn5DE3 de Escherichia coli (que posee expresión de T7 polimerasa inducible por IPTG, y que carece de ribonucleasa III específica de doble cadena; Kamath ef al., 2002, Genome Biol. 2:0002.0001-0002.0010). Los clones recombinantes que poseen genes específicos del PPV son secuenciados para confirmar la identidad de los clones. Estas moléculas de ARNsi se formulan entonces en alimentos, y se usan para el tratamiento de cerdos para prevenir la infección por el PPV usando métodos descritos en los ejemplos anteriores para otros animales (ejemplos 2 y 3).

EJEMPLO 18 Construcción de plásmido recombinante que contiene 21 a 23 nucleótidos de la enfermedad de Newcastle exótica, un patógeno viral de pollos Se diseñan y sintetizan a la medida oligonucleótidos de 21 a 23 elementos específicos para el gen de la proteína de la cápside del ENDV. La síntesis de oligonucleótidos sentido y antisentido que representan estos genes se basa en la secuencia publicada del genoma del parvovirus canino, número de acceso del GenBank NC002617 (Sellers ef al., 2000, Complete sequence for the B1 strain of Newcastle disease virus, en: U. S. Department of Agriculture/Agriculture Research Services). Se unen secuencias de oligonucleótidos sentido y antisentido para generar ADN de doble cadena, y se clonan en un vector de plásmido tal como L4440 (Kamath eí al., 2002, Genome Biol. 2:0002.0001-0002.0010) que contiene dos promotores para la producción de ARN. El plásmido recombinante se usa para transformar la cepa HT115DE3 de Escherichia coli (que posee expresión de T7 polimerasa inducible por IPTG, y que carece de ribonucleasa III específica de doble cadena; Kamath ef al., 2002, Genome Biol. 2:0002.0001-0002.0010). Los clones recombinantes que poseen genes específicos del CPV son secuenciados para confirmar la identidad de los clones. Estas moléculas de ARNsi se formulan entonces en alimentos, y se usan para el tratamiento de pollos para prevenir la infección por el ENDV usando métodos descritos en los ejemplos anteriores para otros animales (véase ejemplo 1d, por ejemplo).

EJEMPLO 19 Construcción de plásmido recombinante que contiene oligonucleótidos de entre 21 y 23 nucleótidos de longitud complementario para glosopeda (FMD), un patógeno viral de vacas Se diseñan y sintetizan a la medida oligonucleótidos de 21 a 23 elementos específicos para el gen de la proteína de la cápside VP1. La síntesis de oligonucleótidos sentido y antisentido que representan estos genes se basa en la secuencia publicada del genoma del parvovirus canino, número de acceso del GenBank NC 004916 (Saravanan ef al., 2003, Foot-and-mouth disease virus Asia 1 (FMDV-Asia1 ), en: Molecular Virology, Indian Veterinary Research Institute, India). Podrían usarse secuencias alternativas para varias cepas en paralelo para proveer una protección más amplia que esta cepa individual de FMD. Se unen secuencias de oligonucleótidos sentido y antisentido para generar ADN de doble cadena, y se cionan en un vector de plásmido L4440 (Kamath eí al., 2002, Genome Biol. 2:0002.0001-0002.0010). El plásmido recombinante se usa para transformar la cepa HT115DE3 de Escherichia coli (que posee expresión de T7 polimerasa inducible por IPTG, y que carece de ribonucleasa III específica de doble cadena; Kamath ef al., 2002, Genome Biol. 2:0002.0001-0002.0010). Los clones recombinantes que poseen genes específicos del CPV son secuenciados para confirmar la identidad de los clones. Estas moléculas de ARNsi se formulan entonces en alimentos, y se usan para el tratamiento de vacas para prevenir la infección por el CPV usando métodos descritos en los ejemplos anteriores para otros animales (véase ejemplo 16).

EJEMPLO 20 Construcción de plásmido recombinante que contiene 21 a 23 nucleótidos del virus de la leucemia felina (FLV), un patógeno viral de gatos Se diseñan y sintetizan a la medida oligonucleótidos de 21 a 23 elementos específicos para un gen de la proteína de la cubierta. La síntesis de oligonucleótidos sentido y antisentido que representan este gen, se basa en la secuencia publicada del segmento del FeLV que contiene genes de la proteína de la cubierta, número de acceso del GenBank AF403716 (Anderson eí al., 2001 , J. Virol. 75: 10563-10672). Se unen secuencias de oligonucieótidos sentido y antisentido para generar ADN de doble cadena, y se clonan en un vector de plásmido L4440 (Kamath ef al., 2002, Genome Biol. 2:0002.0001-0002.0010). El plásmido recombinante se usa para transformar la cepa HTn5DE3 de Escherichia coli (que posee expresión de T7 polimerasa inducible por IPTG, y que carece de ribonucleasa III específica de doble cadena; Kamath ef al., 2002, Genome Biol. 2:0002.0001-0002.0010). Los clones recombinantes que poseen genes específicos del FeLV son secuenciados para confirmar la identidad de los clones. Estas moléculas de ARNsi se formulan entonces en alimentos, y se usan para el tratamiento de gatos para prevenir la infección por el FeLV usando métodos análogos a los descritos en los ejemplos anteriores para otros animales (ejemplos 2 y 3).

EJEMPLO 21 Construcción de plásmido recombinante que contiene 21 a 23 nucleótidos del parvovirus canino (CPV), un patógeno viral de perros Se diseñan y sintetizan a la medida oligonucleótidos de 21 a 23 elementos específicos para el gen de la proteína de la cápside VP1. La síntesis de oligonucleótidos sentido y antisentido que representan estos genes, se basa en la secuencia publicada del genoma del parvovirus canino, número de acceso del GenBank NC001639 (Reed ef al., 1988, J. Virol. 62: 266-276). Se elige la región N-terminal de VP1 para este diseño, puesto que se ha mostrado que afecta el transporte nuclear de cápsides y la infección eficiente por este virus (Vihinen-Ranta et al., 2002, J. Viroi. 76: 1884-1891 ). Se unen secuencias de oligonucleótidos sentido y antisentido para generar ADN de doble cadena, y se clonan en un vector de plásmido L4440 (Kamath et al., 2002, Genome Biol. 2:0002.0001-0002.0010). El plásmido recombinante se usa para transformar la cepa HT115DE3 de Escherichia coli (que posee expresión de T7 polimerasa inducible por IPTG, y que carece de ribonucleasa III específica de doble cadena; Kamath ef al., 2002, Genome Biol. 2:0002.0001-0002.0010). Los clones recombinantes que poseen genes específicos del CPV son secuenciados para confirmar la identidad de los clones. Estas moléculas de ARNsi se formulan entonces en alimentos, y se usan para el tratamiento de perros para prevenir la infección por el CPV usando métodos análogos a los descritos en los ejemplos anteriores para otros animales (ejemplos 2 y 3).

EJEMPLO 22 Construcción de plásmido recombinante que contiene 21 a 23 nucleótidos de genes del virus del síndrome de la mancha blanca (WSSV) para expresión en plantas Se diseñan y sintetizan a la medida oligonucleótidos de 21 a 23 elementos específicos para los siguientes cinco genes del WSSV, y se unen las secuencias de oligonucleótidos sentido y antisentido para generar ADN de doble cadena como se describe en el ejemplo 1. Para su uso en sistemas de plantas, se usa un plásmido diferente basado en la región de ADN T del plásmido Ti de Agrobacterium. Está disponible un gran número de estos plásmidos que son adecuados para su uso en una variedad de especies de plantas (véase referencias). El ADN de doble cadena (ADNds) unido es clonado en un vector de plásmido que tenga dos promotores en cadenas opuestas, tales como los promotores lac, trp o PL, usando métodos estándar para construir el plásmido y producir la construcción (Clark, 1997, Plant Molecular Biology. Springer, Berlín). El plásmido recombinante se usa para transformar células de alfalfa (Taschner ef ai, 1994, Virology 203: 269-276; Larrick et al., 2001 , Biomol. Eng. 18: 87-94; Kelemen et al., 2002, Transgenic Res. 11 : 69-72). El cultivo de callos recombinante que posee genes específicos del WSSV, es secuenciado para confirmar la identidad de los clones. Se usan callos para regenerar plantas genéticamente diseñadas que expresen el ARN específico del WSSV. El material de la planta es desecado suavemente por secado al aire, e incorporado entonces en alimentos y usado para la protección del camarón contra ia infección por el WSSV en métodos análogos a los de los ejemplos 2 y 3.

EJEMPLO 23 Formulación de alimento alternativa que usa recubrimiento superior Se usa recubrimiento superior de alimentos con biomasa usando tecnología de alimentos estándar, en donde la biomasa que contiene a la biomasa como se describió en los ejemplos anteriores (por ejemplo, ejemplos 2, 5, 8, 11 y 12) es recubierta sobre un alimento existente, y provista para proveer la regulación de actividad deseada.

EJEMPLO 24 Diseño de ARNsi del virus del síndrome de Taura Diseños de ARNi para el gen RdRp del virus del síndrome de Taura (TSV) (AF277676) que podrían ser regulados por ARNi, pueden hacerse de varias formas diferentes. Según diseño por Ambion, un diseño de ARNsi se basa en una cadena de ARNsi sentido (5A3') GGAGUGUCUA AUGCGGAGAT T (SEQ ID NO: ) y una cadena de ARNsi antisentido (5'?3") UCUCCGCAUU AGACACUCCT G (SEQ ID NO:_). El diseño del molde para esto usa vectores de ARNsi pSilencer(TM) que tienen el molde de oligonucleótidos de la cadena superior d'-GATCC GGAGT GTCTAATGCG GAGATTCAAG AGATCTCCGC ATTAGACACT CCTG l i l i l í GGAAA-3" (SEQ ID NO: ) y el molde de oligonucleótidos de la cadena inferior d'-AGCTTTTCCA AAAAA CAGGA GTGTCTAATG CGGAGATCTC TTGAATCTCC GCATTAGACA CTCC G-3' (SEQ ID N0:_). Otro diseño de ARNi para el gen RdRp del virus del síndrome de Taura (TSV) (AF277675) que podría ser regulado por ARNi, puede hacerse de varias formas diferentes. Según diseño por Ambion, un diseño de ARNsi se basa en una cadena de ARNsi sentido (5A3') GGGAAGAGCG GAAAGCAGAT T (SEQ ID NO: ) y una cadena de ARNsi antisentido (d '?3') UCUGCUUUCC GCUCUUCCCT T (SEQ ID NO:_). El diseño del molde para esto usa vectores de ARNsi pSilencer(TM) que tienen el molde de oligonucleótidos de la cadena superior d'-GATCC GGGAA GAGCGGAAAG CAGATTCAAG AGATCTGCTT TCCGCTCTTC CCTTTTTTGG AAA-3' (SEQ ID NO: ) y el molde de oligonucleótidos de la cadena inferior d'-AGCTTTTCCA AAAAA GGGAA GAGCGGAAAG CAGATCTCTT GAATCTGCTT TCCGCTCTTC CC G-3' (SEQ ID NO:_). Otro diseño de ARNi para el gen RdRp del virus del síndrome de Taura (TSV) (AF277675) que podría ser regulado por ARNi, puede hacerse de varias formas diferentes. Según diseño por Ambion, un diseño de ARNsi se basa en una cadena de ARNsi sentido (d'?3') GGAAUUCAUU GUUGACAACT T (SEQ ID NO:_ y una cadena de ARNsi antisentido (d'?3') GUUGUCAACA AUGAAUUCCT C (SEQ ID NO:__). El diseño del molde para esto usa vectores de ARNsi pSilencer(TM) que tienen el molde de oligonucleótidos de la cadena superior d'-GATCC GGAAT TCATTGTTGA CAACTTCAAG AGAGTTGTCA ACAATGAATT CCTC l i l i l í GGAAA-3' (SEQ ID NO ) y el molde de oligonucleótidos de la cadena inferior 5'-AGCTTTTCCA AAAAAGAGGA ATTCATTGTT GACAACTCTC TTGAAGTTGT CAACAATGAA TTCC G-3' (SEQ ID N0:__). Diseños de ARNi para el gen vp1 del virus del síndrome de Taura (TSV) (AF277675) que podría ser regulado por ARNi, pueden hacerse de varias formas diferentes. Según diseño por Ambion, un diseño de ARNsi se basa en una cadena de ARNsi sentido (5'?3') GGAUUGGAUG AGAUGUCUAT T (SEQ ID NO:_) y una cadena de ARNsi antisentido (d'?3') UAGACAUCUC AUCCAAUCCT T (SEQ ID NO:__). El diseño del molde para esto usa vectores de ARNsi pSilencer(TM) que tienen el molde de oligonucleótidos de la cadena superior d'-GATCC GGATT GGATGAGATG TCTATTCAAG AGATAGACAT CTCATCCAAT CCTTTTTTGG AAA-3' (SEQ ID NO: ) y el molde de oligonucleótidos de la cadena inferior d'-AGCTTTTCCA AAAAAGGATT GGATGAGATG TCTATCTCTT GAATAGACAT CTCATCCAAT CC G-3' (SEQ ID NO:__). Otro diseño de ARNi para el gen vp del virus del síndrome de Taura (TSV) (AF277675) que podría ser regulado por ARNi, puede hacerse de varias formas diferentes. Según diseño por Ambion, un diseño de ARNsi se basa en una cadena de ARNsi sentido (5A3') GGUACGCUUG CUAAAGCAGT T (SEQ ID NO: ) y una cadena de ARNsi antisentido (5*?3') CUGCUUUAGC AAGCGUACCT G (SEQ ID NO:_). El diseño del molde para esto usa vectores de ARNsi pSilencer(TM) que tienen el molde de oligonucleótidos de la cadena superior d'-GATCC GGTAC GCTTGCTAAA GCAGTTCAAG AGACTGCTTT AGCAAGCGTA CCTG l i l i l í GGAAA-3' (SEQ ID NO: ) y el molde de oligonucleótidos de la cadena inferior 5'- AGCTTTTCCA AAAAA CAGGT ACGCTTGCTA AAGCAGTCTC TTGAACTGCT TTAGCAAGCG TACC G-3' (SEQ ID NO:_). Otro diseño de ARNi para el gen vp1 del virus del síndrome de Taura (TSV) (AF277675) que podría ser regulado por ARNi, puede hacerse de varias formas diferentes. Según diseño por Ambion, un diseño de ARNsi se basa en una cadena de ARNsi sentido (d'?3') GGAUACGAAG GUGUCUUUGT T (SEQ ID NO: ) y una cadena de ARNsi antisentido (5'?3') CAAAGACACC UUCGUAUCCT G (SEQ ID NO:_). El diseño del molde para esto usa vectores de ARNsi pSilencer(TM) que tienen el molde de oligonucleótidos de la cadena superior d'-GATCC GGATA CGAAGGTGTC TTTGTTCAAG AGACAAAGAC ACCTTCGTAT CCTG l i l i l í GGAAA-3' (SEQ ID NO: ) y el molde de oligonucleótidos de la cadena inferior d'-AGCTTTTCCA AAAAA CAGGA TACGAAGGTG TCTTTG TCT CTTGAACAAA GACACCTTCG TATCC G-3' (SEQ ID NO._).

EJEMPLO 25 Diseño de ARNsi para el virus de la cabeza amarilla del camarón Diseños de ARNi para el gen de la glucoproteína estructural YHVgp del virus de la cabeza amarilla (YHV) (AF540644) que podría ser regulado por ARNi, pueden hacerse de varias formas diferentes. Según diseño por Ambion, un diseño de ARNsi se basa en una cadena de ARNsi sentido (5'?3') GGCUCGCAUA UCAUUUAUAT T (SEQ ID NO:_) y una cadena de ARNsi antisentido (5 A3') UAUAAAUGAU AUGCGAGCCT G (SEQ ID NO: ). El diseño del molde para esto usa vectores de ARNsi pSilencer(TM) que tienen el molde de oligonucleótidos de la cadena superior d d'-GATCCGGCTC GCATATCATT TATATTCAAG AGATATAAAT GATATGCGAG CCTGTTTTTT GGAAA-3' (SEQ ID NO:_) y el molde de oligonucleótidos de la cadena inferior d'-AGCTTTTCCA AAAAACAGGC TCGCATATCA TTTATATCTC TTGAATATAA ATGATATGCG AGCC G-3' (SEQ ID NO:__). 0 Otro diseño de ARNi para el gen de la glucoproteína estructural YHVgp del virus de la cabeza amarilla (YHV) (AF540644) puede hacerse de varias formas diferentes. Según diseño por Ambion, un diseño de ARNsi se basa en una cadena de ARNsi sentido (5'->3") GGAUAUCCUC CCGCCAACAT T (SEQ ID NO: ) y una cadena de ARNsi antisentido (5'?3') d UGUUGGCGGG AGGAUAUCCT T (SEQ ID NO:_). El diseño del molde para esto usa vectores de ARNsi pSilencer(TM) que tienen el molde de oligonucleótidos de la cadena superior d'-GATCC GGATA TCCTCCCGCC AACATTCAAG AGATGTTGGC GGGAGGATAT CCTTTTTTGG AAA-3' (SEQ ID NO: ) y el molde de oligonucleótidos de la cadena inferior 5'-0 AGCTTTTCCA AAAAA GGATA TCCTCCCGCC AACATCTCTT GAATGTTGGC GGGAGGATAT CC G-3" (SEQ ID NO:_). Otro diseño de ARNi para el gen de la glucoproteína estructural YHVgp del virus de la cabeza amarilla (YHV) (AF640644) puede hacerse de varias formas diferentes. Según diseño por Ambion, un diseño de ARNsi se basa en una cadena de ARNsi sentido (d'?3') GGUCUUUGUU AUGAAGUAGT T (SEQ ID NO:_) y una cadena de ARNsi antisentido (5'?3') CUACUUCAUA ACAAAGACCT T (SEQ ID NO:_). El diseño del molde para esto usa vectores de ARNsi pSilencer(TM) que tienen el molde de oligonucleótidos de la cadena superior d'-GATCC GGTCT TTGTTATGAA GTAGTTCAAG AGACTACTTC ATAACAAAGA CCTTTTTTGG AAA-3' (SEQ ID NO: ) y el molde de oligonucleótidos de la cadena inferior d'-AGCTTTTCCA AAAAAGGTCT TTGTTATGAA GTAGTCTCTT GAACTACTTC ATAACAAAGA CC G-3' (SEQ ID NO:_).

EJEMPLO 26 Diseño de ARNsi del virus de la necrosis hipodérmica y hematopoyética infecciosa (IHHNV) El diseño de ARNsi para el gen o/ 1 del virus de la necrosis hipodérmica y hematopoyética infecciosa (IHHNV) (AF273215) puede hacerse de varias formas diferentes. Según diseño por Ambion, un diseño de ARNsi se basa en una cadena de ARNsi sentido (5'?3") GGACAUACUG CAUACACGUT T (SEQ ID NO:_) y una cadena de ARNsi antisentido (5A3') ACGUGUAUGC AGUAUGUCCT T (SEQ ID NO:_). El diseño del molde para esto usa vectores de expresión de ARNsi pSilencer(TM) (2.0, 2.1 , 3.0 y 3.1 de Ambion) con el molde de oligonucleótidos de la cadena superior d'- GATCCGGACA TACTGCATAC ACGTTTCAAG AGAACGTGTA TGCAGTATGT CCTTTTTTGG AAA-3' (SEQ ID N0:_) y el molde de oligonucleótidos de la cadena inferior d'-AGCTTTTCCA AAAAA GGACA TACTGCATAC ACGTTCTCTT GAAACGTGTA TGCAGTATGT CC G-3' (SEQ ID NO._). Un segundo diseño de ARNsi para el gen orft del IHHNV (AF273215) puede hacerse de varias formas diferentes. Según diseño por Ambion, un diseño de ARNsi se basa en una cadena de ARNsi sentido (5'?3') GGUCCAAAUC AAGACCCUAT T (SEQ ID NO:_) y una cadena de ARNsi antisentido (d'?3') UAGGGUCUUG AUUUGGACCT G (SEQ ID NO: ). El diseño del molde para esto usa vectores de ARNsi pSilencer(TM) con el molde de oligonucleótidos de la cadena superior 5'-GATCC GGTCC AAATCAAGAC CCTATTCAAG AGATAGGGTC TTGATTTGGA CCTGTTTTTT GGAAA-3' (SEQ ID NO: ) y el molde de oligonucleótidos de la cadena inferior d'-AGCTTTTCCA AAAAACAGGT CCAAATCAAG ACCCTATCTC TTGAATAGGG TCTTGATTTG GACC G-3' (SEQ ID NO:_). Un tercer diseño de ARNsi para el gen orft del IHHNV (AF273216) puede hacerse de varias formas diferentes. Según diseño por Ambion, un diseño de ARNsi se basa en una cadena de ARNsi sentido (5'?3') GGACAAUAUA AAGACAAACT T (SEQ ID NO:_) y una cadena de ARNsi antisentido (5'?3') GUUUGUCUUU AUAUUGUCCT C (SEQ ID NO: ). El diseño del molde para esto usa vectores de ARNsi pSilencer(TM) con el molde de oligonucleótidos de la cadena superior d'-GATCCGGACA ATATAAAGAC AAACTTCAAG AGAGTTTGTC TTTATATTGT CCTC l i l i l í GGAAA-3' (SEQ ID NO: ) y el molde de oligonucleótidos de la cadena inferior d'-AGCTTTTCCA AAAAAGAGGA CAATATAAAG ACAAACTCTC TTGAAGTTTG TCTTTATATT GTCC G-3' (SEQ ID NO:__). Otro gen que podría ser regulado por medio del diseño de ARNi para el gen orfl del IHHNV (AF273215), puede obtenerse de varias formas diferentes. Según diseño por Ambion, un diseño de ARNsi se basa en una cadena de ARNsí sentido (5'?3') GGAUCAAGUG GACCAGACCT T (SEQ ID NO: ) y una cadena de ARNsi antisentido (5"?3') GGUCUGGUCC ACUUGAUCCT T (SEQ ID NO:_). El diseño del molde para esto usa vectores de ARNsi pSilencer(TM) con el molde de oligonucleótidos de la cadena superior d'-GATCCGGATC AAGTGGACCA GACCTTCAAG AGAGGTCTGG TCCACTTGAT CCTTTTTTGG AAA-3' (SEQ ID NO:_) y el molde de oligonucleótidos de la cadena inferior d'-AGCTTTTCCA AAAAAGGATC AAGTGGACCA GACCTCTCTT GAAGGTCTGG TCCACTTGAT CC G-3' (SEQ ID NO:_). Otro diseño de ARNi para el gen orfZ del IHHNV (AF273215) puede hacerse de varias formas diferentes. Según diseño por Ambion, un diseño de ARNsi se basa en una cadena de ARNsi sentido (5'?3') GGAGGCACAU CAUUUGAGAT T (SEQ ID NO:_) y una cadena de ARNsi antisentido (5A3') UCUCAAAUGA UGUGCCUCCT G (SEQ ID NO:_). El diseño del molde para esto usa vectores de ARNsi pSilencer(TM) con el molde de oligonucleótidos de la cadena superior d'-GATCCGGAGG CACATCATTT GAGATTCAAG AGATCTCAAA TGATGTGCCT CCTGTTTTTT GGAAA-3' (SEQ ID NO: ) y el molde de oligonucleótidos de la cadena inferior d'-AGCTTTTCCA AAAAACAGGA GGCACATCAT TTGAGATCTC TTGAATCTCA AATGATGTGC CTCC G-3' (SEQ ID NO:_J. Otro diseño de ARNi para el gen orf? del IHHNV (AF273216) puede hacerse de varias formas diferentes. Según diseño por Ambion, un diseño de ARNsi se basa en una cadena de ARNsi sentido (5'?3') GGAUACUACUGGACUACAUTT (SEQ ID NO:_) y una cadena de ARNsi antisentido (5'?3') AUGUAGUCCA GUAGUAUCCT T (SEQ ID NO:_). El diseño del molde para esto usa vectores de ARNsi pSilencer(TM) con el molde de oligonucleótidos de la cadena superior 5'-GATCCGGATA CTACTGGACT ACATTTCAAG AGAATGTAGT CCAGTAGTAT CCTTTTTTGG AAA-3' (SEQ ID NO: ) y el molde de oligonucleótidos de la cadena inferior d'-AGCTTTTCCA AAAAAGGATA CTACTGGACT ACATTCTCTT GAAATGTAGT CCAGTAGTAT CC G-3' (SEQ ID NO:_).

EJEMPLO 27 Clonación de ARNsi en un vector de plásmido bacteriano Se unen secuencias de oligonucleótidos sentido y antisentido para generar ADN de doble cadena, y se clonan en un vector de expresión pET Directional TOPO(TM) (Invitrogen, Inc., Carlsbad, California) o vector de expresión de plásmido de Caulobacter pCX-TOPO PuruPro(TM) (Invitrogen, Inc.) o vector de plásmido L4440 (Kamath ef al. 2002). El plásmido recombinante se usará para transformar células químicamente competentes One Shot de la cepa BL21 Star(TM) (DE3) de Escherichia coli (Invitrogen, Inc.) o células de Caulobacter crescentus o células HTn5DE3 de Escherichia coli (Kamath ef al. 2001 ), respectivamente. Los clones recombinantes se secuenciarán para confirmar la identidad de los clones. Los clones que contengan genes específicos del virus se desarrollarán en medio de LB que contenga ampicilina e IPTG. La concentración de IPTG se determinará empíricamente para obtener la expresión máxima de ARNsi. Células que contengan la biomasa de bacterias que expresen ARNsi se mezclarán con alimento para camarones en un formato microunido en perlas formadas de alginato y almidón en una forma polimérica. Se añadirán al alimento atrayentes tales como harina de krill para hacerlo más aceptable para los camarones.

EJEMPLO 30 Enfermedades de animales acuáticos y terrestres l. Enfermedades de animales acuáticos A. Protozoarios i. Amyloodinium ocellatum (dinoflagelado) ii. Brooklynella hostilis (ciliado) iii. Cryptocaryon irritans (ciliado) iv. Ichthyopthirius multifilis (un ciliado) v. Chilodonella cyprini (un ciliado) vi. Hexamita (un flagelado) B. Microsporea i. Glugea, Spraguea spp. C. Myxosporia i. Henneguya spp. ii. Myxobolus spp. D. Platelmintos i. Monogenea (tremátodo) ii. Digenea (tremátodos) iii. Cestodos (tenias) E. Nematodos i. Cappalaria (Eimeria spp.) F. Crustáceos i. Argulus spp. (braquiuro) ii. Lepeophtheirus salmonis (piojo del salmón - un copépodo) iii. Learnea spp. (acantocéfalo) G. Esporozoarios i. Coccidia spp. H. Hongos i. Saprolegnia parasítica (un oomiceto) ii. Aphanomyces astaci (un oomiceto) iii. Ichthyophonus hoferí (agente tipo hongo) iv. Fusarium solani (un hifomiceto) v. Expophiala salmonis (un hifomiceto) II. Enfermedades de animales terrestres Virus de la enfermedad equina africana (equinos) Virus de la fiebre porcina africana (porcinos) Virus de la enfermedad de Aujeszky (virus de herpes 1 de porcinos) Virus de la influenza aviar (aves de corral) Babesia caballi y B. equi (equinos) Bacillus anthracis (todos) Virus de la pelagra (ganado vacuno, ovejas, cabras, ciervos) Brucella melitenis (bovinos) Brucella ovis (ovinos) Brucella suis (porcinos) Burkholdaria (Pseudomonas) mallei (equinos) Virus de la fiebre porcina clásica (porcinos) Cochliomya hominivorax (ovinos, bovinos) Virus de la encefalomielitis equina Oriental y Occidental (equinos) Echinococcus multilocularis y E. granulosus (caninos) Virus de la anemia infecciosa equina (equinos) Virus de la glosopeda (ovinos, bovinos) Hystoplasma farciminosum (muchas especies tipo hongo) Poxvirus equino (equinos) Mycoplasma agalactiae (bovinos, ovinos) Mycoplasma mycoides mycoides Mycoplasma mycoides var capri (caprinos) Virus de la enfermedad de Newcastle (aves) Virus de la peste de pequeños rumiantes Virus de la rabia y virus relacionados con la rabia: Duvenhage Murciélago Lagos Mokola Lisavirus I y II del murciélago europeo Virus de la fiebre del valle del Rift Virus rinderpest o de la peste bovina (ovinos, bovinos, caprinos) Poxvirus ovino y caprino Enfermedad vesicular porcina Virus de la enfermedad de Teschen Theileria annulata (ovinos, bovinos) Trichinella spiralis, un protozoario (porcinos) Trypanosoma equiperdum, T. evansi y T. theilerí (protozoarios) Virus de la encefalomielitis equina venezolana (equinos) Virus de la estomatitis vesicular (porcinos) Brucelosis Enfermedad debilitante crónica Anemia infecciosa equina Arteritis viral equina Enfermedad de Johnes Pseudorrabia Scrapie (prurito lumbar) Tuberculosis Lo anterior, es una lista no exhaustiva de trastornos y agentes que causan trastornos que pueden tratarse o inhibirse usando los métodos y las composiciones que se describen en la presente. La descripción de cualquier patente, solicitud de patente y publicación citada en la presente, se incorpora en la misma en su totalidad en la presente como referencia. Aunque esta invención se ha descrito con relación a modalidades específicas, es evidente que otras modalidades y variaciones de esta invención pueden ser concebidas por los expertos en la técnica sin que se aparten del espíritu y alcance reales de la invención. Las reivindicaciones anexas incluyen la totalidad de dichas modalidades y variaciones equivalentes.

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1.- Un alimento, complemento alimenticio o composición terapéutica que comprende ARNsi o ARNds, dicho ARNsi o ARNds siendo expresado en un organismo, y capaz de ser procesado en ARNsi que inhibe a un patógeno de animales. 2.- El alimento, complemento alimenticio o composición terapéutica de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque dicho patógeno es un virus, bacteria u hongo. 3.- El alimento, complemento alimenticio o composición terapéutica de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicho virus se selecciona de virus del síndrome de la mancha blanca, virus del síndrome de Taura, virus de la cabeza amarilla y virus hipodérmico y hematopoyético infeccioso. 4.- El alimento, complemento alimenticio o composición terapéutica de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicho virus se selecciona de parvovirus porcino (PPV), enfermedad de Newcastle exótica, glosopeda (FMD), virus de la leucemia felina (FLV) y parvovirus canino. 5.- El alimento, complemento alimenticio o composición terapéutica de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicha bacteria se selecciona de bacterias patógenas acuícolas o agrícolas. 6.- El alimento, complemento alimenticio o composición terapéutica de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dicha bacteria patógena acuícola se selecciona de Aeromonas spp., Edwardsiella spp., Flavobacterium spp., Flexibacter spp., Mycobacterium sp., Streptococcus spp., Salmonella spp., Vibrio spp. y Yersinia reuckeri. 1 '.- El alimento, complemento alimenticio o composición terapéutica de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dicha bacteria patógena agrícola se selecciona de Mycobacterium spp., Enterococcus spp., Streptococcus spp., Salmonella spp. y Yersinia pestis. 8.- El alimento, complemento alimenticio o composición terapéutica de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicho hongo se selecciona de hongos patógenos acuícolas o agrícolas. 9.- El alimento, complemento alimenticio o composición terapéutica de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque dicho hongo patógeno acuícola se selecciona de Oomycetes, Aphanornyces astaci e Ichthyophonus spp. 10.- El alimento, complemento alimenticio o composición terapéutica de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque dicho hongo patógeno agrícola se selecciona de Trychophyton spp., Fusarium solani y Candida spp. 11.- El alimento, complemento alimenticio o composición terapéutica de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho patógeno es un eucarionte. d 12.- El alimento, complemento alimenticio o composición terapéutica de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque dicho eucarionte se selecciona de ciliado, amiba, protozoario, microspora, mixospora, platelminto, nematodo o esporozoario. 13.- El alimento, complemento alimenticio o composición 0 terapéutica de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho animal es un animal acuático. 14.- Ei alimento, complemento alimenticio o composición terapéutica de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque dicho animal acuático es un crustáceo. d 15.- El alimento, complemento alimenticio o composición terapéutica de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque dicho crustáceo se selecciona de camarón, Anemia, langosta, cangrejo, ástaco y quisquilla. 16.- El alimento, complemento alimenticio o composición 0 terapéutica de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque dicho animal acuático es un pez. 17.- El alimento, complemento alimenticio o composición terapéutica de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque dicho pez se selecciona de salmón, trucha, hipogloso, rodaballo, lobina listada, perca, tilapia, bagre y carpa. 18.- El alimento, complemento alimenticio o composición terapéutica de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además d porque dicho animal es un animal terrestre. 19.- El alimento, complemento alimenticio o composición terapéutica de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque dicho animal terrestre se selecciona de caballo, perro, gato, vaca, oveja, cabra, ave de corral, aves, visón, cerdo, hámster, ratón, conejo, rata, 0 gerbo y conejillo de Indias. 20.- El alimento, complemento alimenticio o composición terapéutica de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho ARNsi o ARNds se expresa en organismos seleccionados de insectos, bacterias, hongos, bacteriófagos, plantas y levaduras. 6 21.- El alimento, complemento alimenticio o composición terapéutica de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque dichos organismos se incluyen en el alimento como células enteras o principalmente enteras. 22.- El alimento, complemento alimenticio o composición 0 terapéutica de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque dichos organismos se incluyen en el alimento como células fracturadas o principalmente fracturadas. 23.- El alimento, complemento alimenticio o composición terapéutica de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque la biomasa de organismos es encapsulada. 24.- El alimento, complemento alimenticio o composición terapéutica de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además d porque la encapsulación se logra usando material seleccionado de polímero digestible, polímero no digestible, fosfolípidos, quitosán y alginato. 26.- Un método para proteger a un animal de un patógeno, que comprende proveer a dicho animal con un alimento que comprende además ARNsi o ARNds, en donde dicho ARNsi o ARNds se expresa en un 0 organismo, y dicho ARNsi o ARNds es capaz de ser procesado en ARNsi y de subregular la expresión del patógeno del animal por interferencia mediada por ARN. 26.- El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque dicho patógeno es un virus, bacteria u hongo. 27.- El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque dicho virus se selecciona de virus del síndrome de la mancha blanca, virus del síndrome de Taura, virus de la cabeza amarilla y virus hipodérmico y hematopoyético infeccioso. 28.- El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque dicho virus se selecciona de parvovirus porcino (PPV), enfermedad de Newcastle exótica, glosopeda (FMD), virus de la leucemia felina (FLV) y parvovirus canino. 29.- El alimento, complemento alimenticio o composición terapéutica de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque dicha bacteria se selecciona de bacterias patógenas acuícolas o agrícolas. 30.- El alimento, complemento alimenticio o composición terapéutica de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque dicha bacteria patógena acuícola se selecciona de Aeromonas spp., Edwardsiella spp., Flavobacterium spp., Flexibacter spp., Mycobacterium sp., Streptococcus spp., Salmonella spp., Vibrio spp. y Yersinia reuckeri. 31.- El alimento, complemento alimenticio o composición terapéutica de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque dicha bacteria patógena agrícola se selecciona de Mycobacterium spp., Enterococcus spp., Streptococcus spp., Salmonella spp. y Yersinia pestis. 32.- El alimento, complemento alimenticio o composición terapéutica de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque dicho hongo se selecciona de hongos patógenos acuícolas o agrícolas. 33.- El alimento, complemento alimenticio o composición terapéutica de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado además porque dicho hongo patógeno acuícola se selecciona de Oomycetes, Aphanornyces astaci e Ichthyophonus spp. 34.- El alimento, complemento alimenticio o composición terapéutica de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado además porque dicho hongo patógeno agrícola se selecciona de Trychophyton spp., Fusarium solani y Candida spp. 35.- El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque dicho patógeno es un eucarionte. 36.- El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque dicho eucarionte se selecciona de ciliado, amiba, protozoario, microspora, mixospora, platelminto, nematodo o esporozoario. 37.- El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque dicho animal es un animal acuático. 38.- El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado además porque dicho animal acuático es un crustáceo. 39.- El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterízado además porque dicho crustáceo se selecciona de camarón, Artemia, langosta, cangrejo, ástaco y quisquilla. 40.- El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado además porque dicho animal acuático es un pez. 41.- El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado además porque dicho pez se selecciona de salmón, trucha, hipogloso, rodaballo, lobina listada, perca, tilapia, bagre y carpa. 42.- El alimento, complemento alimenticio o composición terapéutica de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque dicho animal es un animal terrestre. 43.- El alimento, complemento alimenticio o composición terapéutica de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado además porque dicho animal terrestre se selecciona de caballo, perro, gato, vaca, oveja, cabra, ave de corral, aves, visón, cerdo, hámster, ratón, conejo, rata, gerbo y conejillo de Indias. 44.- El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque dicho ARNsi o ARNds se expresa en organismos seleccionados de insectos, bacterias, hongos, bacteriófagos, plantas y levaduras. 45.- El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado además porque dichos organismos se incluyen en el alimento como células enteras o principalmente enteras. 46.- El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado además porque dichos organismos se incluyen en el alimento como células fracturadas o principalmente fracturadas. 47.- El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado además porque la biomasa de organismos es encapsulada. 48.- El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado además porque la encapsulación se logra usando material seleccionado de polímero digestible, polímero no digestible, fosfolípidos, quitosán y alginato. 49.- El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque un alimento que es complementado con células bacterianas recombi?antes que contienen de 21 a 23 nucleótidos de longitud que degradan selectivamente el ARN mensajero homólogo con un elemento que causa enfermedad, reduce o alivia un estado de enfermedad.