MXPA06007097A

MXPA06007097A - Generacion de plantas con contenido oleaginoso alterado.

Info

Publication number: MXPA06007097A
Application number: MXPA06007097A
Authority: MX
Inventors: John P Davies
Original assignee: Agrinomics Llc
Priority date: 2003-12-17
Filing date: 2004-12-17
Publication date: 2006-09-04
Also published as: BRPI0417191A; WO2005058019A2; ZA200605437B; CN1893818A; US7528295B2; CN100535120C; US20070163001A1; WO2005058019A3

Abstract

La presente invencion esta dirigida a plantas que despliegan un fenotipo de contenido oleaginoso alterado debido a la expresion alterada de acido nucleico HIO32.3; la invencion ademas esta dirigida a metodos para generar plantas con un fenotipo de contenido oleaginoso alterado.

Description

GENERACIÓN DE PLANTAS CON CONTENIDO OLEAGINOSO ALTERADO REFERENCIA SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama la prioridad de la solicitud provisional de E. U. A. 60/530,878 presentada el 17 de diciembre, 2003, el contenido de la cual se incorpora aquí por referencia.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La habilidad de manipular la composición de semillas de cultivo, particularmente el contenido y composición de aceites de semilla, tienen importantes aplicaciones en las industrias agrícolas, relacionando tanto los aceites de alimentos procesados y los aceites para formar alimentos de animales. Las semillas de cultivos agrícolas contienen una variedad de constituyentes valiosos, incluyendo aceite, proteína, y almidón. El procesamiento industrial puede separar algunos o todos estos constituyentes para una venta individual en aplicaciones específicas. Por ejemplo, cerca del 60% del cultivo de fríjol de soya en Estados Unidos se tritura a través de la industria de procesamiento de soya. El procesamiento de soya produce aceite purificado, el cual se vende a un valor muy alto, mientras que el resto se vende principalmente para alimentos de ganado a un precio más bajo (U. S.

Soybean Board, 2001 Soy Stats). Las semillas de cañóla se trituran para producir aceite y el coproducto de alimento de cañóla (Corn Refiners Association). Cerca del 20% de la cosecha de maíz de 1999/2000 en Estados Unidos se refino industrialmente, principalmente para la producción de almidón, etanol, y aceite (Corn Refiners Associaíion). De esta forma, por lo general se desea maximizar el contenido oleaginoso de las semillas. Por ejemplo, las semillas de aceite procesadas tales como soya y cañóla incrementando el contenido oleaginoso absoluto de las semillas incrementará el valor de dichos granos. Para maíz procesado puede ser deseable ya sea incrementar o disminuir el contenido oleaginoso, dependiendo de la utilización de otros constituyentes principales. La disminución de aceite puede mejorar la calidad del almidón aislado a través de la reducción de los sabores no deseados asociados con la oxidación del aceite. Alternativamente, en la producción de etanol, en donde el sabor no es importante, el incremento en el contenido oleaginoso puede incrementar el valor total. En muchos granos alimenticios, tales como maíz y trigo, es deseable incrementar el contenido oleaginoso de la semilla, debido a que el aceite tiene un contenido de energía mayor que otros constituyentes de la semilla tales como carbohidratos. El procesamiento de las semillas de aceite, como en la mayoría de los negocios de procesamiento de granos, es un negocio intensivo en cuanto a capital; de esta forma los pequeños cambios en la distribución de los productos de componentes valuados como bajos a los componentes oleaginosos de alto valor pueden tener impactos sustancialmente económicos para los procesadores de granos. La manipulación biotecnológica de los aceites puede proveer una alteración én la composición y un mejoramiento en el rendimiento del aceite. Las alteraciones en la composición incluyen fríjol de soya alto oleico y aceite de maíz (patentes de E. U. A. Nos. 6,229,033 y 6,248,939), y semillas conteniendo lauréate (patente de E. U. A. No. 5,639,790), entre otros. El trabajo en la alteración en la composición está predominantemente enfocado en semillas de aceite procesado pero se ha extendido rápidamente a cultivos de semillas no de aceite, incluyendo maíz. Ya que existe un interés considerable en el incremento de contenido oleaginoso, la única biotecnología actualmente practicada en esta área es la tecnología de maíz alta en aceite (HOC) (DuPont, patente de E. U. A. No. 5,704,160). HOC emplea polinizadores altos en aceite desarrollados a través de la selección clásica de producción junto con hembras híbridas élite (machos estériles) en un sistema de producción referido como TopCross. El sistema alto en aceite TopCross da origen a contenido oleaginoso de grano cosechado en maíz de aproximadamente 3.5% a aproximadamente 7%, mejorando el contenido de energía del grano. Aunque ha sido provechoso, el sistema de producción HOC tiene limitaciones inherentes. Primero, el sistema de tener un bajo porcentaje de polinizadores responsables de un grupo de semillas del campo completo contiene riesgos inherentes, particularmente en los años de sequía. Segundo, el contenido oleaginoso en los campos HOC actuales ha estado apático en alrededor de 9% de aceite. Finalmente, el maíz alto en aceite no es principalmente un cambio bioquímico, sino más bien un mutante anatómico (tamaño del embrión incrementado) que tiene un resultado indirecto sobre el contenido oleaginoso en incremento. Por estas razones, sería especialmente valiosa una alternativa de estrategia alta en aceite, particularmente una que se deriva de una salida bioquímica alterada, sería especialmente valioso. Los cultivos objetivo más obvios para el mercado de aceite procesado son soya y se milla de colza, y una gran parte de trabajo comercial (por ejemplo, patente de E. U. A. No. 5,952,544; Solicitud PCT WO 9411516) demuestran que Arabidopsis es un modelo excelente para el metabolismo del aceite en estos cultivos. Las selecciones bioquímicas de composiciones oleaginosas de semillas han identificados los genes de Arabidopsis para muchas enzimas biosintéticas críticas y han conocido la identificación de ortólogos de gen agronómicamente importantes. Por ejemplo, las selecciones utilizan poblaciones químicamente mutagenizadas han identificado mutantes lípidos cuyas semillas despliegan una composición de ácido graso alterado (Lemieux y otros, 1990; James y Dooner, 1990). Las selecciones de mutagénesis T-DNA (Fieldmann y otros, 1989) que detectaron las composiciones de ácido graso alteradas identificaron los genes de desaturasa de omega 3 (FAD3) y desaturasa delta-12 {FAD2) (patente de E. U. A. No. 5,952,544; Yadav y otros, 1993; Okuley y otros, 1994). Una selección que se - enfoca sobre el contenido oleaginoso en vez de la calidad del aceite, analizó los mutantes químicamente inducidos para semillas rugosas o la densidad de la semilla alterada, a partir de la cual el contenido oleaginoso de la semilla altera fue inferido (Focks y Benning, 1998). Otra selección, designada para identificar enzimas involucradas en la producción de ácidos grasos de cadena muy larga, identificaron una mutación en el gen que codifica aciltransferasa de diacilglicerol (DGAT) como siendo la responsable de la acumulación de glicerol de triacilo reducido en las semillas (Katavic V y otros, 1995). Además se demostró que la sobre-expresión específica de las semillas de ADNc de DGAT estuvo asociada con el contenido oleaginoso de semilla incrementado (Jako y otros, 2001 ). La activación de la marcación en plantas referidas como un método para generar mutaciones aleatorias a través de la inserción de una construcción de ácido nucleico heterólogo comprende secuencias reguladoras (por ejemplo, un mejorador) dentro del genoma de la planta. Las secuencias reguladoras pueden actuar para mejorar la trascripción de uno o más genes de planta nativos; por consiguiente, la activación de la marcación es un método fructífero para generar ganancias de función, generalmente mutantes dominantes (ver, por ejemplo, Hayashi y otros, 1992; Weigel D y otros, 2000). La construcción insertada provee una etiqueta molecular para una rápida identificación de la planta nativa cuyo error en expresión causa el fenotipo mutante. La activación de la marcación también puede causar la pérdida de la función de lo fenotipos. La inserción puede dar como resultado la interrupción del gen de la planta nativa, en cuyo caso el fenotipo es generalmente recesivo.

La activación de la marcación se ha utilizado en varias especies, incluyendo tabaco y Arabidopsis, para identificar muchas diferentes clases de fenotipos mutantes y de genes asociados con estos fenotipos (Wilson y otros, 1996, Schaffer y otros, 1998, Fridborg y otros, 1999; Kardailsky y otros, 1999; Christensen S y otros, 1998).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención provee una planta transgénica que tiene un fenotipo altamente oleaginoso. La planta transgénica comprende un vector, de transformación que comprende una secuencia de nucleótido que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica el polipéptido HI032.3 que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO:2, o un ortólogo del mismo. En modalidades preferidas, la planta transgénica se selecciona del grupo que consiste de semilla de colza, de soya de maíz, de girasol, de algodón de cacao, de cártamo de aceite de palma, de palma de coco, de lino, de ricino y de cacahuate. La invención también provee un método para producir aceite que comprende el crecimiento de la planta transgénica y la recuperación del aceite a partir de dicha planta. La Invención además provee un método para generar una planta que tiene un fenotipo altamente oleaginoso a través de la identificación de la planta que tiene un alelo en su gen HIO30.4 que da como resultado el contenido de aceite incrementado comparado con plantas que carecen de alelo y la generación de la progenie de la planta identificada, en donde la proviene generada hereda el alelo y tiene un fenotipo altamente oleaginoso. La planta transgénica de la invención se produce a través de métodos que comprenden la introducción de las células progenitoras de la planta a un vector de transformación de la planta que comprende una secuencia de nucleótido que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica un polipéptido HI032.2, y el crecimiento de las células progenitoras trasformadas para producir una planta transgénica, en donde la secuencia de polinucleótido HIO32.2 se expresa originando un fenotipo altamente oleaginoso.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones A menos que se indique otra cosa, todos los términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen el mismo significado que tendrían para un experto en la técnica de la presente invención. Los practicantes están particularmente dirigidos a Sambrook y otros, 1989, y Ausubel F y otros, 1993, para definiciones y términos de la técnica. Se entiende que esta invención no está limitada a la metodología, protocolos, y reactivos particulares descritos, y que éstos pueden variar. - -~- Como se utiliza aquí, el término "vector" se refiere a una construcción de ácido nucleico diseñada para transferirse entre varias células huésped. Un "vector de expresión" se refiere a un vector que tiene la habilidad de incorporar y expresar fragmentos de ADN heterólogos en una célula extraña. Muchos vectores de expresión procarióticos y eucarióticos están comercialmente disponibles. La selección de los vectores de expresión apropiados está dentro del conocimiento de aquellos expertos en la técnica. Una construcción o secuencia de ácido nucleico "heteróloga" tiene una porción de la secuencia que no es nativa para la célula de planta en la cual se expresa. Heterólogo, con respecto a una secuencia de control se refiere a la secuencia de control (es decir, promotora, o mejoradora) que no funcionan en natural para regular el mismo gen de expresión del cual está actualmente regulada. Generalmente, las secuencias de ácido nucleico heterólogas no son endógenas para la célula o parte del genoma en la cual están presentes, y se han adicionado a la célula, a través de infección, transfección, microinyección, electroporación, o similares. Una construcción de ácido nucleico "heteróloga" puede contener una secuencia de control/secuencia de codificación de ADN en combinación que es igual que o diferente de una secuencia de control/secuencia de codificación de ADN en combinación encontrado en la planta nativa. Como se utiliza aquí, el término "gen" significa el segmento de ADN involucrado en la producción de una cadena de polipéptido, la cual puede o no puede incluir regiones que preceden y siguen la región de codificación, por ejemplo, 5' no traducida (5' UTR) o secuencias "líder" y 3' UTR o secuencias "trailer" así como las secuencias que intervienen (intrones) entre los segmentos de codificación individuales (exones) y la secuencia reguladora no transcrita. Como se utiliza aquí, "recombinante" incluye la referencia a una célula vector, que ha sido modificada a través de la introducción de una secuencia de ácido nucleico heteróloga o que la célula se deriva de una célula así modificada. De esta forma, por ejemplo, la células recombinantes expresan genes que no se encuentran en una idéntica dentro de la forma nativa (no recombinante) de la célula o expresan genes nativos que por el contrario están anormalmente expresados, sub-expresados o no expresados para nada como un resultado de la intervención humana deliberada. Como se utiliza aquí, el término "expresión de gen" se refiere al proceso a través del cual el polipéptido se produce con base en la secuencia de ácido nucleico de un gen. El proceso incluye tanto la trascripción como la traducción; por consiguiente, "expresión" se puede referir ya sea a una secuencia de polinucleótido o de polipéptido, o ambos. Algunas veces, la expresión de una secuencia de polinucleótido no conducirá a traducción de la proteína. "Sobre-expresión" se refiere a una expresión incrementada de una secuencia de polinucleótido y/o polipéptido relativa a su expresión en una planta de tipo silvestre (u otra referencia [por ejemplo no transgénica]) y puede estar relacionada con una secuencia de existencia natural o de existencia no natural. "Expresión ectópica" se refiere a la expresión en un momento, lugar y/o nivel incrementado que no ocurre naturalmente en la planta alterada o de tipo silvestre. "Sub-expresión" se refiere a una expresión disminuida de una secuencia de polinucleótido y/o polipéptido, generalmente de un gen endógeno, con relación a su expresión en una planta de tipo silvestre. Los términos "error en la expresión" y "expresión alterada" abarca la sobre expresión, la sub-expresión y la expresión ectópica. El término "introducido" en el contexto de la inserción de una secuencia de ácido nucleico dentro de una célula, significa "transfección", o "transformación" o "transducción" incluye la referencia a la incorporación de una secuencia de ácido nucleico dentro de una célula eucariótico o procariótica en donde la secuencia de ácido nucleico se puede incorporar dentro del genoma de la célula (por ejemplo, cromosoma, plásmido, plástido, o ADN mitocondrial), convertido en un replicón, o temporalmente expresado (por ejemplo, ARNm transfectado). Como se utiliza aquí "célula de planta" se refiere a cualquier célula derivada de una planta, incluyendo células de tejidos no diferenciados (por ejemplo, cayo) así como semillas de planta, polen, propágulos y embriones. Como se utiliza aquí, los términos "nativo" y "de tipo silvestre" -relativos a una característica o fenotipo de planta dada se refiere a la forma en la cual la característica o fenotipo se encuentra en la misma variedad de planta en naturaleza. Como se utiliza aquí, el término "modificado" con respecto a la característica de la planta, se refiere a un cambio en el fenotipo de una planta transgénica con relación a una planta no transgénica similar; un "fenotipo interesante (característica)" con referencia a una planta transgénica se refiere a un fenotipo observable o medible demostrado a través de T1 y/o la subsiguiente generación de la planta, que no se despliega a través de la no transgénica (es decir, una planta genotípicamente similar que ha surgido o se - ha ensayado bajo condiciones similares). Un fenotipo interesante puede representar un mejoramiento en la planta o puede proveer medios para producir mejoras en otras plantas. Un "mejoramiento" es una característica que puede mejorar la utilidad de una especie de planta o variedad a través de la provisión de plantas con una calidad única y/o novedosa. Un "fenotipo de contenido oleaginoso alterado" se refiere a un fenotipo medible de una planta genéticamente modificada, en donde la planta despliega un incremento estadísticamente significativo o una disminución en el contenido oleaginoso global (es decir, el porcentaje de masa de semilla que es aceite), según comparado con la planta no modificada, similar. Un fenotipo altamente oleaginoso se refiere a un incremento en el contenido oleaginoso global. Como se utiliza aquí, una secuencia de polinucleótido "mutante" o gen difiere de la secuencia de polinucleótido de tipo silvestre correspondiente o gen ya sea en términos de secuencia o de expresión en donde la diferencia contribuye a un fenotipo o característica de la planta modificada. Con relación a una planta o línea de plantas, el término "mutante" se refiere a una planta o línea de plantas que tiene un fenotipo o característica de planta modificada, en donde el fenotipo o característica modificada está asociado con la expresión modificada de una secuencia o gen de polinucleótido de tipo silvestre. Como se utiliza aquí, el término "T1" se refiere a la generación de plantas a partir de las semillas de plantas TO. La generación T1 es el . primer grupo de plantas transformadas se pueden seleccionar a través de la aplicación de un agente de selección, por ejemplo, un antibiótico o herbicida, para el cual la planta transgénica contiene el gen resistente correspondiente. - El término de "T2" se refiere a la generación de plantas a través de auto- fertilización de las flores de las plantas T1 , previamente seleccionadas como siendo transgénicas. Las plantas T3 se generan a partir de plantas T2, etc. Como se utiliza aquí, "progenie directo" de una planta dada se deriva a partir de la semilla (o, algunas veces, otro tejido) de la planta y es la generación inmediatamente subsiguiente; por ejemplo, para un linaje dado, una planta T2 es la progenie directa de una planta T1. La "progenie indirecta" de una planta dada se deriva a partir de la semilla (u otro tejido) de la progenie directa de la planta, o de la semilla (u otro tejido) de las generaciones subsecuentes en ese linaje; por ejemplo, una planta T3 es la progenie indirecta de una planta T1. Como se utiliza aquí, el término "parte de la planta" incluye cualquier órgano o tejido de la planta, incluyendo, sin limitación, semillas, embriones, regiones medistemáticas, tejido de callo, hojas, raíces, vastagos, gametofitos, esporofitos, polen, y microesporas. Las células de plantas se - pueden obtener a partir de cualquier órgano o tejido de planta y cultivos preparados de los mismos. La clase de plantas que se pueden utilizar en los métodos de la presente invención son generalmente tan amplios como la clase de plantas más altas sensibles a técnicas de transformación, incluyendo tanto plantas monocotiledóneas como dicotiledóneas. Como se utiliza aquí, "planta transgénica" incluye una planta que comprende dentro de su genoma un polinucleótido heterólogo. El polinucleótido heterólogo puede estar ya sea establemente integrado dentro del genoma o puede ser un extra-cromosoma. Preferiblemente, el polinucleótido de la presente invención está establemente integrado dentro del genoma de tal forma que el polinucleótido se pasa a las generaciones sucesivas. Una célula de planta, tejido, órgano, o planta dentro de los cuales los polinucleótidos heterólogos han sido introducidos se consideran "transformadas", "transfectados", o "transgénicos". La progenie directa e indirecta de plantas o células de planta transformadas que también contienen el polinucleótido heterólogo también se considera transgénicas.

Identificación de Plantas con Fenotipo de Contenido Oleaginoso Alterado Se utilizó la selección de activación de marcación Arabidopsis para identificar la asociación entre el gen que se designó como "HIO32.3", (At3g47710; G1#22331644 que codifica la proteína T23J7.50 (Gl#22331654), y un fenotipo con un contenido oleaginoso alterado (específicamente, un fenotipo altamente oleaginoso). Brevemente, y como se describe adicionalmente en los ejemplos, un gran número de plantas Arabidopsis se mutaron a través de la transformación con el vector pSK1015, el cual comprende un ADN-T a partir del plásmido Ti de Agrobacterium t?mifaciens, un elemento mejorador viral, y un gen marcador seleccionable (Weigel y otros, 2000). Cuando el ADN-T se inserta dentro del genoma de las plantas transformadas, el elemento mejorador, puede originar la regulación ascendente de los genes en su proximidad, generalmente, dentro de aproximadamente 10 kilobases (kb) de los mejoradores. Para identificar las plantas transgénicas, las plantas T1 fueron expuestas a un agente selectivo con el fin de específicamente recuperar plantas transformadas que expresaron el marcador seleccionable y contuvieron el ADN-T. La semilla T2 se cosecho a partir de estas plantas. Los lípidos se extrajeron de aproximadamente 15-20 semillas de T2. El análisis de cromatografía de gas (GC) se llevó a cabo para determinar el contenido de ácido graso j la composición de las muestras de semillas. Una línea de Arabidopsis que mostró un fenotipo altamente oleaginoso se identificó, en donde el contenido oleaginoso (es decir, ácidos grasos) constituyó alrededor del 36.3% de la masa de semilla comparado con un contenido oleaginoso promedio de aproximadamente 27.0% para las semillas de otras plantas que crecieron y se analizaron al mismo tiempo (un incremento de 34% en aceite). La asociación del gen HI032.3 con el fenotipo altamente oleaginoso se descubrió a través de la identificación del sitio de inserción de ADN-T y, como se muestra en los ejemplos, demostró una co-segregación genética del fenotipo de semillas altas en aceite y la presencia de ADN-T. Por consiguiente, los genes HI032.3 y/o los polipéptidos se pueden emplear en el desarrollo de plantas genéticamente modificadas que tienen un fenotipo de contenido de aceite modificado ("un fenotipo HI032.3"). Los genes HI032.3 se pueden utilizar en la generación de cultivos de semillas de aceite que proveen una producción de aceite mejorada a partir del procesamiento de semillas de aceite y en la generación del cultivo de granos de aceite para proveer una energía incrementada para la alimentación de los animales. Los genes HI032.3 además pueden ser utilizados para incrementar el contenido oleaginoso de cultivos de especialidad oleaginosa, con el fin de aumentar la producción de los ácidos grasos inusuales deseables. Las plantas transgénicas que han sido genéticamente modificadas para expresar HIO32.3 se pueden utilizar en la producción de aceite, en donde las plantas transgénicas se hicieron crecer, y el aceite se obtuvo a partir de partes de planta (por ejemplo, semilla) utilizando métodos estándares. Ácidos Nucleicos y Polipéptidos HIQ32.3 Se provee la secuencia de ácido nucleico HI032.3 de Arabidopsis (ADN genómico) en SEC ID NO:1 y en la entrada de Genbank Gl#22331644. La secuencia de proteína correspondiente se provee en SEC ID NO:2 y Gl#22331645. Los ácidos nucleicos y/o proteínas que son ortólogos o parálogos de Arabidopsis HIO32.3, se describen en el Ejemplo 3 a continuación. Como se utiliza aquí, el término "polipéptido HI032.3" se refiere a una proteína o un fragmento HI032.3 de longitud completa, derivado (variante) u ortólogo del mismo que es, "funcionalmente activo" significa lo que el fragmento de proteína, derivado, y ortólogo exhiben una o más de las actividades funcionales asociadas con el péptido de SEC ID NO:2. En una modalidad preferida, un polipéptido HI032.3 funcionalmente activo causa un fenotipo de contenido oleaginoso alterado cuando existe un error en la expresión en la planta. En una modalidad preferida adicional, el error en la expresión del polipéptido HI032.3 causa un fenotipo altamente oleaginoso en una planta. En otra modalidad, el polipéptido HI032.3 funcionalmente activo es capaz de rescatar la actividad de HI032.3 endógena defectuosa (incluyendo deficiente) cuando se expresa en una planta o en células de planta; el polipéptido de escape puede ser de la misma o de diferentes especies como con una actividad defectuosa. En otra modalidad, un fragmento funcionalmente activo de un polipéptido HI032.3 de longitud completa (es decir, un polipéptido nativo que tiene la secuencia de SEC ID NO:2 o un ortólogo de existencia natural del mismo) retiene una o más de las propiedades biológicas asociadas con el polipéptido HI032.3 de longitud completa, de tal forma que la actividad de señalización, la actividad de enlace, la actividad catalítica, o la actividad de localización celular o extracelular. Un fragmento HI032.3 preferiblemente comprende una subunidad beta del dominio HI032.3 del dominio IIF del factor de iniciación de transcripción, tal como una domino C- o N-terminal o catalítico, entre otros, y preferiblemente comprende por lo menos 10, preferiblemente al menos 20, más preferiblemente al menos 25, y más preferiblemente por lo menos 50 aminoácidos contiguos de una proteína HI032.3. Los dominios funcionales se pueden identificar utilizando el programa PFAM (Bateman A y otros, 1999 Nucleic Acids Res 27:260-262). Las variantes funcionalmente activas de los polipéptidos o fragmentos HI032.3 de longitud completa por consiguiente incluyen polipéptidos con inserciones, eliminaciones, o sustituciones de aminoácido que retienen una o más de las propiedades biológicas asociadas con el polipéptido HI032.3 de longitud completa. En algunos casos, las variantes se general para cambiar el procesamiento post-traducción de un polipéptido HI032.3. Por ejemplo, las variantes pueden tener un transporte de proteína alterado o características de localización de proteína a proteínas alteradas de vida media comparadas con el polipéptido nativo. Como se utiliza aquí, el término "ácido nucleico HI032.3" abarca los ácidos nucleicos con la secuencia provista en o complementaria a la secuencia provista en SEC ID NO:1 así como fragmentos, derivados u ortólogos funcionalmente activos de los mismos. Un ácido nucleico HI032.3 de esta invención puede ser ADN, derivado de ADN genómico o ADNc, o ARN. En una modalidad, un ácido nucleico HI032.3 funcionalmente activo codifica, o es complementario a un ácido nucleico que codifica un polipéptido HI032.3 funcionalmente activo. Se incluye dentro de esta definición el ADN genómico que sirve como una plantilla para una trascripción de ARN primaria (es decir, un precursor de ARNm) que requiere de procesamiento, tal como empalme, antes de la codificación del polipéptido HI032.3 funcionalmente activo. Un ácido nucleico HI032.3 puede incluir otras secuencias no de codificación, las cuales pueden o no pueden estar trascritas; dichas secuencias incluyen UTRs 5' y 3', señales de poliadenilación y secuencias reguladoras que controlan la expresión del gen, entre otras, según sean conocidas en la técnica. Algunos polipéptidos requieren de eventos de procesamiento, tales como la división proteolítica, la modificación covalente, etc., con el fin de convertirse en completamente activos. Por consiguiente, los ácidos nucleicos funcionalmente activos pueden codificar el polipéptido HI032.3 maduro o pre-procesado, o una forma intermedia. Un polinucleótido HI032.3 también puede incluir secuencias de codificación heterólogas, por ejemplo, secuencias que codifican un marcador incluido para facilitar la purificación del polipéptido fusionado o un marcador de transformación. En otra modalidad, un ácido nucleico HI032.3 funcionalmente . activo es capaz de ser utilizado en la generación de fenotipos HI032.3 de pérdida de función, por ejemplo, a través de la supresión antisentido, co-supresión, etc. En una modalidad preferida, un ácido nucleico HI032.3 utilizado en los métodos de esta invención comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica un polipéptido HI032.3 de por lo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más de identidad de secuencia a la secuencia de polipéptido presentada en SEC ID NO:2. En otra modalidad, un polipéptido HI032.3 de la invención comprende una secuencia de polipéptido con por lo menos 50% o 60% de identidad con la secuencia de polipéptido HI032.3 de SEC ID NO:2, y puede tener por lo menos 70%, 80%, 85%, 90%, o 95% o más de identidad de secuencia con la secuencia de polipéptido HI032.3 de SEC ID NO:2. En otra modalidad, el polipéptido HI032.3 comprende la secuencia de polipéptido con por lo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% o 95% o más de identidad de secuencia a un fragmento funcionalmente activo del polipéptido presentado SEC ID NO:2, tal como el dominio de bromo. En aún otra modalidad, el polipéptido HI032.3 comprende una secuencia de polipéptido con por lo -menos 50%, 60%, 70%, 80%, o 90% de identidad con la secuencia de polipéptido de SEC ID NO:2 a través de su longitud completa. En otro aspecto la secuencia de polinucleótido HI032.3 es por lo menos 50% a 60% idéntica a través de su longitud completa con la secuencia de ácido nucleico HI032.3 presentada como SEC ID NO:1 , o una secuencia de ácido nucleico es complementaria a dicha secuencia HI032.3, y puede comprender por lo menos 70%, 80%, 85%, 90% o 95% o más de secuencia de identidad con la secuencia HI032.3 presentada en SEC ID NO. , o un fragmento funcionalmente activo de la misma, o secuencias complementarias. Como se utiliza aquí, "porcentaje de identidad de secuencia (%)" con respecto a una secuencia de sujeto especificada, o una porción especificada de la misma, se define como el porcentaje de nucleótidos o aminoácidos en la secuencia derivada candidato idéntico con los nucleótidos o aminoácidos en la secuencia tipo (o porción especificada de la misma), después de la alineación de las secuencias y la introducción de los huecos, si es necesario lograr la identidad de secuencia de porcentaje máximo, según generado por el programa WU-BLAST-2.0a19 (Altschut y otros, J. Mol. Biol. (1990) 215:403-410) con parámetros de búsqueda fijados a valores por omisión. Los parámetros HSP y HSP S2 son valores dinámicos y se establecen a través del programa mismo dependiendo de la composición de la secuencia particular y la composición de datos particular contra la cual la secuencia de interés se está buscando. Un "valor de identidad %" se determina a través del número de nucleótidos con una coincidencia idéntica o aminoácidos divididos por la longitud de secuencia del cual el porcentaje de identidad se está reportando. "Similitud de secuencia de aminoácido porcentaje (%)" se determina haciendo los mismos cálculos según determinados para el porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácido, pero incluyendo las sustituciones de aminoácido conservativas además de los aminoácidos idénticos en el cálculo. Una sustitución de aminoácido _ conservador es una en donde el aminoácido está sustituido por otro aminoácido que tiene propiedades similares de tal forma que el plegado o la actividad de proteína no se afecta significativamente. Los aminoácidos aromáticos que pueden sustituirse uno por el otro son fenilalanina, triptófano, y tirosina; los aminoácidos hidrofóbicos intercambiables son leucina, isoleucina, metionina, y valina; los aminoácidos polares intercambiables son glutamina y asparagina; los aminoácidos básicos intercambiables son arginina, lisina, e histidina, los aminoácidos acídicos intercambiables son ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos pequeños intercambiables son alanina, cerina, treonina cisteína y glicina. Las moléculas de ácido nucleico derivadas de las moléculas de ácido nucleico del tópico incluyen secuencias que selectivamente hibridizan la ~ secuencia de ácido nucleico de SEC ID NO:1. La severidad de la hibridación > se puede controlar a través de temperatura, resistencia iónica, pH, y la presencia de agentes de desnaturalización tales como formamida durante la hibridación y el lavado. Las condiciones rutinariamente utilizadas son bien conocidas (ver, por ejemplo, Current Protocol in Molecular Biology, Vol. 1 , Capítulo 2.10, John Wiley & Sons, Publishers (1994)). En algunas modalidades, una molécula de ácido nucleico de la invención es capaz de hibridizar una molécula de ácido nucleico que contiene la secuencia de nucleótido SEC ID NO:1 bajo condiciones de hibridación severas que son: pre-hibridización de los filtros que contiene el ácido nucleico durante 8 horas durante la noche a 65°C en una solución que comprende 6x de citrato de resistencia individual (SSC) (1X SSC es NaCI 0.15 M, citrato de Na 0.015 M; pH 7.0), solución de Denhardt 5X, 0.05% de pirofosfato de sodio y 100 µg/ml de ADN de esperma de arenque; hibridización durante 18-20 horas a 65°C en una solución que contiene 6X SSC, solución de Denhardt 1X, 100 µg/ml de ARN de levadura y 0.05% de pirofosfato de sodio; y lavado de filtros a 65°C durante 1 hora en una solución conteniendo 0.1X SSC y 0.1 % SDS - (dodecilsulfato de sodio). En otras modalidades, se utilizan condiciones moderadamente severas de hidridización que son: pretratamiento de los filtros que contienen ácido nucleico durante 6 horas a 40°C en una solución que contiene 35% de formamida, 5X SSC, 50 mM de Tris-HCI (pH 7.5), 5 mM EDTA, 0.1% de PVP, 0.1% Ficoll, 1% de BSA, y 500 µg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. La h hibridación durante 18-20 horas a - 40°C en una solución que contiene 35% de formamida 5X SSC, 50 mM de Tris-HCI (pH 7.5), 5 mM de EDTA, 0.02% de PVP, 0.02% Ficoll, 0.2% de BSA, 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón, y 10% (p/volumen) de sulfato de dextrana; seguido por lavado dos veces durante 1 hora a 55°C en una solución conteniendo 2X SSC y 0.1 % SDS. Alternativamente, las condiciones de severidad bajas se pueden utilizar que comprende: incubación durante 8 -- horas durante la noche a 37°C en una solución que comprende 20% de formamida, 5 x SSC, 50 mM fosfato de sodio (pH 7.6), solución de 5X Denhardt, 10% de sulfato de dextrana y 20 µg/ml de ADN de esperma de salmón trasquilado desnaturalizado; hibridación en el mismo regulador de pH durante 18 a 20 horas; y lavado de los filtros en 1 x SSC en aproximadamente 37°C durante 1 hora. Como un resultado de la degeneración del código genético, un número de secuencias de polinucleótido que codifican el polipéptido HI032.3 se puede producir. Por ejemplo, los codones se pueden seleccionar para incrementar la velocidad a la cual la expresión del polipéptido ocurre en una especie huésped particular, de acuerdo con la utilización del codón óptimo dictado por el organismo del huésped particular (por ejemplo, (ver, por *" ejemplo, Nakamura y otros, 1999). Dichas variantes de frecuencia se pueden utilizar en los métodos de esta invención. Los métodos de la invención pueden utilizar ortólogos de Arabidopsios HI032.3. Los métodos para identificar los ortólogos en otras especies de plantas son conocidas en la técnica. Normalmente, los ortólogos en diferentes especies retienen la misma función, gracias a la presencia de uno más motivos de proteína y/o estructuras tridimensionales. En la evolución, cuando un evento de duplicación de gen sigue la evolución de las especies, un sólo gen en una especie, tal como Arabidopsis, puede corresponder a múltiples genes -(parálogos) en otro. Como se utiliza aquí, el término "ortólogos" abarcados los parálogos. Cuando los datos de secuencia están disponibles para una especie de planta particular, los ortólogos generalmente están identificados a través del análisis de homología de secuencia, tal como en el análisis BLAST, usualmente utilizando secuencias de carnada de proteína. Las secuencias son asignadas como ortólogos potenciales si la secuencia con los mejores hits a partir resultado BLAST enviado recupera la secuencia de consulta original en BLAST inverso (Huynen MA y Bork P, Proc Nati Acad Sci (1998) 95:5849-5856; Huynen MA y otros., Genome Research (2000) 10: 1204-1210). Los programas para una alineación de secuencia múltiple, tales como CLUSTAL (Thompson JD y otros, 1994, Nucleic Acids Res 22: 4673-4680) se puede utilizar para resaltar las regiones conservadas _ . y/o los residuos de proteínas ortólogas y para generar árboles filogenéticos.

En una árbol filogenético que representa múltiples secuencias homologas de diversas especies (por ejemplo, recuperadas a través del análisis BLAST), las secuencias ortólogas de dos especies generalmente aparecen más cercanas al árbol con respecto a todas las otras secuencias a partir de estas dos especies. El enlazamiento estructural u otros análisis de dobleces de proteínas (por ejemplo, utilizando software a través de ProCeryon, Biosciences, Salzburg, Austria) también pueden identificar los ortólogos potenciales. Los métodos de hibridación de ácido nucleico también pueden utilizarse para encontrar genes ortólogos y son preferidos cuando los datos de secuencia no están disponibles. El PCR degenerado y la detección de ADNc o colecciones de ADN genómicos son métodos comunes para encontrar las -secuencias de genes relacionados y son bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Sambrook, 1989; Dieffenbach y Dveksler, 1995). Por ejemplo, los métodos para generar una colección de ADNc a partir de especies de planta de interés y sondear la colección con sondas de genes parcialmente homologas se describen en Sambrook y otros. Una porción altamente conservada de Arabidopsois HIO32.3 que codifica la secuencia se puede utilizar como una sonda. Los ácidos nucleicos ortólogos HI032.3 pueden hibridizar el ácido nucleico de SEC ID NO:1 bajo condiciones de severidad altas moderadas o bajas. Después de la amplificación o aislamiento de un segmento de un ortólogo putativo, ese segmento se puede clonar y secuenciar a través de técnicas estándares y utilizarse como una sonda para aislar un ADNc completo o un clon genómico. Alternativamente, es posible iniciar un proyecto EST para generar una base de datos de información de secuencia para las especies de planta de interés. En otro método, los anticuerpos que específicamente enlazan polipéptidos HI032.3 se utilizan para el aislamiento ortólogo (ver, por ejemplo, Harlow y Lañe, 1988, 1999). El -" análisis Western blot puede determinar que un ortólogo HI032.3 (es decir, una proteína ortóloga) está presente en un extracto crudo de una especie de planta particular. Cuando se observa reactividad, la secuencia de codificación - del ortólogo candidato se puede aislar a través de colecciones de expresión de detección que representan las especies de planta particulares. Las colecciones de expresión se pueden construir en una variedad de vectores comercialmente disponibles, incluyendo lambda gt11 , como se describe en Sambrook, y otros, 1989. Una vez que se identifica el(los) ortólogo(s) a través de cualquiera de estos medios, la secuencia ortóloga candidato se utiliza como carnada (la "consulta") para BLAST inversa contra la secuencias de Arabidopsis u otras especies en donde las secuencias de ácido nucleico y/o polipéptido HI032.3 han sido identificadas. Los ácidos nucleicos y polipéptidos HI032.3 se pueden obtener utilizando cualquier método disponible. Por ejemplo, las técnicas para aislar ADNc o secuencias de ADN genómicas de interés a través de colecciones de ADN de detección o a través del uso de reacción de cadena de polimeraza (PCR), como se describe previamente, y es bien conocido en la técnica. Alternativamente, la secuencia de ácido nucleico puede ser sintetizada. Se puede utilizar cualquier método conocido, tal como mutagénesis dirigida al sitio (Kunkel TA y otros, 1991 ), para introducir los cambios deseados dentro del ácido nucleico clonado.

- En general, los métodos de la invención involucran la incorporación de la forma deseada de ácido nucleico HI032.3 en un vector de expresión de planta para la transformación en células de planta, y el polipéptido HI032.3 se expresa en la planta huésped. Una molécula de ácido nucleico HI032.3 aislada es diferente en la forma o configuración en la cual se encuentra en forma natural y se identifica y se separa de por lo menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la cual está ordinariamente asociada en la fuente natural del "ácido nucleico HI032.3. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico HI032.3 aislada incluye moléculas de ácido nucleico HI032.3 contenidas en la célula que ordinariamente expresan HI032.3 en donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una ubicación cromosómica diferente de aquella de las células naturales.

Generación de Plantas Genéticamente Modificadas con un 'Fenotipo de Contenido Oleaginoso Alterado Los ácidos nucleicos y polipéptidos HI032.3 se pueden utilizar én la generación de plantas genéticamente modificadas que tienen un fenotipo de contenido oleaginoso modificado. Como se utiliza aquí, un "fenotipo de contenido oleaginoso modificado" se puede referir a un contenido oleaginoso modificado en cualquier parte de la planta; el contenido oleaginoso modificado por lo general se observa en semilla. En una modalidad preferida, la expresión alterada del gen HI032.3 en una planta se utiliza para general plantas con un fenotipo altamente oleaginoso. .- Los métodos descritos aquí generalmente se aplican a todas las plantas. Aunque la activación de la marcación y la identificación del gen se llevan a cabo en Arabidopsis, el gen H 1032.3 (o un ortólogo, variante o fragmento del mismo) se puede expresar en cualquier tipo de planta. En una modalidad preferida, la invención está dirigida a plantas productoras de aceite, que producen y almacenan triacilglicerol en órganos específicos, principalmente en semillas. Dichas especies incluyen fríjol de soya (Glicina máxima), colza, y cánula (incluyendo Brassica napus, B. campestris), girasol (Helianthus annus), algodón (Gossypium hirsutum), maíz (Zea mays), cacao (Teobroma cacao), cártamo (Carthamus tinctorius), aceite de palma (Elaeis guineensis), palma de coco (Cocos nucífera), lino (Linum usitatissimum), risina (Ricinus communis) y cacahuate (rachishypogaea). La invención también puede estar dirigida a plantas que llevan frutas y vegetales, plantas productoras de grano, plantas productoras de nueces, especies Brassica de un ciclo rápido, alfalfa (medicago Sativa), tabaco (Nicotiana), pasto de césped (familia Poaceae), otros cultivos de follaje, y especies silvestres que pueden ser una fuente de ácidos grasos únicos. El experto en la técnica reconocerá que existe una amplia variedad de técnicas de transformación en la técnica, y que están surgiendo continuamente nuevas técnicas. Cualquier técnica que es adecuada para una planta- huésped objetivo se pude emplear dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, las construcciones se pueden introducir en una variedad de formas incluyendo, pero no limitándose a, estructura de ADN, en un plásmido, o en un cromosoma artificial. La introducción de las construcciones dentro de las células de planta objetivo se puede lograr a través de una variedad de técnicas, incluyendo, pero no limitándose, a transformación mediada por Agrobacterium, electroporación, microinyección, co-precipitación de calcio-fosfato-ADN a través de bombardeo por microproyectiles, o transformación de un ácido nucleico heterólogo mediante por liposoma. La transformación de la planta es preferiblemente permanente, es decir, mediante la integración de las construcciones de expresión introducidas dentro del genoma de la planta huésped por lo que las construcciones introducidas se pasan sobre generaciones de plantas sucesivas. Dependiendo del uso que se pretende, una construcción de ácido nucleico heteróloga comprende un polinucleótido HIO32.3 que puede codificar ~ la proteína completa o una porción biológicamente activa de la misma. En una modalidad, los sistemas de vector basados en Ti binario se pueden utilizar para transferir polinucleótidos. Los vectores binarios Agrobacterium estándares son conocidos por aquellos expertos en la técnica, y pueden estar comercialmente disponibles (por ejemplo, pBI121 Clontech Laboratories, Palo Alto, CA). El procedimiento óptimo para la transformación de plantas con vectores Agrobacterium variará con el tipo de planta que se va a transformar.

- Los métodos ilustrativos para la transformación mediada por Agrobacterium la transformación de explantes de hipocotil, puntas de brotes, tallos o tejido de hojas, derivados de semilleros y/o pequeñas plantas estériles. Dichas plantas transformadas se puede reproducir sexualmente. o a través del cultivo de la célula o tejido. La transformación Agrobacterium ha sido previamente descrita para un gran número de diferentes tipos de planta y los métodos para dicha transformación se pueden encontrar en la literatura científica. De particular relevancia son los métodos para transformar cultivos comercialmente importantes, tales como colza (De Block y otros, 1989), girasol (Everett y otros, 1987), y fríjol de soya (Christou y otros, 1989; Kline y otros, 1987). La expresión (incluyendo la trascripción y traducción) de HI032.3 se puede regular con respecto al nivel de expresión, el(Ios) tipo(s) de tejido(s) en donde la expresión toma lugar y/o la etapa del desarrollo de expresión. Están disponibles un número de secuencias reguladores heterólogas (por ejemplo, promotores y mejoradores) para controlar la expresión de un ácido nucleico HIO32.3. Estas incluyen promotores constitutivos, inducibles, y regulables así como promotores y mejoradores que controlan la expresión en un tejido, o en una forma específica temporal. Los promotores constitutivos ilustrativos incluyen el promotor E4 de frambuesa (patentes de E. U. A. Nos. 5,783,393 y 5,783,394), en CaMV 35S (Jones JD y otros, 1992), el promotor CsVMV (Verdaguer B u otros, 1998), y el promotor de actina de melón (solicitud PCT publicada WO0056863). Los promotores específicos de tejido ilustrativos incluyen el E4 de tomate y los promotores E8 (patente de E. U. A. No. 5,859,330) y el promotor del gen 2AII de tomate (Van Haaren MJJ y otros, 1993).

En una modalidad preferida, la expresión de HI032.3 está bajo el control de secuencias reguladoras a partir de genes cuya expresión está asociada con el desarrollo de la semilla y/o embriones primeros. Los genes de legumbre cuyos promotores están asociados con el desarrollo de semillas y/o embriones primeros incluyen V. taba legumin (Baumlein y otros, 1991 , Mol Gen Genet 225:121-8; Baumlein y otros, 1992, Plant J 2: 233-9), V. faba usp (Fiedler y otros, 1993, Plant Mol Biol 22: 669-79), chícharo conviciíin (Bown y otros, 1988, Biochem J 251 :717-26), chícharo lectin (dePater y otros, 1993, Plant Cell 5: 877-86), P. vulgaris beta phaseolin (Bustos y otros, 1991 , EMBO J 10:1469-79), P. vulgaris DLEC2 y PHS [beta] (Bobb y otros, 1997, Nucleic Acids Res 25:641-7), y fríjol de soya beta-Conglycinin, proteína de -almcenamiento 7S (Chamberland y otros, 1992, Plant Mol Biol 19: 937-49). Los genes de cereal cuyos promotores están asociados con el desarrollo de las primeras semillas y embriones incluyen arroz glutelin ("GluA-3, "Yoshihara y Takaiwa, 1996, Plant Cell Physiol 37:107-11 ; "GluB-l", Takaiwa y otros, 1996, Plant Mol Biol 30: 1207-21 ; Washida y otros, 1999, Plant Mol Biol 40:1-12; "Gt3", Leisy y otros, 1990, Plant Mol Biol 14: 41-50), arroz prolamin (Zhou & Fan, 1993, Transgenic Res 2:141-6), trigo prolamin (Hammond-Kosack y otros, 1993, EMBO J 12:545-54), maíz zein (Z4, Matzke y otros, 1990, Plant Mol Biol 14:323-32), y cebada B-hordeins (Entwistle y otros, 1991 , Plant Mol Biol 17:1217-31 ). Otros genes cuyos promotores están asociados con el desarrollo de las primeras semillas y embriones incluyen GL07A de palma de aceite (globulina 7S, Morcillo y otros, 2001 , Physiol Plant 112: 233-243), Brassica napus napin, proteína de almacenamiento 2S y el gen napA (Josefsson y otros, 1987, J Biol Chem 262: 12196-201 ; Stalberg y otros, 1993,. Plant Mol Biol 1993 23:671-83; Ellerstrom y otros, 1996, Plant Mol Biol 32:1.019-27), Brassica napus oleosin (Keddie y otros, 1994, Plant Mol Biol 24: 327-40), Arabidopsis oleosin (Plant y otros, 1994, Plant Mol Biol 25: 193-205), Arabidopsis FAE1 (Rossak y otros, 2001 , Plant Mol Biol 46:717-25), Cannvalia gladiata con A (Yamamoto y otros, 1995, Plant Mol Biol 27: 729^41), y estrictosidina sintasa Catharanthus roseus (Str, Ouwerkerk y Memelink, 1999, Mol Gen Genet 261: 635-43). En otra modalidad preferida, las secuencias reguladoras a partir de los genes estresados durante la biosíntesis del aceite se utilizan (ver, por ejemplo, patente de E. U. A. No. 5,952,544). Los promotores alternativos son de los genes de proteína de almacenamiento de planta (Bevan y otros, 1993, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 342:209-15). En aún otro aspecto, en algunos casos es deseable inhibir la expresión de HI032.3 endógeno en una célula huésped. Los métodos ilustrativos para practicar este aspecto de la invención incluyen, pero no se limitan a la supresión antisentido (Smith, y otros, 1988; van der Krol y otros, 1988); co-supresión (Napoli, y otros, 1990); ribozimas (publicación PCT WO 97/10328); y combinaciones de sentido y antisentido (Waterhouse, y otros, 1998). Los métodos para la supresión de secuencias endógenas en una célula huésped típicamente emplean la trascripción o trascripción y traducción de por lo menos una porción de la secuencia que se va a suprimir. Dichas secuencias pueden ser homologas para la codificación así como regiones no de codificación de la secuencia endógena. La inhibición antisentido se pude utilizar para la secuencia de ADNc completa (Sheehy y otros, 1988), la secuencia de ADNc parcial incluyendo los fragmentos de la secuencia de codificación 5', (Cannon y otros, 1990), o secuencias no de codifación 3' - (Ching y otros, 1989). Las técnicas de cosupresión se pueden utilizar para la - secuencia de ADNc completa (Napoli y otros, 1990; van der Krol y otros, 1990), o una secuencia de ADNc parcial (Smith y otros, (1990)). Las pruebas molecular estándar y genética se pueden llevar a cabo para un análisis adicional de la asociación entre un gen y un fenotipo observado. Las técnicas ilustrativas se describen a continuación.

Análisis de ADN/ARN La etapa y los patrones de expresión de gen específicos de tejidos en líneas mutantes contra de tipo se silvestre se pueden determinar, por ejemplo, a través de hibridación in situ. Los análisis del estado de la mutilación del gen, especialmente en las regiones reguladoras de flanqueo, se pueden llevar a cabo. Otras técnicas adecuadas incluyen la sobre-expresión, la expresión ectópica, la expresión en otras especies de planta y la aniquilación del gen (genéticos inversos, aniquilación activada, silenciación del gen inducido viral [VIGS, ver Baulcombe D, 1999]). En un perfil de expresión de aplicación preferido, generalmente a través de análisis de microarreglo, se utiliza para simultáneamente medir las diferencias o inducir los cambios en la expresión de muchos genes diferentes.

Las técnicas del análisis del microarreglo son bien conocidas en la técnica (Schena M y otros, Science (1995) 270:467-470; Baldwin D y otros, 1999; Dangond F, Physiol Genomics (2000) 2:53-58; van Hal NL y otros, J Biotechnol (2000) 78:271-280; Richmond T y Somerville S, Curr Opin Plant - Biol (2000) 3:108-116). Del perfil de la expresión de líneas marcadas individuales se puede llevar a cabo. Dichos análisis pueden identificar otros genes que están coordinadamente regulados como una consecuencia de la sobre expresión del gen de interés, lo cual puede ayudar a colocar un gen desconocido en una trayectoria particular.

Análisis de Producto de Gen El análisis de los productos de gen puede incluir la expresión de proteína recombinante, la producción de antisueros, la inmunolocalización, los ensayos bioquímicos para actividad catalítica u otras actividades, análisis del estado de fosforilación, y el análisis de la interacción, otras proteínas a través de dos ensayos híbridos de levadura.

Análisis de Trayectoria El análisis de trayectoria puede incluir la colocación de un gen o de un producto de gen dentro de una trayectoria bioquímica, metabólica o de señalización particular con base en su fenotipo de error en expresión o a través de la homología de secuencia con los genes relacionados.

Alternativamente, el análisis puede comprender los cruces genéticos con líneas de tipo silvestre y otras líneas mutantes (la creación de mutantes dobles) para ordenar el gen una trayectoria, o determinar el efecto de una - mutación sobre la expresión de los genes "reportero" en corriente 5 descendente en una trayectoria.

- -- - - Generación de Plantas Mutadas con Fenotipos de Contenido Oleaginoso Alterado La invención además provee un método para identificar plantas 10 no transgénicas que tienen mutaciones en o un alelo de HI032.3 endógeno que confiere el fenotipo HI032.3 para estas plantas y su proviene. En un método, llamado "CULTIVO" (para activar lesiones locales inducidas en genomas), las mutaciones se inducen en la semilla de una planta de interés, por ejemplo, utilizando el tratamiento EMS. Las plantas resultantes se hacen 15 crecer y se autofertilizan, y la progenie se utiliza para preparar muestras de ADN. La PCR específica de HI032.3 se utiliza para identificar si una planta mutada tiene una mutación HI032.3. Las plantas que tienen mutaciones HI032.3 entonces pueden probarse para un contenido oleaginoso alterado, o alternativamente, las plantas se pueden probar para un contenido oleaginoso 20 alterado, y después PCR específico de HI032.3 se utiliza para determinar si una planta que tiene un contenido oleaginoso alterado tiene un gen HI032.3 mutado. CULTIVO puede identificar las mutaciones que pueden alterar la expresión de los genes específicos o la actividad de las proteínas codificadas por estos genes (ver, Colbert y otros, (2001 ) Plant Physiol 126:480-484; McCallum y otros, (2000) Nature Biotechnology 18:455-457). En otro método, un método de gen candidato/sitio de característica cuantitativa (QTLs) se puede utilizar en un programa de producción asistido por un marcador para identificar alelos de conmutaciones en el gen HI032.3 u ortólogos de HI032.3 que pueden conferir un contenido oleaginoso alterado (ver, Bert y otros, Theor Appl Genet. junio de 2003; 107(1):181-9; y Lionneton y otros, Genome. diciembre 2002 ; 45 (6): 1203-15).

De esta forma, en un aspecto adicional de la invención, un ácido nucleico HI032.3 se utiliza para identificar si una planta que tiene un contenido oleaginoso alterado tiene una mutación en HI032.3 endógeno o tiene un alelo particular que causa el contenido oleaginoso alterado. Ya que la invención ha sido descrita con referencia a métodos y modalidades específicas, se apreciará que varias modificaciones y cambios se pueden hacer sin apartarse de la invención. Todas las publicaciones citadas aquí están, expresamente incorporadas por referencia para los propósitos de describir y mostrar las composiciones y metodología que se podrían utilizar en conexión con la invención. Todas las patentes, solicitudes de patentes, información de secuencias citadas con referencia a las bases de datos públicos referenciadas también se incorporan aquí por referencia.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Generación de Plantas con un Fenotipo HIO32.3 a través de Transformación con una Construcción de Marcación de Activación Los mutantes se generaron utilizando el vector "ACTTAG" de marcación de activación, pSKI015 (Gl#537289; Weigel D y otros, 2000). Los métodos estándares se utilizaron para la generación de plantas transgénicas Arabidopsis y fueron esencialmente como se describe en la solicitud publicada PCT WO 0183697. Brevemente, las plantas Arabidopsis T0 (Col-0) se transformaron con Agrobacterium llevando el vector pSKI015, que comprende ADN-T derivado de plásmido Ti Agrobacterium, un gen marcador seleccionable resistente a herbicida, y el elemento mejorador 4X CaMV 35S. Las plantas transgénicas se seleccionaron en la generación T1 con base en la resistencia a herbicidas. Se recolectaron las semillas T2 de plantas T1 y se almacenaron en una colección indexada, y una porción de las semillas T2 se evaluó para la detección. La determinación cuantitativa del contenido de ácido graso en la semilla se llevó a cabo utilizando los siguientes métodos. Una muestra de 15 a 20 semillas T2 de cada línea se probó, las cuales generalmente contuvieron la inserción de homocigoso, el tipo silvestre de homocigoso, y los genotipos heterocigosos en una relación estándar de 1 :1 :2, se condensaron en un ultra- microbalance UMT-2 (Mettler-Toledo Co., Ohio, E. U. A.) y después se transfirieron a un frasco de extracción de vidrio. Los lípidos se extrajeron de la semillas y se trans-esterificaron en 500 ul 2.5% H2S04 en MeOH durante 3 horas a 80°C, siguiendo el método de Browse y otros, (Biochem J 235:25-31 , 1986) con modificaciones. Se incluyó una cantidad de ácido heptadecanoico conocido en la reacción como un estándar interno. Se agregaron 700 ul de agua y 400 ul de hexano a cada frasco, el cual después se agita vigorosamente y se permitió que se separara la fase. Los frascos de reacción se cargaron directamente sobre GC para el análisis y la fase de hexano superior se muestreó a través de un auto-muestreador. Se utilizó la cromatografía de gas con detección de ionización de flama para separar y cuantificar los esteres metílicos de ácidos grasos. Se utilizó Agilent 6890 Plus GC para la separación con columnas Agilent Innowax (30 m x 0.25 mm ID, grosor de película de 250 um). El gas portador fue hidrógeno a un flujo constante de 2.5 ml/minuto. Se inyectó una muestra de 1 ul en el modo sin división (temperatura interna de 220°C, flujo de purga 15 ml/minuto a 1 minuto). El horno se programó para una temperatura inicial de 105°C, tiempo inicial 0.5 minutos, seguido por una rampa de 60°C por minuto a 175°C, una rampa de 40°C/minuto a 260°C con un tiempo de control final de 2 minutos. La detección fue a través de ionización de flama (temperatura 275°C, flujo del combustible 30.0 ml/minuto, oxidizador 400.0 ml/minuto). El control del instrumento y la recolección de los datos y el análisis de monitorearon utilizando el sistema de administración de cromatografía milenio (versión 3.2, Waters Corporation, Milford, MA). La integración y la cuantificación se realizaron automáticamente, pero todos los análisis se examinaron subsecuentemente manualmente para verificar la identificación pico correcto y una señal aceptable para la relación de ruido antes de la inclusión de los resultados derivados en el estudio. La línea ACTTAG designada W00082263 se identificó como - teniendo un fenotipo alto en aceite. Específicamente, el aceite constituyó 34.3%% de la masa de semillas (v/v) comparado con un contenido de aceite promedio de 27.0% de otras líneas ACTTAG que crecieron y se analizaron en las mismas condiciones (es decir, líneas de referencia). En re-análisis de la misma semilla se llevó a cabo por duplicado. Este análisis confirmó un incremento en el contenido oleaginoso con relación a los controles. Se concluye que la presencia del lugar ACTTAG puede incrementar el contenido oleaginoso en las semillas entre 7% y 11 % con relación a los controles. Se determinó que el fenotipo altamente oleaginoso es dominante con base en el contenido oleaginoso de semillas a partir de individuos genotipificados.

EJEMPLO 2 Caracterización de la Inserción de ADN-T en Plantas que Exhiben un Fenotipo de Contenido Oleaginoso Alterado Se llevaron a cabo análisis moleculares estándares, esencialmente como se describe en la solicitud de patente PCT WOI 83697, para determinar el sitio de la inserción de ADN-T asociado con el fenotipo de contenido oleaginoso alterado. Brevemente, se extrajo ADN genómico de las plantas que exhibieron el fenotipo de contenido oleaginoso alterado. El PCR, utilizando los. iniciadores específicos para el vector pSKI015, confirmó la presencia del mejorador 35S en plantas a partir de la línea W000082263, y el análisis Southern blot verificó la integración genómica de ADN-T ACTTAG y demostró . la presencia de una inserción de ADN-T individual en la línea transgénica. Se utilizó el rescate de plásmido para recuperar ADN genómico que flanquea la inserción de ADN-T, el cual después se sometió a análisis de secuencia utilizando una búsqueda BLASTN básica de la base de datos de ADN genómico de Arabidopsis (TAIR) (ver el sitio web de Recursos de Información de Arabidopsis públicamente disponible). Hubo una identidad de secuencia con el cromosoma 3 de clon T23J7 de BAC (Gl#4741184). Las secuencias para los nucleótidos 16030-16423 y 16443-17200 se recuperaron, colocando la intersección del borde izquierdo del nucleótido 16423 (Gl#741184) y en corriente descendiente del nucleótido 15443. Las secuencias de los nucleótidos 15424-16442 del cromosoma 3 del clon T23J7 de BAC (Gl#4741184) se eliminaron en el cromosoma mutante. Para determinar si la inserción de ADN-T causa la co-segregación de fenotipo alta oleaginoso en semillas de fenotipo alto oleaginoso en semillas y se probó la presencia de ADN-T. Se hicieron crecer 18 plantas T2 a la madurez y las semillas cosechadas de estas plantas se utilizaron para determinar el fenotipo oleaginoso en las semillas. El contenido oleaginoso en las semillas a partir de estas se determinó como se describe en él Ejemplo 1. El genotipo de la semilla T2 se infirió a través del análisis del análisis de la semilla T3 para la presencia o ausencia de ADN-T en el sitio de inserción a través de PCR utilizando iniciadores que son específicos para la región genómica correspondiente y el ADN-T. Los resultados muestran que el contenido oleaginoso promedio de las semillas T3 que contienen el inserto de ADN-T fue mayor que aquellas familias que carecen del inserto. Los homocigosos individuales T2 para el ADN-T en este lugar produjeron semillas con contenido oleaginoso de 107.5% comparado con la progenie que carece de ADN-T. Los homocigosos individuales T2 para este lugar produjeron semillas con un contenido oleaginoso de 112.7% comparado con la progenie que carece de ADN-T. Debido a que los homocigotos y hemicigotos para el lugar altamente oleaginoso despliegan un incremento similar en el contenido oleaginoso, se concluye que el ADN-T está enlazado con el fenotipo altamente oleaginoso y el fenotipo es causado por una mutación de dominante. El análisis de secuencia reveló que el borde izquierdo del inserto ADN-T fue de alrededor de 494 pares de base 5' del sitio de inicio de traducción del gen cuya secuencia de nucleótido se presenta en SEC ID NO: 1 la cual se designó como HI032.3.

EJEMPLO 3 Análisis de la Secuencia Arabidopsis HIO32.3 Los análisis de secuencia se llevaron a cabo con BLAST " (Altschul y otros, 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410), PFAM (Bateman y otros, 1999, Nucleic Acids Res 27:260-262), PSORT(Nakai K, y Horton P, 1999, Trends Biochem Sci 24:34-6), y/o CLUSTAL (Thompson JD y otros, 1994, Nucleic Acids Res 22:4673-4680).

BLAST contra ESTs: Existen más de 10 ESTs de Arabidopsis (cluster unigen At.9308) que corresponden al parálogo de Arabidopsis At5g62520. Ningún EST que corresponde al gen candidato At3g47720 se identificó. También existen otros ESTs de planta similares que muestran similitud con At3g47720. Si fue posible, se hicieron los contigs de ESTs de cada especie. El mejor hit para cada una de las siguientes especies se listan a continuación y se incluyen en el "Cuadro Ortólogo" siguiente: Brassica rapa, Glicina máxima, Lycopersicon esculentun, Gossuypium hirsutum, Zea mays, - Oryzea sativa, Triticum aestivum, Helianthus annuus, Solanum tubersoum. 1. Un EST de col China (Brassica rapa subsp. pekinensis) >gi|20374907|gb|BG543927.1 |BG543927 colección de semillero etiolado de col China E1677 Puntuación = 329 (120.9 bits), Esperado = 2.7e-35 2. Un contig EST de fríjol de soya >gi|19269392|gb|BM885648.1 |BM885648 de brote de germinación (24 horas de germinación) >gi|15285085|gb|BI468976.1 [BI468976 de semilleros de 3 semanas de 'edad Puntuación = 318 (117.0 bits), Esperado = 4. Oe-34 La secuencia contigua es provista a continuación como SEC ID NO : 3. 3. Un EST de algodón >gi|3325723|gb|AI054609.1 |AI054609coau0001106 colección de ADNc de la Zona de Absición de Bola de Algodón Puntuación = 223 (83.6 bits), Esperado = 4.7e-24 4. Un contig EST de maíz >gi|4203679|gb|BG837356.1 |1BG837356 ESTs Zm10_08c08 de de Seda de Maíz después de 6 horas de la Inoculación de Seda de Maíz con Fusarium graminearum >gi|4646391 |gb]AI621721.1 |AI621721 colección de ADN de hoja de primordia 486006G12.x5 486 de Hake lab >gi|4217842|gb|AI391838.1 |A|391838 colección de ADN de hoja de primordia 486006A11.xl 486 de Hake lab >gi|4217921 |gb|A|391917.1 |A|391917 colección de ADN de hoja de primordia 486005B03.xl 486 de Hake lab Puntuación = 176 (67.0 bits), Esperado = 1.8e-26 La secuencia contigua se provee a continuación como SEC ID NO:4. 5. Un EST de girasol (Helianthus annuus) >gi|22387461 |gb|BQ969940.1 |BQ969940 QHB39P16.yg.abl QH_ABCDI girasol RHA801 aislado de una colección elaborada con diferentes partes de la planta Puntuación = 179 (68.1 bits), Esperado = 5.7e-30 Observar que los siguientes ESTs muestran una homología significativa con >g¡|22387461. Es posible que estas secuencias representen el mismo ARNm y que las diferencias en las secuencias de nucleótido puedan ser el resultado del error de secuenciación o de un solo polimorfismo de nucleótido. >gi|22387167|gb|BQ969646.1 |BQ969646 >gi|22315760|gb|BQ916979.1 |BQ916979 >gi|22315563|gb|BQ916782.1 |BQ916782 >gi|22313791 |gb|BQ915010.1 |BQ915010 >gi|22315308|gb|BQ916527.1 |BQ916527 >gi|22387244|gb|BQ969703.1 |BQ969703 >gi|22388939|gb|BQ971418.1 |BQ971418 >gi|22389044|gb|BQ971523.1 |BQ971523 >gi|22386431 |gb|BQ968910.1 |BQ968910 5. Un EST de tomate (Lycopersicon esculentum) >gi|4387847|gb|AI483923.1 |A|483923 EST249794 de ovario de tomate, TAMU Lycopersicon esculentum Puntuación = 241 (89.9 bits), Esperado = 5.8e-26 6. Un EST de trigo (Triticum aestivum) >gi|24979906|gb|CA485901.1 |CA485901 WHE4324_E06_J12ZS ADNc de anterio meiotíco de trigo Puntuación = 186 (70.5 bits), Esperado = 9.1e-30 El EST descrito anteriormente (>gi|24979906) abarca la secuencia del siguiente EST. Sin embargo, estas dos secuencias difieren a través de un nucleótido que podría ser el resultado del error de secuenciación o de un solo polimorfismo de nucleótido >gi|24978183|gb|CA484178.1 |CA484178 WHE4303_ C01_F01ZS ADNc de anterio meiotíco de trigo 7. Un EST de papa (Solanum tuberosum) >gi|13616454|gb|BG598314.1 |BG598314 EST496992 cSTS Solanum tuberosum secuencia 5' CSTS20P7 del clon de ADN, aislado de ojos de tubérculos germinados Puntuación = 191 (72.3 bits), Esperado = 1.8e-28 5. Un EST de arroz (Oryza sativa) >-g¡|18385875|gblBM419074.1 |BM419074 colección de hojas maduras de Oryza sativa R009A04 inducida por M. grísea Puntuación = 153 (58.9 bits), Esperado= 4.3e-16 Observar que los siguientes ESTs muestran una homología significativa con >gi| 18385875. Es posible que estas secuencias representen del mimo ARN y que las diferencias en secuencias de nucleótido puedan ser el resultado- de error de secuenciación o de polimorfismos de nucleótidos individuales. gi|22307912|gb|BQ909134.1 |BQ909134 - >gi|3762808|bj|AU029560.1 |AU029560 BLASTP contra aminoácidos: SEC ID NO : 2 tiene un alto grado de homología para dos proteínas de planta y un bajo grado de homología para una proteína humana. Los 7 hits principales de BLAST se listan y se incluyen en el "Cuadro Ortólogo" siguiente. 1. En sí (3 entradas redundantes) >gi|15228235|ref|NP_190356.11 proteína putativa; id de proteína : At3g47720.1 [Arabidopsis thaliana] >gi|74873751 pir||T07711 proteína hipotética T23J7.50-Arabidopsis thaliana >gi|4741189|emb|CAB41855.1 |proteína putativa [Arabidopsis .thaliana] Puntuación = 604 bits (1557), Esperado = e-172 2. At62520 de Arabidopsis (varias entradas redundantes) . >gi|15241862|ref|NP_201058.1 | proteína putativa; id de proteína : At62520.1 , soportado por ADNc: 23920., soportado por ADNc: gi|5450638, soportado por ADNc: gi|7386159 [Arabidopsis thaliana] >g|0178083tdbj|BAB11502.1 gen Jd: K19BI.13~pir||T07711-similar a la proteína desconocida [Arabidopsis thaliana] >gi|5450639|gb|AAK96591.1 |AT5g62520/K19B1_13 [Arabidopsis thaliana] > g¡||73 86160|gb|AAL3 8626. 1 IAF446893-1 AT5g62520/KI9B1_13 [Arabidopsis thaliana] Puntuación = 281 bits (718), Esperado = 1e-74 - La siguiente secuencia es altamente probable que sea una entrada redundante de At62520 porque los resultados de tblastn indican que se localizan en el mismo lugar en el genoma de Arabidopsis. Sin embargo, difiere de las secuencias listadas anteriormente por dos aminoácidos. Esto probablemente es el resultado del error de secuenciación o de polimorfismos de nucleótido con poco o nada de efecto en la actividad. >gi[21592445|gb|AAM64396.1 | desconocido [Arabidopsis _ thaliana] Puntuación = 275 bits (704), Esperado = Se-73 3. At23550 de Arabidopsis (3 entradas redundantes) >gi|15220787|ref|NP 73769.11 proteína hipotética; id de proteína: At23550.1 [Arabidopsis thaliana] >gi|4056438|gb|AAC98011.1 |F508.11 [Arabidopsis thaliana] . . . _ Puntuación = 158 bits (399), Esperado = le-37 - La siguiente secuencia es otra entrada redundante de At23550 basada en el comentario de Genbank. Sin embargo, difiere de las secuencias listadas a continuación a través de un aminoácido. Esto probablemente es el resultado de errores de secuenciación o de polimorfismos de nucleótido individual con poco o nada de efecto sobre la actividad. >gi|8778582|gb|AAF79590.1 |AC007945_10F28C11.18 Arabidopsis thaliana] Puntuación = 154 bits (390), Esperado = 1e-36 4. At70440 de Arabidopsis (3 entradas redundantes) >gi|15223159|ref|NP_177201.11 proteína hipotética; id de proteína: At70440.1 [Arabidopsis thaliana] Puntuación = 131 bits (330), Esperado = 1e-29 Las siguientes secuencias son entradas redundantes de At70440 basadas en el comentario de Genbank. Sin embargo, difieren de la secuencia listada anteriormente a través de varios aminoácidos. Esto es probablemente el resultado de errores de secuenciación o polimorfismos de nucleótido individuales con poco o nada de efecto sobre la actividad. >gi|7485680|pir|T01478 proteína hipotética F1707.2-Arabidopsis thaliana >gi|3176692|gb|AAC18815.1 |F1707.2 [Arabidopsis thaliana] Puntuación = 118 bits (296), Esperado = 8e-26 5. Atlg32230 de Arabidopsis (varias entradas redundantes). >gi|18398335|ref|NP_564391.1 | proteína expresada; id de proteína: At32230.1 , soportado por ADNc: gi|1044956, soportado por ADNc: gui|9715642 [Arabidopsis thaliana] >gi| 19715643|gb|AAL91641.1 |Atlg32230/F3C3_1 [Arabidopsis thaliana] Puntuación= 111 bits (278), Esperado =1e-23 Las siguientes secuencias son altamente probablemente entradas redundantes de At5g62520 basadas (1 ) los resultados tbiastn que indican que se localizan en el mismo lugar en el genoma de Arabidopsis, y (2) el comentario de Genbank. Sin embargo, difieren de la secuencia listada anteriormente a través de algunos aminoácidos. Esto es probablemente el resultado de errores de secuenciación o polimorfismos de nucleótido individuales con poco o nada de efecto sobre la actividad. > gi|16604703|gb|AAL24144.1 | proteína desconocida [Arabidopsis thaliana] >gi|23296877|gb|AAN13193.1 | proteína desconocida [Arabidopsis thaliana] >gi|11044957|emb|CAC14428.1 | proteína ceo [Arabidopsis thaliana] >gi|10801372|gb|AAG23444.1 |AC084165_10 proteína desconocida [Arabidopsis thaliana] >gi|14150488|gb|AAK54509.1|AF317898_1 ATP8 [Arabidopsis thaliana] 6. Una proteína CEO putativa de arroz >gi|18057156|gb|AAL58179.1 |AC027037_1 proteína CEO putativa [Oryza sativa] Puntuación = 99.4 bits (246), Esperado = 7e-20 7. At2g35510 de Arabidopsis (varias entradas redundantes) >gi|18403862|reflNP_565806.1 l proteína expresada; id de proteína: At2g35510.1 , soportada por ADNc: gi|5810142 [Arabidopsis thaliana] - >gi|20l97351 |gb|AAC36170.21 proteína expresada [Arabidopsis thaliana] >gi|23297349|gb|AAN12947.11 proteína desconocida [Arabidopsis thaliana] Puntuación = 85. 5 bits (210), Esperado = 9e-16 Las siguientes secuencias son entradas redundantes de A.23550 basadas en el comentario de Genbank. Sin embargo, difieren de la secuencia listada anteriormente a través de un aminoácido. Esto es probablemente el resultado de errores de secuenciación o polimorfismos de nucleótido individuales con poco o nada de efecto sobre la actividad. >gi|158 0143|gb|AALO7215.11 proteína desconocida [Arabidopsis thaliana] Puntuación = 84.0 bits (206), Esperado = 3e-15 Homólogos de Arabidopsis más cercanos At3g47720 es una proteína no secretora, carece de péptido de señal (pronosticado por la seña IP) y no tiene dominio de transmembrana (pronosticado por THMHMM). La localización celular de At3g47720 permanece sin aclarar con base en el análisis PSORT2 (48% citoplásmico, 32% nuclear, 20% citoesquelético). No se puede detectar ningún motivo de proteína para At3g47720 a través del análisis Pfam. At3g47720 codifica una proteína que no ha sido funcionalmente caracterizada y no tiene ningún motivo de proteína conocido. Los resultados BLAST de At3g47720 sugieren que es un miembro de la única familia de proteínas pequeñas para plantas.

EJEMPLO 4 Confirmación de la Asociación Fenotipo/Genotipo El análisis RT-PCR mostró que el gen HI032.3 fue sobre-expresado en plantas a partir de la línea desplegando el fenotipo HI032.3. Específicamente, el ARN se extrajo de hojas de roseta y/o sílicos de plantas que exhiben el fenotipo HI032.3 recolectado en una variedad de etapas de desarrollo y agrupado. Se llevo a cabo RT-PCR utilizando iniciadores específicos para la secuencia presentada, SEC ID N0:1 , a otros genes pronosticados en la cercanía a la inserción de ADN-T, y para un gen de actina constitutivamente expresado (control positivo). Los resultados mostraron que las plantas que despliegan el fenotipo HI032.3 sobre-expresan el ARNm para el gen HI032.3, indicando una expresión mejorada del gen HI032.3 correlacionada con el fenotipo HI032.3. El patrón heredado dominante del fenotipo HI032.3 se confirma a través del análisis genético. En general, el análisis genético involucra la producción y el análisis de híbridos F1. Típicamente, los cruces de F1 se llevan a cabo a través de la recolección de polen de plantas T2, el cual se utiliza para polinizar plantas de tipo silvestre. Dichos cruces se llevan a cabo tomando alrededor de 4 flores de cada planta individual seleccionada, y utilizando la flor T2 como el donador de polen macho y las flores de plantas de tipo silvestre son las hembras. Se hicieron 4-5 cruces para un individuo de interés. Las semillas formadas de los cruces de los mismos individuos se agruparon, se plantaron y se hicieron crecer a la madurez como híbridos F1.

EJEMPLO 5 Recapitulación del Fenotipo Altamente Oleaginoso Para confirmar si la sobre-expresión de At3g47720 causa un fenotipo altamente oleaginoso de semilla, el contenido oleaginoso en semillas de plantas transgénicas que sobre-expresan este gen se comparó con el contenido oleaginoso en semillas de plantas de control no transgénicas. Para hacer esto, At3g47720 se clonó en un vector de transformación de planta detrás del promotor PRU específico de semilla y se transformó en plantas Arabidopsis utilizando el método de inmersión floral. El vector de transformación de la planta contiene el gen nptll, el cual provee resistencia a canamicina, y sirve como un marcador seleccionable. Las semillas de las plantas transformadas se colocaron en placas sobre el medio de agar conteniendo canamicina. Después de 7 días, las plantas transgénicas se identificaron como plantas verdes sanas y se transplantaron a la tierra. Las plantas de control no transgénicas se germinaron sobre medio de agar, permitiendo el crecimiento durante 7 días y después se transplantaron a la tierra. Se_ transplantaron 22 cultivos transgénicos y 10 plantas de control no transgénicas a posiciones aleatorias en la misma superficie plana de 32 células. Las plantas se hicieron crecer a la madurez, permitiendo la auto-fertilización y el establecimiento de las semillas. Las semillas se cosecharon a partir de cada planta y su contenido oleaginoso se estimó a través de espectroscopia casi infrarroja (NIR) utilizando los métodos descritos a continuación. El espectro infrarrojo NIR se capturó utilizando un espectrómetro casi infrarrojo Broker 22 N/F. Se utilizó el software Broker para estimar el contenido de aceite en la semilla total y el contenido de proteína de semilla total utilizando los datos NIR de las muestras y métodos de referencia de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La calibración pronosticada para el contenido oleaginoso se desarrollo siguiente el método general del procedimiento Am1-92 AOCS, Official Methods and Recommended Practices of the American Oil Chemists Society, 5a. Ed., AOCS, Champaign lll). Se desarrolló la calibración que permitió los pronósticos NIR de aceite crudo, ASE aceite crudo (Aceite Puro, Extracción de Solvente Acelerado). El efecto de sobre-expresión de At3g47720 sobre el aceite de semilla ha sido probado en los experimentos. En ambos experimentos, las plantas que sobre-expresan At3g47720 tuvieron un contenido oleaginoso en semilla más alto que la plantas de control que crecieron en la misma superficie plana no tuvieron diferencia en dos experimentos. A través de los experimentos, el promedio de contenido oleaginoso en las semillas de las plantas que sobre-expresa At3g47720 fue 3.8% mayor que el de los controles no transformados. El contenido oleaginoso de semilla en plantas que sobre-expresa At3g47720 fue significativamente más grande que para plantas de control no transgénicas (ANOVA de dos vías; P = 0.0001 ) Referencias Altschul, S. F. y otros, J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990. Altschul, S. F. y otros, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402,1997. Ausubel FM y otros, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N. Y., 1993. Baldwin D y otros, Cur Opin Plant Biol. 2 (2):96-103, 1999. Bateman y otros, 1999, Nucleic Acids Res 27:260-262. Baulcombe D, Arch Virol Suppl 15: 189-201 , 1999. Bert y otros, Theor Appl Genet. 2003 Junio; 107(1):181-9. Cannon y otros, Plant Molec. Biol. (1990) 15:39-47. Ching y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1989) 86:10006-10010 Christensen S y otros, 9th International Conference on Arabidopsis Research. Univ. of Wisconsin-Madison, Junio 24-28,1998. Abstract 165. Christou y otros, Proc. Nati. Acad. Sci USA (1989) 86: 7500-7504. Colbert y otros (2001 ) Plant Physiol 126:480-484. Cough, SJ and Bent, AF, the Plant Journal 16 (6):735-743,1998. De Block y otros, Plant Physiol. (1989) 91 :694-701. Dieffenbach C and Dveksler G (Eds. ) PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989. Everett y otros, Bio/Technology (1987) 5:1201 Feldmann y otros, Science 243:1351-1354,1989.

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Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una planta transgénica que comprende un vector de transformación de planta que comprende una secuencia de nucleótido que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica el polipéptido -HI03

2.3 que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO:2, o un ortólogo del mismo, mientras la planta transgénica tiene un fenotipo oleaginoso alto con relación a las plantas de control. 2.- La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque se selecciona del grupo que consiste de colza, soya, maíz, girasol, algodón, cacao, cártamo, palma de aceite, palma de coco, lino, ricino, y cacahuate.

3.- Una parte de la planta obtenida de la planta de conformidad con la reivindicación 1.

4.- La parte de la planta de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque es una semilla.

5.- Un método para producir aceite que comprende el crecimiento de una planta transgénica de conformidad con la reivindicación 1 , y recuperar el aceite a partir de dicha planta.

6.- Un método para producir un fenotipo altamente oleaginoso en una planta, dicho método comprende: a) introducir en las células progenitoras de la planta un vector de trasformación de planta que comprende una secuencia de nucleótido que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica el polipéptido HI032.3 que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO:2, o un ortólogo de la misma, y b) hacer crecer las células progenitoras transformadas para producir una planta transgénica, en donde dicha secuencia de polinucleótido se expresa, y dicha planta transgénica exhibe un fenotipo de contenido oleaginoso alterado con relación a las plantas de control.

7.- Una planta obtenida a través del método de conformidad con la reivindicación 6.

8.- La planta de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque se selecciona del grupo que consiste de colza, soya, maíz, girasol, algodón, cacao, cártamo, palma de aceite, palma de coco, lino, ricino, y cacahuate.

9.- La planta de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque la planta se selecciona del grupo que consiste de una planta que crece a partir de las células progenitoras, una planta que es la progenie directa de una planta que crece a partir de dichas células progenitoras, y una planta que es la progenie directa de una planta que crece de dicha células progenitoras.

10.- Un método para generar una planta que tiene un fenotipo altamente oleaginoso que comprende la identificación de una planta que tiene un alelo en su gen HI032.3 que da como resultado un contenido oleaginoso incrementado comparado con plantas que carecen de alelo y que generan una progenie de dicha planta identificada, en donde la progenie generada hereda el alelo y tiene un fenotipo altamente oleaginoso.

11.- El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque emplea una metodología de gen candidato/QTL.

12.- El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque emplea la metodología de CULTIVO.