MXPA06006221A

MXPA06006221A - Produccion de particula tipo virus icosaedrico recombinante en organismos del genero pseudomonas.

Info

Publication number: MXPA06006221A
Application number: MXPA06006221A
Authority: MX
Inventors: Lada Rasochova; Philip Phuoc Dao
Original assignee: Dow Global Technologies Inc
Priority date: 2003-12-01
Filing date: 2004-12-01
Publication date: 2008-02-13
Also published as: EP1758925A2; EP1758925A4; CA2547511A1; AU2004313458A1; WO2005067478A2; CN101151272A; BRPI0417159A; JP2007512842A; US20050214321A1; KR20060114340A; WO2005067478A3; AU2004313458B2

Abstract

La presente invencion provee un procedimiento mejorado para la produccion de peptidos recombinantes mediante fusion de los peptidos recombinantes con capsides virales icosaedricas y expresion de la fusion en celulas bacterianas de origen pseudomonadido. Las celulas se organismos del genero Pseudomonas soportan la formacion de particulas tipos virus a partir de las capsides virales icosaedricas in vivo, y permiten la inclusion de peptidos recombinantes mas grandes como monomeros o concatameros en la particula tipo virus. La invencion provee especificamente celulas que expresan fusiones de capside viral, acidos nucleicos que codifican para fusiones de proteinas toxicas con capsides virales icosaedricas y procedimientos para la fabricacion de proteinas recombinantes.

Description

PRODUCCIÓN DE PARTÍCULA TIPO VIRUS ICOSAEDRICO RECOMBINANTE EN ORGANISMOS DEL GENERO Pseudomonas CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención provee un procedimiento mejorado para la producción de péptidos recombinantes. En particular, la presente invención provee un procedimiento mejorado para la producción o presentación de péptidos recombinantes en células bacterianas utilizando partículas tipo virus a partir de virus icosaédricos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La revolución de la ingeniería genética se ha expandido hacia el desarrollo de péptidos recombinantes para uso como agentes terapéuticos en humanos y animales. En la actualidad, existen más de 100 agentes terapéuticos y vacunas derivados de biotecnología aprobados por la Agencia de Fármacos y Alimentos de EE.UU. (U.S.

FDA) para uso médico y más de 1000 fármacos y vacunas adicionales están en diversas fases de pruebas clínicas. (Véase M. Rai y H. Padh, (2001 ) "Expression systems for production of heterologous proteins, "Cur. Science 80(9): 1 121-1 128). Actualmente se utilizan sistemas de expresión bacterianos, de levadura, Dictyostelium discoideum, insecto, y células de mamífero para producir péptidos recombinantes, con grados variables de éxito. Un objetivo en la creación de sistemas de expresión para la producción de péptidos heterólogos es el de proveer plataformas y procedimientos con base amplia, flexibles, eficientes, económicos y prácticos que se puedan utilizar en aplicaciones comerciales, terapéuticas y de vacunas. Por I ejemplo, para la producción de algunos péptidos, sería ideal tener un sistema de expresión que pueda producir en una manera eficiente y no costosa, cantidades grandes de productos finales, deseables in vivo con el fin de eliminar o reducir los costos de re-ensamblado corriente abajo. Actualmente, las bacterias son el sistema de expresión más ampliamente utilizado para la producción de péptido recombinantes debido a su potencial para producir cantidades abundantes de péptidos recombinantes. Sin embargo, las bacterias con frecuencia están limitadas en cuanto a sus capacidades para producir algunos tipos de péptidos, lo que requiere el uso de sistemas de expresión alternativos, y más costosos. Por ejemplo, los sistemas bacterianos están restringidos en cuanto a su capacidad para producir péptidos anti-microbianos monoméricos debido a la toxicidad de dichos péptidos para las bacterias, lo que con frecuencia conduce a la muerte de la célula después de expresar el péptido. Debido a las desventajas inherentes en términos de los costos y rendimientos de producto de los sistemas de expresión no bacterianos, se han gastado tiempo y recursos significativos para tratar de mejorar la capacidad de los sistemas bacterianos para producir una amplia gama de péptidos útiles desde el punto de vista comercial y terapéutico. Aunque se han hecho avances en esta área, serían benéficos procedimientos y plataformas adicionales para la producción de péptidos heterólogos en sistemas de expresión bacterianos.

Virus Una estrategia para mejorar la producción de péptido en sistemas de expresión de célula hospedera es el de utilizar las propiedades de los virus replicativos para producir los péptidos recombinantes de interés. Sin embargo, el uso de virus replicativos, de longitud completa tiene numerosas dificultades para su uso en las estrategias de producción de péptido recombinante. Por ejemplo, podría ser difícil controlar la producción de péptido recombinante durante las condiciones de fermentación, lo cual podría requerir de la regulación estricta de la expresión con el fin de llevar al máximo la eficiencia de la corrida de fermentación. Asimismo, el uso de virus replicativos para producir péptidos recombinantes podría dar como resultado la imposición de requisitos regulatorios, lo cual puede conducir a pasos de purificación corriente abajo incrementados. Para superar los aspectos de producción en particular durante la fermentación, un área de investigación se ha enfocado en la expresión y ensamblado de virus en una célula que no sea un hospedero natural para el virus particular (una célula hospedera no trópica). Una célula no trópica es una célula a la cual el virus es incapaz de entrar exitosamente debido a la incompatibilidad entre las cápsides virales y las moléculas de receptor del hospedero, o una incompatibilidad entre la bioquímica del virus y la bioquímica de la célula, lo que evita que el virus complete su ciclo vital. Por ejemplo, la patente E.U.A. No. 5,869,287 para Price eí al. , describe un método para sintetizar y ensamblar, en células de levadura, virus con capacidad de replicación o infecciosos que contienen ARN, ya sea que las cápsides virales o el ARN contenido dentro de las cápsides provengan de una especie viral que no ataque a levaduras de la familia Nodaviridae o Bromoviridae. Sin embargo, esta estrategia no supera los obstáculos regulatorios potenciales que están asociados con la producción de proteínas en virus con capacidad de replicación.

Partículas tipo virus Otra estrategia para mejorar la producción de péptidos recombinantes ha sido la de utilizar partículas tipo virus (VLP por sus siglas en inglés). En general, los virus encapsidados incluyen una cubierta proteica o "cápside" que se ensambla para que contenga el ácido nucleico viral. Muchos virus tienen cápsides que pueden ser "auto-ensambladas" a partir de las cápsides expresadas en forma individual, tanto dentro de la célula la cápside se expresa en el interior ("ensamblado in vivo") formando los VLP, como fuera de la célula después del aislamiento y purificación ("ensamblado in vitro"). De manera ideal, las cápsides se modifican para que contengan un péptido recombinante objetivo, lo que genera una fusión de cápside viral-péptido recombinante. El péptido de fusión después se puede expresar en una célula, y de manera ideal, ensamblar in vivo para formar partículas tipo virus o virales recombinantes.

Esta estrategia ha tenido grado variable de éxito, véase, por ejemplo, C Marusic ef al., J Virol. 75(18):8434-39 (Septiembre de 2001 ) (expresión en plantas de cápsides de virus X de papa helicoidales recombinantes fusionadas por los extremos a un péptido de VI H, antigénico, con formación in vivo de partículas virales recombinantes); FR Brennan et al., Vaccine 1 7(1 5-16): 1846-57 (9 de abril de 1999); (expresión en plantas de cápsides de virus de mosaico de garbanzo icosaédrico o de cápsides de virus X de papa helicoidales, recombinantes fusionadas por los extremos a un péptido de Staphylococcus aureus, antigénico, con formación in vivo de partículas virales recombinantes). La patente E. U.A. No. 5,874,087 para Lomonossoff y Johnson describe la producción de virus vegetales recombinantes, en células vegetales, en las cuales las cápsides virales incluyen cápsulas manipuladas genéticamente para que contengan un péptido biológicamente activo, tal como una hormona, factor de crecimiento, o péptido antigénico. Un virus que se selecciona a partir de los géneros Comovirus, Tombusvirus, Sobemovirus, y Nepovirus se manipula genéticamente para que contenga la secuencia que codifica para el péptido exógeno y el genoma completo manipulado genéticamente del virus se expresa para que produzca el virus recombinante. La secuencia codificadora del péptido exógeno se inserta dentro de una o más de las secuencias codificadoras de motivo de bucle de superficie de cápside. Se han hecho intentos para utilizar células no trópicas para producir partículas tipo virus particulares. Véase, por ejemplo, JW Lamb ef al., J Gen. Virol. 77(parte 7): 1349-58 (Julio de 1996), que describen la expresión en células de insecto de cápsides de virus de rollo de hoja de papa icosaédricos fusionados por los extremos a un heptadecapéptido, con formación in vivo de partículas tipo virus. En algunas situaciones, podría ser preferible una VLP no trópica. Por ejemplo, una cápside viral no trópica puede ajustarse más a la inserción de péptido exógeno sin alterar la capacidad para ensamblarse como partículas tipo virus que la de una cápside viral original. De manera alternativa, la cápside viral no trópica puede caracterizarse y entenderse de manera más adecuada que una cápside proveniente de un virus trópico, original. Además, la aplicación particular, tal como la producción de vacunas, podría no permitir el uso de un virus trópico en un sistema de expresión de célula hospedera particular. La patente E.U.A. No. 6,232,099 para Chapman ef al. describe el uso de virus tipo bastoncillo para producir proteínas exógenas conectadas a las sub-unidades de cápside viral en plantas. Los virus con forma de bastoncillo, también clasificados como virus helicoidales, tal como el virus X de papa (PVX) tienen péptidos recombinantes de interés insertados dentro del genoma del virus para crear fusiones cápside viral-péptido recombinantes. El virus recombinante se utiliza después para infectar una célula hospedera, y el virus se replica activamente en la célula hospedera y también infecta otras células. Por último, la fusión de cápside viral-péptido recombinante se purifica a partir de las células hospederas vegetales.

Uso de partículas tipo virus en sistemas de expresión bacterianos Debido al potencial de producciones rápidas, eficientes, no costosas, y abundantes de péptidos recombinantes, las bacterias se han examinado como células hospederas en sistemas de expresión para la producción de partículas tipo virales de fusión de cápside viral-péptido recombinante. Los investigadores han demostrado que las cápsides virales de tipo silvestre particulares sin insertos de péptido recombinante se pueden expresar en forma transgénica en enterobacterias no trópicas. Los investigadores también han demostrado que estas cápsides se pueden ensamblar, tanto in vivo como in vitro, para formar partículas tipo virus. Véase, por ejemplo, SJ Shire ef al., Biochemistry 29(21 ):51 19-26 (29 de mayo de 1990) (ensamblado in vitro de partículas tipo virus a partir de cápsides de virus de mosaico de tabaco helicoidales expresadas en E. coli); X Zhao ef al., Virology 207(2):486-94 (10 de marzo de 1995) (ensamblado in vitro de partículas tipo virus provenientes de cápsides de virus del moteado clorótico de garbanzo icosaédrico expresado en E. coli); Y Stram ef al., Virus Res. 28(1 ):29-35 (Abril de 1 993) (expresión de cápsides de virus Y de papa filamentosos en E. coli, con formación in vivo de partículas tipo virus); J Joseph y HS Savithri, Arch. Virol. 144(9): 1679-87 (1999) (expresión de cápsides de virus de las bandas de vena de pimiento filamentosos en E coli, con formación in vivo de partículas tipo virus); DJ Hwang et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 91 (1 9):9067-71 (13 de septiembre de 1 994) (expresión de cápsides de virus del mosaico del tabaco helicoidales en E. coli, con formación in vivo de partículas tipo virus); M Sastri ef al., J Mol. Biol. 272(4):541 -52 (3 de octubre de 1 997) (expresión de cápsides de virus del moteado de Physalis icosaédricos en E. coli, con formación in vivo de partículas tipo virus). Hasta la fecha, la expresión exitosa y el ensamblado in vivo de partículas de fusión de cápside viral-péptido recombinante en una bacteria no trópica han sido variados. En general, el ensamblado in vivo exitoso de estas partículas ha estado limitado a partículas de fusión de cápside viral-péptido objetivo no icosaédrico. Véase, por ejemplo, MN Jagadish ef al., Intervirology 39(1 -2):85-92 (1996) (expresión en células no vegetales de cápsides de virus de mosaico de Sorghum halepense (Johnsongrass) no icosaédricos, filamentosos, recombinantes fusionadas por los extremos a un péptido antigénico, con formación in vivo de partículas tipo virus). La expresión de péptidos ligados a cápsides icosaédricas no ha tenido éxito o son de utilidad limitada. Por ejemplo, V Yusibov eí al., J Gen. Virol. 77 (parte 4):567-73 (abril de 1996) describen el ensamblado in vitro de partículas tipo virus a partir de cápsides de virus de mosaico de alfalfa icosaédricos recombinantes, expresados en E. coli fusionadas por los extremos a un péptido de hexahistidina. Brumfield et al. , intentaron sin éxito expresar como partículas tipos virus ensambladas in vivo péptidos recombinantes insertados dentro de una cápside icosaédrica. Véase Brumfield ef al. , (2004) "Heterologous expression of the modified capsid of Cowpea chlorotic motile bromovirus results in the assembly of protein cages with aitered architectures and functions, "J. Gen. Vir. 85: 1 049-1 053. Las razones para la incapacidad observada de las partículas de fusión de cápside viral-péptido icosaédricas para ensamblarse como partículas tipo virus in vivo en E. coli no se ha entendido adecuadamente. Brumfield ef al. , asocian el fracaso para el ensamblado al hecho que E. coli produce una cápside insoluble. Chapman, en la patente E. U.A. No. 6,232,099, señala que los virus icosaédricos toleran un tamaño de inserción limitado. Chapman cita al documento WO 92/1861 8, el cual limita el tamaño de un péptido recombinante en un virus icosaédrico para expresión en una célula hospedera vegetal hasta 26 aminoácidos de longitud, en apoyo a su disertación. Chapman plantea la teoría de que un péptido más grande presente en el sitio de inserción interno en la cápside de los virus icosaédricos podría dar como resultado la alteración de la geometría de la proteína y/o su capacidad para interactuar con éxito con otras cápsides lo que conduce al fracaso de los virus quiméricos para ensamblarse. Esta referencia también describe él uso de virus no replicativos, con forma de bastoncillo, para producir péptidos de fusión de péptido recombinante-cápside en células que pueden incluir E. coli. Por lo tanto, es un objetivo de la presente invención proveer un sistema de expresión bacteriano mejorado para la producción de partículas tipo virus, en el cual la partícula tipo virus se obtiene a partir de un virus icosaédrico. Es otro objetivo de la presente invención proveer organismos bacterianos para ser utilizados como células hospederas en un sistema de expresión mejorado para la producción de partículas tipo virus. Es incluso otro objetivo de la presente invención proveer procedimientos para la producción mejorada de partículas tipo virus en bacterias. Es incluso otro objetivo de la presente invención proveer construcciones y ácidos nucleicos novedosos para ser utilizados en un sistema de expresión bacteriano mejorado para la producción de partículas tipo virus.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Las partículas de fusión de péptido recombinante-cápside icosaédricas se ensamblan como partículas tipo virus o estructuras de jaula solubles in vivo cuando se expresan en organismos del género Pseudomonas (pseudomonádidos). Asimismo, se pueden insertar péptidos recombinantes o concatámeros peptídicos, mayores de 50 aminoácidos, en una cápside icosaédrica y ensamblar in vivo en organismos del género Pseudomonas. En un aspecto de la presente invención, se proveen organismos del género Pseudomonas que incluyen una construcción de ácido nucleico que codifica para un péptido de fusión de una cápside icosaédrica y un péptido recombinante. En una modalidad específica de la presente invención, la célula pseudomonádida es Pseudomonas fluorescens. En una modalidad la célula produce partículas tipo virus o estructuras de jaula solubles. Las partículas tipo virus que se producen en la célula típicamente no pueden infectar a la célula. La secuencia de la cápside viral se puede obtener a partir de un virus no trópico para la célula. En una modalidad, la célula no incluye proteínas virales diferentes a las de la cápside icosaédrica deseada. En una modalidad, la cápside viral se obtiene a partir de un virus con un tropismo hacia una familia diferente de organismos que la de la célula. En otra modalidad, la cápside viral se obtiene a partir de un virus con un tropismo hacia un género diferente de organismos que el de la célula. En otra modalidad, la cápside viral se obtiene a partir de un virus con un tropismo hacia una especie diferente de organismos que el de la célula. En una modalidad de la presente invención, la cápside icosaédrica se obtiene a partir de un virus icosaédrico de plantas. En una modalidad particular, la cápside icosaédrica se obtiene a partir del grupo que se selecciona a partir de Virus del Mosaico del Garbanzo, Virus del Moteado Clorótico del Garbanzo, y Virus del Mosaico de la Alfalfa. En una- modalidad de la presente invención, el péptido recombinante fusionado a la cápside icosaédrica es un péptido terapéutico útil para tratamientos en humanos o animales. En una modalidad particular, el péptido recombinante es un antígeno. En una modalidad, las partículas tipo virus de péptido recombinante-cápside se pueden administrar como una vacuna en una aplicación en humanos o animales. En otra modalidad particular, el péptido recombinante es un péptido que es tóxico para la célula hospedera cuando está en forma monomérica libre. En una modalidad más particular, el péptido tóxico es un péptido anti-microbiano. En una modalidad, el péptido recombinante fusionado a la cápside icosaédrica es de por lo menos 7, por lo menos 8, por lo menos, 9, por lo menos 1 0, por lo menos 12, por lo menos 15, por lo menos 20, por lo menos 25, por lo menos 30, por lo menos 35, por lo menos 40, por lo menos 45, por lo menos 50, por lo menos 55, por lo menos 60, por lo menos 65, por lo menos 75, por lo menos 85, por lo menos 95, por lo menos 99, o por lo menos 1 00 aminoácidos. En una modalidad de la presente invención, el péptido recombinante fusionado a la cápside icosaédrica contiene por lo menos un monómero de un péptido objetivo deseado. En una modalidad alternativa, el péptido recombinante contiene más de un monómero de un péptido objetivo deseado. En algunas modalidades, el péptido está constituido de por lo menos dos, por lo menos 5, por lo menos 10, por lo menos 15 o por lo menos 20 monómeros separados que están ligados en forma operable como un péptido concatamérico a la cápside. En otra modalidad, los monómeros individuales en el péptido concatamérico están ligados mediante regiones enlazadoras susceptibles de corte. Incluso en otra modalidad, el péptido recombinante está insertado en por lo menos un bucle de superficie de la cápside viral icosaédrica. En una modalidad, está insertado por lo menos un monómero en más de uno de los bucles de superficie de la cápside viral icosaédrica. Se puede modificar más de un bucle de la partícula tipo virus. En una modalidad particular, el péptido recombinante se expresa en por lo menos dos bucles de superficie de la partícula tipo virus icosaédrico. En otra modalidad, están insertados por lo menos dos péptidos diferentes en por lo menos dos bucles de superficie de la cápside viral, jaula o partícula tipo virus. En otra modalidad, están insertados por lo menos tres péptidos recombinantes en por lo menos tres bucles de superficie de la partícula tipo virus. Los péptidos recombinantes en los bucles de superficie pueden tener la misma secuencia de aminoácido. En modalidades separadas, difiere la secuencia de aminoácido de los péptidos recombinantes en los bucles de superficie. Incluso en otra modalidad, la célula incluye por lo menos un ácido nucleico adicional que codifica ya sea para una segunda cápside de tipo silvestre o para un segundo péptido de fusión péptido recombinante-cápside, en la cual las cápsides múltiples se ensamblan in vivo para producir partículas tipo virus quiméricas. En un aspecto de la presente invención, se proveen organismos del género Pseudomonas que incluyen un péptido de fusión de una cápside icosaédrica y un péptido recombinante. En una modalidad específica de la presente invención, la célula pseudomonádida es Pseudomonas fluorescens. En una modalidad el péptido de fusión péptido recombinante-cápside se ensambla in vivo para formar una partícula tipo virus. En otro aspecto de la presente invención, se proveen construcciones de ácido nucleico que codifican para un péptido de fusión de una cápside icosaédrica y un péptido recombinante. En una modalidad de la presente invención, la cápside icosaédrica se obtiene a partir de un virus icosaédrico de plantas. En una modalidad particular, la cápside icosaédrica se obtiene a partir del grupo que se selecciona de Virus del Mosaico del Garbanzo, Virus del Moteado Clorótico del Garbanzo, y Virus del Mosaico de la Alfalfa. En una modalidad, el péptido recombinante es un péptido que es tóxico para la célula hospedera cuando está en forma monomérica libre. En una modalidad más particular, el péptido tóxico es un péptido anti-microbiano. En una modalidad de la presente invención, el péptido recombinante contiene por lo menos un monómero de un péptido objetivo deseado. En una modalidad alternativa, el péptido recombinante contiene más de un monómero de un péptido objetivo deseado. Incluso en otra modalidad, el péptido recombinante está insertado en por lo menos un bucle de superficie de la cápside de virus icosaédrico. En otra modalidad, la construcción de ácido nucleico puede incluir secuencias de ácido nucleico adicionales que incluyen por lo menos un promotor, por lo menos un marcador de selección, por lo menos una secuencia de operador, por lo menos un origen de replicación, y por lo menos un sitio de unión a ribosoma. En un aspecto, la presente invención provee un procedimiento para producir un péptido recombinante que incluye: a) proveer una célula pseudomonádida; b) proveer un ácido nucleico que codifique para un péptido de fusión, en el cual la fusión es de un péptido recombinante y una cápside icosaédrica; c) expresar el ácido nucleico en la célula de organismo del género Pseudomonas, en el cual la expresión en la célula provee el ensamblaje in vivo del péptido de fusión como partículas tipo virus; y d) aislar las partículas tipo virus. En una modalidad, el procedimiento también incluye: e) cortar el producto de fusión para separar al péptido recombinante de la cápside. En una modalidad de la presente invención, la célula pseudomonádida es Pseudomonas fluorescens. En una modalidad, el procedimiento ¡ncluye co-expresar otro ácido nucleico que codifique para una cápside de tipo silvestre o para un péptido de fusión péptido recombinante-cápside, en el cual las cápsides se ensamblan in vivo para producir partículas tipo virus quiméricas. En otro aspecto de la presente Invención, se provee un sistema de expresión para la producción de péptidos recombinantes que ¡ncluye: a) una célula pseudomonádida; b) un ácido nucleico que codifica para un péptido de fusión; en el cual el péptido de fusión comprende por lo menos un péptido recombinante, y por lo menos una cápside viral icosaédrica; y c) un medio de crecimiento. Cuando se expresa, el péptido de fusión se puede ensamblar como partículas tipo virus dentro de la célula.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 presenta un mapa de plásmido de un plásmido de expresión CCMV129-CP útil para la expresión de VLP recombinantes en células hospederas pseudomonádidas. La figura 2 ilustra un esquema para la producción de monómeros peptídicos en Partículas Tipo Virus (VLP) en células hospederas, por ejemplo, células hospederas pseudomonádidas. Se inserta una secuencia que codifica para el inserto de péptido objetivo deseado ("I"), en marco, dentro de la secuencia que codifica para la cápside viral ("CP") en la construcción de un gen de cápside viral recombinante {"rCP"), el cual, como parte de un vector, se transforma en el interior de la célula hospedera y se expresa para formar cápsides recombinantes ("rCP"). Estas después se ensamblan para formar VLPs que contienen hasta 180 rCP cada una, en el caso de CCMV. Las VLPs se ilustran con insertos de péptido objetivo ("I") expresados en el o los bucles externos de la cápside. Cada una de las VLP contiene insertos de péptido múltiples por partícula, por ejemplo, hasta 180 o un múltiplo de los mismos. Las VLP después se precipitan fácilmente a partir del lisado celular para recuperación, por ejemplo, mediante precipitación con PEG. Los insertos de péptido recombinante expresados en los bucles de superficie y/o extremos terminales de la cápside se pueden aislar en forma altamente pura a partir de las VLP precipitadas. La figura 3 ilustra un esquema para la producción de multímeros peptídicos en VLP en células hospederas, por ejemplo, células hospederas pseudomonádidas. El inserto de péptido es un multímero (se muestra un trímero) del o los péptidos objetivos deseados, cuyas secuencias codificadoras ("/"') están insertadas en la secuencia que codifica para la cápside viral ("CP") en la construcción de un gen de cápside viral recombinante ("rCP"). Cada una de las secuencias que codifican para el péptido objetivo está unida por secuencias codificadoras para sitios de corte ("*") y el inserto de ácido nucleico completo se marca como ("/"). En la ilustración, únicamente se efectúa una inserción de trímero por cada cápside de CCMV, y cada una de las VLP resultante contiene hasta 180 insertos de péptido ("I") para un total de hasta 540 péptidos objetivos ("i"). Los péptidos objetivos se aislan después fácilmente en forma altamente pura, después de precipitación de las VLP, tratando las VLP, con un agente para corte, por ejemplo un ácido o una enzima. La figura 4 es un mapa de plásmido del plásmido de expresión CCMV63-CP útil para la expresión de VLP recombinantes. Se manipulan genéticamente los sitios de restricción Asc\ y ?/ofl que en la CCMV-CP (SEQ ID NO: 1 ) para que sirva como un sitio de inserción para péptidos. La figura 5 es un mapa de plásmido del plásmido de expresión R26C-CCMV63/129-CP útil para la expresión de VLP recombinantes. Se manipulan genéticamente dos sitios de inserción {Asc\-Not\ y BamHI) en la CP para inserciones de dos péptidos idénticos o diferentes. La figura 6 es una imagen de un gel de SDS-PAGE que muestra la expresión de CCMV CP quimérica en Pseudomonas fluorescens 24 horas después de la inducción. La CP quimérica se manipula genéticamente para que exprese un péptido antigénico de 20 aminoácidos PD 1 . La CP quimérica tiene motilidad más lenta en comparación con la CP de CCMV de tipo silvestre (ts) no manipulada genéticamente. El carril 1 es una escalara de tamaño, el carril 2 es CP de tipo silvestre a las 0 horas después de la inducción, el carril 3 es CP de tipo silvestre 24 horas después de la inducción, el carril 4 es CCMV129-PD1 0 horas después de la inducción y el carril 5 es CCMV129-PD1 24 horas después de la inducción. La figura 7 es una imagen de un Western blot que muestra la expresión de CCMV CP quimérica en Pseudomonas fluorescens. La CP quimérica se manipula genéticamente para que exprese un péptido antigénico de 20 aminoácidos PD1 . La CP quimérica tiene motilidad más lenta en comparación con la CP de CCMV de tipo silvestre (ts) no manipulada genéticamente. El carril 1 es una escalara de tamaño, . el carril 2 es CP de tipo silvestre a las 0 horas después de la inducción, el carril 3 es CP de tipo silvestre 24 horas después de la inducción, el carril 4 es CCMV129-PD 1 0 horas después de la inducción y el carril 5 es CCMV129-PD 1 24 horas después de la inducción. La figura 8 es una imagen de un Western blot de fracciones de gradiente de sacarosa de VLP de CCMV129-PD 1 . Las CP de CCMV quiméricas manipuladas genéticamente para que expresen un péptido antigénico de 20 aminoácidos PD1 se expresan en Pseudomonas fluorescens. Las VLP quiméricas se aislan 24 horas después de la inducción mediante precipitación con PEG y se fraccionan en un gradiente de densidad de sacarosa. Las fracciones de VLP son positivas respecto a CP quimérica. El carril 1 es una fracción de gradiente de VLP de CCMV1 29-PD1 , el carril 2 es una fracción de gradiente de VLP de CCMV129-PD1 , el carril 3 es una fracción de gradiente de VLP de CCMV129-PD1 y el carril 4 es una escalera de tamaño. La figura 9 es una imagen de microscopia electrónica (EM) de VLP de CCMV quiméricas que muestra péptidos antigénicos de 20 aminoácidos PD 1 . Las VLP se aislan a partir de P. fluorescens utilizando precipitación con PEG y fraccionamiento por densidad de sacarosa. La figura 10 es una imagen de un gel de SDS-PAGE que muestra la expresión de CP de CCMV quimérica en Pseudomonas fluorescens 12, 24, y 48 horas después de la inducción. La CP quimérica se manipula genéticamente para que exprese un trímero de péptido antimicrobiano D2A21 separados por sitios de hidrólisis acida. La CP quimérica tiene una motilidad más lenta en comparación con la CP de CCMV de tipo silvestre (ts) no manipulada genéticamente. El carril 1 es una escalera de tamaño, el carril 2 es CP de tipo silvestre 0 horas después de la inducción, el carril 3 es CP de tipo silvestre 12 horas después de la inducción, el carril 4 es CP de tipo silvestre 24 horas después de la inducción, el carril 5 es CP de tipo silvestre 48 horas después de la inducción, el carril 6 es CCMV129-(D2A21 )3 0 horas después de la inducción, el carril 7 es CCMV129-(D2A21 )3 12 horas después de la inducción, el carril 8 es CCMV129-(D2A21 )3 24 horas después de la inducción y el carril 9 es CCMV129-(D2A21 )3 48 horas después de la inducción. La figura 1 1 es una imagen de un Western blot de fracciones gradiente de sacarosa de VLP de CCMV129-(D2A21 )3. Las CP de CCMV quiméricas manipuladas genéticamente para que exprese un trímero de péptido antimicrobiano de 96 aminoácidos D2A21 separados por sitios de hidrólisis acida se expresan en Pseudomonas fluorescens. Las VLP quiméricas se aislan 24 horas después de la inducción mediante precipitación con PEG y se fraccionan en un gradiente de densidad de sacarosa. Las fracciones de VLP son positivas respecto a CP quimérica.

El carril 1 es una escalera de tamaño, los carriles 2-4 son fracciones de gradiente de sacarosa de VLP de CCMV129-(D2A21 )3. La figura 12 es una imagen de microscopia electrónica (EM) de VLP de CCMV quiméricas que muestran un trímero de péptido antimicrobiano D2A21 separados por sitios de hidrólisis acida. Las VLP se aislan a partir de P. fluorescens utilizando precipitación con PEG y fraccionamiento por densidad de sacarosa. La figura 13 es un cromatograma de HPLC que muestra la liberación de de monómeros de péptido AMP D2A21 a partir de VLP quiméricas manipuladas genéticamente para desplegar un trímero de péptido antimicrobiano D2A21 separados por sitios de corte ácido mediante tratamiento con ácido. El pico de péptido AMP no se detecta en VLP no manipuladas genéticamente (vacías). La figura 14 es una gráfica de MALDI-MS que muestra la identidad de monómeros de péptido AMP D2A21 liberados a partir de VLP quiméricas manipuladas genéticamente para desplegar un trímero de péptido antimicrobiano D2A21 separados por sitios de corte ácido mediante tratamiento con ácido. El peso molecular es como se pronosticó para el monómero de péptido D2A21 . La figura 15 es una imagen de un gel de SDS-PAGE que muestra la expresión de CP de CCMV quimérica en Pseudomonas fluorescens 1 2 y 24 horas después de la inducción. La CP quimérica se manipula genéticamente para que exprese cuatro péptido antigénicos diferentes de 25 aminoácidos PA1 , PA2, PA3, y PA4. La CP quimérica tiene una motilidad más lenta en comparación con la CP de CCMV de tipo silvestre (ts) no manipulada genéticamente. El carril 1 es una escalera de tamaño, el carril 2 es CCMV129-PA1 0 horas después de la inducción, el carril 3 es CCMV129-PA1 12 horas después de la inducción, el carril 4 es CCMV129-PA1 24 horas después de la inducción, el carril 5 es CCMV129-PA2 0 horas después de ia inducción, el carril 6 es CCMV129-PA2 12 horas después de la inducción, el carril 7 es CCMV129-PA2 24 horas después de la inducción, el carril 8 es CCMV129-PA3 0 horas después de la inducción, el carril 9 es CCMV129-PA3 12 horas después de la inducción, el carril 10 es CCMV129-PA3 24 horas después de la inducción, el carril 1 1 es CCMV129-PA4 0 horas después de la inducción, el carril 12 es CCMV129-PA4 12 horas después de la inducción, el carril 13 es CCMV129-PA4 24 horas después de la inducción. La figura 16 es una imagen de un Western blot de fracciones de gradiente de sacarosa de VLP de CCMV129-PA1 , CCMV129-PA2, CCMV129-PA3, CCMV129-PA4. Las CP de CCMV quiméricas manipuladas genéticamente para que expresen un péptido antigénico PA de 25 aminoácidos se expresan en Pseudomonas fluorescens. Las VLP quiméricas se aislan 24 horas después de la inducción mediante precipitación con PEG y se fraccionan en un gradiente de densidad de sacarosa. Las fracciones de VLP son positivas respecto a CP quimérica. El carril 1 es una escalera de tamaño, los carriles 2-4 son fracciones de gradiente de sacarosa de VLP de CCMV129-PA1 , los carriles 5-7 son fracciones de gradiente de sacarosa de VLP de CCMV129-PA2; los carriles 8-10 son fracciones de gradiente de sacarosa de VLP de CCMV129-PA3 y los carriles 1 1 -13 son fracciones de gradiente de sacarosa de VLP de CCMV129-PA4. La figura 17 es una imagen de un SDS-PAGE que muestra la expresión de CP de CCMV quimérica en Pseudomonas fluorescens. La CCMV63-CP quimérica se manipula genéticamente para que exprese un péptido antimicrobiano de 20 aminoácidos PBF20 separados por sitios de hidrólisis acida. La CP quimérica tiene una motilldad más lenta en comparación con la CP de CCMV de tipo silvestre (ts) no manipulada genéticamente. El carril 1 es una escalera de tamaño,- el carril 2 es CP de tipo silvestre 0 horas después de la inducción, el carril 3 es CP de tipo silvestre 24 horas después de la inducción, el carril 4 es CCMV63-PBF20 0 horas después de la inducción, el carril 5 es CCMV63-PBF20 24 horas después de la inducción. La figura 1 8 es una imagen de microscopia electrónica (EM) de VLP de CCMV quiméricas obtenidas a partir de CCMV63-CP y que muestra un péptido antimicrobiano de 20 aminoácidos a PBF20 separados por sitios de hidrólisis acida. Las VLP quiméricas se aislan a partir de P. fluorescens utilizando precipitación con PEG y fraccionamiento por densidad de sacarosa. La figura 19 es una imagen de un SDS-PAGE que muestra la expresión de CP de CCMV quimérica en Pseudomonas fluorescens. La CCMV129-CP quimérica se manipula genéticamente para que exprese un péptido antimicrobiano de 20 aminoácidos PBF20 separados por sitios de hidrólisis acida. El carril 1 es una escalera de tamaño, el carril 2 es CCMV129-PBF20 0 horas después de la inducción y el carril 3 es CCMV129-PBF20 24 horas después de la inducción. La figura 20 es una imagen de microscopia electrónica (EM) de VLP de CCMV quiméricas obtenidas a partir de CCMV129-CP y que muestran un péptido antimicrobiano de 20 aminoácidos PBF20 separados por sitios de hidrólisis acida. Las VLP quiméricas se aislan a partir de P. fluorescens utilizando precipitación con PEG y fraccionamiento por densidad de sacarosa. La figura 21 es una imagen de un SDS-PAGE que muestra la expresión de CP de CCMV quimérica en Pseudomonas fluorescens. La CCMV63/129-CP quimérica se manipula genéticamente para que exprese un péptido antimicrobiano de 20 aminoácidos PBF20 separado por sitios de hidrólisis acida en dos sitios de inserción diferentes en la CP (63 y 129). La CP quimérica que contiene un doble inserto (CP + 2x20 AA) tiene motilidad más lenta en el gel de SDS-PAGE en comparación con la cápside manipulada genéticamente para que exprese un solo inserto (CP + 1 x20 AA) del mismo péptido. El carril 1 es una escalera de tamaño, el carril 2 es CCMV63-PBF20 0 horas después de la inducción, el carril 3 es CCMV63-PBF20 24 horas después de la inducción, el carril 4 es CCMV63/129-2x (PBF20) 0 horas después de la inducción, el carril 5 es CCMV63/129-2x (PBF20) 24 horas después de la inducción, el carril 6 es CCMV63/129-2x (PBF20) 0 horas después de la inducción, el carril 7 es CCMV63/129-2x (PBF20) 24 horas después de la inducción, el carril 8 es CCMV63/129-2x (PBF20) 0 horas después de la inducción, el carril 9 es CCMV63/129-2x (PBF20) 24 horas después de la inducción. La figura 22 es una imagen de microscopia electrónica (EM) de VLP de CCMV quiméricas obtenidas a partir de CCMV63/129-CP que muestra un péptido antimicrobiano de 20 aminoácidos PBF20 separado por sitios de hidrólisis acida en dos sitios de inserción por cápside (63 y 129). Las VLP quiméricas se aislan a partir de P. fluorescens utilizando precipitación con PEG y fraccionamiento por densidad de sacarosa.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención provee un procedimiento para la expresión en bacterias de péptidos de fusión que comprende una cápside viral icosaédrica y un péptido recombinante de interés. El término "péptido" tal como se utiliza en la presente invención no queda limitado a ningún peso molecular particular, y también puede incluir proteínas o polipéptidos. La presente invención también provee células bacterianas y construcciones de ácido nucleico para uso en el procedimiento. Específicamente, la invención provee organismos del género Pseudomonas con construcción de ácido nucleico que codifica para un péptido de fusión de una cápside icosaédrica y un péptido recombinante. En una modalidad específica de la presente invención, la célula pseudomonádida es Pseudomonas fluorescens. En una modalidad la célula produce partículas tipo virus o estructuras de jaula solubles. La invención también provee construcciones de ácido nucleico que codifican para el péptido de fusión de una cápside icosaédrica y un péptido recombinante, el cual puede ser, en una modalidad, un péptido terapéutico útil para tratamientos en humanos y animales. La invención también provee un procedimiento para producir un péptido recombinante en una célula pseudomonádida suministrando: un ácido nucleico que codifica para un péptido de fusión de un péptido recombinante y una cápside icosaédrica; expresar el ácido nucleico en la célula de organismo del género Pseudomonas, en el cual la expresión en la célula provee el ensamblaje in vivo del péptido de fusión como partículas tipo virus; y aislar las partículas tipo virus.

I. Células pseudomonádidas recombinantes La presente invención provee células de organismos del género Pseudomonas que incluyen una construcción de ácido nucleico que codifica para un péptido de fusión de una cápside icosaédrica y un péptido recombinante. Las células se pueden utilizar en un procedimiento para producir péptidos recombinantes.

Cápside virales En una modalidad, la invención provee células de organismos del género Pseudomonas para uso en un procedimiento para producir péptidos mediante expresión del péptido fusionado a una cápside viral ¡cosaédrica. La expresión típicamente da como resultado por lo menos una partícula tipo virus (VLP por sus siglas en inglés) en la célula. Los virus se pueden clasificar en aquellos que tienen simetría helicoidal o aquellos con simetría icosaédrica. Las morfologías de cápside generalmente reconocidas incluyen: icosaédrica (incluyendo icosaédrica propiamente dicha, isométrica, quasi-isométrica, y geminada o "hermanada"), poliédrica (incluyendo esférica, ovoide, y con forma de limón), baciliforme (incluyendo con forma de varilla o con forma de bala, y fusiforme o con forma de habano), y helicoidal (Incluyendo en forma de varilla, cilindrico, y filamentoso); cualquiera de los cuales puede tener cola y/o puede contener proyecciones de superficie, tales como espigas o protuberancias con terminación globular (knobs).

Morfología En una modalidad de la invención, la secuencia de aminoácido de la cápsidé se selecciona a partir de las cápsides de virus clasificados como de morfología icosaédrica. En una modalidad, la secuencia de aminoácido de la cápside se selecciona a partir de las cápsides de entidades que son icosaédricas propiamente dichas. En otra modalidad, la secuencia de aminoácido de la cápside se selecciona a partir de las cápsides de virus icosaédricos. En una modalidad particular, la secuencia de aminoácido de la cápside se selecciona a partir de las cápsides de virus icosaédricos de plantas. Sin embargo, en otra modalidad, la cápside viral se obtiene a partir de un virus icosaédrico no infeccioso para las plantas. Por ejemplo, en una modalidad, el virus es un virus infeccioso para mamíferos. En términos generales, las cápsides virales de virus icosaédricos están constituidas por numerosas subunidades de proteína ordenadas en simetría icosaédrica (cúbica). Las cápsides icosaédricas originales se pueden construir, por ejemplo, con 3 subunidades que forman cada cara triangular de una cápside, lo que da como resultado que 60 subunidades formen una cápside completa. Un representante de esta estructura viral pequeña es, por ejemplo, el bacteriófago fX174. Muchas cápsides de virus icosaédricos contienen más de 60 subunidades. Muchas cápsides de virus icosaédricos contienen un motivo de pliegue de barril ß de ocho cadenas, antl-paralelo. El motivo tiene un bloque con forma de cuña con cuatro cadenzas beta (designado BIDG) en un lado y cuatro (designado CHEF) en el otro. También están presentes dos hélices alfa conservadas (designadas A y B), una está entre betaC y betaD, y la otra está entre betaE y betaF. Los virus con envoltura pueden salir de una célula infectada sin que se destruya totalmente por la extrusión (gemación) de la partícula a través de la membrana, durante la cual la partícula queda envuelta en una envoltura lipídica derivada de la membrana de la célula (Véase, por ejemplo: AJ Cann (ed.) (2001 ) Principies of Molecular Virology (Academic Press); A Granoff y RG Webster (eds.) (1 999) Encyclopedia of Virology (Academic Press); DLD Caspar (1980) Biophys. J. 32: 103; DLD Caspar y A Klug (1962) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 27: 1 ; J Grimes eí al. (1 988) Nature 395:470; JE Johnson (1 996) Proc. Nati Acad. Sci. USA 93:27; y J Johnson y J Speir (1997) J. Mol. Biol. 269:665).

Virus Las taxonomías virales reconocen los siguientes taxones de entidades de partícula encapsidada: Virus del Grupo I, es decir los virus de dsADN; Virus del Grupo II, es decir los virus de ssADN; Virus del Grupo l l l , es decir los virus dsARN; Virus del Grupo IV, es decir los virus de cadena positiva de ssARN (+) sin etapa de ADN; Virus del Grupo V, es decir virus de ssARN de cadena (-); Virus del Grupo VI, es decir virus de ARN retroides, los cuales son virus que transcriben ssARN inverso; Virus Grupo Vi l , es decir virus de ADN retroides, los cuales son virus que transcriben dsADN inverso; Deltavirus; Viroides; y Fagos satélite y virus satélite, excluyendo los ácidos nucleicos y priones satélite.

Los miembros de estos taxones son bien conocidos para el experto en la técnica y son revisados en: H. V. Van Regenmortel ef al. (eds.), Virus Taxonomy: Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses (2000) (Academic Press/Elsevier, Burlington Mass. , USA); la página electrónica en la red sobre Taxonomía Viral del Departamento de Microbiología e Inmunología de la Universidad de Leicester (RU) en http://wwwmicro.msb.le.ac. uk/3035/Virusgroups.html; y las secciones en línea "Virus" y "Viroid" del navegador de Taxonomía del Centro Nacional para Información sobre Biotecnología (NCBI por sus siglas en inglés) de la Biblioteca Nacional de Medicina de los Institutos Nacionales de Salud del Departamento Norteamericano de Servicios Humanos y para la Salud (Washington, D.C. , E.U.A.) en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/tax.html. La secuencia de aminoácido de la cápside se puede seleccionar a partir de las cápsides de cualesquiera miembros de cualquiera de estos taxones. Las secuencias de aminoácido para las cápsides de los miembros de estos taxones se pueden a obtener a partir de fuentes, incluyendo, pero sin limitarse a, por ejemplo: las secciones en línea "Nucleótido" (Genbank), "Proteína", y "Estructura" de los recursos de búsqueda PubMed ofrecidos por el NCBI en http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi. En una modalidad, la secuencia de aminoácido de la cápside se pueden seleccionar a partir de los miembros de los tazones que sean específicos para por lo menos uno de los siguientes hospederos: hongos incluyendo levaduras, plantas, protistas incluyendo algas, animales invertebrados, animales vertebrados, y humanos. En una modalidad, la secuencia de aminoácido de la cápside se puede seleccionar a partir de miembros de cualquiera de los siguientes taxones: Grupo I, Grupo II, Grupo ll l, Grupo IV, Grupo V, Grupo Vi l , Viroides, y Virus Satélite. En una modalidad, la secuencia de aminoácido de la cápside se puede seleccionar a partir de miembros de cualquiera de estos siete taxones que sean específicos para por lo menos uno de los seis tipos de hospedero descritos anteriormente. En una modalidad más específica, la secuencia de aminoácido de la cápside se puede seleccionar a partir de miembros de cualquiera del Grupo I I , Grupo l l l , Grupo IV, Grupo Vi l, y Virus Satélite; o a partir de cualquiera del Grupo I I , Grupo IV, Grupo Vi l , y Virus Satélite. En otra modalidad, la cápside viral se selecciona a partir del Grupo IV o Grupo Vi l. La secuencia de la cápside viral se puede obtener a partir de un virus no trópico para la célula. En una modalidad, la célula no incluye proteínas virales provenientes del virus particular seleccionado diferentes a las de las cápsides icosaédricas deseadas. En una modalidad, la cápside viral se obtiene a partir de un virus con un tropismo hacia una familia diferente de organismos que el de la célula. En otra modalidad, la cápside viral se obtiene a partir de un virus con un tropismo hacia un género diferente de organismos que el de la célula.

En otra modalidad, la cápside viral se obtiene a partir de un virus con un tropismo hacia una especie diferente de organismos que el de la célula. En una modalidad específica, la cápside viral se selecciona a partir de un virus del Grupo IV.

En una modalidad, la cápside viral se selecciona a partir de un virus icosaédrico. El virus icosaédrico se puede seleccionar a partir de un miembro de cualquiera de los virus Papillomaviridae, Totiviridae, Dicistroviridae, Hepadnaviridae, Togaviridiae, Polyomaviridiae, Nodaviridae, Tectiviridae, Leviviridae, Microviridae, Sipoviridae, Nodaviridae, Picornoviridae, Parvoviridae, Calciviridae, Tetraviridae, y virus satélite. En una modalidad particular, la secuencia se puede seleccionar a partir de miembros de cualquiera de los taxones que sean específicos para por lo menos un hospedero vegetal. En una modalidad la especie de virus icosaédrico de plantas puede ser una especie de virus infeccioso para la planta que sea o es un miembro de cualquiera de los taxones Bunyaviridae, Reoviridae, Rhabdoviridae, Luteovirídae, Nanoviridae, Partitiviridae, Sequiviridae, Tymoviridae, Ourmiavirus, Virus Satélite de la necrosis del tabaco, Caulimoviridae, Geminiviridae, Comoviridae, Sobemovirus, Tombusviridae, o Bromoviridae. En una modalidad, la especie de virus icosaédrico de plantas es una especie de virus infeccioso para la planta que sea o es un miembro de cualquiera de los taxones Luteoviridae, Nanoviridae, Partitiviridae, Sequiviridae, Tymoviridae, Ourmiavirus, Virus Satélite de la necrosis del tabaco, Caulimoviridae, Geminiviridae, Comoviridae, Sobemovirus, Tombusviridae, o Bromoviridae. En modalidades específicas, la especie de virus icosaédrico de plantas es una especie de virus infeccioso para la planta que sea o es un miembro de cualquiera de los taxones Caulimoviridae, Geminiviridae, Comoviridae, Sobemovirus, Tombusviridae, o Bromoviridae. En modalidades más particulares, la especie de virus icosaédrico de plantas puede ser una especie de virus infeccioso para la planta que sea o es un miembro de cualquiera de los Comoviridae, Sobemovirus, Tombusviridae, o Bromoviridae. En modalidades más particulares, la especie de virus icosaédrico de plantas puede ser una especie de virus infeccioso para la planta que sea un miembro de la familia Comoviridae o Bromoviridae. En una modalidad particular la cápside viral se obtiene a partir de un Virus del Mosaico del Garbanzo o un Virus del Moteado Clorótico del Garbanzo. En otra modalidad, la cápside viral se obtiene a partir de una especie del taxón Bromoviridae. En una modalidad específica, la cápside se obtiene a partir de un llarvirus o un Alfamovirus. En una modalidad más específica, la cápside se obtiene a partir de un virus de la lista del tabaco, o un virus del mosaico de la alfalfa (AMV) (incluyendo AMV 1 o AMV 2).

VLP La cápside viral icosaédrica de la invención no tiene capacidad de infección en las células hospederas descritas. En una modalidad, se forma una partícula tipo virus (VLP) o estructura de jaula en la célula hospedera durante o después de la expresión de la cápside viral. En una modalidad, la VLP o estructura de jaula también incluye al péptido de interés, y en una modalidad particular, el péptido de interés se expresa sobre la superficie de la VLP. El sistema de expresión típicamente no contiene proteínas virales adicionales que permitan la capacidad de infección del virus. En una modalidad típica, el sistema de expresión ¡ncluye una célula hospedera y un vector que codifica para una o más cápsides virales y un péptido de interés ligado en forma operable. El vector típicamente no incluye proteínas de ensamblado viral adicionales. La invención se deriva del descubrimiento que las cápsides virales se forman en un grado mayor en ciertas células hospederas y permiten la recuperación más eficiente de péptído recombinante. En una modalidad, la VLP o estructura de jaula es un ensamble multimérico de cápsides, incluyendo desde tres hasta 200 cápsides aproximadamente. En una modalidad, la VLP o estructura de jaula incluye por lo menos 30, por lo menos 50, por lo menos 60, por lo menos 90 o por lo menos 120 cápsides. En otra modalidad, cada VLP o estructura de jaula ¡ncluye por lo menos 150 cápsides, por lo menos 160, por lo menos 170, o por lo menos 1 80 cápsides. En una modalidad, la VLP se expresa como una estructura ¡cosaédrica. En otra modalidad, la VLP se expresa en la misma geometría que la del virus original a partir del cual se obtiene la secuencia de cápside. Sin embargo, en una modalidad separada, la VLP no tiene la geometría idéntica del virus original. Por ejemplo, en algunas modalidades, la estructura se produce en una partícula formada a partir de cápsides múltiples pero que no forma una VLP de tipo original. Por ejemplo, se puede formar una estructura de jaula que tenga 3 cápsides virales. En modalidades separadas, se puede formar estructuras de jaula de 6, 9, 12, 15, 18, 21 , 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51 , 54, 57, o 60 cápsides aproximadamente.

En una modalidad, por lo menos una de las cápsides incluye por lo menos un péptido de interés. En una modalidad, el péptido se expresa dentro de por lo menos un bucle interno, o por lo menos en un bucle de superficie externo de la VLP. Se puede modificar más de un bucle de la cápside viral. En una modalidad particular, el péptido recombinante se expresa en por lo menos dos bucles de superficie de la partícula tipo virus icosaédrico. En otra modalidad, por lo menos dos péptidos diferentes están insertados en por lo menos dos bucles de superficie de la cápside viral, jaula o partícula tipo virus. En otra modalidad, por lo menos tres péptidos recombinantes están insertados en por lo menos tres bucles de superficie de la partícula tipo virus. Los péptidos recombinantes en los bucles de superficie pueden tener la misma secuencia de aminoácido. En modalidades separadas, difiere la secuencia de aminoácido de los péptidos recombinantes en los bucles de superficie. En algunas modalidades, se puede modificar la célula hospedera para mejorar el ensamblado de la VLP. Por ejemplo, la célula hospedera se puede modificar para que incluya proteínas chaperonas que promuevan la formación de las VLP a partir de las cápsides virales expresadas. En otra modalidad, la célula hospedera se modifica para que incluya una proteína represora para regular de manera más eficiente la expresión de la cápside para promover la formación regulada de las VLP. La secuencia de ácido nucleico que codifica para la cápside o proteínas virales también se pueden modificar adicionalmente para alterar la formación de las VLP (véase por ejemplo Brumfield, et al. (2004) J. Gen. Virol. 85: 1 049-1 053). Por ejemplo, de manera más típica se generan tres clases generales de modificación para modificar la expresión y ensamblado de la VLP. Estas modificaciones están diseñadas para alterar el interior, exterior o la interfaz entre subunidades adyacentes en la jaula proteica ensamblada. Para lograr esto se pueden utilizar iniciadores mutagénicos para: (i) alterar la carga de superficie interior de la región de unión a ácido nucleico viral remplazando los residuos con carácter básico (por ejemplo K, R) en el extremo N-terminal con ácidos glutámicos de carácter ácido (Douglas et al. , 2002b); (ii) suprimir los residuos interiores del extremo N-terminal (en CCMV, normalmente los residuos 4-37); (iii) insertar un ADNc que codifique para una secuencia para elección de célula como blanco peptídica de 1 1 aminoácidos (Graf et al. , 1987) en un bucle de superficie expuesto; y (iv) modificar las interacciones entre subunidades virales alterando los sitios de unión a metal (en CCMV, residuos 81 /148 mutantes).

Péptidos recombinantes Tamaño En una modalidad, los péptidos ligados en forma operable a una secuencia de la cápside viral contienen por lo menos dos aminoácidos. En otra modalidad, los péptidos son de por lo menos tres, por lo menos cuatro, por lo menos cinco, o por lo menos seis aminoácidos de longitud. En una modalidad separada, los péptidos son de por lo menos siete aminoácidos de largo, los péptidos también pueden ser de por lo menos ocho, por lo menos nueve, por lo menos diez, por lo menos 1 1 , 12, 1 3, 14, 15, 1 6, 1 7, 18, 19, 20, 30, 45, 50, 60, 65, 75, 85, 95, 96, 99 o más aminoácidos de largo. En una modalidad, los péptidos codificados son de por lo menos 25kD. En una modalidad, el péptido puede contener desde 2 hasta 300 aminoácidos aproximadamente, o desde 5 aproximadamente hasta 250 aminoácidos aproximadamente, o desde 5 aproximadamente hasta 200 aminoácidos aproximadamente, o desde 5 aproximadamente hasta 150 aminoácidos aproximadamente, o desde 5 aproximadamente hasta 100 aminoácidos aproximadamente. En otra modalidad, el péptido contiene desde 10 aproximadamente hasta 140 aminoácidos aproximadamente, o desde 10 aproximadamente hasta 120 aminoácidos aproximadamente, o desde 10 aproximadamente hasta 100 aminoácidos aproximadamente. En una modalidad, los péptidos o proteínas ligados en forma operable a una secuencia de la cápside viral pueden contener 500 aminoácidos aproximadamente. En una modalidad, el péptido puede contener menos de 500 aminoácidos. En otra modalidad, el péptido puede contener hasta 300 aminoácidos aproximadamente, o hasta 250 aproximadamente, o hasta 200 aproximadamente, o hasta 1 80 aproximadamente, o hasta 160 aproximadamente, o hasta 150 aproximadamente, o hasta 140 aproximadamente, o hasta 120 aproximadamente, o hasta 1 10 aproximadamente, o hasta 100 aproximadamente, o hasta 90 aproximadamente, o hasta 80 aproximadamente, o hasta 70 aproximadamente, o hasta 60 aproximadamente, o hasta 50 aproximadamente, o hasta 40 aproximadamente o hasta 30 aminoácidos aproximadamente. En una modalidad, el péptido recombinante fusionado a la cápside icosaédrica es de por lo menos 7, por lo menos 8, por lo menos, 9, por lo menos 10, por lo menos 12, por lo menos 15, por lo menos 20, por lo menos 25, por lo menos 30, por lo menos 35, por lo menos 40, por lo menos 45, por lo menos 50, por lo menos 55, por lo menos 60, por lo menos 65, por lo menos 75, por lo menos 85, por lo menos 95, por lo menos 99, o por lo menos 1 00 aminoácidos. En una modalidad de la presente invención, el péptido recombinante contiene por lo menos un monómero de un péptido objetivo deseado. En una modalidad alternativa, el péptido recombinante contiene más de un monómero de un péptido objetivo deseado. En algunas modalidades, el péptido está constituido de por lo menos dos, por lo menos 5, por lo menos 10, por lo menos 15 o por lo menos 20 monómeros separados que están ligados en forma operable como un péptido concatamérico a la cápside. En otra modalidad, los monómeros individuales en el péptido concatamérico están ligados mediante regiones enlazadoras susceptibles de corte. Incluso en otra modalidad, el péptido recombinante está insertado en por lo menos un bucle de superficie de la partícula tipo virus ¡cosaédrico. En una modalidad, está insertado por lo menos un monómero en un bucle de superficie de la partícula tipo virus.

Clasificación Los péptidos de interés que están fusionados a las cápsides virales pueden ser una proteína heteróloga que no se derive del virus y, opcionalmente, que no se obtenga a partir de la misma especie que la de la célula. Los péptidos de interés que están fusionados a las cápsides virales pueden ser péptidos funcionales; péptidos estructurales; péptidos antigénicos, péptidos tóxicos, péptidos anti-microbianos, fragmentos de los mismos; precursores de los mismos; combinaciones de cualquiera de los anteriores; y/o concatámeros de cualquiera de los anteriores. En una modalidad de la presente invención, el péptido recombinante es un péptido terapéutico útil para tratamientos en humanos y animales. Los péptidos funcionales incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo: péptidos bio-activos (es decir péptidos que ejercen, inducen, o de alguna otra manera dan como resultado la iniciación, incremento, prolongación, atenuación, terminación o prevención de una función o actividad biológica en o de una entidad biológica, por ejemplo, un organismo, célula, cultivo, tejido, órgano, u organelo); péptidos catalíticos; péptidos activos de microestructura y de nanoestructura (es decir péptidos que forman parte de microestructuras o nanoestructuras diseñadas en las cuales, o en conjunto con las cuales, éstos desempeñan una actividad, por ejemplo, movimiento, transducción de energía); y péptidos estimulantes (por ejemplo, saborizantes, colorantes, odorantes, feromonas, atrayentes, disuasorios, y repelentes peptídicos). Los péptidos bio-activqs incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo: péptidos inmuno-activos (por ejemplo, péptidos antigénicos, péptidos alergénicos, inmuno-reguladores peptídicos, inmuno- moduladores peptídicos); péptidos para señalización y para transducción de señal (por ejemplo, hormonas peptídicas, citocinas, y neurotransmisores; receptores; péptidos agonistas y antagonistas; péptidos para señal de selección de péptido como blanco y secreción de péptido); y péptidos bio-inhibidores (por ejemplo, péptidos tóxicos, biocidas, o biostáticos, tales como toxinas peptídicas y péptidos antimicrobianos). Los péptidos estructurales incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo: aptámeros peptídicos; péptidos para plegamiento (por ejemplo, péptidos que promuevan o induzcan la formación o retención de una conformación física en otra molécula); péptidos promotores de adhesión (por ejemplo, péptidos adhesivos, péptidos promotores de adhesión a célula); péptidos interfaciales (por ejemplo, tensoactivos y emulsificantes peptídicos); péptidos arquitectónicos de microestructura y nanoestructura (es decir péptidos estructurales que forman parte de microestructuras o nanoestructuras diseñadas); y péptidos de preactivación (por ejemplo, péptidos líder de pre-proteínas, pro-proteínas, y pre-pro-proteínas y pre-péptidos, pro-péptidos, y pre-pro-péptidos; inteínas). Los péptidos catalíticos incluyen, por ejemplo, péptidos de citidina desaminasa que editan ARN de apo B; péptidos catalíticos de glutaminil-ARNt sintetasas; péptidos catalíticos de aspartato transcarbamoilasas; péptidosm inactivadores de ribosoma tipo 1 de plantas; péptidos catalíticos virales tales como, por ejemplo, péptido catalítico del virus de la enfermedad de pies y boca [FMDV-2A]; péptidos de metaloproteinasa de matriz; y metalo-oligopéptidos catalíticos. El péptido también puede ser epítopes, haptenos peptídicos, o péptidos relacionados (por ejemplo, péptidos virales antigénicos; péptidos relacionados con virus, por ejemplo, péptidos relacionados con VIH, péptidos relacionados con hepatitis; dominios idiotípicos de anticuerpo; péptidos de superficie celular; péptidos antigénicos de humano, animal, protista, planta, fúngico, bacteriano, y/o péptidos de Archaea-, péptidos alergénicos y péptidos des-sensibilizadores a alérgeno). El péptido también puede ser un inmuno-regulador o inmuno-modulador peptídico (por ejemplo, interferones, interleucinas, inmuno-depresores e inmuno-potenciadores peptídicos); péptidos de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos de cadena sencilla; fragmentos y construcciones de anticuerpo de cadena individual, por ejemplo, moléculas Fv de cadena individual; moléculas de cadena ligera de anticuerpo, moléculas de cadena pesada de anticuerpo, moléculas de cadena ligera o pesada de anticuerpo con dominio suprimido; dominios y moléculas de anticuerpo de cadena individual, por ejemplo, un dominio CH 1 , CH 1 -3, CH3, CH 1 -4, CH4, VHCH 1 , CL, CDR1 , or FR1 -CDR1 -FR2; péptidos paratópicos; micro-anticuerpos); otro péptido de unión (por ejemplo, aptámeros peptídicos, proteínas de receptor de superficie celular e intracelulares, fragmentos de receptor; péptidos anti-factor de necrosis tumoral).

El péptido también pude ser un péptido de substrato de enzima o un péptido ¡nhibidor de enzima (por ejemplo, substratos e inhibidores de caspasa, substratos e inhibidores de proteína cinasa, substratos de enzima de péptido de transferencia de energía- resonancia-fluorescencia). El péptido también puede ser un ligando, agonista y antagonista del péptido del receptor de superficie celular (por ejemplo, ceruleínas, dinorfinas, orexinas, péptidos activadores de adenilato ciclasa de la pituitaria, péptidos del factor de necrosis tumoral; synthetic peptide ligandos, agonistas, y antagonista de péptido sintético); una hormona peptídica (por ejemplo, hormonas endocrinas, paracrinas, y autocrinas, incluyendo, por ejemplo: amilinas, angiotensinas, bradiquininas, calcitoninas, neuropéptidos cardioexcitadores, casomorfinas, colecistocininas, corticotropinas y péptidos relacionados con corticotropina, factores de diferenciación, endorfinas, endotelinas, encefalinas, eritropoyetinas, exendinas, hormonas estimuladoras de folículo, galaninas, gastrinas, glucagones y péptidos tipo glucagon, gonadotropinas, hormonas del crecimiento y factores de crecimiento, insulinas, calidinas, cininas, leptinas, hormonas lipotrópicas, hormonas luteinizantes, hormonas estimuladoras de melanocito, melatoninas, péptidos natriuréticos, neurocininas, neuromedinas, nociceptinas, osteocalcinas, oxitocinas (es decir ocitocinas), hormonas paratiroideas, pleyotrofinas, prolactinas, relaxinas, secretinas, serotoninas, péptidos inductores de sueño, somatomedinas, timopoyetinas, hormonas estimuladoras de la tiroides, tirotropinas, urotensinas, péptidos vasoactivos intestinales, vasopresinas); una citocina, quimiocina, virocina peptídica, y péptido liberador eihibidor de liberación de hormona del viroceptor (por ejemplo, hormonas liberadoras de corticotropina, cortistatinas, factores liberadoras de la hormona estimulante de folículo, péptidos inhibidores gástricos, péptidos libradores de gastrina, hormonas liberadoras de gonadotropina, hormonas liberadoras de la hormona del crecimiento, hormonas liberadoras de la hormona luteinizante, hormonas liberadoras de melanotropina, factores inhibidores de la liberación de melanotropina; nocistatinas, pancreastatinas, péptidos liberadores de prolactina, factores inhibidores de la liberación de prolactina; somatostatinas; hormonas liberadoras de tirotropina); un neurotransmisor o bloqueador de canal peptídico (por ejemplo, bombesinas, neuropéptido Y, neurotensinas, sustancia P), una toxina peptídica, péptido precursor de toxina, o porción de péptido de toxina. En algunas modalidades, una toxina peptídica no contiene D-aminoácidos. Los péptidos precursores de toxina pueden ser aquellos que no contienen D-aminoácidos y/o que no han sido convertidos mediante modificación post-traducción en una estructura de toxina original, tal como, por ejemplo, mediante acción de un agente inductor de configuración D (por ejemplo, una péptido isomerasa(s) o péptido epimerasa(s) o péptido racemasa(s) o péptido transaminasa(s)) que puedan introducir una configuración D en un aminoácido(s), y/o mediante acción de un agente de ciclación (por ejemplo, una péptido tioesterasa, o una péptido ligasa tal como una proteína de trans-empalme o inteína) que pueda formar una estructura de péptido cíclico. Las porciones de péptido de toxina pueden ser porciones de oligopéptido y polipéptido lineales o precicladas de toxinas que contienen péptido. Los ejemplos de toxinas peptídicas incluyen, por ejemplo, agatoxinas, amatoxinas, caribdotoxinas, clorotoxinas, conotoxinas, dendrotoxinas, insectotoxinas, margatoxinas, péptidos desgranuladores de mastocito, saporinas, sarafotoxinas; y exotoxinas bacterianas tales como, por ejemplo, toxinas del ántrax, toxinas del botulismo, toxinas de difteria, y toxinas del tétanos. El péptido también puede ser un péptido relacionado con el metabolismo y la digestión (por ejemplo, péptidos de colequistocinina-pancreozimina, péptido yy, péptidos pancreáticos, motilinas); un péptido modulador o mediador de adhesión celular, péptido de matriz extracelular (por ejemplo, adhesinas, selectinas, lamininas); un péptido neuroprotector o promotor de mielinización; un péptido inhibidor de agregación (por ejemplo, péptidos inhibidores de agregación celular o plaquetaria, péptidos inhibidores de la formación o deposición de amiloide); un péptido de unión (por ejemplo, neuropéptidos de unión cardiovascular, péptidos de unión a iga); o un péptido variado (por ejemplo, péptidos relacionados con agutí, péptidos amiloides, péptidos relacionados con hueso, péptidos permeables de célula, conantocinas, contrifanos, contulacinas, proteína básica de mielina, y otros). En algunas modalidades, el péptido de interés es exógeno con respecto a la cápside viral seleccionada. Los péptidos pueden ser de secuencia original o sintética (y sus secuencias codificadoras pueden ser secuencias de nucleótido originales o sintéticas). Por lo tanto, por ejemplo, quedan abarcadas secuencias de aminoácidos originales, originales modificadas, y completamente artificiales. Del mismo modo, las secuencias de las moléculas de ácido nucleico que codifica para estas secuencias de aminoácido pueden ser secuencias de ácido nucleico originales, originales modificadas, o completamente artificiales, y pueden ser el resultado de, por ejemplo, una o más mutaciones racionales o aleatorias y/o de los procedimientos de recombinación y/o síntesis y/o selección utilizados (es decir aplicados por una agencia humana) para obtener las moléculas de ácido nucleico. La secuencia codificadora puede ser una secuencia codificadora original para el péptido objetivo, si estuviera disponible, pero típicamente puede ser una secuencia codificadora que ha sido seleccionada, mejorada, u optimizada para uso en la célula hospedera de expresión seleccionada: por ejemplo, sintetizando el gen para reflejar la preferencia de uso de codón de una especie hospedera. En una modalidad de la invención, la especie hospedera es P. fluorescens, y se toma en consideración la preferencia de codón de P. fluorescens cuando se diseña tanto la secuencia de señal como la secuencia del péptido.

Péptidos antigénicos (epítopes peptídicos) En una modalidad, se produce un péptido antigénico a través de la expresión con una cápside viral. El péptido antigénico se puede seleccionar a partir de aquellos que sean péptidos antigénicos de agentes patógenos para humanos o animales, incluyendo agentes infecciosos, parásitos, células de cáncer, y otros agentes patógenos. Dichos agentes patógenos también incluyen los factores de virulencia y los factores de patogénesis, por ejemplo, exotoxinas, endotoxinas, et al. , de dichos agentes. Los agentes patógenos pueden presentar cualquier nivel de virulencia, es decir estos pueden ser, por ejemplo, virulentos, avirulentos, pseudo-virulentos, semi-virulentos, etc. En una modalidad, el péptido antigénico puede contener una secuencia de aminoácido epitópica proveniente del agente o agentes patógenos. En una modalidad, la secuencia de aminoácido epitópica puede incluir aquella de por lo menos una porción de un péptido de superficie de por lo menos uno de dichos agentes. En una modalidad, las partículas tipo virus de péptido recombinante-cápside se pueden utilizar como una vacuna en una aplicación en humanos o animales. Se puede seleccionar más de un péptido antigénico, en cuyo caso las partículas tipo virus resultantes pueden presentar péptidos antigénicos múltiples diferentes. En una modalidad particular de un formato de péptido antigénico múltiple, los diversos péptidos antigénicos se puede seleccionar todos a partir de una pluralidad de epítopes provenientes del mismo agente patógeno. En una modalidad particular de un formato de péptido multi-antigénico, los diversos péptidos antigénicos seleccionados se pueden seleccionar todos a partir de una pluralidad de agentes patógenos cercanamente relacionados, por ejemplo, cepas, subespecies, variedades biológicas, variedades patológicas, variedades séricas, o variedades genéticas diferentes de la misma especie o de especies diferentes del mismo género.

En una modalidad, el o los agentes patógenos pertenecen por lo menos a uno de los siguientes grupos: agentes provenientes de Bacteria y Mycoplasma incluyendo, pero sin limitarse a, patógenos: Bacillus spp. , por ejemplo, Bacillus anthracis; Bartonella spp., por ejemplo, B. quintana; Brucella spp.; Burkholderia spp. , por ejemplo, B. pseudomallei; Campylobacter spp.; Clostridium spp. , por ejemplo, C. tetani, C. botulinum; Coxiella spp. , por ejemplo, C. burnetii; Edwardsiella spp. , por ejemplo, E. tarda; Enterobacter spp. , por ejemplo, E. cloacae; Enterococcus spp. , por ejemplo, E. faecalis, E. faecium; Escherichia spp. , por ejemplo, E. coli; Francisella spp. , por ejemplo, F. tularensis; Haemophilus spp. , por ejemplo, H. influenzae; Klebsiella spp., por ejemplo, K. pneumoniae; Legionella spp.; Listeria spp. , por ejemplo, L. monocytogenes; Meningococos y Gonococos, por ejemplo, Neisseria spp.; Moraxella spp.; Mycobacterium spp. , por ejemplo, M. leprae, M. tuberculosis; Pneumococos, por ejemplo, Diplococcus pneumoniae; Pseudomonas spp. , por ejemplo, P. aeruginosa; Rickettsia spp. , por ejemplo, R. prowazekii, R. rickettsii, R. typhi; Salmonella spp. , por ejemplo, S. typhi; Staphylococcus spp., por ejemplo, S. aureus; Streptococcus spp. , incluyendo estreptococos del grupo A y estreptococos hemolíticos, por ejemplo, S. pneumoniae, S. pyogenes; Streptomyces spp.; Shigella spp. ; Vibrio spp. , por ejemplo, V. cholerae; y Yersinia spp. , por ejemplo, Y. pestis, Y. enterocolitica. Agentes provenientes de hongos y levaduras incluyendo, pero sin limitarse a, patógenos: Alternaría spp.; Aspergillus spp.; Blastomyces spp. , por ejemplo, B. dermatiditis; Candida spp. , por ejemplo, C. albicans; Cladosporium spp. ; Coccidiodes spp. , por ejemplo, C. immitis; Cryptococcus spp. , por ejemplo, C. neoformans; Histoplasma spp. , por ejemplo, H. capsulatum; y Sporothrix spp. , por ejemplo, S. schenckii. En una modalidad, el o los agentes patógenos provienen de una gente protista incluyendo, pero sin limitarse a, patógenos: Amoebae, incluyendo Acanthamoeba spp., Amoeba spp. , Naegleria spp., Entamoeba spp. , por ejemplo, E. histolytica; Cryptosporidium spp., por ejemplo, C. parvum; Cyclospora spp. ; Encephalitozoon spp. , por ejemplo, E. intestinalis; Enterocytozoon spp. ; Giardia spp. , por ejemplo, G. lamblia; Isospora spp.; Microsporidium spp.; Plasmodium spp., por ejemplo, P. falciparum, P. malariae, P. ovale, P. vivax; Toxoplasma spp., por ejemplo, 7. gondii; y Trypanosoma spp. , por ejemplo, 7. brucei. En una modalidad, el o los agentes patógenos provienen de un agente parasitario (por ejemplo, parásitos helmínticos) incluyendo, pero sin limitarse a, patógenos: Ascaris spp. , por ejemplo, A. lumbricoides; Dracunculus spp. , por ejemplo, D. medinensis; Onchocerca spp. , por ejemplo, O. volvulus; Schistosoma spp.; Trichinella spp. , por ejemplo, T. spiralis; y Trichuris spp. , por ejemplo, 7. trichiura. En otra modalidad, el o los agentes patógenos provienen de un agente viral incluyendo, pero sin limitarse a, patógenos: Adenovirus; Arenavirus, por ejemplo, virus de la fiebre de Lassa; Astrovirus; Bunyavirus, por ejemplo, Hantavirus, virus de la fiebre del valle Rift; Coronavirus, Deltavirus; Citomegalovirus, virus de Epstein-Barr, Herpes virus, virus de Varicela; Filovirus, por ejemplo, virus del Ebola, virus de Marburg; Flavirus, por ejemplo, virus del Dengue, virus de la fiebre del Nilo Occidental, virus de la fiebre amarilla; virus de Hepatitis; virus de la Influenza; Lentivirus, virus linfotrópicos de célula T, otros virus de leucemia; virus de Norwalk; virus del papiloma, otros virus tumorales; Paramyxovirus, por ejemplo, virus del sarampión, virus de las paperas, virus de parainfluenza, Pneumovirus, virus de Sendai; Parvovirus; Picornavirus, por ejemplo, Cardiovirus, virus Coxsackie, Echovirus, virus de la poliomielitis, Rhinovirus, otros enterovirus; Poxvirus, por ejemplo, virus de Varióla, virus Vaccinia, Parapoxvirus; Reovirus, por ejemplo, Coltivirus, Orbivirus, Rotavirus; Rhabdovirus, por ejemplo, Lyssavirus, virus de estomatitis vesicular; y Togavirus, por ejemplo, virus de la rubéola, virus Sindbis, virus de encefalitis occidental. En una modalidad particular, el péptido antigénico se selecciona a partir del grupo que consiste de un péptido de parvovirus canino, péptido antigénico de antígeno protector (PA) de Bacillus anthracis, y un péptido antigénico de encefalitis equina oriental. En una modalidad particular, el péptido antigénico es el péptido derivado de parvovirus canino con la secuencia de aminoácido de SEQ. ID. NO: 7. En otra modalidad particular, el péptido antigénico es el péptido antigénico de antígeno protector (PA) de Bacillus anthracis con cualquiera de las secuencias de aminoácido de SEQ. ID. NOs: 9, 1 1 , 13 o 15. Incluso en otra modalidad particular, el péptido antigénico es un péptido antigénico de virus de encefalitis equina oriental con la secuencia de aminoácido de una de SEQ. ID. NOs: 25 ó 27.

Péptido tóxico para la célula hospedera En otra modalidad particular, el péptido recombinante es un péptido que es tóxico para la célula hospedera cuando está en forma monomérica libre. En una modalidad más particular, el péptido tóxico es un péptido anti-microbiano. En algunas modalidades, el péptido de interés expresado en conjunto con una cápside viral puede ser un péptido tóxico para la célula hospedera. En algunas modalidades, esta proteína puede ser un péptido anti-microbiano. Un péptido tóxico para la célula hospedera indica un péptido bio-inhibidor que es biostático, biocida, o tóxico para la célula hospedera en la cual éste se expresa, o para otras células en el cultivo celular u organismo del cual es miembro la célula hospedera, o para células del organismo o especie que provee las células hospederas. En una modalidad, el péptido tóxico para la célula hospedera puede ser un péptido bio-inhibidor que sea biostático, biocida, o tóxico para la célula hospedera en la cual éste se expresa. Algunos ejemplos de péptidos tóxicos para la célula hospedera incluyen, pero no se limitan a: toxinas peptídicas, péptidos anti-microbianos, y otros péptidos antibióticos. Los péptidos anti-microbianos incluyen, por ejemplo, péptidos antibacterianos tales como, por ejemplo, magaininas, betadefensinas, algunas alfa-defensinas; catelicidinas; histatinas; péptidos antifúngicos; péptidos anti-protozoarios; AMP sintéticos; antibióticos peptídicos o las porciones de oligopéptido o polipéptido lineales o pre-cicladas de los mismos; otros péptidos antibióticos (por ejemplo, péptidos anti-helmínticos, péptidos hemolíticos, péptidos tumoricidas); y péptidos anti-virales (por ejemplo, algunas alfa- defensinas; péptidos virucidas; péptidos que inhiban la infección viral). En una modalidad particular, el péptido anti-microbiano es el péptido D2A21 con la secuencia de aminoácido de SEQ I D NO: 20. En otra modalidad, el péptido anti-microbiano es el péptido anti-microbiano PBF20 con la secuencia de aminoácido que corresponde sustancialmente a SEQ ID NO: 24.

Células para uso en la expresión de la VLP La célula utilizada como un hospedero para la expresión de la cápside viral o péptido de fusión de cápside viral (también conocida como "célula hospedera") de la invención es una en la cual la cápside viral no permite la replicación o infección de la célula. En una modalidad, la cápside viral se obtiene a partir de un virus que no infecta la especie de célula a partir de la cual se obtiene la célula hospedera. Por ejemplo, en una modalidad, fa cápside viral se obtiene a partir de un virus icosaédrico de plantas y se expresa en una célula hospedera de una especie bacteriana. En otra modalidad, la especie viral infecta mamíferos y el sistema de expresión incluye una célula hospedera bacteriana. En una modalidad, la célula hospedera puede ser un procariote tal como una célula bacteriana incluyendo, pero sin limitarse a especies de Pseudomonas. Las células bacterianas típicas se describen, por ejemplo, en "Biological Diversity: Bacteria and Archaeans", un capítulo del Libro de Biología en línea, provisto por el Dr. MJ Farabee del Colegio Comunitario Estrella Mountain, Arizona, EUA en la URL: http://www.emc.maricopa.edu/faculty/ farabee/BIOBK/BioBookDiversity_2.html. En algunas modalidades, la célula hospedera puede ser una célula pseudomonádida, y típicamente puede ser una célula de P. fluorescens. En una modalidad, la célula hospedera puede ser un miembro de cualesquiera especies de eubacterias. El hospedero pude ser un miembro de cualquiera de los taxones: Acidobacteria, Actinobacteira, Aquificae, Bacteroidetes, Chlorobi, Chlamydiae, Choroflexi, Chrysiogenetes, Cyanobacteria, Deferribacteres, Deinococcus, Dictyoglomi, Fibrobacteres, Firmicutes, Fusobacteria, Gemmatimonadetes, Lentisphaerae, Nitrospirae, Planctomycetes, Proteobacteria, Spirochaetes, Thermodesulfobacteria, Thermomicrobia, Thermotogae, Thermus (Thermales), o Verrucomicrobia. En una modalidad de una célula hospedera eubacteriana, la célula puede ser un miembro de cualesquiera especies de eubacterias, excluyendo Cyanobacteria. El hospedero bacteriano puede ser un miembro de cualesquiera especies de Proteobacterias. Una célula hospedera proteobacteriana puede ser un miembro de cualquiera de los taxones Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Deltaproteobacteria, o Epsilonproteobacteria. Además, el hospedero puede ser un miembro de cualquiera de los taxones Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, o Gammaproteobacteria, y un miembro de cualesquiera especies de Gammaproteobacteria.

En una modalidad de un hospedero Gamma Proteobacteriano, el hospedero es un miembro de cualquiera de los taxones Aeromonadales, Alteromonadales, Enterobacteríales, Pseudomonadales, o Xanthomonadales; o un miembro de cualesquiera especies de los Enterobacteriales o Pseudomonadales. En una modalidad, la célula hospedera puede ser del orden Enterobacteriales, la célula hospedera es un miembro de la familia Enterobacteriaceae, o un miembro de cualquiera de los géneros Erwinia, Escherichia, o Serratia; o un miembro del género Escherichia. En una modalidad de una célula hospedera del orden Pseudomonadales, la célula hospedera es un miembro de la familia Pseudomonadaceae, incluso del género Pseudomonas. Los hospederos Gamma Proteobacterianos incluyen miembros de la especie Escherichia coli y miembros de la especie Pseudomonas fluorescens. También se pueden utilizar otros organismos del género Pseudomonas. Los pseudomonádidos y especies cercanamente relacionadas incluyen el subgrupo 1 de Proteobacteria Gram (-), eí cual incluye al grupo de Proteobacterias que pertenecen a las familias y/o géneros descritos como "Bacilos y Cocos Aeróbicos Gram-Negativos " por R. E. Buchanan y N. E. Gibbons (eds.), Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, pp. 217-289 (8a ed. , 1974) (The Williams & Wiikins Co. , Baltimore, MD, EUA) (de aquí en adelante "Bergey (1 974)"). El cuadro 1 presenta estas familias y géneros de organismos.

CUADRO 1 Familias y géneros listados en la sección, "GRAM-NEGATIVE AEROBIC RODS AN D COCCI" (en BERGEY (1974)) "Subgrupo 1 de Proteobacterias Gram (-)" también incluye Proteobacterias que pueden ser clasificadas en este encabezado de conformidad con los criterios utilizados en la clasificación. El encabezado también ¡ncluye grupos que previamente se clasificaron en esta sección pero que ya no están, tales como los géneros Acidovorax, Brevundimonas, Burkholderia, Hydrogenophaga, Oceanimonas, Ralstonia, y Stenotrophomonas, el género Sphingomonas (y el género Blastomonas, derivado a partir del mismo), el cual se creó reagrupando organismos que pertenecen a (y denominadas previamente especies de) el género Xanthomonas, el género Acidomonas, el cual se creó reagrupando organismos que pertenecen al género Acetobacter como se define en Bergey (1974). Además, los hospederos pueden incluir células provenientes del género Pseudomonas, Pseudomonas enalia (ATCC 14393), Pseudomonas nigrifaciens (ATCC 19375), y Pseudomonas putrefaciens (ATCC 8071 ), los cuales han sido re-clasificados respectivamente como Alteromonas haloplanktis, Alteromonas nigrifaciens, y Alteromonas putrefaciens. De igual manera, por ejemplo, Pseudomonas acidovorans (ATCC 15668) y Pseudomonas testosteroni (ATCC 1 1 996) desde entonces fueron reclasificados como Comamonas acidovorans y Comamonas testosteroni, respectivamente; y Pseudomonas nigrifaciens (ATCC 19375) y Pseudomonas piscicida (ATCC 15057) han sido reclasificados respectivamente como Pseudoalteromonas nigrifaciens y Pseudoalteromonas piscicida. "Subgrupo 1 de Proteobacterias Gram (-)" también ¡ncluye Proteobacterias clasificadas como pertenecientes a cualquiera de las familias: Pseudomonadaceae, Azotobacteraceae (actualmente nombrada con frecuencia con el sinónimo, el grupo " grupo Azotobacter" de Pseudomonadaceae), Rhizobiaceae, and Methylomonadaceae (actualmente nombrada con frecuencia con el sinónimo, "Methylococcaceae"). Por consiguiente, además de aquellos géneros descritos de otra manera en la presente invención, los géneros de Proteobacterias adicionales que caen dentro de "Subgrupo 1 de Proteobacterias Gram (-)" incluyen: 1 ) bacterias del grupo Azotobacter del género Azorhizophilus; 2) bacterias de la familia Pseudomonadaceae de los géneros Cellvibrio, Oligella, y Teredinibacter; 3) bacterias de la familia Rhizobiaceae de los géneros Chelatobacter, Ensifer, Liberibacter (también llamado "Candidatus Liberibacter"), y Sinorhizobium; y 4) bacterias de la familia Methylococcaceae de los géneros Methylobacter, Methylocaldum, Methylomicrobium, Methylosarcina, y Methylosphaera. En otra modalidad, la célula hospedera se selecciona a partir del "Subgrupo 2 de Proteobacterias Gram (-)". "Subgrupo 2 de Proteobacterias Gram (-)" se define como el grupo de Proteobacterias de los siguientes géneros (con el número total de cepas depositadas de los mismos, listados en catálogo, públicamente disponibles indicado entre paréntesis, todos depositados en el ATCC, excepto que se indique de otra manera): Acidomonas (2); Acetobacter (93); Gluconobacter (37); Brevundimonas (23); Beijerinckia (13); Derxia (2); Brucella (4); Agrobacterium (79); Chelatobacter (2); Ensifer (3); Rhizobium (144); Sinorhizobium (24); Blastomonas (1 ); Sphingomonas (27); Alcaligenes (88); Bordetella (43); Burkholderia (73); Ralstonia (33); Acidovorax (20); Hydrogenophaga (9); Zoogloea (9); Methylobacter (2); Methylocaldum (1 en el NCI MB); Methylococcus (2); Methylomicrobium (2); Methylomonas (9); Methylosarcina (1 ); Methylosphaera; Azomonas (9); Azorhizophilus (5); Azotobacter (64); Cellvibrio (3); Oligella (5); Pseudomonas (1 139); Francisella (4); Xanthomonas (229); Stenotrophomonas (50); y Oceanimonas (4).

Los ejemplos de especies de células hospederas del "Subgrupo 2 de Proteobacterias Gram (-)" incluyen, pero no se limitan a las siguientes bacterias (los números de depósito en el ATCC u otros números de depósito de la cepa o cepas de ejemplo de los mismos se muestran entre paréntesis): Acidomonas methanolica (ATCC 43581 ); Acetobacter aceti (ATCC 1 5973); Gluconobacter oxydans (ATCC 1 9357); Brevundimonas diminuta (ATCC 1 1 568); Beijerinckia indica (ATCC 9039 y ATCC 1 9361 ); Derxia gummosa (ATCC 1 5994); Brucella melitensis (ATCC 23456), Brucella abortus (ATCC 23448); Agrobacterium tumefaciens (ATCC 23308), Agrobacterium radiobacter (ATCC 1 9358), Agrobacterium rhizogenes (ATCC 1 1325); Chelatobacter heintzii (ATCC 29600); Ensifer adhaerens (ATCC 33212); Rhizobium leguminosarum (ATCC 1 0004); Sinorhizobium fredii (ATCC 35423); Blastomonas natatoria (ATCC 35951 ); Sphingomonas paucimobilis (ATCC 29837); Alcaligenes faecalis (ATCC 8750); Bordetella pertussis (ATCC 9797); Burkholderia cepacia (ATCC 25416); Ralstonia pickettii (ATCC 2751 1 ); Acidovorax facilis (ATCC 1 1228); Hydrogenophaga flava (ATCC 33667); Zoogloea ramigera (ATCC 1 9544); Methylobacter luteus (ATCC 49878); Methylocaldum gracile (NCI MB 1 1 912); Methylococcus capsulatus (ATCC 19069); Methylomicrobium agüe (ATCC 35068); Methylomonas methanica (ATCC 35067); Methylosarcina fibrata (ATCC 700909); Methylosphaera hansonii (ACAM 549); Azomonas agilis (ATCC 7494); Azorhizophilus paspali (ATCC 23833); Azotobacter chroococcum (ATCC 9043); Cellvibrio mixtus (UQM 2601 ); Oligella urethralis (ATCC 17960); Pseudomonas aeruginosa (ATCC 1 0145), Pseudomonas fuorescens (ATCC 35858); Francisella tularensis (ATCC 6223); Stenotrophomonas maltophilia (ATCC 13637); Xanthomonas campestris (ATCC 33913); y Oceanimonas doudoroffii (ATCC 27123). En otra modalidad, la célula hospedera se selecciona a partir del "Subgrupo 3 de Proteobacterias Gram (-)". El "Subgrupo 3 de Proteobacterias Gram (-)" se define como el grupo de Proteobacterias de los siguientes géneros de los siguientes géneros: Brevundimonas; Agrobacterium; Rhizobium; Sinorhizobium; Blastomonas; Sphingomonas; Alcaligenes; Burkholderia; Ralstonia; Acidovorax; Hydrogenophaga; Methylobacter; Methylocaldum; Methylococcus; Methylomicrobium; Methylomonas; Methylosarcina; Methylosphaera; Azomonas; Azorhizophilus; Azotobacter; Cellvibrio; Oligella; Pseudomonas; Teredinibacter; Francisella; Stenotrophomonas; Xanthomonas; y Oceanimonas. En otra modalidad, la célula hospedera se selecciona a partir del "Subgrupo 4 de Proteobacterias Gram (-)". El "Subgrupo 4 de Proteobacterias Gram (-)" se define como el grupo de Proteobacterias de los siguientes géneros: Brevundimonas; Blastomonas; Sphingomonas; Burkholderia; Ralstonia; Acidovorax; Hydrogenophaga; Methylobacter; Methylocaldum; Methylococcus; Methylomicrobium; Methylomonas; Methylosarcina; Methylosphaera; Azomonas; Azorhizophilus; Azotobacter; Cellvibrio; Oligella; Pseudomonas; Teredinibacter; Francisella; Stenotrophomonas; Xanthomonas; y Oceanimonas. En una modalidad, la célula hospedera se selecciona a partir del "Subgrupo 5 de Proteobacterias Gram (-)". El "Subgrupo 5 de Proteobacterias Gram (-)" se define como el grupo de Proteobacterias de los siguientes géneros: Methylobacter; Methylocaldum; Methylococcus; Methylomicrobium; Methylomonas; Methylosarcina; Methylosphaera; Azomonas; Azorhizophilus; Azotobacter; Cellvibrio; Oligella; Pseudomonas; Teredinibacter; Francisella; Stenotrophomonas; Xanthomonas-, y Oceanimonas. La célula hospedera se puede seleccionar a partir del "Subgrupo 6 de Proteobacterias Gram (-)". El "Subgrupo 6 de Proteobacterias Gram (-)" se define como el grupo de Proteobacterias de los siguientes géneros: Brevundimonas; Blastomonas; Sphingomonas; Burkholderia; Ralstonia; Acidovorax; Hydrogenophaga; Azomonas; Azorhizophilus; Azotobacter; Cellvibrio; Oligella; Pseudomonas; Teredinibacter; Stenotrophomonas; Xanthomonas; y Oceanimonas. La célula hospedera se puede seleccionar a partir del "Subgrupo 7 de Proteobacterias Gram (-)". El "Subgrupo 7 de Proteobacterias Gram (-)" se define como el grupo de Proteobacterias de los siguientes géneros: Azomonas; Azorhizophilus; Azotobacter; Cellvibrio; Oligella; Pseudomonas; Teredinibacter; Stenotrophomonas; Xanthomonas; y Oceanimonas. La célula hospedera se puede seleccionar a partir del "Subgrupo 8 de Proteobacterias Gram (-)". El "Subgrupo 8 de Proteobacterias Gram (-)" se define como el grupo de Proteobacterias de los siguientes géneros: Brevundimonas; Blastomonas; Sphingomonas; Burkholderia; Ralstonia; Acidovorax; Hydrogenophaga; Pseudomonas; Stenotrophomonas; Xanthomonas; y Oceanimonas.

La célula hospedera se puede seleccionar a partir del "Subgrupo 9 de Proteobacterias Gram (-)". El "Subgrupo 9 de Proteobacterias Gram (-)" se define como el grupo de Proteobacterias de los siguientes géneros: Brevundimonas; Burkholderia; Ralstonia; Acidovorax; Hydrogenophaga; Pseudomonas; Stenotrophomonas; y Oceanimonas. La célula hospedera se puede seleccionar a partir del "Subgrupo 1 0 de Proteobacterias Gram (-)". El "Subgrupo 10 de Proteobacterias Gram (-)" se define como el grupo de Proteobacterias de los siguientes géneros: Burkholderia; Ralstonia; Pseudomonas; Stenotrophomonas; y Xanthomonas. La célula hospedera se puede seleccionar a partir del "Subgrupo 1 1 de Proteobacterias Gram (-)". El "Subgrupo 1 1 de Proteobacterias Gram (-)" se define como el grupo de Proteobacterias de los géneros: Pseudomonas; Stenotrophomonas,- y Xanthomonas. La célula hospedera se puede seleccionar a partir del "Subgrupo 12 de Proteobacterias Gram (-)". El "Subgrupo 12 de Proteobacterlas Gram (-)" se define como el grupo de Proteobacterias de los siguientes géneros: Burkholderia; Ralstonia; Pseudomonas. La célula hospedera se puede seleccionar a partir del "Subgrupo 1 3 de Proteobacterias Gram (-)". El "Subgrupo 1 3 de Proteobacterias Gram (-)" se define como el grupo de Proteobacterias de los siguientes géneros: Burkholderia; Ralstonia; Pseudomonas; y Xanthomonas. La célula hospedera se puede seleccionar a partir del "Subgrupo 14 de Proteobacterias Gram (-)". El "Subgrupo 14 de Proteobacterias Gram (-)" se define como el grupo de Proteobacterias de los siguientes géneros: Pseudomonas y Xanthomonas. La célula hospedera se puede seleccionar a partir del "Subgrupo 15 de Proteobacterias Gram (-)". El "Subgrupo 15 de Proteobacterias Gram (-)" se define como el grupo de Proteobacterias del género Pseudomonas. La célula hospedera se puede seleccionar a partir del "Subgrupo 16 de Proteobacterias Gram (-)". El "Subgrupo 16 de Proteobacterias Gram (-)" se define como el grupo de Proteobacterias de las siguientes especies de Pseudomonas (los números de depósito en el ATCC u otros números de depósito de la cepa o cepas de ejemplo se muestran entre paréntesis): Pseudomonas abietaniphila (ATCC 700689); Pseudomonas aeruginosa (ATCC 1 0145); Pseudomonas alcaligenes (ATCC 14909); Pseudomonas anguilliseptica (ATCC 33660); Pseudomonas citronellolis (ATCC 13674); Pseudomonas flavescens (ATCC 51555); Pseudomonas mendocina (ATCC 2541 1 ); Pseudomonas nitroreducens (ATCC 33634); Pseudomonas oleovorans (ATCC 8062); Pseudomonas pseudoalcaligenes (ATCC 17440); Pseudomonas resinovorans (ATCC 14235); Pseudomonas straminea (ATCC 33636); Pseudomonas agarici (ATCC 25941 ); Pseudomonas alcaliphila; Pseudomonas alginovora; Pseudomonas andersonii; Pseudomonas asple?ii (ATCC 23835); Pseudomonas azelaica (ATCC 27162); Pseudomonas beijerinckii (ATCC 1 9372); Pseudomonas borealis; Pseudomonas boreopolis (ATCC 33662); Pseudomonas brassicacearum; Pseudomonas butanovora (ATCC 43655); Pseudomonas cellulosa (ATCC 55703); Pseudomonas aurantiaca (ATCC 33663); Pseudomonas chlororaphis (ATCC 9446, ATCC 1 3985, ATCC 17418, ATCC 17461 ); Pseudomonas fragi (ATCC 4973); Pseudomonas lundensis (ATCC 49968); Pseudomonas taetrolens (ATCC 4683); Pseudomonas cissicola (ATCC 33616); Pseudomonas coronafaciens; Pseudomonas diterpeniphila; Pseudomonas elongata (ATCC 1 0144); Pseudomonas flectens (ATCC 12775); Pseudomonas azotoformans; Pseudomonas brenneri; Pseudomonas cedrella; Pseudomonas corrúgate (ATCC 29736); Pseudomonas extremorientalis; Pseudomonas fluorescens (ATCC 35858); Pseudomonas gessardii; Pseudomonas libanensis; Pseudomonas mandelii (ATCC 700871 ); Pseudomonas marginalis (ATCC 10844); Pseudomonas migulae; Pseudomonas mucidolens (ATCC 4685); Pseudomonas orientalis; Pseudomonas rhodesiae; Pseudomonas synxantha (ATCC 9890); Pseudomonas tolaasii (ATCC 3361 8); Pseudomonas veronii (ATCC 700474); Pseudomonas frederiksbergensis; Pseudomonas geniculata (ATCC 1 9374); Pseudomonas gingeri; Pseudomonas graminis; Pseudomonas grimontii; Pseudomonas halodenitrificans; Pseudomonas halophila; Pseudomonas hibiscicola (ATCC 19867); Pseudomonas huttiensis (ATCC 14670); Pseudomonas hydrogenovora; Pseudomonas jessenii (ATCC 700870); Pseudomonas kílonensis; Pseudomonas lanceolata (ATCC 14669); Pseudomonas lini; Pseudomonas marginata (ATCC 25417); Pseudomonas mephitica (ATCC 33665); Pseudomonas denitrificans (ATCC 1 9244); Pseudomonas pertucinogena (ATCC 1 90); Pseudomonas pictorum (ATCC 23328); Pseudomonas psychrophila; Pseudomonas fulva (ATCC 31418); Pseudomonas monteilii (ATCC 700476); Pseudomonas mosseiii; Pseudomonas oryzihabitans (ATCC 43272); Pseudomonas plecoglossicida (ATCC 700383); Pseudomonas putida (ATCC 12633); Pseudomonas reactans; Pseudomonas spinosa (ATCC 14606); Pseudomonas baleárica; Pseudomonas luteola (ATCC 43273); Pseudomonas stutzeri (ATCC 1 7588); Pseudomonas amygdali (ATCC 33614); Pseudomonas avellanae (ATCC 700331 ); Pseudomonas caricapapayae (ATCC 33615); Pseudomonas cichorii (ATCC 10857); Pseudomonas ficuserectae (ATCC 351 04); Pseudomonas fuscovaginae; Pseudomonas meliae (ATCC 33050); Pseudomonas syringae (ATCC 1931 0); Pseudomonas viridiflava (ATCC 13223); Pseudomonas thermocarboxydovorans (ATCC 35961 ); Pseudomonas thermotolerans; Pseudomonas thivervalensis; Pseudomonas vancouverensis (ATCC 700688); Pseudomonas wisconsinensis; y Pseudomonas xiamenensis. La célula hospedera se puede seleccionar a partir del "Subgrupo 17 de Proteobacterias Gram (-)". El "Subgrupo 17 de Proteobacterias Gram (-)" se define como el grupo de Proteobacterias conocido en la técnica como los "pseudomonádidos fluorescentes" incluyendo aquellos que pertenecen, por ejemplo, a las siguientes especies de Pseudomonas: Pseudomonas azotoformans; Pseudomonas brenneri; Pseudomonas cedrella; Pseudomonas corrugata; Pseudomonas extremorientalis; Pseudomonas fluorescens; Pseudomonas gessardii; Pseudomonas libanensis; Pseudomonas mandelii; Pseudomonas marginalis; Pseudomonas migulae; Pseudomonas mucidolens; Pseudomonas orientalis; Pseudomonas rhodesiae; Pseudomonas synxantha; Pseudomonas tolaasii; y Pseudomonas veronii.

En esta modalidad, la célula hospedera se puede seleccionar a partir del "Subgrupo 1 8 de Proteobacterias Gram (-)". El "Subgrupo 1 8 de Proteobacterias Gram (-)" se define como el grupo de todas las subespecies, variedades, cepas, y otras sub-unidades de especies de la especie Pseudomonas fluorescens, incluyendo aquellas que pertenecen, por ejemplo, a las siguientes (los números de depósito en el ATCC u otros números de depósito de la cepa o cepas de ejemplo se muestran entre paréntesis): Pseudomonas fluorescens biotipo A, también llamada biovariante 1 o biovariante I (ATCC 13525); Pseudomonas fluorescens biotipo B, también llamada biovariante 2 o biovariante I I (ATCC 17816); Pseudomonas fluorescens biotipo C, también llamada biovariante 3 o biovariante l l l (ATCC 17400); Pseudomonas fluorescens biotipo F, también llamada biovariante 4 o biovariante IV (ATCC 12983); Pseudomonas fluorescens biotipo G, también llamada biovariante 5 o biovariante V (ATCC 1751 8); Pseudomonas fluorescens biovariante VI ; Pseudomonas fluorescens PfO-1 ; Pseudomonas fluorescens Pf-5 (ATCC BAA-477); Pseudomonas fluorescens SBW25; y Pseudomonas fluorescens subsp. cellulosa (NCIMB 10462). La célula hospedera se puede seleccionar a partir del "Subgrupo 19 de Proteobacterias Gram (-)". El "Subgrupo 19 de Proteobacterias Gram (-)" se define como el grupo de todas las cepas de Pseudomonas fluorescens biotipo A. Una cepa particular de este biotipo es P. fíuorescens cepa MB101 (véase patente E. U.A. No. 5, 169,760 para Wilcox), y derivados de la misma. Un ejemplo de un derivado de la misma es P. fluorescens cepa MB214, que se construye insertando en el locus de asd (gen de aspartato deshidrogenasa) cromosómico de MB1 01 , una construcción Placl-lacl-lacZYA original de E. coli (es decir en la cual se ha suprimido PlacZ). Las cepas de P. fluorescens adicionales que se pueden utilizar en la presente invención incluyen Pseudomonas fluorescens Migula y Pseudomonas fluorescens Loitokitok, que tienen las siguientes designaciones del ATCC: [NCIB 8286]; NRRL B-1244; NCIB 8865 cepa CO1 ; NCIB 8866 cepa CO2; 1291 [ATCC 17458; IFO 15837; NCIB 8917; LA; NRRL B-1 864; pirrolidina; PW2 [ICMP 3966; NCPPB 967; NRRL B-899]; 13475; NCTC 10038; NRRL B-1603 [6; IFO 15840]; 52-1 C; CCEB 488-A [BU 140]; CCEB 553 [IEM 15/47]; lAM 1 008 [AHH-27]; lAM 1055 [AHH-23]; 1 [IFO 15842]; 12 [ATCC 25323; N IH 1 1 ; den Dooren de Jong 216]; 18 [I FO 15833 ; WRRL P-7]; 93 [TR-10]; 1 08 [52-22; I FO 15832]; 143 [IFO 15836; PL]; 149 [2-40-40; I FO 15838]; 182 [I FO 3081 ; PJ 73]; 184 [IFO 15830]; 185 [W2 L-1]; 186 [IFO 15829; PJ 79]; 187 [NCPPB 263]; 188 [NCPPB 316]; 189 [PJ227; 1208]; 1 91 [IFO 15834; PJ 236; 22/1]; 194 [Klinge R-60; PJ 253]; 196 [PJ 288]; 197 [PJ 290]; 198 [PJ 302]; 201 [PJ 368]; 202 [PJ 372]; 203 [PJ 376]; 204 [IFO 15835; PJ 682]; 205 [PJ 686]; 206 [PJ 692]; 207 [PJ 693]; 208 [PJ 722]; 212 [PJ 832]; 215 [PJ 849]; 216 [PJ 885]; 267 [B-9]; 271 [B-1612]; 401 [C71 A; IFO 15831 ; PJ 187]; NRRL B-3178 [4; IFO 1 5841 ]; KY 8521 ; 3081 ; 30-21 ; [I FO 3081]; N; PYR; PW; D946-B83 [BU 2183; FERM-P 3328]; P-2563 [FERM-P 2894; IFO 1 3658]; IAM-1 126 [43F]; M-1 ; A506 [A5-06]; A505 [A5-05-1 ] ; A526 [A5-26]; B69; 72; NRRL B-4290; PMW6 [NCIB 1 1615]; SC 12936; A1 [I FO 15839]; F 1 847 [CDC-EB]; F 1 848 [CDC 93]; NCI B 10586; P17; F-12; AmMS 257; PRA25; 6133D02 ; 6519E01 ; N1 ; SC1 5208; BNL-WVC; NCTC 2583 [NCIB 81 94]; H 13; 1013 [ATCC 1 1251 ; CCEB 295]; IFO 3903; 1062; o Pf-5.

I I . Construcciones de ácido nucleico La presente invención también provee construcciones de ácido nucleico que codifican para un péptido de fusión de una cápside icosaédrica y un péptido recombinante. En una modalidad, una construcción de ácido nucleico para uso en la transformación de una célula hospedera pseudomonádida incluye a) un ácido nucleico que codifica para un péptido recombinante, y b) una secuencia de ácido nucleico que codifica para una cápside icosaédrica se provee, en la cual el ácido nucleico de a) y el ácido nucleico de b) están ligados en forma operable para formar una proteína de fusión cuando se expresan en una célula. En algunas modalidades, el vector puede Incluir secuencias para cápsides múltiples, o para péptidos de interés múltiples. En una modalidad, el vector puede incluir por lo menos dos secuencias codificadoras de péptido-cápside diferentes. En una modalidad, las secuencias codificadoras están ligadas al mismo promotor. En algunas modalidades, las secuencias codificadoras están separadas por un sitio de unión a ribosoma interno. En otras modalidades, las secuencias codificadoras están ligadas mediante una secuencia de enlazador que permite la formación de partículas tipos virus en la célula. En otra modalidad, las secuencias codificadoras están ligadas a promotores diferentes. Estos promotores pueden ser controlados por las mismas condiciones de inducción. En otra modalidad, se proveen vectores múltiples que codifican para combinaciones diferentes de cápside- péptido. Los vectores múltiples pueden incluir promotores que sean controlados por las mismas condiciones de inducción, o por condiciones de inducción diferentes. En una modalidad, el promotor es un promotor lac, o un derivado del promotor lac tal como el promotor tac. La secuencia que codifica para un péptido de interés se puede insertar en la secuencia que codifica para una cápside viral o cápside en un sitio predeterminado. El péptido también se puede insertar en un sitio no predeterminado y las células se evalúan respecto a la producción de las VLP. En una modalidad, el péptido se inserta en la secuencia que codifica para la cápside de modo tal que se exprese como un bucle durante la formación de una VLP. En una modalidad, se incluye una secuencia codificadora del péptido en el vector, sin embargo, en otras modalidades, se incluyen secuencias múltiples. Las secuencias múltiples pueden estar en forma de concatámeros, por ejemplo, concatámeros ligados por secuencias enlazadoras susceptibles de corte. Los péptidos se pueden insertar en más de un sitio de inserción en una cápside. Por lo tanto, los péptidos se pueden insertar en más de un motivo de bucle de superficie de una cápside; los péptidos también pueden estar insertados en sitios múltiples dentro de un motivo de bucle determinado. El péptido o péptidos individuales funcionales y/o estructurales del o los insertos, y/o el o los insertos de péptido completo, se pueden separar mediante sitios de corte, es decir sitios en los cuales puede actuar un agente que corte o hidrolice la proteína para separar al o los péptidos del remanente de la estructura o ensamblaje de cápside. Los péptidos se pueden insertar dentro de bucles que miren hacia el exterior y/o dentro de bucles que miren hacia el interior, es decir dentro de bucles de la cápside que miran respectivamente en dirección opuesta o hacia el centro de la cápside. Cualquier aminoácido o péptido unido en un bucle de superficie de una cápside puede servir como una inserción para el péptido. Típicamente, el sitio de inserción se selecciona alrededor del centro del bucle, es decir aproximadamente en la posición ubicada más distante del centro de la estructura terciaria del péptido de cápside plegado. La secuencia que codifica para el péptido se puede insertar en forma operable dentro de la posición de la secuencia que codifica para la cápside correspondiente a su centro aproximado del o los bucles seleccionados. Esto incluye la retención del marco de lectura para dicha porción de la secuencia de péptido de la cápside que es sintetizada hacia el extremo 3' desde el sitio de inserción de péptido. En otra modalidad, el péptido se puede insertar en el extremo amino terminal de la cápside. El péptido se puede ligar a la cápside a través de una o más secuencias enlazadoras, incluyendo los enlazadores susceptibles de corte descritos anteriormente. Incluso en otra modalidad, el péptido se puede insertar en el extremo carboxi terminal de la cápside. El péptido se puede ligar al extremo carboxi terminal a través de uno o más enlazadores, los cuales pueden ser cortados mediante hidrólisis química o enzimática. En una modalidad, las secuencias de péptido están ligadas tanto el extremo amino terminal como carboxi terminal, o en un extremo y por lo menos un sitio interno, tal como un sitio que se exprese sobre la superficie de la cápside en su conformación tridimensional. En una modalidad, el péptido se puede insertar dentro de la cápside proveniente de un virus de mosaico clorótico de garbanzo. En una modalidad particular, el péptido se puede insertar en el aminoácido 129 del virus de CCMV. En otra modalidad, la secuencia de péptido se puede insertar en los aminoácidos 60, 61 , 62, ó 63 del virus de CCMV. Incluso en otra modalidad, el péptido se puede insertar en ambos aminoácidos 129 y aminoácidos 60-63 del virus de CCMV. En una modalidad particular, la presente invención provee una construcción de ácido nucleico que incluye a) un ácido nucleico que codifica para un péptido anti-microbiano, y b) un ácido nucleico que codifica para una cápside icosaédrica, en la cual el ácido nucleico de a) y el ácido nucleico de b) están ligados en forma operable para formar una proteína de fusión cuando se expresan en una célula. Otras cápsides y péptidos recombinantes útiles para construir la construcción de ácido nucleico se discutieron anteriormente.

Promotores En una modalidad, la construcción de ácido nucleico incluye una secuencia de promotor unida en forma operable a la secuencia de ácido nucleico que codifica para el péptido de fusión péptido recombinante-cápside. Una unión o enlace operable se refiere a cualquier configuración en la cual los elementos de transcripción y cualesquiera elementos regulatorios de traducción estén unidos en forma covalente a la secuencia descrita de modo tal que mediante acción de la célula hospedera, los elementos reguladores puedan dirigir la expresión de la secuencia de interés. En un proceso de fermentación, una vez que se induce la expresión del péptido recombinante objetivo, sería ideal tener un nivel elevado de producción con el fin de llevar al máximo la eficiencia del sistema de expresión. El promotor inicia la transcripción y por lo general está colocado a 10-1 00 nucleótidos hacia el extremo 5' del sitio de unión de ribosoma. De manera ideal, un promotor será lo suficientemente fuerte para permitir la acumulación de péptido recombinante de alrededor del 50% de la proteína celular total de la célula hospedera, que se pueda someter a regulación estricta, y que se pueda inducir en forma fácil (y de manera poco costosa). Los promotores utilizados de conformidad con la presente invención pueden ser promotores constitutivos o promotores regulados. Los ejemplos de promotores inducibles utilizados comúnmente y sus inductores subsiguientes incluyen lac (IPTG), lacUV5 (IPTG), tac (IPTG), trc (IPTG), Psyn (I PTG), trp (inanición de triptófano), araBAD (1 -arabinosa), lppa (IPTG), Ipp-lac (IPTG), phoA (inanición de fosfato), recA (ácido nalidixico), proU (osmolaridad), cst-1 (inanición de glucosa), tetA (tretracilina), cadA (pH), nar (condiciones anaeróbicas), PL (cambio térmico a 42°C), cspA (cambio térmico a 20° C), T7 (inducción térmica), operador T7-lac (IPTG), operador T3-lac (IPTG), operador T5-lac (IPTG), gen 32 de T4 (infección por T4), operador nprM-lac (IPTG), Pm (alquilbenzoatos o halógeno-benzoatos), Pu (alquiltoluenos o halógeno-toluenos), Psal (salicilatos), y VHb (oxígeno). Véase, por ejemplo, Makrides, S. C. (1996) Microbiol. Rev. 60, 512-538 ; Hannig G. y Makrides, S. C. (1 998) TIBTECH 16,54-60; Stevens, R. C. (2000) Structures 8, R1 77-R1 85. Véase, por ejemplo: J. Sánchez-Romero y V. De Lorenzo, Genetic Engineering of Nonpathogenic Pseudomonas strains as Biocatalysts for Industrial and Environmental Processes, en Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology (A. Demain & J. Davies, eds.) pp. 460-74 (1 999) (ASM Press, Washington, D. C); H. Schweizer, Vectors to express foreign genes and techniques to monitor gene expression for Pseudomonads, Current Opinión in Biotechnology, 12: 439-445 (2001 ); y R. Slater y R. Williams, The Expression of Foreign DNA in Bacteria, in Molecular Biology and Biotechnology (J. Waiker y R. Rapley, eds.) pp. 125-54 (2000) (La Real Sociedad de Química, Cambridge, RU). También se puede utilizar un promotor que tenga la secuencia de nucleótido de un promotor originario para la célula hospedera bacteriana seleccionada para controlar la expresión del transgen que codifica para el péptido objetivo, por ejemplo, un promotor de operón de antranilato o benzoato de Pseudomonas (Pant, Pben). También se pueden utilizar promotores en serie en los cuales más de un promotor está unido en forma covalente a otro, ya sean iguales o diferentes en secuencia, por ejemplo, un promotor en serie Pant-Pben (híbrido inter-promotor) o un promotor en serie Plac-Plac. Los promotores regulados utilizan proteínas reguladoras de promotor con el fin de controlar la transcripción del gen del cual es una parte el promotor. En casos en los que se utilice un promotor regulado en la presente invención, también es parte una proteína reguladora promotora correspondiente de un sistema de expresión de conformidad con la presente invención. Los ejemplos de proteínas reguladoras de promotor incluyen: proteínas activadoras, por ejemplo, proteína activadora de catabolito de E. coli, proteína MaIT; activadores de transcripción de la familia AraC; proteínas represoras, por ejemplo proteínas Lacl de E. coli; y proteínas reguladoras de facción doble, por ejemplo proteína NagC de E. coli. Muchos pares de promotor regulado/proteína reguladora de promotor son conocidos en la técnica. Las proteínas reguladoras de promotor interactúan con un compuesto efector, es decir un compuesto que de manera reversible o irreversible se asocia con la proteína reguladora para permitir que la proteína se libere o se una a por lo menos una región reguladora de transcripción de ADN del gen que está bajo el control del promotor, con lo cual se permite o se bloquea la acción de una enzima transcriptasa para iniciar la transcripción del gen. Los compuestos efectores se clasifican ya sea como inductores o como co-represores, y estos compuestos incluyen compuestos efectores originales y compuestos inductores gratuitos. En la técnica son conocidos muchos tríos de promotor regulado/proteína reguladora de promotor/compuesto efector. Aunque se puede utilizar un compuesto efector a lo largo de todo el cultivo celular o fermentación, en una modalidad particular en la cual se utiliza un promotor regulado, después del crecimiento de una cantidad deseada o densidad de biomasa de la célula hospedera, se agrega un compuesto efector apropiado al cultivo con el fin de que resulte en forma directa o indirecta en la expresión del gen o genes objetivos deseados. A manera de ejemplo, en casos en los que se utiliza un promotor de la familia lac, también puede estar presente en el sistema un gen lacl, o un derivado del mismo tal como un gen laciQ o lacQ1. El gen lacl, el cual (normalmente) es un gen expresado en forma constitutiva, codifica para la proteína represora Lac (proteína Lacl) la cual se une al operador lac de estos promotores. Por lo tanto, en casos en los que se utilice un promotor de la familia lac, el gen lacl también puede estar incluido y ser expresado en el sistema de expresión. En el caso de los miembros de la familia del promotor lac, por ejemplo, el promotor tac, el compuesto efector es un inductor, de preferencia un inductor gratuito tal como IPTG (isopropil-ß-D-1 -tiogalactopiranósido, también llamado "isopropiltiogalactósido"). En una modalidad particular, se utiliza un promotor de la familia lac o tac en la presente invención, incluyendo Plac, Ptac, Ptre, Ptacl l , PlacUVd, lpp-PlacUV5, Ipp-lac, nprM-lac, T71 ac, T51 ac, T31 ac, y Pmac.

Otros elementos Se pueden incluir otros elementos reguladores en una construcción de expresión, incluyendo las secuencias lacO. Dichos elementos incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, secuencias de incrementador de transcripción, secuencias de incrementador de traducción, otros promotores, activadores, señales de inicio y detención de traducción, terminadores de transcripción, reguladores cistrónicos, reguladores policistrónicos, secuencias tag , tales como las secuencias "tags" de nucleótido y las secuencias codificadoras de péptido "tag", las cuales facilitan la identificación, separación, purificación, o aislamiento de un péptido expresado, incluyendo la marca His, marca Flag, marca T7, marca S, marca HSV, marca B, marca Strep, poliarginina, policisteína, polifenilalanina, ácido poliaspártico, (Ala-Trp-Trp-Pro)n, tioredoxina, beta-galactosidasa, cloramfenicol acetiltransferasa, ciclomaltodextrina gluconotransferasa, CTP:CMP-3-desoxi-D-mano-octulosonato citidiltransferasa, trpE o trpLE, avidina, estreptavidina, gen 10 de T7, gp55 de T4, proteína A de Staphylococcal, proteína G de streptococcal, GST, DHFR, CBP, MBP, dominio de unión a galactosa, dominio de unión a Calmodulina, GFP, KSI , c-myc, ompT, ompA, pelB, NusA, ubiquitina, y hemosilina A. En una modalidad, la construcción de ácido nucleico también comprende una secuencia de marca adyacente a la secuencia codificadora para el péptido recombinante de interés, o ligada a una secuencia codificadora para una cápside viral. En una modalidad, esta secuencia tag permite la purificación de la proteína. La secuencia tag puede ser una marca de afinidad , tal como una marca de afinidad de hexa-histidina. En otra modalidad, la marca de afinidad puede ser una molécula de glutation-S-transferasa. La marca también puede ser una molécula fluorescente, tal como YFP o GFP, o análogos de dichas proteínas fluorescentes. La marca también puede ser una porción de una molécula de anticuerpo, o un antígeno o ligando conocido para un compañero de unión conocido útil para purificación. La presente invención puede incluir, además de la secuencia codificadora de péptido recombinante-cápside, los siguientes elementos reguladores ligados en forma operable a la misma: un promotor, un sitio de unión a ribosoma (RBS), un terminador de transcripción, señales de inicio y detención de traducción. Los RBS útiles se pueden obtener a partir de cualquiera de las especies útiles como células hospederas en los sistemas de expresión de conformidad con la presente invención, de preferencia a partir de la célula hospedera seleccionada. Se conocen muchos RBS específicos y una variedad de RBS de consenso, por ejemplo, por ejemplo, aquellos descritos en y a los que se hace referencia por D. Fpshman ef al. , Starts of bacterial genes: estimating the reliabillty of computer predictions, Gene 234(2):257-65 (8 de julio de 1999); y B.E. Suzek et al. , A probabilistic method for identifying start codons in bacterial genomes, Bioinformatics 1 7(12): 1 123-30 (diciembre de 2001 ). Además, se pueden utilizar RBS ya sea originarios o sintéticos, por ejemplo, aquellos descritos en: EP 0207459 (RBS sintéticos); O. Ikehata eí al. , Primary structure of nitrile hydratase deduced from the nucleotide sequence of a Rhodococcus species and its expression in Escherichia coli, Eur. J. Biochem. 1 81 (3):563-70 (1 989) (secuencia RBS original de AAGGAAG). Los ejemplos adicionales de métodos, vectores, y elementos de traducción y transcripción, y otros elementos útiles en la presente invención se describen en, por ejemplo: patente E.U.A. No. 5,055,294 para Gilroy y patente E.U.A. No. 5,128,130 para Gilroy ef al.; patente E.U.A. No. 5,281 ,532 para Rammler ef al. ; patentes E. U.A Nos. 4,695,455 y 4,861 ,595 para Barnes ef al. ; patente E.U.A. No. 4,755,465 para Gray et al.; y patente E. U.A. No. 5, 169,760 para Wilcox.

Vectores La transcripción del ADN que codifica para las enzimas de la presente invención utilizando un hospedero pseudomonádido puede también incrementarse insertando una secuencia incrementadora dentro del vector o plásmldo. Los incrementadores típicos son elementos de ADN que actúan en cis, normalmente de 10 a 300 pb aproximadamente de tamaño que actúan sobre el promotor para incrementar su transcripción. En términos generales, los vectores de expresión recombinantes incluyen orígenes de replicación y marcadores susceptibles de selección que permiten la transformación de la célula hospedera pseudomonádida, por ejemplo, los péptidos de fusión péptido recombinante-cápside de la presente invención, y un promotor que se obtiene a partir de un gen altamente expresado para dirigir la transcripción de una secuencia estructural hacia el extremo 5'. Dichos promotores se describieron anteriormente. La secuencia estructural heteróloga se ensambla en fase apropiada con las secuencias de inicio y terminación de traducción. De manera opcional, y de conformidad con la presente invención, la secuencia heteróloga puede codificar para un péptido de fusión que incluya un péptido de identificación del extremo N-terminal que imparta las características deseadas, por ejemplo, estabilización o purificación simplificada del producto recombinante expresado. Los vectores de expresión útiles para ser utilizados con P. fluorescens en la expresión de los péptidos de fusión de péptido recombinante-cápside se construyen insertando una secuencia de ADN estructural que codifica para un péptido objetivo deseado fusionado con un péptido de cápside junto con las señales de inicio y terminación de traducción apropiadas en fase de lectura operable con un promotor funcional. El vector puede comprender uno o más marcadores fenotípicos susceptibles de selección y un origen de replicación para asegurar el mantenimiento del vector y para, si fuera deseable, proveer la amplificación dentro del hospedero. Los hospederos apropiados para transformación de conformidad con la presente descripción incluyen varias especies dentro del género Pseudomonas, y en particular, la cepa de célula hospedera de Pseudomonas fluorescens. Los vectores son conocidos en la técnica como útiles para expresar proteínas recombinantes en células hospederas, y cualquiera de estos se puede modificar y utilizar para expresar los productos de fusión de conformidad con la presente invención. Dichos vectores incluyen, por ejemplo, plásmidos, cósmidos y vectores de expresión de fago. Los ejemplos de vectores de plásmido útiles que se pueden modificar para ser utilizados en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, los plásmidos de expresión pBBRI MCS, pDSK51 9, pKT240, pML122, pPS10, RK2, RK6, pRO1600, y RSF1 010. Los ejemplos adicionales pueden incluir pALTER-Ex1 , pALTER-Ex2, pBAD/His, pBAD/Myc-His, pBAD/g l I I, pCal-n, pCal-n-EK, pCal-c, pCal-Kc, pcDNA 2.1 , pDUAL, pET-3a-c, pET 9a-d, pET-1 1 a-d, pET-12a-c, pET-14b, pET15b, pET-16b, pET-17b, pET-1 9b, pET-20b(+), pET-21 a-d(+), pET-22b(+), pET-23a-d(+), pET24a-d(+), pET-25b(+), pET-26b(+), pET-27b(+), pET28a-c(+), pET-29a-c(+), pET-30a-c(+), pET31 b(+), pET-32a-c(+), pET-33b(+), pET-34b(+), pET35b(+), pET-36b(+), pET-37b(+), pET-38b(+), pET-39b(+), pET-40b(+), pET-41 a-c(+), pET-42a-c(+), pET-43a-c(+), pETBIue-1 , pETBIue-2, pETBIue-3, pGEMEX-1 , pGEMEX-2, pGEXI?T, pGEX-2T, pGEX-2TK, pGEX-3X, pGEX-4T, pGEX-5X, pGEX-6P, pHAT10/1 1 /12, pHAT20, pHAT-GFPuv, pKK223-3, pLEX, pMAL-c2X, pMAL-c2E, pMAL-c2g, pMAL-p2X, pMAL-p2E, pMAL-p2G, pProEX HT, pPROLar.A, pPROTet.E, pQE-9, pQE-16, pQE-30/31 /32, pQE-40, pQE-50, pQE-70, pQE-80/81 /82L, pQE-100, pRSET, y pSE280, pSE380, pSE420, pThioHis, pTrc99A, pTrcHis, pTrcHis2, pTriEx-1 , pTriEx-2, pTrxFus. Otros ejemplos de dichos vectores útiles incluyen aquellos descritos por, por ejemplo: N. Hayase, en Appl. Envir. Microbiol. 60(9):3336-42 (septiembre de 1994); A. A. Lushnikov ef al. , en Basic Life Sci. 30:657-62 (1985); S. Graupner y W. Wackernagel, en Biomolec. Eng. 1 (1 ): 1 -16. (octubre de 2000); H.P. Schweizer, en Curr. Opin.

Biotech. 12(5):439-45 (octubre de 2001); M. Bagdasarian y K.N. Timmis, en Curr. Topics Microbiol. Immunol. 96:47-67 (1982); T. ishii eí al., en FEMS Microbiol. Lett. 116(3):307-13 (1 de marzo de 1994); I. N. Olekhnovich y Y.K. Fomichev, en Gene 140(1): 63-65 (11 de marzo de 1994); M. Tsuda y T. Nakazawa, en Gene 136(1-2): 257-62 (22 de diciembre de 1993); C. Nieto ef al., en Gene 87(1): 145-49 (1 de marzo de 1990); J. D. Jones y N. Gutterson, en Gene 61(3): 299-306 (1987); M. Bagdasarian eí al., en Gene 16(1-3): 237-47 (diciembre de 1981); H.P. Schweizer eí al., en Genet. Eng. (NY) 23:69- 81 (2001); P. Mukhopadhyay eí al., en J. Bact. 172(1): 477-80 (enero de 1990); D. O. Wood eí al., en J. Bact. 145(3): 1448-51 (marzo de 1981); y R. Holtwick ef al., en Microbiology 147 (etapa 2): 337-44 (febrero 2001). Los ejemplos adicionales de vectores de expresión que se pueden utilizar en células hospederas del género Pseudomonas Incluyen aquellas listadas en el cuadro 2 tal como se obtienen a partir de los replicones indicados.

CUADRO 2 Algunos eiemplos de vectores de expresión útiles CUADRO 2 (cont.) El plásmido de expresión, RSF1 01 0, es descrito por, por ejemplo F. Heffron ef al. , en Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 72(9):3623-27 (septiembre de 1975), y por K. Nagahari y K. Sakaguchi, en J. Bact. 1 33(3): 1527-29 (marzo de 1 978). El plásmido RSF1010 y los derivados del mismo son vectores particularmente útiles en la presente invención. Los ejemplos de derivados útiles de RSF1010, los cuales son conocidos en la técnica, incluyen, por ejemplo, pKT212, pKT214, pKT231 y los plásmidos relacionados, y pMYC1 050 y plásmidos relacionados (véase, por ejemplo, patentes E.U.A Nos. 5,527,883 y 5,840,554 para Thompson ef al.), tales como, por ejemplo, pMYC1803. El plásmido pMYC1803 se obtiene a partir del plásmido pTJS260 basado en RSF10410 (véase patente E. U.A. No. 5, 169,760 para Wilcox), el cual porta un marcador de resistencia a tetraciclina regulado y los loci de replicación y movilización provenientes del plásmido RSF1 01 0. otros ejemplos de vectores útiles incluyen aquellos descritos en la patente E.U .A. No. 4,680,264 para Puhler ef al. En una modalidad, se utiliza un plásmido de expresión como el vector de expresión. En otra modalidad, se utiliza RSF1010 o un derivado del mismo como el vector de expresión. Incluso en otra modalidad , se utiliza como el vector de expresión a pMYC1050 o un derivado del mismo, o pMYC1 803 o un derivado del mismo. El sistema de expresión de pET Champion™ provee un nivel elevado de producción de proteína. La expresión se induce a partir del promotor lac de T7 fuerte. Este sistema aprovecha la elevada actividad y especificidad de la ARN polimerasa del bacteriófago T7 para la transcripción de alto nivel del gen de interés. El operador lac ubicado en la región de promotor provee regulación más estricta que los vectores basados en T7 tradicionales, lo que mejora la estabilidad del plásmido y la viabilidad celular (Studier, F. W. y B. A. Moffatt (1 986) J Molecular Biology 189(1 ): 1 13-30; Rosenberg, ef al. (1987) Gene 56(1 ): 125-35). El sistema de expresión de T7 utiliza al promotor de T7 y la ARN polimerasa de T7 (T7 RNAP por sus siglas en inglés) para la transcripción de nivel elevado del gen de interés. La expresión de nivel elevado se logra en sistemas de expresión de T7 debido a que la T7 RNAP tiene mayor capacidad de procesamiento que la RNAP de E. coli original y está dedicada a la transcripción del gen de interés. La expresión del gen identificado se induce suministrando una fuente de T7 RNAP en la célula hospedera. Esto se logra utilizando un hospedero de E. coli BL21 que contiene una copia cromosómica del gen de T7 RNAP. El gen de T7 RNAP está bajo el control del promotor lac UV5 el cual puede ser inducido por I PTG. La T7 RNAP se expresa después de la inducción y transcribe el gen de interés. El sistema de expresión pBAD permite la expresión estrictamente controlada, titulable de proteína recombinante a través de la presencia de fuentes de carbón específicos tales como glucosa, glicerol y arabinosa (Guzman, eí al. (1 995) J Bacteriology 177(14): 4121 - 30). Los vectores pBAD están diseñados en forma exclusiva para brindar un control preciso sobre los niveles de expresión. La expresión de gen heterólogo a partir de los vectores pBAD se inicia en el promotor araBAD. El promotor es regulado tanto en forma positiva como en forma negativa por el producto del gen araC. AraC es un regulador de transcripción que forma un complejo con L-arabinosa. En ausencia de L-arabinosa, el dímero de AraC bloquea la transcripción. Para la activación de transcripción máxima se requiere de dos eventos: (i) que L-arabinosa se una a AraC permitiendo que comience la transcripción, (ii) que el complejo de proteína activadora de AMPc (CAP)-AMPc se una al ADN y estimule la unión de AraC al sitio correcto de la región de promotor. El sistema de expresión trc permite expresión de alto nivel, regulada en E. coli a partir del promotor de trc. Los vectores de expresión de trc han sido optimizados para expresión de genes eucariotas en E. coli. El promotor de trc es un promotor híbrido fuerte obtenido a partir de los promotores de triptófano (trp) y lactosa (lac). Este es regulado por el operador lacO y el producto del gen laclQ (Brosius, J. (1984) Gene 27(2): 161 -72) l l l . Expresión de partículas tipo virus en organismos del género Pseudomonas La presente invención también provee un procedimiento para producir un péptido recombinante. El procedimiento incluye: a) proveer una célula de organismo del género Pseudomonas b) proveer un ácido nucleico que codifique para un péptido de fusión; en el cual la fusión es de un péptido recombinante y una cápside icosaédrica; c) expresar el ácido nucleico en la célula pseudomonádida, en el cual la expresión en la célula provee el ensamblado in vivo del péptido de fusión como partículas tipo virus; y d) aislar las partículas tipo virus. Los péptidos se pueden expresar como insertos de péptido de copia única dentro de un péptido de cápside (es decir, se expresan como insertos individuales a partir de las secuencias que codifican para el péptido de cápside recombinante que sean mono-cistrónicas para el péptido) o se pueden expresar como insertos de péptido de copia doble, triple o múltiple (es decir, se expresan como insertos concateméricos a partir de las secuencias que codifican para el péptido de cápside recombinante que sean poli-cistrónicas para el péptido; el o los insertos concateméricos pueden contener copias múltiples del mismo péptido exógeno de interés o pueden contener copias de péptidos exógenos diferentes de interés). Los concatémeros pueden ser homo-concatémeros o hetero-concatémeros. En una modalidad, la partícula tipo virus aislada se puede administrar a un humano o animal en una estrategia de vacuna. En otra modalidad, la construcción de ácido nucleico se puede co-expresar con otro ácido nucleico que codifique para una cápside de tipo silvestre. En una modalidad particular, las partículas de fusión de cápside co-expresada/péptido recombinante-cápside se ensamblan in vivo para formar una partícula tipo virus quimérica. La VLP quimérica es una partícula tipo virus que incluye cápsides o fusiones de cápside-péptido codificadas por lo menos por dos construcciones de ácido nucleico diferentes. Incluso en otra modalidad, la construcción de ácido nucleico se puede co-expresar con otro ácido nucleico que codifique para una partícula de fusión de péptido recombinante-cápside diferente. En una modalidad particular, las partículas de fusión de cápside co-expresadas se ensamblan in vivo para formar una partícula tipo virus quimérica. Incluso en otra modalidad, un segundo ácido nucleico, el cual está diseñado para expresar un péptido diferente, tal como una proteína chaperona, se puede expresar en forma concomitante con el ácido nucleico que codifica para el péptido de fusión. Las células pseudomonádidas, cápsides y péptidos recombinantes útiles para la presente invención se discutieron anteriormente. En una modalidad, el procedimiento produce por lo menos 0.1 g/l de proteína en forma de VLP. En otra modalidad, el procedimiento produce 0.1 a 1 0 g/l de proteína en forma de VLP. En submodalidades, el procedimiento produce por lo menos 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 ó 1 .0 g/l aproximadamente de proteína en la forma de VLP o estructuras de jaula. En una modalidad, la proteína recombinante total que se produce es de por lo menos 1 .0 g/l. En algunas modalidades, la cantidad de proteína de VLP que se produce es de por lo menos 5% aproximadamente, 10% aproximadamente, 15% aproximadamente, 20% aproximadamente, 25% aproximadamente, 30% aproximadamente, 40% aproximadamente, 50% aproximadamente, 60% aproximadamente, 70% aproximadamente, 80% aproximadamente, 90% aproximadamente, 95% aproximadamente o más de la proteína recombinante total producida. En una modalidad, el procedimiento produce por lo menos 0.1 g/l de VLP preformadas o estructuras de jaula. En otra modalidad, el procedimiento produce 0.1 a 10 g/l de VLP preformadas en la célula. En otra modalidad, el procedimiento produce 0.1 a 10 g/l de estructuras de jaula preformadas en la célula. En sub-modalidades, el procedimiento produce por lo menos 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 ó 1 .0 g/l aproximadamente de VLP preformadas. En una modalidad, la proteína de VLP preformada total que se produce es de por lo menos 1 .0 g/l. En sub-modalidades, la proteína de VLP total producida puede ser de por lo menos 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, 15.0, 20.0 ó 50.0 g/l aproximadamente. En algunas modalidades, la cantidad de proteína de VLP que se produce es de por lo menos 5% aproximadamente, 10% aproximadamente, 15% aproximadamente, 20% aproximadamente, 25% aproximadamente, o más de la proteína recombinante total producida. En otra modalidad, se puede producir más del 50% del péptido transgénico, péptido, proteína, o fragmentos de los mismos expresados producidos en una forma que se pueda volver a naturalizar en la célula hospedera. En otra modalidad aproximadamente el 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% de la proteína expresada se obtiene en forma activa o se puede volver a naturalizar en forma activa. El procedimiento de la invención también puede conducir a un rendimiento incrementado de proteína recombinante. En una modalidad, el procedimiento produce proteína recombinante a 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40 ó 50, 55, 60, 65, 70, ó 75% de la proteína celular total (tcp). "Por ciento de proteína celular total" es la cantidad de péptido en la célula hospedera como un porcentaje de proteína celular agregada. La determinación del por ciento de proteína celular total es bien conocida en la técnica. En una modalidad particular, la célula hospedera puede tener un nivel de expresión de péptido recombinante, péptido, proteína, o fragmento de los mismos de por lo menos 1 % de tcp y una densidad celular de por lo menos 40 g/l, cuando se cultivan (es decir dentro de un intervalo de temperatura de 4°C aproximadamente hasta 55°C aproximadamente, inclusive) en un medio con sales minerales. En una modalidad particular, el sistema de expresión puede tener un nivel de expresión de proteína o péptido recombinante de por lo menos 5% de tcp y una densidad celular de por lo menos 40 g/l, cuando se cultivan (es decir dentro de un intervalo de temperatura de 4°C aproximadamente hasta 55°C aproximadamente, inclusive) en un medio con sales minerales a una escala de fermentación de por lo menos 10 litros. En una modalidad separada, se forma una porción de la cápside viral expresada ligada en forma operable a un péptido de interés en un agregado insoluble en la célula. En una modalidad, el péptido de interés se puede renaturalizar a partir del agregado insoluble.

Corte del péptido de interés En una modalidad, el procedimiento también provee: e) cortar el producto de fusión para separar el péptido recombinante de la cápside. Se puede incluir una secuencia de enlazamiento susceptible de corte entre la proteína viral y el péptido recombinante. Los ejemplos de agentes que pueden cortar dicha secuencia incluyen, pero no se limitan a reactivos químicos tales como ácidos (HCIm ácido fórmico), CNBr, hidroxilamina (para asparagina-glicina), 2-nitro-5-tiocianobenzoato, O-yodosobenzoato, y agentes enzimáticos, tales como endopeptidasas, endoproteasas, tripsina, clostripaína, y proteasa de Staphylococcal. Las secuencias de enlazamiento susceptibles de corte son bien conocidas en la técnica. En la presente invención, se puede utilizar cualquier secuencia de enlazamiento susceptible de corte reconocida por agentes de corte, incluyendo secuencias para corte de dipéptido tales como Asp-Por.

Expresión El procedimiento de la invención conduce de manera óptima a la producción incrementada de péptido recombinante en una célula hospedera. De manera alternativa la producción incrementada puede ser un nivel incrementado de péptido activo por gramo de proteína producida, o por gramo de proteína hospedera. La producción incrementada también puede ser un nivel incrementado de péptido recuperable, tal como proteína soluble, producida por gramo de proteína recombinante o por gramo de proteína de célula hospedera. La producción incrementada también puede ser cualquier combinación de nivel total incrementado y nivel activo o soluble incrementado de proteína. La expresión mejorada de proteína recombinante puede ser a través de la expresión de la proteína insertada en las VLP. En algunas modalidades, por lo menos 60, por lo menos 70, por lo menos 80, por lo menos 90, por lo menos 1 00, por lo menos 1 1 0, por lo menos 120, por lo menos 130, por lo menos 140, por lo menos 150, por lo menos 160, por lo menos 170, o por lo menos 180 copias de un péptido de interés se expresan en cada VLP. Las VLP se pueden producir y recuperar a partir del citoplasma, periplasma o medio extracelular de la célula hospedera. En otra modalidad, el péptido puede ser insoluble en la célula. En algunas modalidades, el péptido insoluble se produce en una partícula formada a partir de cápsides múltiples pero sin que forme una VLP de tipo original. Por ejemplo, se puede formar una estructura de jaula que tenga cuando mucho 3 cápsides virales. En algunas modalidades, la estructura de cápside incluye más de una copia de un péptido de interés y en algunas modalidades, incluye por lo menos 10, por lo menos 20, o por lo menos 30 copias. El péptido o la secuencia de cápside viral también puede incluir uno o más secuencias para selección de blanco o secuencias que ayuden a la purificación. Estas pueden ser una marca de afinidad. Estas también pueden ser secuencias para selección de blanco que dirijan el ensamblado de las cápsides como una VLP.

Crecimiento celular La transformación de las células hospederas de Pseudomonas con el o los vectores se puede efectuar utilizando cualquier metodología de transformación conocida en la técnica, y las células hospederas bacterianas se pueden transformar como células intactas o como protoplastos (es decir incluyendo citoplastos). Los ejemplos de metodologías de transformación incluyen metodologías de poración, por ejemplo, electroporación, fusión de protoplasto, conjugación bacteriana, y tratamiento con catión divalente, por ejemplo tratamiento con cloruro de calcio o tratamiento con CaCI/Mg2+, u otros métodos bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Morrison, J. Bact. , 132:349-351 (1977); Clark-Curtiss y Curtiss, Methods in Enzymology, 101 :347-362 (Wu eí al. , eds, 1983), Sambrook et al. , Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed. 1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); y Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al. , eds., 1994)). Tal como se utiliza en la presente invención, el término "fermentación" incluye tanto modalidades en las cuales se emplea la fermentación literal así como modalidades en las cuales se emplean otros modos de cultivo no fermentativos. La fermentación se puede efectuar a cualquier escala. En una modalidad, el medio de fermentación se puede elegir a partir de entre medios ricos, medios mínimos, y medios con sales minerales. Se puede utilizar un medio enriquecido, pero éste de preferencia se evita. En otra modalidad se selecciona cualquiera de un medio mínimo o un medio con sales minerales. Incluso en otra modalidad, se selecciona un medio mínimo. Incluso en otra modalidad, se selecciona un medio con sales minerales. Son particularmente preferidos los medios con sales minerales. Los medios con sales minerales consisten de sales minerales y una fuente de carbono tales, por ejemplo, glucosa, sacarosa, o glicerol. Los ejemplos de medios con sales minerales incluyen, por ejemplo, medio M9, medio para Pseudomonas (ATCC 179), medio de Davis y Minglioli (véase, BD Davis y ES Minglioli (1950) en J. Bact. 60: 17-28). Las sales minerales utilizadas para elaborar medios con sales minerales incluyen aquellas que se seleccionan a partir de entre otras, fosfatos de potasio, sulfato de amonio o cloruro de amonio, sulfato o cloruro de magnesio, y minerales vestigiales tales como cloruro de calcio, borato, y sulfatos de hierro, cobre, manganeso o zinc. No se incluye fuente de nitrógeno orgánico, tal como peptona, triptona, aminoácidos, o un extracto de levadura, en un medio con sales minerales. En cambio, se utiliza una fuente de nitrógeno inorgánico y ésta se puede seleccionar de entre otras, por ejemplo, sales de amonio, amoniaco acuoso, y amoniaco gaseoso. Un medio con sales minerales preferido puede contener glucosa como la fuente de carbono. En comparación con los medios de sales minerales, los medios mínimos también pueden contener sales minerales y una fuente de carbono, pero se pueden complementar con, por ejemplo, niveles bajos de aminoácidos, vitaminas, peptonas, u otros ingredientes, aunque éstos se agregan a niveles muy mínimos. El cultivo de densidad celular elevada puede iniciar como un procedimiento intermitente que es seguido por un cultivo de lote de alimentación de dos fases. Después del crecimiento no limitado en la parte de lotes, el crecimiento de puede controlar a una velocidad de crecimiento específica reducida a lo largo de un período de 3 tiempos de duplicación en los cuales la concentración de biomasa se puede incrementar varias veces. Los detalles adicionales de dichos procedimientos de cultivo son descritos por Ríesenberg, D. ; Schuiz, V. ; Knorre, W. A.; Pohl, H. D.; Korz, D.; Sanders, E. A. ; Ross, A. ; Deckwer, W.D. (1991 ) "High cell density cultivation of Escherichia coli at controlled speclfic growth rate" J Biotechnol: 20(1 ) 17-27. El sistema de expresión de conformidad con la presente invención se puede cultivar en cualquier formato de fermentación. Por ejemplo, se pueden emplear en la presente invención modos de fermentación por lotes, por lote de alimentación, semi-continuos, y continuos. Los sistemas de expresión de conformidad con la presente invención son útiles para la expresión de transgen a cualquier escala (es decir volumen) de fermentación. Por lo tanto, por ejemplo, se puede utilizar volúmenes de fermentación a escala de microlitros, a escala de centilitros, y a escala de decilitros; y se puede utilizar volúmenes de fermentación a escala de 1 litro y más grandes. En un modalidad, el volumen de fermentación puede ser o estar por encima de 1 litro. En otra modalidad, el volumen de fermentación está en o por encima de 5 litros, 10 litros, 15 litros, 20 litros, 25 litros, 50 litros, 75 litros, 1 00 litros, 200 litros, 500 litros, 1 ,000 litros, 2,000 litros, 5,000 litros, ó 50,000 litros. En la presente invención, el cultivo, crecimiento y/o fermentación de las células hospederas transformadas se efectúa dentro de un intervalo de temperatura que permita la supervivencia de las células hospederas, de preferencia una temperatura dentro del intervalo de 4°C aproximadamente hasta 55°C aproximadamente, inclusive. Por lo tanto, por ejemplo, los términos "crecimiento" (y "crecer", "que crece"), "cultivar" (y "cultivo"), y "fermentación" (y "fermenta", "que fermenta"), tal como se utilizan en la presente invención con respecto a las células hospederas de la presente invención, significan en forma inherente "crecer", "cultivar", y "fermentación", dentro de un intervalo de temperatura de 4°C aproximadamente hasta 55°C aproximadamente, inclusive. Además, "crecimiento" se utiliza para indicar ambos estados biológicos de división celular activa y/o agrandamiento, así como estados biológicos en los cuales una célula no en división y/o no en crecimiento se sostiene metabólicamente, siendo el uso último del término "crecimiento" sinónimo con el término "mantenimiento".

Densidad celular Una ventaja adicional de utilizar Pseudomonas fluorescens para expresar péptidos recombinantes enclaustrados en VLP incluye la capacidad de Pseudomonas fluorescens para que se cultive en densidades celulares elevadas en comparación con E. coli. u otros sistemas de expresión bacterianos. Para este fin, los sistemas de expresiones de Pseudomonas fluorescens de conformidad con la presente invención pueden proveer una densidad celular de aproximadamente 20 g/l o mayor. Los sistemas de expresiones de Pseudomonas fluorecens de conformidad con la presente invención de igual manera pueden proveer una densidad celular de por lo menos 70 g/l aproximadamente, como queda indicado en términos de biomasa por volumen, midiendo la biomasa como peso celular seco. En una modalidad, la densidad celular es de por lo menos 20 g/l. En otra modalidad, la densidad celular será de por lo menos 25 g/l, 30 g/l, 35 g/l, 40 g/l, 45 g/l, 50 g/l, 60 g/l, 70 g/l, 80 g/l, 90 g/l, 100 g/l, 1 10 g/l, 120 g/l, 130 g/l, 140 g/l, o por lo menos 150 g/l. En otras modalidades, la densidad celular en la inducción está entre 20 g/l y 1 50 g/l; 20 g/l y 120 g/l; 20 g/l y 80 g/l; 25 g/l y 80 g/l; 30 g/l y 80 g/l; 35 g/l y 80 g/l; 40 g/l y 80 g/l; 45 g/l y 80 g/l; 50 g/l y 80 g/I; 50 g/l y 75 g/l; 50 g/l y 70 g/I; 40 g/l y 80 g/l.

Aislamiento de VLP o péptido de interés En algunas modalidades, la invención provee un procedimiento para mejorar la recuperación de péptidos de interés mediante protección del péptido durante la expresión a través del enlazamiento y co-expresión con una cápside viral. En algunas modalidades, la fusión de cápside de viral forma una VLP, la cual se puede separar fácilmente del lisado celular. Las proteínas de esta invención se pueden aislar, y purificar hasta una pureza sustancial utilizando técnicas estándar bien conocidas en el campo, incluyendo, pero sin limitarse a, precipitación son sulfato de amonio o etanol, extracción acida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía con fosfocelulosa, cromatografía por interacción hidrofóbica, cromatografía de afinidad, cromatografía con níquel, cromatografía con hidroxilapatita, cromatografía de fase inversa, cromatografía con lectina, electroforesis preparativa, solubilización con detergente, precipitación selectiva con sustancias tales como cromatografía de columna, métodos de inmuno-purificación, y otros. Por ejemplo, las proteínas que tengan propiedades de adhesión molecular establecidas se pueden fusionar en forma reversible a un ligando. Con el ligando apropiado, la proteína se puede adsorber en forma selectiva a una columna de purificación y después liberar de ía columna en una forma relativamente pura. La proteína fusionada se retira después mediante actividad enzimática. Además, la proteína se puede purificar utilizando columnas de inmuno-afinidad o columnas de Ni-NTA. Las técnicas generales se describen de manera adicional en, por ejemplo, R. Scopes, Protein Purification: Principies and Practice, Springer-Verlag: N.Y. (1982); Deutscher, Guide to Protein Purification, Academic Press (1 990); patente E. U.A. No. 4,51 1 ,503; S. Roe, Protein Purification Techniques: A Practical Approach (Practical Approach Series), Oxford Press (2001 ); D. Bollag, eí al. , Protein Methods, Wiley-Lisa, Inc. (1996); AK Patra eí al. , Protein Expr Purif, 18(2):p/1 82-92 (2000); y R. Mukhija, eí al. , Gene 165(2): p. 303-6 (1 995). Véase también, por ejemplo, Ausubel, eí al. (1987 y suplementos periódicos); Deutscher (1990) "Guide to Protein Purification", Methods in Enzymology vol. 182, y otros volúmenes en esta serie; Coligan, eí al. (1996 y suplementos periódicos) Current Protocols in Protein Science Wiley/Greene, NY; y la literatura del fabricante respecto al uso de productos para purificación de proteína, por ejemplo, Pharmacia, Piscataway, N.J. , o Bio-Rad , Richmond, Calif. La combinación con técnicas recombinantes permite la fusión a segmentos apropiados, por ejemplo, a una secuencia FLAG o un equivalente el cual se puede fusionar a través de una secuencia removible con proteasa. Véase además, por ejemplo, Hochuli (1 989) Chemische Industrie 12:69-70; Hochuli (1 990) "Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent" ¡n Setlow (ed.) Genetic Engineering, Principie and Methods 12:87-98, Plenum Press, NY; y Crowe, eí al. (1992) QIAexpress: The High Level Expression & Protein Purification System QU IAGEN, Inc. , Chatsworth, Calif. De manera similar, las partículas tipo virus o las estructuras tipo jaula se pueden aislar y/o purificar hasta pureza sustancial utilizando técnicas estándar bien conocidas en el cambio. Las técnicas para aislamiento de VLP, incluyen, además de aquellas descritas anteriormente, técnicas de precipitación tales como precipitación con polietilenglicol o con sal. Las técnicas de separación incluyen cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía por exclusión de tamaño, cromatografía con fosfocelulosa, cromatografía por interacción hidrofóbica, cromatografía de afinidad, cromatografía con níquel, cromatografía con hidroxilapatita, cromatografía de fase inversa, cromatografía con lectina, electroforesis preparativa, métodos de inmuno-purificación, centrifugación, ultra-centrifugación, centrifugación por gradiente de densidad (por ejemplo, en un gradiente de sacarosa o un gradiente de cloruro de cesio (CsCl)), ultra-filtración a través de un filtro para exclusión por tamaños, y cualesquiera otros métodos de aislamiento de proteínas conocidos en la técnica. La invención también puede mejorar la recuperación de péptidos recombinantes activos. Los niveles de proteína activa se pueden medir, por ejemplo, midiendo la interacción entre un péptido identificado y un péptido precursor, variante de péptido, péptido sustituido con segmento y/o péptido sustituido con residuo utilizando cualquier prueba in vitro o in vivo conveniente. Por lo tanto, se puede.n utilizar pruebas in vitro para determinar cualquier interacción detectable entre una proteína identificada y un péptido de interés, por ejemplo entre enzima y substrato, entre hormona y receptor de hormona, entre anticuerpo y antígeno, etc. Dicha detección puede incluir la medición de cambios colorimétricos, cambios en radioactividad, cambios en solubilidad, cambios en peso molecular según se mide mediante electroforesis en gel y/o procedimientos de exclusión en gel, etc. Las pruebas in vivo incluyen, pero no se limitan a, pruebas para detectar efectos fisiológicos, por ejemplo ganancia de peso, cambio en el equilibrio de electrolitos, cambio en el tiempo de coagulación sanguíneo, cambios en la disolución de coágulos y la inducción de respuesta antigénica. En términos generales, se puede utilizar cualquier prueba in vivo en tanto que exista un parámetro variable para detectar un cambio en la interacción entre el péptido identificado y el péptido de interés. Véase, por ejemplo, patente E. U.A. No. 5,834,250. Para liberar las proteínas recombinantes a partir del periplasma, se han utilizado tratamientos que implican productos químicos tales como cloroformo (Ames et al. (1 984) J. Bacteriol. , 160: 1 1 81 -1 183), clorhidrato de guanidina, y tritón X-100 (Naglak y Wang (1990) Enzyme Microb. Technol. , 12: 603-61 1 ). Sin embargo, estos compuestos químicos no son inertes y pueden tener efectos perjudiciales sobre muchos productos de proteína recombinantes o sobre los procedimientos de purificación subsiguientes. El tratamiento con glicina de células de E. coli, que ocasiona la permeabilización de la membrana exterior, también se ha reportado para liberar los contenidos periplasmáticos (Ariga eí al. (1989) J. Ferm. Bioeng, 68: 243-246). Los métodos utilizados más ampliamente de liberación periplasmática de proteína recombinante son choque osmótico (Nosal y Heppel (1966) J. Biol. Chem., 241 : 3055-3062; Neu y Heppel (1965) J. Biol. Chem., 240: 3685-3692), tratamiento con llsozima de clara de huevo de gallina (HEW)/ácido etilendiamintetra-acético (Neu y Heppel (1964) J. Biol. Chem., 239: 3893-3900; Witholt eí al. (1976) Biochim. Biophys. Acta, 443: 534-544; Pierce ef al. (1995) ICheme Research. Event, 2: 995-997), y tratamiento de choque osmótico/lisozima de H.EW (French ef al. (1996) Enzyme and Microb. Tech. , 19: 332-338). El método de French implica la re-suspensión de las células en una solución reguladora para fraccionamiento seguido por la recuperación de la fracción peri- plasmática, en la cual el choque osmótico inmediatamente sigue al tratamiento con lisozima. Los efectos de sobre-expresión de la proteína recombinante, a-amilasa de S. thermoviolaceus, y la fase de crecimiento del organismo hospedero en la recuperación también se discuten. Típicamente, estos procedimientos incluyen una disrupción inicial en medio osmóticamente estabilizador seguido por liberación selectiva en medio no estabilizador. La composición de estos medios (pH, agente protector) y los métodos de ruptura utilizados (cloroformo, lisozima de HEW, EDTA, irradiación de energía sónica) varían entre los procedimientos específicos reportados. Una variación en el tratamiento de lisozima de HEW/EDTA utilizando un detergente iónico dipolar en lugar de EDTA es discutido por Stabel eí al. (1994) Veterinary Microbio/. , 38:307-314. Para una revisión general del uso de sistemas enzimáticos líticos intracelulares para lisar E. coli, véase Dabora y Cooney (1990) en Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Vol. 43, A. Fiechter, ed. (Springer-Verlag: Berlín), pp. 1 1 -30. Los métodos convencionales para la recuperación de proteína recombinante a partir del citoplasma, como proteína soluble o como partículas refringentes, implica la desintegración de la célula bacteriana utilizando rompimiento mecánico. El rompimiento mecánico típicamente implica la generación de cavitaciones locales en una suspensión líquida, agitación rápida con glóbulos rígidos, irradiación de energ ía sónica, o molienda de la suspensión celular (Bacterial Cell Surface Techniques, Hancock y Poxton (John Wiley y Sons Ltd, 1988), capítulo 3, p. 55). La lisozima de HEW actúa bioquímicamente para hidrolizar la estructura base de péptido glucano de la pared celular. El método fue desarrollado por primera vez por Zinder y Arndt (1956) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 42:586-590, quienes trataron E. coli con albúmina de huevo (la cual contiene lisozima de HEW) para producir esferas celulares redondas conocidas posteriormente como esferoplastos. Estas estructuras conservan algunos componentes de la pared celular pero tienen áreas de superficie grandes en las cuales queda expuesta a la membrana citoplasmática. La patente E. U.A. No. 5, 169,772 describe un método para purificar heparinasa a partir de bacterias que comprende romper la envoltura de la bacteria en un medio osmóticamente estabilizado, por ejemplo solución de sacarosa al 20% utilizando, por ejemplo, EDTA, lisozima, o un compuesto orgánico, liberar las proteínas de tipo no heparinasa a partir del espacio periplasmático de las bacterias usadas exponiendo las bacterias a una solución reguladora de fuerza iónica baja, y liberar las proteínas tipo heparinasa exponiendo las bacterias lavadas con baja fuerza iónica a una solución salina regulada. Se han utilizado muchas modificaciones diferentes de estos métodos en un intervalo amplio de sistemas de expresiones con grados variables de éxito (Joseph-Liazun et al. (1990) Gene, 86:291 -295; Cárter eí al. (1992) Bio/Technology, 10: 163-167). Se han reportado esfuerzos para inducir el cultivo de células recombinante para producir lisozima. El documento EP 0 155 1 89 describe medios para inducir un cultivo de célula recombinante para producir lisozimas, lo cual normalmente se esperaría que aniquile dichas células hospederas por medio de destrucción o lisado de la estructura de la pared celular. La patente E. U.A. No. 4,595,658 describe un método para facilitar la exteriorización de proteínas transportadas hacia el espacio periplasmático de E. coli. Este método permite el aislamiento selectivo de proteínas que se ubican en el periplasma sin la necesidad de tratamiento con lisozima, molienda mecánica, o tratamiento por choque osmótico de las células. La patente E. U.A. No. 4,637,980 describe la producción de un producto bacteriano transformando un lisógeno sensible a la temperatura con un molécula de ADN que codifique, de manera directa o indirecta, para el producto, cultivar el transformante bajo condiciones permisivas para expresar el producto génico en forma intracelular, y exteriorizar el producto elevando a la temperatura para inducir funciones codificadas por fago. Asami ef al. (1997) J. Ferment. and Bioeng., 83: 51 1 -516 describen la disrupción sincronizada de células de E. coli mediante infección con fago T4, y Tanji ef al. (1998) J. Ferment. and Bioeng. , 85: 74-78 describen la expresión controlada de genes de lisis codificados en el fago T4 para el rompimiento suave de células de E. coli. Después de la lisis celular, el ADN genómico se sale del citoplasma hacia el medio y da como resultado un incremento significativo en la viscosidad de fluido que puede impedir la sedimentación de sólidos en un campo centrífugo. En ausencia de fuerzas de corte tangencial tal como aquellas ejercidas durante el rompimiento mecánico para disociar los polímeros de ADN, la velocidad de sedimentación más baja de los sólidos a través del fluido viscoso da como resultado la pobre separación de sólidos y líquidos durante la centrifugación. Además de la fuerza de corte mecánico, se presentan enzimas nucleolíticas que degradan al polímero de ADN. En E. coli, el gen endógeno endA codifica para una endonucleasa (peso molecular de la proteína madura es de aproximadamente 24.5 kD) que normalmente es secretada al periplasma y corta el ADN en oligodesoxi-ribonucleótidos en una manera endonucleolítica. Se ha sugerido que E. coli expresa en forma relativamente débil a endA (Wackernagel eí al. (1995) Gene 154: 55-59). La detección de la proteína expresada se logra utilizando métodos conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, pruebas radio-¡nmunológicas, técnicas de Western blot o inmuno-precipitación. Algunas proteínas expresadas en esta invención pueden formar agregados insolubles ("cuerpos de inclusión"). Varios protocolos son apropiados para la purificación de proteínas a partir de los cuerpos de inclusión. Por ejemplo, la purificación de los cuerpos de inclusión típicamente implica la extracción, separación y/o purificación de los cuerpos de inclusión mediante rompimiento de las células hospederas, por ejemplo, mediante incubación en una solución reguladora de 50 mM TRIS/HCL pH 7.5, 50 mM NaCI, 5 mM MgCI2, 1 mM DTT, 0.1 mM ATP, y 1 mM PMSF. La suspensión celular típicamente se lisa utilizando 2-3 bases a través de una prensa de French. La suspensión celular también se puede homogenizar utilizando un aparato Polytron (Brinkrnan Instruments) o mediante irradiación de energía sónica en hielo. Los métodos alternativos de lisado bacteriano serán evidentes para los expertos en la técnica (véase, por ejemplo Sambrook eí al. , supra; Ausubel eí al. , supra). Si fuera necesario, los cuerpos de inclusión se pueden solubilizar, y la suspensión de células usadas típicamente se puede centrifugar para eliminar la materia insoluble no deseada. Las proteínas que forman los cuerpos de inclusión se puede re-naturalizar mediante dilución o diálisis con una solución reguladora compatible. Los solventes apropiados incluyen, pero no se limitan a urea (desde 4 M aproximadamente hasta 8 M aproximadamente), formamida (por lo menos 80% aproximadamente, volumen en volumen), y clorhidrato de guanidina (desde 4 M aproximadamente hasta 8 M aproximadamente), aunque el clorhidrato de guanidina y los agentes similares son desnaturalizantes, esta desnaturalización no es irreversible y la renaturalización se puede presentar después de retirar (mediante diálisis, por ejemplo) o dilución dei desnaturalizante, lo que permite la re-formación de proteína inmunológicamente y/o biológicamente activa. Los expertos en la técnica conocen otras soluciones reguladoras apropiadas. De manera alternativa, es posible purificar los péptidos recombinantes a partir del periplasma del hospedero. Después de la lisis de la célula hospedera, cuando la proteína recombinante se exporta al interior del periplasma de la célula hospedera, la fracción periplasmática de la bacteria se puede aislar mediante choque osmótico en frío además de otros métodos conocidos por el experto en la técnica. Para aislar proteínas recombinantes a partir del periplasma, por ejemplo, las células bacterianas se pueden centrifugar para formar un comprimido. El comprimido se puede volver a suspender en una solución reguladora que contenga 20% de sacarosa. Para lisar las células, las bacterias se pueden centrifugar y el comprimido se puede volver a suspender en solución helada 5 mM de MgSO y mantener en un baño de hielo durante 10 minutos aproximadamente. La suspensión de célula se puede centrifugar y el sobrenadante se decanta y se guarda. Las proteínas recombinantes presentes en el sobrenadante se pueden separar de las proteínas del hospedero mediante técnicas de separación estándar bien conocidas por los expertos en la técnica. Un fraccionamiento inicial con sal puede separar muchas de las proteínas de la célula hospedera no deseadas (o proteínas obtenidas a partir del medio de cultivo celular) de la proteína recombinante de interés. Uno de dichos ejemplos puede ser sulfato de amonio. El sulfato de amonio precipita las proteínas reduciendo en forma efectiva la cantidad de agua en la mezcla de proteína. Las proteínas precipitan después con base a su solubilidad. Mientras más hidrofóbica sea una proteína, más probablemente se va a precipitar a concentraciones más bajas de sulfato de amonio. Un protocolo típico incluye agregar sulfato de amonio saturado a una solución de proteína de modo tal que la concentración de sulfato de amonio resultante este entre 20-30%. Esta concentración va a precipitar a las más hidrofóbicas de las proteínas. El precipitado se desecha después (a menos que la proteína de interés sea hidrofóbica) y se agrega sulfato de amonio al sobrenadante a una concentración conocida para precipitar la proteína de interés. El precipitado se solubiliza después en solución reguladora y la sal en exceso se remueve si fuera necesario, ya sea a través de diálisis o diafiltración. Se pueden utilizar otros métodos que se basan en la solubilidad de las proteínas, tales como la precipitación con etanol frío, los cuales son bien conocidos por los expertos en la técnica, para fraccionar mezclas complejas de proteínas. Se puede utilizar el peso molecular de una proteína recombinante para aislarla de las proteínas de mayor y menor tamaño utilizando ultra-filtración a través de membranas de tamaño de poro diferente (por ejemplo, membranas Amicon o Millipore). Como un primer paso, la mezcla de proteína se puede someter a ultra-filtración a través de una membrana con un tamaño de poro que tenga un corte de peso molecular más bajo que el peso molecular de la proteína de interés. El material retenido de la ultra-filtración se puede después someter nuevamente a ultra-filtración contra una membrana con un corte molecular mayor que el del peso molecular de la proteína de interés. La proteína recombinante pasa a través de la membrana hacia el material filtrado. El material filtrado se puede después someter a cromatografía como se describe más adelante. Las proteínas recombinantes también se pueden separar de otras proteínas con base a su tamaño, carga de superficie neta, carácter hidrofóbico, y afinidad para ligandos. Además, se pueden conjugar anticuerpos creados contra proteínas a matrices de columna y las proteínas se someten a inmuno-purificación. Todos estos métodos son bien conocidos en la técnica. Será evidente para el experto en la técnica que se pueden efectuar técnicas cromatográficas a cualquier escala y utilizando equipo proveniente de muchos fabricantes diferentes (por ejemplo, Pharmacia Biotech).

Re-naturalización y repliegue La proteína insoluble se puede re-naturalizar o replegar para generar conformación de estructura de proteína secundaria y terciaria. Se pueden utilizar pasos de repliegue de proteína, según sea necesario, para completar la configuración del producto recombinante. El repliegue y re-naturalización se puede lograr utilizando un agente que sea conocido en la técnica para promover la disociación/asociación de proteínas. Por ejemplo, la proteína se puede incubar con ditiotreitol seguido por incubación con sal disódica de glutatión oxidado seguido por incubación con una solución reguladora que contenga un agente para repliegue tal como urea. La proteína recombinante también se puede re-naturalizar, por ejemplo, dializándola contra solución salina regulada con fosfato (PBS) o solución reguladora de acetato de sodio 50 mM, pH 6, más 200 mM de NaCl. De manera alternativa, la proteína se puede replegar mientras se encuentra en inmóvil en una columna, tal como la columna Ni-NTA utilizando un gradiente lineal de urea 6M-1 M en 500 mM de NaCI, 20% de glicerol, Tris/HCI 20 mM, pH 7.4, que contiene inhibidores de proteasa. La re-naturalización se puede efectuar a lo largo de un período de 1 .5 horas o más. Después de la re-naturalización las proteínas se pueden eluir mediante la adición de 250 mM de imidazol. El imidazol se puede eliminar mediante un paso de diálisis final contra PBS o solución reguladora de acetato de sodio 50 mM, pH 6, más 200 mM de NaCl. La proteína purificada se puede almacenar a 4°C o congelar a - 80°C. Otros métodos incluyen, por ejemplo, aquellos que pueden describirse en MH Lee eí al. , Protein Expr. Purif., 25(1 ): p. 166-73 (2002), W. K. Cho eí al. , J. Biotechnology, 77(2-3): p. 169-78 (2000), Ausubel, eí al. (1987 y suplementos periódicos), Deutscher (1990) "Guide to Protein Purification", Methods in Enzymology vol. 182, y otros volúmenes en esta serie; Coligan, eí al. (1996 y suplementos periódicos) Current Protocols in Protein Science Wiley/Greene, NY, S. Roe, Protein Purification Techniques: A Practical Approach (Practical Approach Series), Oxford Press (2001 ); D. Bollag, ef al. , Protein Methods, Wiley-Lisa, Inc. (1996).

Análisis de péptido activo Las proteínas activas pueden tener una actividad específica de por lo menos 20%, 30%, ó 40%, y de preferencia por lo menos 50%, 60%, ó 70%, y más preferido aún por lo menos 80%, 90%, ó 95% que la del péptido original a partir del cual se obtiene la secuencia. Asimismo, la especificidad de substrato (kcat/Km) es de manera opcional sustancialmente similar a la del péptido original. Típicamente, kca-¡7Km será de por lo menos 30%, 40%, ó 50%, de la del péptido nativo; y de manera más preferible por lo menos 60%, 70%, 80%, ó 90%. Los métodos para analizar y cuantificar las medidas de proteína y actividad de péptido y especificidad de substrato (kCat/Km), son bien conocidos por los expertos en la técnica. La actividad de un péptido recombinante que se produce de conformidad con la presente invención se puede medir mediante cualquier prueba convencional específica de proteína o estándar in vitro o in vivo conocida en la técnica. Se puede comparar la actividad del péptido recombinante producido por Pseudomonas con la actividad de la proteína original correspondiente para determinar si la proteína recombinante presenta o no actividad sustancialmente similar o equivalente a la actividad generalmente observada en el péptido original bajo las mismas condiciones o condiciones fisiológicas similares. La actividad de la proteína recombinante se puede comparar con una actividad estándar de péptido original previamente establecida. De manera alternativa, la actividad del péptido recombinante se puede determinar en una prueba simultánea, o sustancialmente simultánea, comparativa con el péptido original. Por ejemplo, se puede utilizar una prueba in vitro para determinar cualquier interacción detectable entre un péptido recombinante y un objetivo, por ejemplo, entre una enzima expresada y el substrato, entre la hormona expresada y el receptor de hormona, entre el anticuerpo expresado y el antígeno, etc. Dicha detección puede incluir la medición de cambios colorimétricos, cambios de proliferación, muerte celular, repulsión celular, cambios en radioactividad, cambios en solubilidad, cambios en peso molecular según se miden mediante electrofóresis en gel y/o métodos de exclusión en gel, capacidades de fosforilación, pruebas de especificidad a anticuerpo tales como las pruebas ELISA, etc. Además, las pruebas in vivo incluyen, pero no se limitan a, pruebas para detectar efectos fisiológicos del péptido producido por Pseudomonas en comparación con los efectos fisiológicos del péptido original, por ejemplo ganancia en peso, cambio en equilibrio de electrolitos, cambio en el tiempo de coagulación sanguíneo, cambios en la disolución de coágulo y la inducción de respuesta antigénica. En términos generales, se puede utilizar cualquier prueba in vitro o in vivo para determinar la naturaleza activa del péptido recombinante producido por Pseudomonas que permita un análisis comparativo con el péptido original en tanto que dicha actividad se pueda analizar. De manera alternativa, los péptidos producidos en la presente invención se pueden analizar respecto a la capacidad para estimular o inhibir la interacción entre el péptido y una molécula que normalmente interactúa con el péptido, por ejemplo, un substrato o un componente de la ruta de señal con la cual interactúa normalmente la proteína nativa. Dichas pruebas pueden incluir típicamente los pasos de combinar la proteína con un molécula de substrato bajo condiciones que permitan que el péptido interactúe con la molécula objetivo, y detectar la consecuencia bioquímica de la interacción con la proteína y la molécula objetivo. Las pruebas que se pueden utilizar para determinar la actividad de péptido se describen, por ejemplo, en Ralph, P. J. , ef al. (1 984) J. Immunol. 132: 1858 o Saiki et al. (1981 ) J. Immunol. 127:1044, Steward, W. E. II (1980) The Interferon Systems. Springer-Verlag, Vienna y New York, Broxmeyer, H . E., ef al. (1982) Blood 60:595, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2d ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Sambrook, J. , E. F. Fritsch y T. Maniatis eds., 1 989, y "Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques", Academic Press, Berger, S. L. y A. R. Kimmel eds. , 1 987, AK Patra eí al. , Protein Expr Purif, 18(2): p/1 82-92 (2000), Kodama ef al. , J. Biochem. 99: 1465-1472 (1986); Stewart ef al. , Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90:5209-521 3 (1 993); (Lombillo ef al. , J. Cell Biol. 128: 107-1 15 (1995); (Vale eí al. , Cell 42:39-50 (1985).

EJEMPLOS En estos ejemplos, se utiliza el virus del moteado clorótico del garbanzo (CCMV) como un portador de péptido y se utiliza Pseudomonas fluorescens como el hospedero de expresión. CCMV es un miembro del grupo bromovirus de la familia Bromoviridae. Los bromovirus son virus icosaédricos de 25-28 nanómetros de diámetro con un genoma de ARN de cadena sencilla, de sentido positivo, de cuatro componentes. ARN 1 y ARN2 codifican para las enzimas replicasa. ARN3 codifica para una proteína implicada en el movimiento viral dentro de los hospederos vegetales. ARN4 (un ARN subgenómico obtenido a partir de ARN3), es decir ARN4sg, codifica para la cápside de 20 kDa (CP), SEQ ID NO: 1 .

Cápside de CCMV de tipo silvestre codificada por sgARN4 (SEQ ID NO: 1 ) Met Ser Thr Val Gly Thr Gly Lys Leu Thr Arg Ala Gln Arg Arg Ala Ala Ala Arg Lys Asn Lys Arg Asn Thr Arg Val Val Gln Pro Val lle Val Glu Pro lle Ala Ser Gly Gln Gly Lys Ala lle Lys Ala Trp Thr Gly Tyr Ser Val Ser Lys Trp Thr Ala Ser Cys Ala Ala Ala Glu Ala Lys Val Thr Ser Ala lle Thr lle Ser Leu Pro Asn Glu Leu Ser Ser Glu Arg Asn Lys Gln Leu Lys Val Gly Arg Val Leu Leu Trp Leu Gly Leu Leu Pro Ser Val Ser Gly Thr Val Lys Ser Cys Val Thr Glu Thr Gln Thr Thr Ala Ala Ala Ser Phe Gln Val Ala Leu Ala Val Ala Asp Asn Ser Lys Asp Val Val Ala Ala Met Tyr Pro Glu Ala Phe Lys Gly lle Thr Leu Glu GIn Leu Thr Ala Asp Leu Thr lle Tyr Leu Tyr Ser Ser Ala Ala Leu Thr Glu Gly Asp Val lle Val His Leu Glu Val Glu His Val Arg Pro Thr Phe Asp Asp Ser Phe Thr Pro Val Tyr Cada partícula de CCMV contiene hasta 180 copias aproximadamente de la CP de CCMV. Una secuencia de ADN de ejemplo que codifica para la CP de CCMV se muestra en SEQ ID NO: 21 .

Eiemplo de secuencia de ADN que codifica para la CP de CCMV (SEQ ID NO: 21 ) atg tet acá gtc gga acá ggg aag tta act cgt gca caá cga agg gct gcg gcc cgt aag aac aag cgg aac act cgt gtg gtc caá cct gtt att gta gaa ccc atc gct tca ggc caá ggc aag gct att aaa gca tgg acc ggt tac age gta tcg aag tgg acc gcc tet tgc gcg gcc gcc gaa gct aaa gta acc tcg gct ata act atc tet etc cct aat gag cta tcg tec gaa agg aac aag cag etc aag gta ggt aga gtt tta tta tgg ctt ggg ttg ctt ccc agt gtt agt ggc acá gtg aaa tec tgt gtt acá gag acg cag act act gct gct gcc tec ttt cag gtg gca tta gct gtg gcc gac aac tcg aaa gat gtt gtc gct gct atg tac ccc gag gcg ttt aag ggt ata acc ctt gaa caá etc acc gcg gat tta acg atc tac ttg tac age agt gcg gct etc act gag ggc gac gtc atc gtg cat ttg gag gtt gag cat gtc aga cct acg ttt gac gac tet ttc act ccg gtg tat tag. Se ha resuelto la estructura cristalina de CCMV. Esta estructura provee una imagen más clara de las interacciones de la cápside que parecen ser críticas para la estabilidad y dinámica de la partícula y ha sido útil para guiar el diseño racional de sitios de inserción. Los estudios previos han demostrado que las cápsides de CCMV se pueden modificar genéticamente para que porten péptidos heterólogos sin que interfieran con su capacidad para formar partículas. Se han identificado un número de sitios de inserción apropiados. La estrategia general seguida para la producción de VLP de fusión cápside-péptido en P. fluorescens se muestra en forma de diagrama en la figura 2. Se puede insertar un total de hasta 180 copias de una unidad de péptido heterólogo (ya sea péptido individual o concatámero) en la partícula de CCMV si se utiliza un solo sitio de inserción en la CP de CCMV. Los sitios de inserción identificados dentro de la CP de CCMV hasta la fecha pueden acomodar péptidos de diversas longitudes. Además, se pueden insertar formas multiméricas de los péptidos en los sitios de inserción. Asimismo, se pueden utilizar sitios de inserción múltiples al mismo tiempo para expresar péptidos ¡guales o diferentes en/sobre la misma partícula. Los insertos de péptido pueden ser de 200 residuos de aminoácido aproximadamente de longitud o menos, de manera más preferida hasta o aproximadamente 180, incluso más preferido hasta o aproximadamente 1 50, incluso más preferido aún hasta o aproximadamente 120, de manera más preferida hasta o aproximadamente 1 00 residuos de aminoácido en longitud. En una modalidad preferida, los insertos de péptido son de 5 aproximadamente o más residuos de aminoácido en longitud. En una modalidad preferida, los insertos de péptido son de 5 aproximadamente hasta 120 aproximadamente, más preferido 5 aproximadamente hasta 100 residuos de aminoácido aproximadamente de longitud.

Materiales y métodos A menos que se indique lo contrario, se utilizan técnicas, vectores, elementos de secuencia de control, estándares y otros elementos de sistema de expresión conocidos en el campo de biología molecular para la manipulación, transformación, y expresión de ácido nucleico. Dichas técnicas estándar, vectores, y elementos se pueden encontrar, por ejemplo, en: Ausubel ef al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (1995) (John Wiley y Sons); Sambrook, Fritsch, y Maniatis (eds.), Molecular Cloning (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY); Berger y Kimmel, Methods in Enzymology 152: Guide to Molecular Cloning Techniques (1987) (Academic Press); y Bukhari ef al. (eds.), DNA Insertion Elements, Plasmids and Episomes (1977) (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY).

Construcciones de mapa de plásmido Todos los mapas de plásmido se construyen utilizando VECTORNTI (InforMax Inc. , Frederick, MD, E.U.A.).

Extracciones de ADN Todas las extracciones de ADN de plásmido a partir de E. coli se efectúan utilizando los estuches mini, midi, y maxi provenientes de Qiagen (Alemania) de conformidad con las instrucciones del fabricante.

Estrategia experimental Se siguen los siguientes procedimientos. Se transforman células hospederas de P. fluorescens con los plásmidos de expresión que codifican para fusiones de inserto de péptido objetivo-cápside viral quiméricas. Las células transformadas se hacen crecer hasta la densidad deseada y se inducen para que expresen las fusiones de péptido-cápside viral quiméricas. Las células se lisan después y se analizan sus contenidos.

Construcción de ADN de CP de CCMV modificada para agregar un sitio de inserción manipulado genéticamente Se modifica una molécula de ADN que contiene la secuencia de codificación de CP CCMV insertando, en marco de lectura, un sitio de reconocimiento de enzima de restricción ßamHI y sitio de corte (gggatcctn), el cual introduce un tripéptido (Gly-lle-Leu), dentro de la secuencia de aminoácido de CP de CCMV original, entre Asn 129 y Ser130. Por lo tanto, la secuencia de aminoácido de CP CCMV (SEQ ID NO: 1 ) se modifica para formar la CP de CCMV129 (SEQ I D NO: 2).

CP de CCMV con el sitio BamHl agregado insertado en el codón 129 (CP CCMV129) (SEQ ID NO: 2): Met Ser Thr Val Gly Thr Gly Lys Leu Thr Arg Ala GIn Arg Arg Ala Ala Ala Arg Lys Asn Lys Arg Asn Thr Arg Val Val Gln Pro Val lle Val Glu Pro lle Ala Ser Gly GIn Gly Lys Ala lle Lys Ala Trp Thr Gly Tyr Ser Val Ser Lys Trp Thr Ala Ser Cys Ala Ala Ala Glu Ala Lys Val Thr Ser Ala lle Thr lle Ser Leu Pro Asn Glu Leu Ser Ser Glu Arg Asn Lys GIn Leu Lys Val Gly Arg Val Leu Leu Trp Leu Gly Leu Leu Pro Ser Val Ser Gly Thr Val Lys Ser Cys Val Thr Glu Thr Gin Thr Thr Ala Ala Ala Ser Phe Gln Val Ala Leu Ala Val Ala Asp Asn Gly lle Leu Ser Lys Asp Val Val Ala Ala Met Tyr Pro Glu Ala Phe Lys Gly lle Thr Leu Glu Gln Leu Thr Ala Asp Leu Thr lle Tyr Leu Tyr Ser Ser Ala Ala Leu Thr Glu Gly Asp Val lle Val His Leu Glu Val Glu His Val Arg Pro Thr Phe Asp Asp Ser Phe Thr Pro Val Tyr. Se diseña el iniciador CCMV-For (secuencia de ácido nucleico: 5'- gactagtagg aggaaagaga tgtctacagt cgg-3' (SEQ ID NO: 3)) para agregar un sitio de restricción Spel ACTAGT y para agregar la secuencia de consenso de Shine-Dalgarno a la secuencia codificadora de CP de CCMV. Se diseña el iniciador CCMV-Rev (secuencia de ácido nucleico: 5'-ccgctcgagt cattactaat acaccgg-3' (SEQ ID NO : 4)) para agregar un sitio de restricción Xho\ de CTCGAG y para introducir dos codones de detención a la secuencia codificadora de CP de CCMV.

Estos dos iniciadores se utilizan en una primera reacción de PCR con el ADN que codifica para la secuencia de CP de CCMV.

Construcción de ADN de CP de CCMV63 para agregar un sitio de inserción manipulado genéricamente Se diseñan los sitios de restricción AScl y Notl en CP de CCMV (SEQ ID NO: 1 ) para que sirvan como un sitio de inserción. Los sitios de reconocimiento y corte para Ascl (ggcgcgcc), Notl (gcggccgc), y nucleótidos adicionales introducen un heptapéptido (Glu-Ala-Trp-Arg-Ala-Ala-Ala) en la CP de CCMV entre el residuo Ala 60 y AL 61 . Por lo tanto, se modifica CP de CCMV para formar CP de CCMV63. Además, el residuo Arg 26 se muta hasta Cys 26 para agregar estabilidad a las VLP ensambladas. El mapa de plásmido de pCCMV63-CP se muestra en la figura 4.

Secuencia de ORF de CCMV63-CP (SEQ ID NO: 221 atgtctacagtcggaacagggaagttaactcgtgcacaacgaagggctgcggccc gtaagaacaagcggaacacttgtgtggtccaacctgttattgtagaacccatcgcttcaggccaaggc aaggctattaaagcatggaccggttacagcgtatcgaagtggaccgcctcttgtgcggctgccgaag cttggcgcgccgcggccgctaaagtaacctcggctataactatctctctccctaatgagctatcgtccg aaaggaacaagcagctcaaggtaggtagagttttattatggcttgggttgcttcccagtgttagtggca cagtgaaatcctgtgttacagagacgcagactactgctgctgcctcctttcaggtggcattagctgtgg ccgacaactcgaaagatgttgtcgctgctatgtaccccgaggcgtttaagggtataacccttgaacaa ctcaccgcggatttaacgatctacttgtacagcagtgcggctctcactgagggcgacgtcatcgtgcat ttggaggttgagcatgtcagacctacgtttgacgactctttcactccggtgtattagtaatga Construcción de R26C-CCMV63/129-CP de doble inserción Se manipulan genéticamente los sitios de restricción Ascl y Notl en CCMV129-CP (SEQ ID NO: 2) para que sirva como el segundo sitio de inserción. Los sitios de reconocimiento y corte para Ascl (ggcgcgcc), Notl (gcggccgc), y nucleótidos adicionales introducen un heptapéptido (GIu-Ala-Trp-Arg-Ala-Ala-Ala) en CCMV129-CP entre el residuo Ala 60 y Ala 61 . Por lo tanto, se modifica CCMV129-CP para formar CCMV63/129-CP. Además, el residuo Arg 26 se muta a Cys 26 para agregar estabilidad a las VLP ensambladas para crear R26C- CCMV63/129-CP. El mapa de plásmido de pR26C-CCMV63/129-CP se muestra en la figura 5.

Secuencia de ORF de R26C-CCMV63/129-CP (SEQ ID NO:23) atgtctacagtcggaacagggaagttaactcgtgcacaacgaagggctgcggccc gtaagaacaagcggaacacttgtgtggtccaacctgttattgtagaacccatcgcttcaggccaaggc aaggctattaaagcatggaccggttacagcgtatcgaagtggaccgcctcttgtgcggctgccgaag cttggcgcgccgcggccgctaaagtaacctcggctataactatctctctccctaatgagctatcgtccg aaaggaacaagcagctcaaggtaggtagagttttattatggcttgggttgcttcccagtgttagtggca cagtgaaatcctgtgttacagagacgcagactactgctgctgcctcctttcaggtggcattagctgtgg ccgacaacgggatcctgtcgaaagatgttgtcgctgctatgtaccccgaggcgtttaagggtataacc cttg aacaactcaccgcggatttaacgatctacttgtacag cag tgcggctctcactgagggcgacgt catcgtgcatttggaggttgagcatgtcagacctacgtttgacgactctttcactccggtgtattagtaatga EJEMPLO 1 Producción de péptido PD1 en VLP de CCMV en Pseudomonas 1 .A. Construcción del gen guimérico de CCMV-PD1 Se selecciona un péptido antigénico de 20 aminoácidos para expresión como un inserto en la cápside viral de CCMV. El péptido antigénico no está relacionado a CCMV y a Pseudomonas fluorescens. Se amplifica un oligonucleótido que codifica para el péptido a partir del ADN del plásmido pCP7Parvol utilizando los iniciadores Parvo-BamHI-F (secuencia de ácido nucleico: 5'-cgggatcctg gacccggatg-3' (SEQ ID NO: 16)) y Parvo-BamH I-R (secuencia de ácido nucleico: 5'-cgggatcccc gggtctcttt c-3' (SEQ ID NO: 17)). (Estos iniciadores se obtienen a partir de Integrated DNA Technologies, Inc. , Coralville, IA, E. U.A. , de aquí en adelante en la presente invención "IdtDNA"). Estos iniciadores amplifican una secuencia que codifica para el péptido de parvovirus canino al tiempo que se agregan los sitios de restricción SamHI al mismo en ambos extremos para inserción en la secuencia que codifica para CCMV129, en el sitio de restricción ßa H I del mismo. Las reacciones de PCR se efectúan utilizando un termociclador PTC225 (MJ Research, South San Francisco, CA, E. U.A.) de conformidad con el siguiente protocolo: CUADRO 4 Protocolo de PCR *(Provenientes de Invitrogen Corp, Carlsbad, CA, E. U.A. , de aquí en adelante "Invitrogen") La secuencia de ADN se inserta en el plásmido de lanzadera CCMV129, un plásmido que se construye a través del plásmido pESC (obtemido de Stratagene Corp. , LaJolla, CA, E.U.A) insertando ácido nucleico que contiene la secuencia de ADN para CP de CCMV129 en el mismo, utilizando las enzimas de restricción Spel y Xho\. El ácido nucleico que codifica para el péptido PD1 se inserta en el sitio de restricción Sa/nH I dentro de las CDS de CCMV129, lo que produce al plásmido de lanzadera CCMV129-PD1 . Las CDS de PD1 también se insertan en las CDS de CCMV129. Como resultado, la secuencia que codifica para PD1 insertada es: 5'-tgg gcc tgc cgc ggc acg gcc ggc tgg ccg ccg tec ggc tgc acg gcg ccg tec ggg tcg-3' (SEQ ID NO: 18), que codifica para un péptido PD1 cuya secuencia de aminoácido es: Trp Ala Cys Arg Gly Thr Ala Gly Trp Pro Pro Ser Gly Cys Thr Ala Pro Ser Gly Ser (SEQ ID NO: 7). La secuencia de nucleótido que codifica para PD 1 no está relacionada con parvovirus canino. 1 .B. Construcción de un plásmído de expresión de CCMV- PD1 El plásmido de lanzadera CCMV129-PD1 se digiere con las enzimas de restricción Spel y Xhol. El fragmento que contiene la secuencia de ADN quimérica de CCMV129-PD1 se aisla mediante purificación en gel. Este después se inserta en el plásmido de expresión pMYC1803, en lugar del gen de la toxina buibui, en unión operable a un promotor tac, en los sitios de restricción Spel y Xho\ del plásmido de expresión. Véase figura 1 . El plásmido de expresión resultante se evalúa mediante digestión con enzima de restricción con Spel y Xho\ para confirmar la presencia del inserto. 1.C. Transformación del plásmido en células hospederas de pseudomonas El plásmido de expresión CCMV129-PD 1 se transforma en células hospederas MB214 de Pseudomonas fluorescens de conformidad con el siguiente protocolo. Las células hospederas se descongelan gradualmente en frascos mantenidos en hielo. Para cada transformación, se agrega 1 µl del ADN del plásmido de expresión purificado a las células hospederas y la mezcla resultante se agita suavemente con la punta de una pipeta para que se mezcle, y después se incuba en hielo durante 30 minutos. La mezcla s transfiere a celdas desechables para electroporación (celda BioRad Gene Pulser, espacio de electrodo 0.2 cm, No. de catálogo 165-2086). Las celdas se colocan en un pulsador Biorad Gene pre-ajustado a 200 Ohmios, 25 µfaradios, 2.25 kV. Las células se pulsan brevemente (1 -2 segundos aproximadamente). Después se agrega inmediatamente medio LB frío y la suspensión resultante se incuba a 30°C durante 2 horas. Las células se siembran después en agar LB tetld (medio LB compolementado con tetraciclina) y se cultivan a 30° durante la noche. 1 .D. Expresión en matraz agitado de la construcción CCMV-PD1 Se toma una colonia a partir de cada caja y la muestra escogida se inocula en 50 ml de cultivo de semilla LB en un matraz para agitación con deflectores. Los cultivos de suspensión líquidos se hacen crecer durante la noche a 30°C con agitación de 250 rpm. Después se utilizan 1 0 ml de cada cultivo de semilla resultante para inocular 200 ml del medio para matraz agitado (es decir extractos de levadura y sal con elementos traza, citrato de sodio, y glicerol, pH 6.8) en un matraz para agitación de 1 litro con deflectores. Se agrega tetraciclina para la selección. Los cultivos inoculados se dejan crecer durante la noche a 30°C con agitación de 250 rpm y se inducen con IPTG para la expresión de las cápsides quiméricas CCMV129-PD 1 . 1 . E. Separación del lisado de cultivo celular en fracciones solubles y fracciones no solubles Después se centrifugan alícuotas de 1 ml provenientes de cada cultivo en matraz agitado hasta que las células se convierten en un comprimido. Los comprimidos de células se vuelven a suspender en 0.75 ml de Tris-HCl 50 mM, pH 8.2, que contiene 2 mM de EDTA. Después se agrega 0.1 % en volumen de detergente Tritón X-100 al 10% seguido por una adición de lisozima hasta una concentración final de 0.2 mg/ml. Las células se incuban después en hielo durante 2 horas, en cuyo momento debe ser evidente un lisado celular transparente y viscoso. A los usados, se agrega un volumen de 1 /200 de MgC12 1 M, seguido por una adición de un volumen 1 /200 de solución de ADNasal 2 mg/ml, y después se incuba en hielo durante 1 hora, en cuyo momento el lisado se convierte en un líquido mucho menos viscoso. Los usados tratados se centrifugan después durante 30 minutos a 4°C a la velocidad máxima en una centrífuga de escritorio y los sobrenadantes se decantan en tubos limpios. Los sobrenadantes decantados son las fracciones de proteína "solubles". Los comprimidos remanentes se vuelven a suspender después en 0.75 mL de solución reguladora TE (Tric-CI 10 mM, pH 7.5, EDTA 1 mM). Los comprimidos re-suspendidos son las fracciones "insolubles". 1 .F. Análisis de SDS-PAGE y Western blot de las fracciones de proteína soluble e insoluble estas fracciones "solubles" y "insolubles" se someten después a electroforesis en geles de Bis-Tris al 4-12% de NuPAGE (de Invitrogen, Cat. NP0323), que tienen cavidades de 1 .0 Ohmios x 15, de conformidad con la especificación del fabricante. Los geles se tiñen con tinción SimpIyBlue Safe, (de Invitrogen, Cat. LC6060) y se destiñen durante la noche con agua. La detección con Western blot emplea IgG de CCMV (No. de Acceso AS001 1 de DSMZ, Alemania) y el estuche WESTERN BREEZE (de Invitrogen, Cat. WB7105), siguiendo los protocolos del fabricante. Los resultados son positivos para la producción de CCMV y específicamente para la producción de CP quimérica de CCM;V (véase figura 6 y 7). 1 .G. Precipitación con PEG de las VLP Quiméricas Las VLP quiméricas, s decir, recombinantes, se precipitan mediante lisis de muestras de cultivo de matraz de cultivo separadas, seguido por tratamiento con PEG (polietilenglicol) de los usados celulares resultantes, de conformidad con el siguiente protocolo. Se centrifugan alícuotas de 5 ml de cada cultivo de matraz agitado hasta convertir las células en un comprimido. Las células convertidas en comprimidos se vuelven a suspender en solución regulada de fosfatos OJ M (de preferencia una combinación de fosfato de potasio de monobásico y dibásico), pH 7.0, a una proporción de 2 volúmenes de solución reguladora para un volumen de comprimido. Las células se someten después a irradiación de energía sónica durante 10 segundos, 4 veces, con descansos de 2 minutos en hielo entre las mismas. Durante este procedimiento de aplicación de energía sónica, el lisado celular debe ser un poco transparente. Después de la aplicación de energía sónica, se agrega lisozima hasta una concentración final de 0.5 mg/ml. Se permite que la digestión con lisozima proceda durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los usados tratados resultantes se centrifugan después durante 5 minutos a 15,000 x G a 4°C. Los sobrenadantes resultantes se eliminan y se miden sus volúmenes. A cada sobrenadante, se agrega PEG6000 hasta una concentración final de 4%; seguido por adición de NaCl hasta una concentración final de 0.2 M, e incubación sobre hielo durante 1 hora o durante la noche a 4°C. Después, estos se centrifugan a 20000 x G durante 15 minutos a 4°C. Los comprimidos precipitados se vuelven a suspender después en 1 /10 del volumen inicial del sobrenadante de solución reguladora de fosfatos y se almacena a 4°C. 1 . H. Centrifugación con gradiente de sacarosa Se preparan soluciones de sacarosa con sacarosa (Sigma, Cat. S-5390) en solución reguladora de fosfatos. Los gradientes de sacarosa se vierten manualmente 10%, 20%, 30%, y 40% desde la parte alta hacia la porción inferior. Las muestras de comprimido precipitados re-suspendidas se centrifugan después en un rotor Beckman-Coulter SW41 -TÍ en una ultracentrífuga óptima XL 100K de Beckman-Coulter durante 1 hora sin frenado. Cada fracción de 1 ml del gradiente de sacarosa se eluye por separado y se centrífuga adicionalmente para obtener comprimidos de VLP. Los comprimidos de VLP se vuelven a suspender en solución reguladora de fosfatos, se someten a electroforesis en geles de SDS-PAGE, y se someten a análisis Western blot utilizando IgG de CCMV de conformidad con el protocolo anterior. El análisis Western blot es positivo para la formación de VLP (figura 8). Una porción de cada preparación de VLP resultante se utiliza para microscopia electrónica. 1 .1. Análisis de microscopia electrónica Las muestras de VLP se aplican como manchas en cualquiera de rejillas revestidas con colodión/carbón o formvar/carbón. Las muestras se tiñen con ácido fosfotúngstico al 2% (PTA) y se someten a formación de imagen en un microscopia electrónico de transmisión de CM-12 TEM de Philips (Serie #D769), operado a un voltaje de aceleración de 120 kV. Las imágenes se registran digitalmente con una cámara CCD MultiScan (de Gatan, Inc., Pleasanton, CA, E. U.A; Modelo 749, Serie # 971 1 19010). Se confirma la formación de VLP (figura 9).

EJEMPLO 2 Producción de trímeros de AMP D2A21 en VLP de CCMV en Pseudomonas y en recuperación de los AMP a partir de la misma 2. A. Síntesis del inserto de D2A21 Se amplifica una secuencia de nucleótido que codifica para un trímero de péptido antimicrobiano ("AMP") ("trímero de D2A21 ", es decir que contiene tres AMP monoméricos de D2A21 ) a partir del plásmido pET (D2A21 ) 3 utilizando los iniciadores D2A21 -BamHI-F (secuencia de ácido nucleico: 5'-cgggatcctg ggacagcaaa tgggtcgcga tccg-3' (SEQ ID NO: 5)) y D2A21 -BamHI-R (secuencia de ácido nucleico: 5'-cgggatcccg tcgacggagc tcgaattcgg atcacc-3' (SEQ ID NO: 6)). Las reacciones de PCR se efectúan de conformidad con los mismos protocolos descritos en el ejemplo 1 .A. anterior. El inserto amplificado resultante contiene un sitio de restricción SamHI agregado en cada extremo, para uso en la inserción de las CDS del trímero D2A21 en las CDS de CCMV129 en el sitio BamH I manipulado genéticamente. La secuencia de nucleótido codificadora, y la secuencia de aminoácido de, el trímero D2A21 s muestran en las SEQ ID NOs: 19 y 20, respectivamente.

Secuencia de nucleótido que codifica para el trímero D2A21 (SEQ ID NO: 19) 5'-ttc gcg aag aag ttt gcg aaa aag ttc aag aaa ttt gcc aag aag ttt gcc aag ttc gca ttc gcg ttc ggc gat ccg ttc gcg aag aag ttt gcg aaa aag ttc aag aaa ttt gcc aag aag ttt gcc aag ttc gca ttc gcg ttc ggc gat ccg ttc gcg aag aag ttt gcg aaa aag ttc aag aaa ttt gcc aag aag ttt gcc aag ttc gca ttc gcg ttc ggt-3' Secuencia de aminoácido del trímero D2A21 (SEQ ID NO: 20) Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Phe Ala Phe Ala Phe Gly Asp Pro Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Phe Ala Phe Ala Phe Gly Asp Pro Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Phe Ala Phe Ala Phe Gly. Las CDS del trímero contienen las tres CDS del monómero de AMP separadas por las CDS del sitio de corte lábil a ácido de dipéptido Asp-Pro, como se muestra en la figura 3. Las CDS del trímero completo también está bordeada en cada extremo terminal por una CDS de sitio de corte lábil a ácido de di-péptido Asp-Pro. El inserto amplificado se digiere con la enzima de restricción ßamHI para crear extremos adhesivos para clonación en el plásmido de lanzadera pESC-CCMV129BamHI en el sitio ßamHI dentro de la CDS de CCMV129. El plásmido de lanzadera resultante se digiere con las enzimas de restricción Spel y Xhol. El fragmento RBS/CDS quimérico se aisla mediante purificación en gel. 2.B. Construcción de plásmido de expresión El polinucleótido CCMV129-(D2A21 )3 quimérico resultante se inserta después en el plásmido de expresión pMYC1803, en lugar de la secuencia que codifica para buibui, en unión operable a un promotor tac. El plásmido de expresión resultante se evalúa mediante digestión de restricción con Spel y Xhol respecto a la presencia del inserto. Se utilizan los mismos protocolos descritos anteriormente para el ejemplo 1 B. 2.C. Transformación y expresión El plásmido de expresión resultante se transforma en P. fluorescens MB214, utilizando el protocolo descrito anteriormente para el ejemplo 1 .C. Los transformantes colonizados en placa se escogen y transfieren a matraces de agitación para expresión, siguiendo el mismo protocolo que el descrito para el ejemplo 1 .D. anterior. 2. D. Recuperación v análisis de proteína v VLP Las células cultivadas en matraz agitado se lisan y fraccionan, siguiendo los procedimientos del ejemplo 1 .E. Las fracciones resultantes se analizan mediante SDS-PAGE y análisis Western blot como se describe para el ejemplo 1 . F. Las VLP quiméricas se recuperan mediante precipitación con PEG y centrifugación en gradiente de sacarosa, y se analizan mediante microscopia electrónica, como se describió anteriormente para los ejemplos 1 .G. hasta 1 .1. Se confirma el ensamble de VLP de CCMV quiméricas. Los resultados son positivos para la producción de CCMV. El análisis SDS-PAGE para la expresión de CP quimérica muestra un inserto de 96 aminoácidos (figura 10), lo cual se confirma mediante western blot después de fraccionar en gradiente de sacarosa para mostrar la formación de VLP (figura 1 1 ) y mediante micrografía electrónica para confirmar la formación de VLP (figura 12) 2.E. Análisis de producción del péptido antimicrobiano de D2A21 Las fracciones de proteína soluble e insoluble se tratan adicionalmente para caracterizar los péptidos de D2A21 producidos en las VLP quiméricas, de la siguiente manera. 2.E. 1. Corte ácido de D2A21 La fracción insoluble se disuelve en acetonitrilo acuoso al 15% v/v y aproximadamente 40-50% v/v de ácido fórmico acuoso. La fracción soluble se vuelve a suspender en aproximadamente 45-50% de ácido fórmico. Las muestras se incuban después a 60°C durante 24 horas para permitir que procesa el corte en medio ácido. Las reacciones se detienen mediante congelación a -20°C, a cuya temperatura se almacenan las muestras tratadas hasta el análisis de HPLC. 2.E.2. Análisis de D2A21 mediante HPLC Las fracciones solubles se filtran a través de una membrana de 0.22 µm; las fracciones insolubles se centrifugan para precipitar los restos celulares y después se filtran a través de una membrana de 0.22 µm. Se agregan 50 µl de cada muestra a 950 µl de acetonltrilo acuoso al 25%. Se inyecta un volumen de 250 µl de cada muestra, que contiene un péptido de control interno de D2A21 (10 µg totales del péptido de control), en una columna C18 de fase inversa de 250 mm, VYDAC, de 6.4 mm de diámetro interno (disponible de Grace Vydac, Hesperia, CA, E. U.A), instalada en un sistema de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) de Beckman. La elución se efectúa utilizando un gradiente acuoso de 25% de acetonitrilo/0.1 % de ácido trifluoroacético (TFA) hasta 75% acetonitrilo/0.01 % de TFA a lo largo de 30 minutos. Los eluatos se recolectan mediante goteo en fracciones de cromatografía. El pico de péptido apropiado s observa únicamente en la muestra obtenida a partir de las VLP que contienen al péptido manipulado genéticamente pero no en la muestra obtenida a partir de VLP no manipuladas genéticamente (figura 13). 2.E.3. Análisis de espectrometría de masas de los péptidos D2A21 El análisis mediante espectrometría de masa de los controles de péptido y de las fracciones cromatográficas se efectúa utilizando un sistema de espectrometría de masas de desorción/ionización de láser-tiempo de vuelo asistida por matriz lineal (MALDI-TOF)de Micromass M@LDI (de Micromass UK Ltd. , Manchester, RU). Antes del análisis de MS, las fracciones de HPLC se concentran mediante evaporación centrífuga utilizando un sistema Speed Vac (disponible de Thermo Savant, Milford, MA, E. U.A.; modelo 250DDA). Los resultados demuestran la producción exacta de los AMP de los D2A21 y que el péptido que se libera es el péptido D2A21 (figura 14). Estos resultados demuestran que el uso de una fusión de VLP para la expresión de péptido en pseudomonádidos es efectivo para evitar la toxicidad de otra manera normal, de la célula del hospedero. Se ha demostrado la producción de (A) VLP quiméricas y se ha demostrado la producción de (B) multímeros peptídicos en el formato de VLP (hasta 96 aminoácidos totales). Por lo tanto, este ejemplo: (1 )evalúa la capacidad de P. Fluorescens para soportar la expresión y ensamble partícula de CP de CCMV, (2) purifica las VLP quiméricas utilizando un método sencillo (precipitación con PEG), (3) corta los péptidos de interés utilizando métodos previamente elevados (hidrólisis en medio ácido) y (4) confirma la identidad e integridad del péptido.

EJEMPLO 3 Producción de antígenos de ántrax en VLP de CCMV en psedumonas 3. A. Síntesis de inserto de péptido de PA Se expresan en forma independiente en las VLP de CCMV cuatro péptidos de antígeno protector ("PA") de bacillus anthracis (PA1 -PA4). Los ácidos nucleicos que codifican para PA1 -PA4 se sintetizan mediante SOE (extensión de empalme mediante traslape) de oligonucleótidos sintéticos. Los ácidos nucleicos resultantes contienen los extremos terminales del sitio de reconocimiento ßamHI. Las secuencias de nucléotido codificadoras, y las secuencias de aminoácido, de, estos péptidos de PA son respectivamente las siguientes 1 ) para PA1 , SEQ ID NOs: 8 y 9; 2) para PA2, SEQ ID NOs: 10 y 1 1 ; 3) para PA3, SEQ ID NOs: 12 y 13; e 4) para PA4, SEQ ID NOs: 14 y 15. Los ácidos nucleicos resultantes se digieren con ßamH I para crear extremos adhesivos para clonación en el vector de lanzadera. Cada uno de los insertos de PA resultantes se clona en el plásmido de lanzadera pESC-CCMV129BamHI en el sitio ßamHI de la CDS de CCMV129. Cada plásmido de lanzadera resultante se digiere con las enzimas de restricción Spel y Xhol . Cada uno de los fragmentos que codifican para CCMV129-PA-quiméricos se aisla mediante purificación en gel.

PA1 PA1 PA3 Secuencia de ácido nucleico (SEQ 5'-cgt att att ttc aat ggc aaa gat ID NO: 12 etc aat etc gtg gaa cgt cgt att gct gct gtg aat cct tet gat cct ctc-3' Secuencia de aminoácido (SEQ ID Arg lle lle Phe Asn Gly Lys Asp NO: 13) Leu Asn Leu Val Glu Arg Arg lle Ala Ala Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu PA4 Secuencia de ácido nucleico (SEQ 5'-cgt caá gat ggc aaa acc ttc att ID NO: 14 gat ttc aaa aag tat aat gat aaa etc cct etc tat att tet aat cct aat-3' Secuencia de aminoácido (SEQ ID Arg Gln Asp Gly Lys Thr Phe lle NO: 15) Asp Phe Lys Lys Tyr Asn Asp Lys Leu Pro Leu Tyr lle Ser Asn Pro Asn 3.B. Construcción del plásmido de expresión Los polinucleótidos CCMV129-PA quiméricos resultantes se insertan después cada uno en el plásmido de expresión pMYC1803, en lugar de la secuencia que codifica para buibui, en unión operable al promotor tac. El plásmido de expresión resultante se evalúa mediante digestión de restricción con Spel y Xhol respecto a la presencia del inserto. Se utilizan los mismos protocolos descritos anteriormente para el ejemplo 1 B. 3.C. Transformación y expresión El plásmido de expresión resultante se transforma en P. fluorescens MB214, utilizando el protocolo descrito anteriormente para el ejemplo 1 .C. Los transformantes colonizados en placa se escogen y transfieren a matraces de agitación para expresión, siguiendo el mismo protocolo que el descrito para el ejemplo 1 . D. anterior. 3.D. Recuperación y análisis de proteína y VLP Las células cultivadas en matraz agitado se lisan y fraccionan, siguiendo los procedimientos del ejemplo 1 .E. Las fracciones resultantes se analizan mediante SDS-PAGE y análisis Western blot como se describe para el ejemplo 1 . F. Los resultados son positivos para la producción de CCMV. Los resultados son positivos para la producción de CP de CCMV quimérica (véase figura 15). Las VLP de recuperan mediante precipitación con PEG y fraccionamiento con gradiente de sacarosa como se describe en el ejemplo 1 .G. y 1 . H. El análisis western blot de la fracción de gradiente de sacarosa se efectúa como se describe en 1 .H. Los resultados son positivos para la formación de VLP (figura 16).

EJEMPLO 4 Producción de monómeros de AMP PBF20 mediante inserción sencilla v doble en las VLP de CCMV en Pseudomonas Se siguen los procedimientos indicados en los ejemplos 1 , 2, y 3. El ácido nucleico que codifica para los péptidos monoméricos de PBF20 (que codifica para los AMP que comprenden las secuencias de aminoácido 3-22 de la secuencia de aminoácido Asp Pro Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Asp Pro (SEQ ID NO: 24)) y los sitios de corte ácido que comprenden la secuencia de aminoácido 1 -2 y 23-24 de SEQ ID NO: 24 se insertan en forma individual en CCMV63-CP en el sitio Ascl/Notl y CCMV129-CP en el sitio BamHl. El péptido también se inserta en R26C-CCMV63/129-CP tanto en el sitio Ascl/Notl como en el sitio BamH l al mismo tiempo.

Los polinucleótidos quiméricos resultantes se insertan después cada uno en el plásmido de expresión pMYC1803, en lugar de la secuencia que codifica para buibui, en unión operable al promotor tac. El plásmido de expresión resultante se evalúa mediante digestión de restricción con Spel y Xhol respecto a la presencia del inserto y se transforma en P. fluorescens MB214, utilizando el protocolo descrito anteriormente para el ejemplo 1 .C. Los transformantes colonizados en placa se escogen y transfieren a matraces de agitación para expresión, siguiendo el mismo protocolo que el descrito para el ejemplo 1 .D. anterior. Las células cultivadas en matraz agitado se lisan y fraccionan, siguiendo los procedimientos del ejemplo 1 .E. Las fracciones resultantes se analizan mediante SDS-PAGE y análisis Western blot como se describe para el ejemplo 1 . F. Los resultados son positivos para la producción de las VLP. En la figura 17 se muestra el análisis SDS-PAGE que muestra la expresión de CCMV63-CP quimérica manipulada genéticamente para que exprese un péptido antimicrobiano de 20 aminoácidos PBF20 separado por sitios de hidrólisis acida en Pseudomonas fluorescens. La CCMV63-CP-PBF20 quimérica tiene una motilidad más lenta en comparación con la CCMV-CP de tipo silvestre (ts) no manipulada genéticamente. En la figura 18 se muestra una imagen de microscopia electrónica (EM) de las VLP de CCMV quiméricas obtenidas a partir de CCMV63-CP y que muestran un péptido antimicrobiano de 20 aminoácidos PBF20 separado por sitios de hidrólisis acida. En la figura 19 se muestra el análisis SDS-PAGE que muestra la expresión de CCMV129-CP quimérica manipulada genéticamente para que exprese un péptido antimicrobiano de 20 aminoácidos PBF20 separado por sitios de hidrólisis acida en Pseudomonas fluorescens. La CCMV129-CP-PBF20 quimérica tiene motilidad más lenta en comparación con la CP de CCMV de tipo silvestre no manipulada genéticamente. En la figura 20 se muestra una imagen de microscopia electrónica (EM) de las VLP de CCMV quiméricas obtenidas a partir de CCMV129-CP y que muestran un péptido antimicrobiano de 20 aminoácidos PBF20 separado por sitios de hidrólisis acida. En la figura 21 se muestra el análisis de SDS-PAGE que muestra la expresión de CCMV63/129-CP quimérica manipulada genéticamente para que exprese un péptido antimicrobiano de 20 aminoácidos PBF20 separado por sitios de hidrólisis acida en dos sitios de inserción diferentes en la CP en Pseudomonas fluorescens. La CP quimérica que contiene un doble inserto (CP + 2x20 AA) tiene motilidad más lenta en el gel de SDS-PAGE en comparación con la cápside manipulada genéticamente para que exprese un solo inserto (CP + 1 x20 AA) del mismo péptido. En la figura 22 se muestra una imagen de microscopia electrónica de las VLP de CCMV quiméricas obtenidas a partir de CCMV63/129-CP que muestran un péptido antimicrobiano de 20 aminoácidos PBF20 separado por sitios de hidrólisis acida en dos sitios de inserción por cápside. Se encuentra que cada VLP contiene hasta 360 monómeros de BPF20 por partícula.

EJEMPLO 5 Producción de antígenos de virus de encefalitis eguina del este (EEE) eh las VLP de CCMV en Pseudomonas 5. A. Síntesis de inserto de péptido de EEE Se expresan de manera independiente dos péptidos de EEE diferentes (EEE-1 y EEE-2) en las VLP de CCMV.

Secuencia del péptido EEE-1 DLDTHFTQYKLARPYIADCPNCGHS (SEQ ID NO: 25) Secuencia de ácido nucleico de EEE-1 5'gacctggacacccacttcacccagtacaagctggcccgcccgtacatcgccga ctgcccgaactgcggccacagc-3' (SEQ ID NO: 26) Secuencia del péptido EEE-2 GRLPRGEGDTFKGKLHVPFVPVKAK (SEQ ID NO: 27) Secuencia de ácido nucleico de EEE-2 5'gg ccg cctg ccg cgcggcgaaggcgacaccttcaaggg caag ctg cacgtgccgttcg tgccggtgaaggccaag-3' (SEQ ID NO: 28) Los ácidos nucleicos que codifican para EEE-1 y EEE-2 se sintetizan mediante SOE de oligonucleótidos sintéticos. Los ácidos nucleicos resultantes contienen los extremos terminales del sitio de reconocimiento ßamH l. Los iniciadores de oiligonucleótido de sentido u anti-sentido para la síntesis de los insertos incluyen los sitios de restricción ßamHI y son los siguientes: EEE 1 .S 5' - cgg gga tec tgg acc tgg acá ccc act tca ccc agt acá age tgg ccc gcc cgt ac-3' (SEQ ID NO: 29).

EEE 1 .AS 5'-cgc agg atc ccg ctg tgg ccg cag ttc ggg cag tcg gcg atg tac ggg cgg gcc agc-3' (SEQ ID NO: 30).

EEE2.S 5'-cgg gga tec tgg gcc gcc tgc cgc gcg gcg aag gcg acá cct tca agg gca agc-3' (SEQ ID NO: 31 ).

EEE2.AS 5'-cgc agg atc ccc ttg gcc ttc acc ggc acg aac ggc acg tgc age ttg ccc ttg-3' (SEQ ID NO: 32). Los ácidos nucleicos resultants se digieren con BamHl para crear extrermo adhesivos para clonación en el plásmido de lanzadera pESC-CCMV129 BamHl .

Cada uno de los insertos de EEE resultantes se clona en el plásmido de lanzadera pESC-CCMV129 ßamHI en el sitio BamHl de la CDS CCMV129 CDS. Cada plásmido de lanzadera resultanbte se digiere con las enzimas de restricción Spel y Xho. Cada uno de los fragmentos que codifican para CCMV-129-EEE quiméricos deseados se aislan mediante purificación en gel. 5.B. Construcción del plásmido de expresión Los fragmentos de polinucleótido de CCMV129-EE quiméricos resultantes se insertan cada uno después en el plásmido de expresión pMYC1803 restringido con Spel y Xhol en lugar de la secuencia que codifica para buibui, en unión operable al promotor tac.

El plásmido de expresión resultante se evalúa mediante digestión de restricción con Spel y Xhol respecto a la presencia del inserto. Se utilizan los mismos protocolos descritos anteriormente para el ejemplo 1 B. 5.C. Transformación y expresión El plásmido de expresión resultante se transforma en P. fluorescens MB214, utilizando los protocolos descritos anteriormente en el ejemplo 1 .C. Se utilizan los mismos protocolos descritos anteriormente para el ejemplo 1 . D. para la expresión de las VLP quiméricas que muestran los antígenos de EEE. 5.D. Recuperación y análisis de proteína y VLP Las células cultivadas en matraz agitado se lisan y fraccionan, siguiendo los procedimientos del ejemplo 1 .E. Las fracciones resultantes se analizan mediante SDS-PAGE y análisis Western blot como se describe para el ejemplo 1 . F.

Claims

REIVINDICACIONES 1 .- Una célula Pseudomonádida que comprende una primera construcción de ácido nucleico que comprende: a) por lo menos una secuencia de ácido nucleico que codifica para una cápside viral icosaédrica; y b) por lo menos una secuencia de ácido nucleico que codifica para un péptido recombinante. 2.- La célula de conformidad con la reivindicación 1 , en la cual el Pseudomonádido es Pseudomonas fluorescens. 3.- La célula de conformidad con la reivindicación 1 , en la cual la cápside viral icosaédrica proviene de un virus que no presenta un tropismo original hacia una célula Pseudomonádida. 4.- La célula de conformidad con la reivindicación 3, en la cual la cápside viral icosaédrica proviene de un virus icosaédrico de plantas. 5.- La célula de conformidad con la reivindicación 4, en la cual el virus icosaédrico de plantas se selecciona a partir del grupo que consiste de un Virus del Moteado Clorótico del Garbanzo, un Virus del Mosaico del Garbanzo, y un Virus del Mosaico de la Alfalfa. 6.- La célula de conformidad con la reivindicación 1 , en la cual el ácido nucleico codifica por lo menos para dos cápsides virales icosaédricas diferentes. 7.- La célula de conformidad con la reivindicación 6, en la cual por lo menos una de las cápsides virales icosaédricas proviene de un virus icosaédrico de plantas. 8.- La célula de conformidad con la reivindicación 1 , en la cual el ácido nucleico que codifica para el péptido recombinante contiene más de un monómero. 9.- La célula de conformidad con la reivindicación 8, en la cual el ácido nucleico que codifica para el péptido recombinante contiene por lo menos tres monómeros. 10.- La célula de conformidad con la reivindicación 8, en la cual los monómeros están ligados de manera operable como concatámeros. 1 1 .- La célula de conformidad con la reivindicación 1 , en la cual el péptido recombinante fusionado a la cápside icosaédrica es un péptido terapéutico. 12.- La célula de conformidad con la reivindicación 1 , en la cual el péptido recombinante es un antígeno. 13.- La célula de conformidad con la reivindicación 12, en la cual el antígeno se selecciona a partir del grupo que consiste de un antígeno de Parvovirus canino, un antígeno de Bacillus anthracis, y un antígeno viral de Encefalitis Equina Oriental. 14.- La célula de conformidad con la reivindicación 1 , en la cual el péptido recombinante es un péptido antimicrobiano. 1 5.- La célula de conformidad con la reivindicación 14, en la cual el péptido antimicrobiano se selecciona a partir del grupo que consiste de D2A21 y PBF20. 16.- La célula de conformidad con la reivindicación 1 , en la cual el péptido recombinante es de por lo menos 7 aminoácidos de longitud. 17.- La célula de conformidad con la reivindicación 16, en la cual el péptido recombinante es de por lo menos 15 aminoácidos de longitud. 18.- La célula de conformidad con la reivindicación 1 , en la cual la célula también comprende un segundo ácido nucleico que codifica para una proteína de virus icosaédrico de tipo silvestre. 19.- La célula de conformidad con la reivindicación 1 , en la cual la célula también comprende un segundo ácido nucleico que comprende: c) por lo menos una secuencia de ácido nucleico que codifica para una segunda cápside viral icosaédrica; y d) por lo menos una secuencia de ácido nucleico que codifica para un segundo péptido recombinante. 20.- La célula de conformidad con la reivindicación 1 9, en la cual la primera y la segunda cápsides virales icosaédricas son diferentes. 21 .- Una célula Pseudomonádida que comprende un péptido de fusión, en la cual el péptido de fusión comprende: a) por lo menos una cápside viral icosaédrica; y b) por lo menos un péptido recombinante. 22.- La célula de conformidad con la reivindicación 21 , en la cual el péptido de fusión se ensambla dentro de la célula para formar una partícula tipo virus. 23.- La célula de conformidad con la reivindicación 21 , en la cual el péptido de fusión se ensambla dentro de la célula para formar una estructura de jaula soluble. 24.- La célula de conformidad con la reivindicación 22, en la cual la partícula tipo virus no tiene capacidad de replicación. 25.- La célula de conformidad con la reivindicación 22, en la cual la partícula tipo virus no puede infectar una célula. 26.- La célula de conformidad con la reivindicación 21 , en la cual el péptido recombinante está insertado en por lo menos un bucle de superficie de la cápside icosaédrica. 27.- La célula de conformidad con la reivindicación 21 , en la cual un péptido recombinante está insertado en más de un bucle de superficie de la cápside icosaédrica. 28.- La célula de conformidad con la reivindicación 21 , en la cual el péptido de fusión comprende más de un péptido recombinante fusionado a cápside viral icosaédrica. 29.- La célula de conformidad con la reivindicación 28, en la cual los péptidos recombinantes son diferentes. 30.- La célula de conformidad con la reivindicación 21 , en la cual el péptido recombinante es un péptido terapéutico. 31 .- La célula de conformidad con la reivindicación 21 , en la cual el péptido recombinante es un antígeno. 32.- La célula de conformidad con la reivindicación 31 , en la cual el antígeno se selecciona a partir del grupo que consiste de un antígeno de Parvovirus canino, un antígeno de Bacillus anthracis, y un antígeno viral de Encefalitis Equina Oriental. 33.- La célula de conformidad con la reivindicación 22, en la cual la partícula tipo virus se puede utilizar como una vacuna. 34.- La célula de conformidad con la reivindicación 21 , en la cual el péptido recombinante es un péptido que es un péptido antimicrobiano. 35.- La célula de conformidad con la reivindicación 34, en la cual el péptido antimicrobiano se selecciona a partir del grupo que consiste de D2A21 y PBF20. 36.- La célula de conformidad con la reivindicación 21 , en la cual el péptido recombinante es de por lo menos 7 aminoácidos de longitud. 37.- La célula de conformidad con la reivindicación 21 , en la cual el péptido recombinante es de por lo menos 15 aminoácidos de longitud. 38.- La célula de conformidad con la reivindicación 21 , en la cual la célula también comprende una cápside viral icosaédrica de tipo silvestre. 39.- La célula de conformidad con la reivindicación 21 , en la cual la célula también comprende un segundo péptido de fusión que comprende: a) por lo menos una segunda cápside viral icosaédrica; y b) por lo menos un segundo péptido recombinante. 40.- La célula de conformidad con la reivindicación 39, en la cual el segundo péptido de fusión se ensambla dentro de la célula para formar un partícula tipo virus o una estructura de jaula soluble. 41 .- La célula de conformidad con la reivindicación 39, en la cual el segundo péptido de fusión comprende una secuencia de aminoácido diferente a la del primer péptido de fusión. 42.- La célula de conformidad con la reivindicación 21 , en la cual la cápside viral y el péptido recombinante están ligados mediante una secuencia de aminoácido que comprende un enlazador. 43.- La célula de conformidad con la reivindicación 42, en la cual la secuencia de aminoácido del enlazador comprende una secuencia susceptible de corte. 44.- La célula de conformidad con la reivindicación 21 , en la cual el Pseudomonádido es Pseudomonas fluorescens. 45.- Una construcción de ácido nucleico que comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica para una cápside viral icosaédrica ligada en forma operable a una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica para un péptido que sea toxico para una célula microbiana. 46.- La construcción de conformidad con la reivindicación 45, en la cual la cápside viral icosaédrica proviene de un virus icosaédrico de plantas. 47.- La construcción de conformidad con la reivindicación 46, en la cual el virus icosaédrico de plantas se selecciona a partir del grupo que consiste de un Virus del Moteado Clorótico del Garbanzo, un Virus del Mosaico del Garbanzo, y un Virus del Mosaico de la Alfalfa. 48.- La construcción de conformidad con la reivindicación 46, en la cual el péptido tóxico comprende más de una secuencia de monómero peptídico. 49.- La construcción de conformidad con la reivindicación 46, en la cual el péptido tóxico comprende por lo menos tres secuencias de monómero peptídico. 50.- La construcción de conformidad con la reivindicación 48, en la cual los monómeros están ligados de manera operable para formar a concatámero. 51 .- La construcción de conformidad con la reivindicación 45, en la cual el enlace operable es interno con respecto a la primera secuencia de ácido nucleico que codifica para la cápside. 52.- La construcción de conformidad con la reivindicación 45, en la cual la segunda secuencia de ácido nucleico que codifica para el péptido tóxico está ligado en forma operable a la secuencia de cápside en un sitio que codifica para por lo menos un bucle de superficie de la cápside. 53.- La construcción de conformidad con la reivindicación 45, en la cual la construcción codifica para más de una secuencia de péptido tóxico ligada en forma operable a los sitios de la secuencia de cápside que codifica para más de un bucle de superficie de la cápside. 54.- La construcción de conformidad con la reivindicación 45, en la cual el péptido recombinante es un péptido antimicrobiano. 55.- La construcción de conformidad con la reivindicación 54, en la cual el péptido antimicrobiano se selecciona a partir del grupo que consiste de D2A21 y PBF20. 56.- Un procedimiento para producir un péptido recombinante que comprende: a) proveer una célula pseudomonádida; b) proveer un ácido nucleico que codifica para un péptido de fusión, en el cual el péptido de fusión comprende por lo menos un péptido recombinante y por lo menos una cápside icosaédrica; c) expresar el ácido nucleico en la célula de organismo del género Pseudomonas, en el cual el péptido de fusión se ensambla como partículas tipo virus; y d) aislar las partículas tipo virus. 57.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 56, que comprende: e) cortar el péptido de fusión para separar al péptido recombinante de la cápside viral icosaédrica. 58.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 56, en el cual el pseudomonádido es Pseudomonas fluorescens. 59.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 56, en el cual la partícula tipo virus no tiene capacidad de replicación. 60.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 56, en el cual la partícula tipo virus no puede infectar una célula. 61 .- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 56, en el cual ia cápside viral icosaédrica proviene de un virus que no presenta un tropismo original hacia una célula pseudomonádida. 62.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 56, en el cual la cápside viral icosaédrica proviene de un virus icosaédrico de plantas. 63.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 62, en el cual el virus icosaédrico de plantas se selecciona a partir del grupo que consiste de un Virus del Moteado Clorótico del Garbanzo, un Virus del Mosaico del Garbanzo, y un Virus del Mosaico de la Alfalfa. 64.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 56, en el cual el ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica por lo menos para dos cápsides virales icosaédricas diferentes'. 65.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 64, en el cual por lo menos una de las cápsides virales icosaédricas proviene de un virus icosaédrico de plantas. 66.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 56, en el cual el péptido recombinante comprende más de un monómero peptídico. 67.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 56, en el cual el péptido recombinante comprende por lo menos tres monómeros. 68.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 66, en el cual los monómeros están ligados de manera operable como un concatámero. 69.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 56, en el cual el péptido recombinante está ligado en forma operable a por lo menos un bucle de superficie de la cápside icosaédrica. 70.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 69, en el cual un péptido recombinante está ligado en forma operable a más de un bucle de superficie de la cápside icosaédrica. 71 .- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 56, en el cual el péptido de fusión comprende más de un péptido recombinante, los péptidos recombinantes no son iguales. 72.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 56, en el cual el péptido recombinante es un péptido terapéutico. 73.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 56, en el cual el péptido recombinante es un antígeno. 74.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 73, en el cual el antígeno se selecciona a partir del grupo que consiste de un antígeno de Parvovirus canino, un antígeno de Bacillus anthracis, y un antígeno viral de Encefalitis Equina Oriental. 75.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 56, en el cual la partícula tipo virus se puede utilizar como una vacuna. 76.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 56, en el cual el péptido recombinante es un péptido que es un péptido antimicrobiano. 77.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 76, en el cual el péptido antimicrobiano se selecciona a partir del grupo que consiste de D2A21 y PBF20. 78.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 56, en el cual el péptido recombinante es de por lo menos 7 aminoácidos de longitud. 79.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 56, en el cual el péptido recombinante es de por lo menos 15 aminoácidos de longitud. 80.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 56, en el cual la célula también comprende un segundo ácido nucleico que codifica para una cápside viral icosaédrica de tipo silvestre. 81 .- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 56, en el cual la célula también comprende un segundo ácido nucleico que codifica para un segundo péptido de fusión que comprende: a) por lo menos una segunda cápside viral icosaédrica; y b) por lo menos un segundo péptido recombinante. 82.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 81 , que comprende expresar el segundo ácido nucleico en la célula. 83.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 81 , en el cual el segundo péptido de fusión se ensambla dentro de la célula para formar un partícula tipo virus o una estructura de jaula soluble. 84.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 81 , en el cual la primera cápside viral icosaédrica comprende una primera secuencia de aminoácido y la segunda cápside viral icosaédrica cornprende una segunda secuencia de aminoácido y la primera y segunda secuencia de cápside son diferentes. 85.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 81 , en el cual el primer péptido recombinante comprende una primera secuencia de aminoácido y el segundo péptido recombinante comprende una segunda secuencia de aminoácido y la primera y segunda secuencia de aminoácido recombinantes son diferentes.