MXPA06004204A - Deteccion molecular de mycobacterias avium subsp. paratuberculosis - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a la detección de identificación molecular del mycobacterium avium subespecie Paratuberculosis (MAP). Más particularmente, la invención se efectúa con el desarrollo de ensayos de PCR con uno o más iniciadores de oligonucleótidos dirigidos a diferentes regiones genómicas del elemento IS900 específico para MAP.

Description

DETECCIÓN MOLECULAR DE MYCOBACTERIÜM AVIUM SUBESPECIE PARATÜBERCÜLOSIS Campo de la Invención La presente invención se refiere a la detección molecular de Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (MAP) . Más particularmente, se refiere a ensayos de PCR con pares de iniciadores de oligonucleótidos dirigidos a diferentes regiones genómicas del elemento IS900 específico para MAP, para su uso en la detección e identificación molecular de MAP. Técnica anterior El Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (MAP) es una bacteria muy molesta desde el punto de vista de la identificación microbiológica, que puede ocasionar una seria enfermedad frecuentemente fatal, es decir, paratuberculosis, en diversas especies animales. Además, un número creciente de reportes implican la bacteria MAP específica con la patogénesis de ciertas formas de enfermedad intestinal infecciosa en el hombre (Chiodini, 1989) , (Chamberlain et al., 2001). La identificación de MAP se facilita actualmente por la amplia aplicación de técnicas moleculares. Sin embargo, la necesidad de verificar los resultados frecuentemente hacen que las técnicas existentes sean laboriosas y prácticamente aplicables solo para su uso en investigación. Más específicamente, el diagnóstico de infecciones MAP obtenido mediante serología requiere una confirmación posterior, a fin de evitar los resultados negativos falsos que frecuentemente se registran en etapas tempranas de la infección y las reacciones cruzadas con especies micobacteriales genéticamente relacionadas encontradas en la naturaleza (Ridge et al.1991; Nielsen et al., 2001). La utilidad del cultivo, como método de diagnóstico o de confirmación, se daña por el largo período de incubación requerido para el crecimiento de MAP. De este modo, la reacción en cadena de polimerasa (PCR) ha sido largamente considerada una herramienta muy útil para la detección e identificación de la bacteria anterior (Hance et al., 1989) . Sin embargo, la confirmación de los resultados es necesaria también para técnicas moleculares, especialmente, cuando se aplican para diagnóstico de rutina. Esto comúnmente sugiere la incorporación de análisis de hibridación, que sin embargo, hacen al proceso completo laborioso y prácticamente aplicable solo para uso en la investigación . Por tanto, es de un significado considerable un método basado en PCR rápida de bajo costo que pudiera incorporarse de manera confiable a la identificación de rutina de MAP a partir de material clínico. El bajo costo debe combinarse con una muy alta sensibilidad y especificidad. También es muy importante asegurar que los resultados puedan repetirse muy frecuentemente, especialmente debido a que con frecuencia se encuentra en la práctica, que los métodos que funcionan satisfactoriamente en un laboratorio, cuando se utilizan en otro laboratorio pueden dar resultados que no pueden utilizarse. Sumario de la invención La presente invención ha permitido el desarrollo de un método basado en PCR de bajo costo y rápido que puede incorporarse confiablemente a la identificación de rutina de MAP a partir de material clínico o cualquier otro material. A fin de asegurar la confiabilidad del ensayo propuesto y la reproductivilidad de los resultados en diferentes laboratorios, ha tenido lugar la verificación cruzada intra-laboratorio. La invención hizo posible desarrollar un método para la detección e identificación de rutina de MAP, a partir de muestras de tejido de origen humano, animal, vegetal u otro. Dicho método puede aplicarse no solo en material clínico, sino también en otro material de origen humano, animal o vegetal, en polvo en productos alimenticios en general , etc . El ensayo propuesto combina un óptimo desempeño y costo con alta reproductivilidad, sin importar las diversas condiciones y prácticas específicas y sea aplicable en diferentes laboratorios. La invención se realiza a través del desarrollo de un ensayo de PCR utilizando uno o más de los iniciadores oligonucleótidos que se describen abajo: PIN GCATGGCCCACAGGACGTTGAG P2N CTACAACAAGAGCCGTGCCG P3N GGGTGTGGCGTTTTCCTTCG P4N TCCTGGGCGCTGAGTTCCTC En una modalidad preferida se utilizan combinaciones de los iniciadores de oligonucleótidos, a fin de formar conjuntos de oligonucleótidos. Los conjuntos de oligonucleótidos preferidos son P1N/P3N, P1N/P4N, P2N/P3N, P2N/P4N, P1N/P2N/P3N, P1N/P2N/P4N, P1N/P3N/P4N, P2N/P3N/P4N. Particularmente preferido es el conjunto de oligonucleótidos que comprende todos los cuatro iniciadores de oligonucleótidos, es decir P1N/P2N/P3N/P4N. Estos iniciadores se dirigen a la región genómica del elemento IS900 específico para MAP y permite la detección efectiva, rápida y confiable del Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (MAP) . Estos Iniciadores se seleccionaron de entre otros debido a que tienen mejores resultados . Descripción detallada El uso de los iniciadores de oligonucleótidos antes mencionados, -solos o en combinación- se encontraron estar preferentemente en un ensayo de PCR de un tubo para la detección confiable de MAP. En una modalidad preferida, se utilizan combinaciones de los iniciadores de oligonucleótidos a fin de formar conjuntos de oligonucleótidos. Los conjuntos de oligonucleótidos útiles para la detección de MAP son P1N/P2N, P3N/P4N, P1N/P3N, P1N/P4N, P2N/P3N, P2N/P4N, P1N/P2N/P3N, P1N/P2N/P4N, P1N/P3N/P4N, P2N/P3N/P4N. En una modalidad adicional y particularmente preferida, se utiliza el conjunto de oligonucleótidos que comprende los cuatro iniciadores de oligonucleótido, es decir, P1N/P2N/P3N/P4N. Se prefiere más el uso de PCR en serie de un tubo, utilizando los cuatro iniciadores de oligonucleótido, es decir P1N/P2N/P3N/P4N. A fin de lograr un método para la detección confiable de MAP mediante PCR, se condujeron pruebas en diversos laboratorios, algunos de los cuales se efectuaron incluso en diferentes países. A fin de detectar la exactitud y confiabilidad del método, no se armonizaron todos los diferentes parámetros que componen normalmente una reacción PCR y este factor se incorporó también para evaluar nuestro método . El procedimiento anterior no se ha descrito nunca antes con referencia a MAP. Diferentes laboratorios se encargaron de evaluar los procedimientos de extracción de ADN y los diferentes ensayo de PCR para la detección de MAP. Para la extracción de ADN, se utilizó un método interno y uno comercial, mientras que para PCR se evaluó un número significativo de análisis diferentes, comenzando con la evaluación de la especificidad del iniciador con una búsqueda extensa en la base de datos del GenBank. De este modo, se concluyó un ensayo de PCR en serie de un tubo, en serie de dos, y uno simple, dirigido a diferentes regiones genómicas del elemento IS900 específico para MAP. Estos cuatro métodos se aplicaron en muestras de control positivas y negativas, que consistieron de cultivos bacteriales puros y muestras de tejido embebidas en parafina fijadas con formalina (FFPE) recolectadas de ganado con paratuberculosis y pollos con infecciones por Mycobacterium avium. En las pruebas llevadas a cabo, todas las muestras se identificaron con números codificados y los resultados se comunicaron entre los laboratorios colaboradores. En base al criterio de confiabilidad y de costo, el procedimiento que se desempeñó mejor fue el ensayo de PCR en serie de un tubo que utiliza los iniciadores de oligonucleótidos antes mencionados, combinados con el método interno de extracción de ADN. Este método produjo el resultado esperado a partir de las muestras positivas y negativas de control utilizadas, permitiendo la diferenciación incluso entre especies micobacteriales genéticamente relacionadas. La concordancia de los resultados obtenidos por los diferentes laboratorios en donde se llevaron a cabo las pruebas, indica la confiabilidad del ensayo propuesto incluso bajo diferentes condiciones de laboratorio. Ej e plos Materiales : Se extrajo ADN de los cultivos y de material clínico (muestras de tejido embebidas en parafina fijadas con formalina (FFPE) ) y se llevaron a cabo para estos las técnicas moleculares descritas abajo. En mayor detalle, se utilizaron cultivos de 10 cepas de Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (MAP) y 30 cepas de diversos otros miembros Mycobacterium spp . (como se describe en detalle en la Tabla 1) . Para la evaluación de la especificidad del método descrito, se utilizaron cultivos de diversas especies bacteriales genéticamente relacionadas (Escherichia coli , Staphylococcus aureus, Salmonella spp . Enterobacter spp . ) . El material clínico (muestras de tejido) que se incluyó en las pruebas efectuadas, consistió de muestras embebidas en parafina fijadas en formalina (FFPE) recolectadas de ganado y pollos. Se utilizaron 10 muestras FFPE del intestino de ganado, con lesiones típicas de paratuberculosis. Se utilizó un número igual de muestras FFPE de hígado e intestino de pollos, conteniendo lesiones típicas de infección micobacterial . El material clínico correspondiente del ganado y los pollos fue positivo mediante el cultivo para MAP y Mycobacterium avium subespecie avium (MAA) , respectivamente. Adicionalmente, se examinaron 30 muestras frescas y FFPE de intestino y nodo linfático recolectadas de humanos y animales sin indicación clínica u otra indicación de infección micobacterial. Este material se utilizó como control negativo (estos datos no se muestran en la presente especificación) . Métodos : A) Extracción de ADN de muestras de tejido FFPE y cultivos bacteriales La extracción de ADN de las muestras FFPE se efectuó de dos maneras, ambas utilizadas sobre de 2 a 3 secciones de parafina de 10 µm de grosor por muestra: Al. Para la extracción de ADN, llevada a cabo como se describió previamente (método interno) (Ikonomopoulos et al., 1999), se retiró la cera del material mediante incubaciones repetidas en xíleno a 60 °C, y etanol al 100% y finalmente etanol al 75%. El producto del proceso anterior se incubó durante aproximadamente una hora en SDS y proteinasa K a 50 °C de temperatura a fin de digerirlo subsecuentemente . Estas proteínas se retiraron con la adición sucesiva de una solución de fenol y fenol-cloroformo-alcohol isoamílico. Subsecuentemente, el ADN se precipitó en etanol y acetato de natrio (Sambrook et al., 1989) y se recolectó en la forma de sedimento que se eluyó entonces en 50 µl de amortiguador TE . A2. Alternativamente, la extracción de ADN a partir de muestras FFPE se efectuó con el equipo MicroLysis (Microzone) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La extracción de ADN a partir de bacterias se efectuó con CTAB-proteinasa K seguida por una combinación de fenol y fenol-cloroformo-alcohol isoamílico. El extracto de ADN se precipitó por etanol y acetato de natrio como se describió anteriormente . La evaluación de la calidad del extracto de ADN con referencia a cantidad, pureza e integridad, se efectuó con conteos de densidad óptica y electroforesis de gel de agarosa . B) Reacción en cadena de polimerasa (PCR) : Se evaluó un número significativo de ensayos de PCR, iniciando con la evaluación de la especificidad del iniciador con una búsqueda extensa en la base de datos del GenBank con NCBl BLAST. De este modo, se concluyeron y evaluaron 4 diferentes ensayo de PCR con un total de 7 pares de iniciadores de oligonucleótidos dirigidos a diferentes regiones genómicas del elemento IS900 específico para MAP.

Estos diferentes ensayo dé PCR se describen abajo, bajo Bl, B2 , B3 y B4. Más específicamente: Bl . El primer ensayo de PCR de control fue con los iniciadores de oligonucleótidos IS900-F e IS900-R (mostrados en la Tabla 2) . Estos iniciadores amplifican un fragmento de ADN de 707 bp del elemento IS900 de MAP (Green et al., 1989). B2. Otro ensayo de PCR de control fue un ensayo de PCR en serie con los iniciadores s204 y s749 (Tabla 2) que amplifican un fragmento de ADN de 563 bp del elemento IS900 de MAP. El producto de esta reacción diluido 1:10, se incorporó en la segunda reacción con los iniciadores s345 y s535 (Tabla 2) que amplifican un fragmento de ADN de 210 bp dentro del fragmento de ADN de 563 bp amplificado por los iniciadores s204-s749 (Englund et al., 1999). B3- Otro ensayo de PCR de control fue un ensayo de PCR en serie con los iniciadores IS01 e IS04 (Tabla 2) que amplifican un fragmento de ADN de 302 bp del elemento IS900. El producto de esta reacción diluido 1:10, se incorporó en la segunda reacción con los iniciadores IS02 e IS03 (Tabla 2) que amplifican un fragmento de ADN de 159 bp dentro del fragmento de ADN de 302 bp amplificado previamente. B4. Finalmente, un ensayo de PCR de acuerdo con la invención fue un ensayo de PCR en serie de un tubo comprendiendo los iniciadores, PIN, P2N, P3N y P4N (Tabla 2) . Todos los iniciadores se agregaron simultáneamente en la mezcla de la reacción de PCR que amplifica un fragmento de ADN de 257 bp del elemento IS900. La mezcla de reacción para cada uno de los ensayo de PCR antes mencionados se preparó con 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8.4, a temperatura ambiente), 1.5 mM MgCl2, 0.25 µM de cada uno de los iniciadores de oligonucleótidos, 200 µM de dNTPs, 2.5 unidades de Taq polimerasa (Promega), 0.05-0.1 µg de ADN, y agua de calidad para HPLC hasta un volumen final de 50 µl para los ensayos Bl y B4, y 25 µl para los ensayos B2 y B3. El perfil de temperatura utilizado para los ensayos B1-B3 (Tabla 3) consistió de una etapa inicial de desnaturalización de 5 minutos a 94 °C, seguida por 35 ciclos de 1 minuto a 94 °C, 1 minuto a 63 °C (para los ensayos Bl y B2) o 62 °C (para el ensayo B3) y 1 minuto a 72 °C. A esta etapa siguió una etapa de incubación de 10 minutos a 72 °C para completar el producto de ADN (Tabla 3) . Ambas etapas de las reacciones en serie B2 y B3 , se llevaron a cabo al mismo perfil de temperatura opuesto al análisis B4 que implicó diferentes perfiles de temperatura para cada una de las dos etapas de la reacción en serie (Tabla 3) . La primera etapa consistió de una etapa inicial de desnaturalización a 94 °C durante 1 minuto, seguida por 16 ciclos, con 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 54 °C y 1 minuto a 72 °C, y 30 ciclos con 1 minuto a 94 °C, 1 minuto a 67 °C y 1 minuto a 72 °C, seguida por una etapa final de extensión de 3 minutos a 72 °C (Tabla 3) . Los productos de PCR se analizaron mediante electroforesis en geles de agarosa al 2%, se colorearon mediante bromuro de etidio, y se fotografiaron. La evaluación de la sensibilidad de cada uno de los métodos anteriores se determinó como se describió previamente (Ikonomopoulos et al., 1998) con su aplicación en diluciones decimales del ADN extraído de cultivos MAP. Evaluación de reproductivilidad: Los métodos de extracción de ADN y los ensayos de PCR se aplicaron en la referencia y el material clínico antes descritos, bajo las diferentes condiciones específicas de cada diferente laboratorio (tipo de termociclador, tipo de ADN-polimerasa, amortiguadores) . Las muestras se identificaron con números codificados y los resultados se comunicaron entre los diferentes laboratorios y se compararo . Resultados A. Extracción de ADN: Los métodos Al y A2 , produjeron ADN de calidad y cantidad satisfactoria a partir de las muestras FFPE utilizadas. La cantidad de ADN producido por dos o tres secciones de parafina de 10 µm de grosor se estimó a 1 µg/µl, y su calidad, con referencia a pureza e integridad, fue la misma sin importar el método utilizado para la extracción de ADN. Sin embargo, el método interno (Al) , probó ser considerablemente menor en costo aunque más laborioso. La calidad del producto de ADN extraído de cultivos bacteriales con el método interno (Al) , como se esperaba, fue muy satisfactorio con referencia a la cantidad e integridad del producto. B . PCR: La aplicación de los cuatro ensayo de PCR (Bl, B2, B3 y B4) antes descritos, en el ADN extraído de los cultivos bacteriales utilizados (Tabla 1) , permitió la detección e identificación específica de todas las cepas MAP que se utilizaron. Por otra parte, ninguno de los controles negativos, con referencia tanto a cultivos bacteriales como a muestras FFPE, produjo resultados positivos con ninguno de los pares de iniciadores evaluados. El número de resultados positivos registrado con los métodos Bl, B2 , B3 y B4 , de las 10 muestras FFPE derivadas de ganado con enfermedad de Johne, fue 6, 9, 6, y 10, respectivamente (Tabla 4) (Figura 1) . La sensibilidad de todos los métodos de PCR evaluados fue satisfactoria, especialmente con referencia a los ensayos en serie. La cantidad mínima de ADN necesaria para un resultado positivo a partir de cultivos bacteriales se estimó a 8 pg (método B4) correspondiente a aproximadamente 1500 células bacteriales (Baess et al., 1984) .

C. Evaluación de reproducibilidad: La aplicación de los métodos Bl a B4 para la detección de MAP a partir de cultivos bacteriales y muestras de tejido FFPE produjo resultados completamente consistentes en todos los laboratorios participantes . Más específicamente, se encontró que los métodos B2 y B3 pueden cubrir diagnósticamente el rango total de MAP, solo cuando se utilizan en combinación, aunque se encontró el mismo problema también para el método Bl . El método B4 permitió la detección de MAP, sin importar el material utilizado. En base a nuestros datos experimentales, se muestra que el método B4 , un PCR en serie de un tubo, tiene al mismo tiempo la más alta sensibilidad,' especificidad y reproducibilidad, mientras al mismo tiempo permite verificar directamente los resultados en el menor tiempo posible y con el menor costo necesario. Se encontró que los métodos Bl y B4 detectaron con especificidad el MAP entre bacterias extraídas de los cultivos. Sin embargo, solo los métodos B2 y B4 detectaron todas las muestras FFPE positivas utilizadas. Esto, a pesar del hecho de que todos los iniciadores se diseñaron para detectar MAP y sus síntesis se definió en base a la misma región genómica (IS900) . Este hecho indica aún otro parámetro de la importancia de la presente invención, justificando el procedimiento de evaluación diseñado, de manera que el método con los iniciadores propuestos por la presente invención, asegura falsos resultados mínimos para una aplicación de rutina confiable y' no solamente para investigación. Los discrepantes resultados registrados con los métodos Bl y B3 que también se verificaron mediante la colaboración entre laboratorios, no fueron sorprendentes. Se esperaba que el método Bl fuera menos sensible que las reacciones en serie, mientras que el método B3 se diseñó específicamente para implementar y aumentar la eficiencia de diagnóstico del método B2. Este realmente probó ser preciso dado que la combinación de los métodos B2 y B3 no identificaron correctamente todas nuestras muestras FFPE de control positivo (Figura 1) . Las discrepancias de los resultados registrados con los métodos Bl y B3 también podrían atribuirse a la diversidad genética de las cepas MAP, al menos con referencia a las muestras FFPE evaluadas . La presencia de inhibidores de PCR que conducen frecuentemente a resultados negativos falsos, especialmente con muestras FFPE (Hermon-Taylor et al., 2000), no pueden ser consistentes con la causa de esta discrepancia dado que se utilizaron los mismos productos de ADN para todas las reacciones PCR (también con los métodos B2 y B4) . Por la misma razón, estos resultados no pueden atribuirse a posible fragmentación del ADN, dado que el producto del procedimiento de extracción de ADN siempre se evaluó mediante electroforesis y espectrofotometría y las muestras que produjeron ADN de baja calidad siempre se descartaron. Finalmente, la selección del elemento IS900 como objetivo común de todas las reacciones PCR antes descritas, también debe excluirse de los factores que podrían dar como resultado la ineficiencia de los métodos Bl y B3. La selección de cierta área objetivo de ADN fue obligatoria dado que la demostración de la presencia del elemento IS900 se considera actualmente un prerrequisito para la identificación molecular de MAP (Green et al., 1998) . El método B4 presenta ventajas importantes en comparación también con el método B2 , sin importar el hecho de que se sabe que ambos métodos son diagnósticamente suficientes. Más específicamente el método B2 es un ensayo de PCR que comprende dos etapas consecutivas. A fin de proceder desde una etapa a otra, el tubo que se utilizó durante la primera etapa debe abrirse y esto es peligroso por infección, debido a la alta posibilidad de la entrada en la mezcla de la última reacción, de productos de ADN de análisis positivos previos que se encuentran en cantidad en el laboratorio (efecto de transferencia) . Por el contrario, este hecho, que frecuentemente conduce al incremento de resultados positivos falsos, se evita por el método B4 , dado que todos los constituyentes del ensayo en serie se insertan entre sí en el tubo de reacción y éste no se abre durante el ensayo. Además de lo anterior, el método B4 tiene ventajas significativas en comparación con el método B2 , pero también con el método B3 , debido a que requiere un tiempo significativamente menor y un menor costo dado que se necesitan menos consumibles ya que implica una sola reacción. Las ventajas anteriores del método B4 y el hecho de que, como para los otros ensayos de PCR antes mencionados, los resultados se controlan sin necesidad de utilizar un control interno, que aumentaría significativamente el costo y complejidad del análisis, pero también sin la necesidad de hibridación de ADN, que entre otros también aumentaría el tiempo necesario para el procedimiento, constituyen al método B4 claramente superior a todos los otros métodos que se evaluaron. Además de lo anterior, el método B4 mostró una sensibilidad extremadamente alta, lo que hace posible que el porcentaje de resultados negativos falsos resulte extremadamente bajo. Adicionalmente, el hecho de que el ensayo propuesto (B4) detectó exclusivamente solo el MAP a partir de todos los materiales utilizados, muestra su muy alta especificidad, que también hace posible que el porcentaje de resultados negativos falsos sea extremadamente bajo. A este respecto, es importante definir que dicho ensayo mostró una especificidad absoluta, no solo con las bacterias extraídas en cultivo, sino también en muestras FFPE originadas de pollos infectados por Mycobacterium avium, que presentan una relación genética especialmente alta para MAP. Opuesto a la esperada ineficiencia de algunos de los otros métodos evaluados, la completa reproducibilidad de los resultados registrados por los laboratorios colaboradores con respecto al método B4, aumenta su confiabilidad y apoya lo anterior. En conclusión, puede sostenerse que el ensayo de PCR en serie B4 se caracteriza por la velocidad y el relativo bajo costo, mientras que también permite detectar MAP de muestras de tejido embebidas en parafina fijadas en formalina. Lo anterior se demostró no solo con nuestros cultivos bacteriales sino también con las muestras FFPE MAA-positivas derivadas de pollos, a pesar de la alta similitud genética de las últimas con MAP. Finalmente, la consistencia de los resultados obtenidos con dicho método (B4) por los laboratorios colaboradores, convierte a la reacción B4 en un método más promisorio para el diagnóstico de rutina confiable de MAP. Considerando la base técnica de una reacción PCR, el método propuesto con los iniciadores de oligonucleótido específicos puede producir resultados de igual valor (sensibilidad-especificidad) con muestras diferentes a las clínicas, siempre que el procedimiento de extracción de ADN produzca ADN de una calidad similar a la antes mencionada.

El óptimo desempeño del ensayo propuesto con los iniciadores de oligonucleótido específicos se ha verificado con la detección de MAP a partir de muestras de queso y leche que se colectaron de Grecia y la República Checa y se evaluaron con diferentes ensayo de PCR y con cultivo. Descripción de las Figuras y Tablas La Tabla 1 muestra las cepas prototipo de las especies micobacteriales utilizadas para la evaluación de los métodos PCR propuestos. La Tabla 2 muestra la composición de las secuencias de nucleótidos de los iniciadores utilizados. La Tabla 3 muestra los perfiles de temperatura de las reacciones PCR Bl, B2 , B3 y B4. La Tabla 4 muestra los resultados comparativos de PCR en las muestras FFPE con lesiones típicas de enfermedad de Johne, colectadas de ganado. La Figura 1 muestra los resultados representativos de electroforesis de productos de PCR de los métodos Bl, B2 , B3 y B4 incorporados al examen de muestras FFPE colectadas de ganado y pollos . Más específicamente, La vía 1 muestra una escala de ADN de 100 bp (Biolabs) . Las vías 2-4 muestran los productos de ADN de PCR efectuados en muestras del intestino delgado de ganado.

La vía 5 muestra los productos de ADN de PCR efectuados en muestras de un nodo linfático mesentérico de ganado. Las vías 6-7 muestran los productos de ADN de ensayo de PCR efectuados en muestras del íleo de ganado. La vía 8 muestra los resultados de PCR producidos de una muestra de bazo de pollo. La vía 9 muestra los resultados de PCR producidos de una muestra de hígado de pollo. La ruta T muestra los resultados de PCR producidos de muestras de control negativo (sin ADN) .

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Tabla 1 : Número de cepas de las especies micobacteriales que se utilizaron para la evaluación de los métodos PCR propuestos.

Número Especies Fuente de cepas 1 M. tuberculosis RIVM, Países Bajos 1 M. cannet ti 1 M. bovis BCG 5 M. anium 1 M. int rae el luí are tipo I 1 M. intracellulare tipo II 1 M. gordonae I 1 M. fortui tum 1 M. scrofulaceum 1 M. kansasii 1 M. avium paratuberculosis Hospital de 8 M. tuberculosis enfermedades torácicas, Grecia 3 M. avium 3 M. gordonae 1 M. celatum 1 M. fortui tum VRI, República 9 M. avium paratuberculosis Checa RIVM: Instituto nacional de salud pública y medio ambiente, Países Bajos VRI : Instituto de Investigación Veterinaria, República Checa Tabla 2 : Composición de los iniciadores de oligonucleótidos Ensayo de PCR Iniciador Composición del Iniciador Bl IS900-F ACGCCGCGGGTAGTTA IS900-R GGGGCGTTTGAGGTTTC B2 S204 TGATCTGGACAATGACGGTTACGGA S749 CGCGGCACGGCTCTTGTT S345 GCCGCGCTGCTGGAGTTGA S535 AGCGTCTTTGGCGTCGGTCTTG B3 IS01 CTTACCTTTCTTGAAGGGTGTTC IS04 GTCGTTAATAACCATGCAGTAATG IS02 GTATGGCTTTCATGTGGTTGCT IS03 TAACCGTCATTGTCCAGATCAAC B4 PIN GCATGGCCCACAGGACGTTGAG P2N CTACAACAAGAGCCGTGCCG P3N GGGTGTGGCGTTTTCCTTCG P4N TCCTGGGCGCTGAGTTCCTC Tabla 3 Perfiles de temperatura de las reacciones Bl, B2 , B3 y B4.

Perfil de temperatura Ia etapa de reacción 2 a etapa de reacción Desnatura Híbrida Extensión Número Desnatura Híbrida Extensión Número lización ción (°C/min) de lización ción (°C/min) de (°C/min) (°C/min) ciclos (°C/min) (°C/min) ciclos Reacción Bl 94/1 63/1 72/1 35 * * * * B2 94/1 63/1 72/1 35 94/1 63/1 72/1 35 B3 94/1 62/1 72/1 35 94/1 62/1 72/1 35 B4 94/1 54/1 72/1 16 94/1 67/1 72/1 30 * La reacción Bl se lleva a cabo en una sola etapa Tabla 4 : Resultados de PCR de los métodos Bl, B2 , B3 y B4 en las muestras FFPE con típicas lesiones de enfermedad de Johne, colectadas de ganado Resultados Ensayos PCR Descripción Positivos Bl PCR 6/10 (60%) B2 PCR en serie 9/10 (100%) B3 PCR en serie 6/10 (60%) PCR en serie de un B4 tnhn 10/10 (100%)

Claims (4)

1. REIVINDICACIONES 1. Los oligonucleótidos útiles para la detección de Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (MAP) seleccionados del grupo que consiste de los oligonucleótidos de las secuencias siguientes: PIN GCA TGG CCC ACÁ GGA CGT TGA G P2N CTA CAÁ CA GAG CCG TGC CG P3N GGG TGT GGC GTT TTC CTT CG P4N TCC 'TGG GCG CTG AGT TCC TC
2. 2. Un conjunto de oligonucleótidos que comprenden solos o en combinación, uno o más de los oligonucleótidos de acuerdo con la reivindicación 1, particularmente las combinaciones de oligonucleótidos P1N/P2N, P3N/P4N, P1N/P3N, P1N/P4N, P2N/P3N, P2N/P4N, P1N/P2N/P3N, P1N/P2N/P4N, P1N/P3N/P4N, P2N/P3N/P4N y/o P1N/P2N/P3N/P4N.
3. 3. Un método para la detección de MA y/o MAP en una muestra que comprende las etapas (a) aislar ADN de la muestra; (b) efectuar un PCR de un tubo utilizando el ADN aislado de al menos uno de los oligonucleótidos de acuerdo con la reivindicación 1; (c) detectar sistemáticamente los resultados positivos de la amplificación PCR; (d) identificación de muestras que contienen MAP, cuyo método se caracteriza en que al menos uno de los oligonucleótidos de acuerdo con la reivindicación 1, se utiliza en el PCR. 4. Método de acuerdo con la reivindicación 3 utilizando uno o más conjuntos de oligonucleótidos de acuerdo con la reivindicación 2, particularmente un conjunto que comprende todos los cuatro oligonucleótidos. 5. El uso del método de acuerdo con las reivindicaciones 3 o 4 para la detección de MAP en una muestra de un animal vivo, en un producto derivado de una criatura viva, incluyendo seres humanos o animales, particularmente de ganado, aves o pollos, y/o en una muestra derivada de origen no vivo, particularmente de polvo o plantas . 6. El uso del método de acuerdo con las reivindicaciones 3 o 4 para el diagnóstico de infección por MAP en una criatura viva, incluyendo humanos, particularmente en ganado, aves o pollos. 7. El equipo para la detección de MAP en un espécimen, que comprende: a) un medio para aislar el ADN de la muestra; b) oligonucleótidos de acuerdo con la reivindicación 1 y/o un conjunto de oligonucleótidos de acuerdo con la reivindicación 2; c) medios para detectar sistemáticamente los resultados positivos de la amplificación PCR; d) medios de identificación de muestras que contienen MAP. 8. El equipo* que comprende uno o más oligonucleótidos de acuerdo con la reivindicación 1 y/o uno o más conjuntos de oligonucleótidos de acuerdo con la reivindicación 2, y un recipiente. 9. El equipo que comprende todos los cuatro oligonucleótidos de acuerdo con la reivindicación 1 y un recipiente . 10. El uso de un equipo de acuerdo con la reivindicación 7, 8 o 9, para el método de acuerdo con la reivindicación 3 y/o
4. 4.